Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện gen LipL21 mã hóa cho Lipoprotein từ Leptospira interrogans trong Escherichia coli

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:105

Thêm vào BST

Báo xấu

26
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm 2 mục tiêu: Nhân dòng và biểu hiện thành công đoạn gen LipL21 đặc hiệu trong vector biểu hiện pET32a trên hệ biểu hiện E. coli BL21; tinh sạch và đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của protein LipL21 tái tổ hợp thu được.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện gen LipL21 mã hóa cho Lipoprotein từ Leptospira interrogans trong Escherichia coli

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Đặng Thị Quỳnh NGHIÊN CỨU NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN LipL21 MÃ HÓA LIPOPROTEIN TỪ Leptospira interrogans TRONG Escherichia coli LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội – tháng 04 năm 2021
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Đặng Thị Quỳnh NGHIÊN CỨU NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN LipL21 MÃ HÓA LIPOPROTEIN TỪ Leptospira interrogans TRONG Escherichia coli Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 19811017 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS. TS. Nghiêm Ngọc Minh Hà Nội - 2021
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi. Các số liệu sử dụng phân tích trong luận văn có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định. Các kết quả trong luận văn chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Đặng Thị Quỳnh
LỜI CẢM ƠN Hoàn thành đề tài nghiên cứu này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Nghiêm Ngọc Minh – Viện Nghiên cứu hệ gen – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng tới lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen và các thầy cô Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi, tận tình giúp đỡ trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Võ Thị Bích Thủy – trưởng phòng Hệ gen học vi sinh và các cán bộ, học viên, sinh viên thuộc phòng Hệ gen học vi sinh, những người đã giúp đỡ tôi rất nhiều để tôi có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Đặng Thị Quỳnh
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Amp Ampicillin APS Ammonium persulphate bp Base pair BSA Bovine Serum Albumins (Huyết thanh bò) CBB Comassie Brilliant Blue DNA Deoxyribonucleic acid E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Acid IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb Kilobase kDa KiloDalton L. interrogans Leptospira interrogans L. Bataviae Leptospira interrogans serovar Bataviae L. Canicola Leptospira interrogans serovar Canicola L. Grippotyphosa Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa L. Icterohaemorrhagiae Leptospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae
L. Pomona Leptospira interrogans serovar Pomona LB Luria Bertani LPS Lipopolysaccaride OD Optical density PBS Phosphate buffer saline Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuếch đại PCR gen) RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate TBST Tris-buffered saline với Tween 20 TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Ưu thế của từng loại vector pET .................................................... 15 Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi LipL21 Fw/Rv .................................................... 27 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ............................................................. 29 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector nhân dòng .................... 31 Bảng 2.4. Thành phẩn phản ứng gắn ............................................................. 35 Bảng 2.5. Công thức pha gel tách ................................................................... 37 Bảng 2.6. Công thức pha gel cô ...................................................................... 37 Bảng 2.7. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford ........................... 40 Bảng 3.1. Các vị trí nucleotide khác biệt giữa năm chủng Leptospira ........... 45 Bảng 3.2. Trình tự các vùng epitope được dự đoán của gen Lipl21 ............... 46 Bảng 3.3. Kết quả đo độ hấp thụ BSA ở bước sóng 595nm ........................... 63
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Tỷ lệ mắc bệnh Leptospirosis ở người hàng năm trên toàn cầu 3 Hình 1.2. Hình dạng Leptospira interrogans dưới kính hiển vi (KHV) điện tử quét .................................................................................................................... 8 Hình 1.3. Cấu trúc màng của xoắn khuẩn Leptospira interrogans [2] ........... 11 Hình 1.4. Bản đồ gen vector nhân dòng pJET 1.2 (Thermo Scientific) ......... 14 Hình 1.5. Bản đồ gen vector biểu hiện pET (Novagen).................................. 18 Hình 1.6. Bản đồ gen vector biểu hiện pGEX-6P-3 (Merch) ......................... 19 Hình 1.7. Đánh giá khả năng gây miễn dịch của một số chủng Leptospira sử dụng kháng huyết thanh LipL32 tinh chế từ thỏ. ............................................ 22 Hình 1.8. Đánh giá và tiêu chuẩn hóa nồng độ kháng nguyên tái tổ hợp LipL32 khi pha loãng huyết thanh với tỉ lệ 1:1000......................................... 24 Hình 3.1. Trình tự nucleotit của gen LipL21 tương đồng đối chiếu từ 5 chủng vi khuẩn L. interrogans. Tên các chủng vi khuẩn lần lượt được ký hiệu: ...... 44 Hình 3.2. Trình tự axit amin của gen LipL21.................................................. 45 Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân bản gen LipL21 ............................ 48 Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen LipL21 từ plasmid trong các khuẩn lạc 1, 2, 3, 4, 5 và 6............................................................................... 49 Hình 3.5. Kết quả so sánh trình tự gen LipL21 của chủng L. Bataviae và trình tự gen LipL21 trong vector nhân dòng pJET-LipL21. .................................... 50 Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm vector pJET- LipL21. .................................... 51 Hình 3.7. Điện di đồ sản phẩm plasmid pET 32a ........................................... 52 Hình 3.8. Điện di đồ sản phẩm cắt vector pJET-LipL21 bằng enzyme giới hạn EcoRV và XhoI ................................................................................................ 53 Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm cắt vector pET32a bằng enzyme giới hạn EcoRV và XhoI ................................................................................................ 53 Hình 3.10. Điện di đồ kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi T7 promoter Fw/ T7 terminater Rv ................................................................................................... 54 Hình 3.11. Điện di đồ kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi LipL21 Fw/Rv .......... 55 Hình 3.12. Điện di đồ kiểm tra sự biểu hiện của protein LipL21 ở E. coli BL21 ................................................................................................................ 57 Hình 3.13. Điện di đồ kiểm tra sự biểu hiện của LipL21 ở E. coli BL21 trong các điều kiện nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng khác nhau. ...................................... 58 Hình 3.14 . Điện di đồ kiểm tra sự biểu hiện của LipL21 ở E. coli BL21 trong các điều kiện nồng độ cảm ứng IPTG khác nhau. .......................................... 60 Hình 3.15. Điện di đồ kiểm tra sự biểu hiện của LipL21 ở E. coli BL21 trong các điều kiện thời gian cảm ứng IPTG khác nhau. ......................................... 61 Hình 3.16. Đồ thị đường chuẩn BSA .............................................................. 63 Hình 3.17. Nồng độ protein của các phân đoạn tinh sạch thu được định lượng bằng Bradford .................................................................................................. 64
Hình 3.18. Điện di đồ kiểm tra sự biểu hiện của pET32a-LipL21 ở E. coli BL2 đã tinh sạch.............................................................................................. 65 Hình 3.19. Phản ứng Western Blot giữa kháng nguyên tái tổ hợp LipL21 với kháng thể thu được từ huyết thanh chuột ........................................................ 66
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vi MỤC LỤC viii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH LETOSPIROSIS 2 1.1.1. Tổng quan tình hình thế giới 2 1.1.2. Tổng quan tình hình trong nước 6 1.2. VI KHUẨN LEPTOSPIRA 7 1.2.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn Leptospira 7 1.2.2. Đặc điểm cấu trúc và hệ gen vi khuẩn Leptospira 10 1.2.3. Gen LipL21, protein LipL21 liên quan đến độc lực của vi khuẩn Leptospira và tính ứng dụng 12 1.3. NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN NGOẠI LAI 13 1.3.1. Biểu hiện protein ngoại lai trong E. coli 13 1.3.2. Nhân dòng và biểu hiện gen của vi khuẩn Leptospira interrogans 20 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU27 2.1. NGUYÊN LIỆU, MÁY MÓC 27 2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất 27 2.1.2. Máy móc, dụng cụ thí nghiệm 28 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.2.1. Phương pháp nhân dòng gen LipL21 vào vector pJET1.2 29 2.2.2. Phương pháp biểu hiện gen LipL21 trong E. coli BL21 32 2.2.3. Phương pháp thu, tinh sạch, đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của protein LipL21 tái tổ hợp 36 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1. TẠO VECTOR MANG GEN LIPL21 43
3.2. TẠO VECTOR BIỂU HIỆN GEN LipL21 TRONG E. coli BL21 50 3.3. BIỂU HIỆN PROTEIN LIPL21 TRONG E. coli BL21 56 3.3.1. Biểu hiện protein LipL21 trong E. coli BL21 56 3.3.2. Tối ưu các điều kiện biểu hiện 58 3.4. TINH SẠCH, ĐỊNH LƯỢNG VÀ KIỂM TRA ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA PROTEIN LIPL21 TÁI TỔ HỢP TRÊN CHUỘT 62 3.4.1. Tinh sạch và định lượng protein tái tổ hợp LipL21 62 3.4.2. Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của protein LipL21 tái tổ hợp trên chuột 65 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 4.1. Kết luận 67 4.2. Kiến nghị 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68
1 MỞ ĐẦU Bệnh Xoắn khuẩn vàng da (hay còn gọi là bệnh Leptospirosis) do vi khuẩn thuộc chi Leptospira gây ra, là một trong những bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng và phổ biến hiện nay. Bệnh có khả năng lây truyền từ động vật sang người qua da, niêm mạc, vết thương hở hoặc do tiếp xúc trực tiếp, gián tiếp với dịch nhầy, nước tiểu, mẫu mô động vật đã nhiễm khuẩn. Ở nước ta, bệnh Leptospirosis lần đầu được phát hiện trên người năm 1931. Đến nay, bệnh đã có mặt ở tất cả các vùng miền trong cả nước. Leptospira interrogans là xoắn khuẩn Gram âm thuộc chi Leptospira, họ Leptospiraceae, được xác định là một trong loài phổ biến gây ra bệnh Xoắn khuẩn vàng da Leptospirosis. Năm 2003, trình tự bộ gen đầy đủ của chủng Leptospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae được công bố trên tạp chí Nature. Việc công bố những dữ liệu phân tích bộ gen đầy đủ đã hỗ trợ phát hiện và nghiên cứu các gen mã hóa kháng nguyên cho vắc-xin chống bệnh Leptospriosis. Những nghiên cứu gần đây cho thấy 16 protein tiềm năng cho việc sản xuất vắc xin tái tổ hợp, trong đó có Lipoprotein LipL21. Với các nghiên cứu trước đó, chúng tôi đã lựa chọn được đoạn gen LipL21 đặc hiệu, giàu epitope trên năm chủng Leptospira interrogans tại Việt Nam. Chính vì lý do trên, chúng tôi tiếp tục thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện gen LipL21 mã hóa cho Lipoprotein từ Leptospira interrogans trong Escherichia coli” với mục tiêu: + Nhân dòng và biểu hiện thành công đoạn gen LipL21 đặc hiệu trong vector biểu hiện pET32a trên hệ biểu hiện E. coli BL21. + Tinh sạch và đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của protein LipL21 tái tổ hợp thu được.
2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH LETOSPIROSIS 1.1.1. Tổng quan tình hình thế giới Bệnh Xoắn khuẩn vàng da (hay còn gọi là bệnh Leptospirosis) là một trong những bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng và phổ biến hiện nay gây ra bởi chủng vi khuẩn Leptospira gây bệnh [1-3]. Bệnh có khả năng lây truyền giữa động vật và từ động vật sang người. Bệnh xuất hiện trong các môi trường dịch tễ học đa dạng và ảnh hưởng đến các quần thể dễ bị tổn thương. Bệnh được Tổ chức Sức khỏe động vật Thế giới (World Organisation for Animal Health – OIE) xếp vào nhóm thứ 2 của Bệnh nguy hiểm và thuộc nhóm bệnh nghề nghiệp tại Việt Nam. Bệnh xuất hiện tại hầu hết các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, bao gồm Châu Mỹ Latin, Trung Đông Châu Phi và Châu Á (Hình 1.1) [4] .Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và các nguồn dữ liệu khác, mỗi năm có từ 7 đến 10 triệu người mắc bệnh Leptospirosis với tỉ lệ ước tính từ 0.1-1/100000 ở vùng khí hậu ôn đới và 10-100/100000 ở vùng khí hậu nhiệt đới [5-7]. Tỷ lệ ca nhiễm có thể cao hơn ở các nước thuộc vùng khí hậu nhiệt đới. Thế giới đã trải qua nhiều trận dịch bệnh Leptospirosis tại nhiều nước trên thế giới như Nicaragua năm 1995, Orrisa năm 1999, Jakarta năm 2002, Mimbai năm 2005, Srilanka năm 2008 hoặc xảy ra theo mùa ở Thái Lan và một số vùng ở Ấn Độ [7, 8]. Ở Hoa Kỳ, hàng năm có khoảng 40 - 120 bệnh nhân được thông báo thuộc những nhóm nghề nghiệp thường bị phơi nhiễm hoặc tiếp xúc trực tiếp với nguồn nước và đất bị nhiễm Leptospira như: thú y, công nhân nông nghiệp, công nhân vệ sinh, công nhân lò mổ và những công nhân công nghiệp cá. Ở các nước Tây Âu, những người mắc bệnh do tiếp xúc với súc vật nuôi trong nhà hoặc do chơi thể thao dưới nước bị phơi nhiễm với nguồn nước có Leptospira như: bơi xuồng, thuyền buồm, bơi, lướt ván v.v... Nghiên cứu mới đây ở Hà Lan cho biết 14% mắc bệnh xoắn khuẩn vàng da do đi du lịch ở các nước nhiệt đới và Đông Nam Á. Dịch bệnh diễn ra gây thiệt hại lớn về kinh tế và sức khỏe con người.
3 Hình 1.1. Tỷ lệ mắc bệnh Leptospirosis ở người hàng năm trên toàn cầu Kí hiệu màu sắc phản ánh tỷ lệ mắc bệnh theo thứ tự giảm dần: đỏ, hồng, xanh lá cây, màu vàng. Màu nâu vàng phản ánh các khu vực có thể xảy ra, nhưng không ước tính cho tỉ lệ mắc cao. Màu trắng phản ánh sự thiếu của dữ liệu [4] Con người có thể mắc bệnh khi tiếp xúc trực tiếp với nước tiểu và các chất dịch cơ thể khác của động vật bị nhiễm bệnh. Vi khuẩn Leptospira xâm nhập qua da, niêm mạc, vết thương hở khi tiếp xúc trực tiếp, gián tiếp với dịch nhầy, nước tiểu, mẫu mô động vật đã nhiễm khuẩn. Người và động vật Sau khi nhiễm khuẩn, thể bệnh có những biểu hiện lâm sàng như nhiễm khuẩn thể ẩn, hội chứng nhiễm độc toàn thân, tổn thương gan, thận và gây ra hội chứng Weil. Động vật nhiễm bệnh Leptospirosis có thể dẫn đến thai chết lưu, giảm khả năng sinh sản, giảm năng suất và tử vong, từ đó gây thiệt hại lớn về kinh tế. Ở người, khoảng 5 - 15% các trường hợp nhiễm Leptospirosis xuất hiện biến chứng đa cơ quan nghiêm trọng với tỉ lệ tử vong từ 5 đến 40% [9]. Vì vậy, bệnh Leptospirosis đã được Tổ chức Sức khỏe động vật Thế giới (World Organization for Animal Health-OIE) xếp vào nhóm thứ 2 của Bệnh nguy hiểm và được bổ sung vào nhóm bệnh nghề nghiệp ở Việt Nam.
4 Mọi người đều có thể cảm nhiễm với bệnh xoắn khuẩn vàng da nhưng sự biểu hiện lâm sàng của bệnh không giống nhau, chủ yếu là tuỳ thuộc vào biến thể huyết thanh gây bệnh. Miễn dịch đặc hiệu biến thể huyết thanh học được tạo thành sau khi mắc bệnh hoặc dùng vắc xin dự phòng nhưng không có miễn dịch chéo giữa các nhóm gây bệnh khác nhau. Bệnh Leptospirosis có thời kỳ ủ bệnh từ 2 đến 20 (thường từ 7 đến 13 ngày). Người bị bệnh Leptospirosis thường trải qua 2 giai đoạn chính là nhiễm trùng và miễn dịch. Sự phân biệt giữa 2 giai đoạn này thường không rõ ràng và những trường hợp bệnh nhẹ thường không có giai đoạn 2. Giai đoạn nhiễm trùng bắt đầu đột ngột, nhức đầu, đau cơ bắp, ớn lạnh, sốt, ho, viêm họng, đau ngực, và ở một số bệnh nhân, ho ra máu. Viêm kết mạc đồng thời thường xuất hiện vào ngày thứ 3 hoặc thứ 4. Lách to và gan to là không phổ biến. Giai đoạn này kéo dài từ 4 đến 9 ngày, với ớn lạnh và sốt thường tăng> 39° C. Ngoài ra, các biểu hiện lâm sàng của bệnh Leptospirosis rất đa dạng và thường gây nhầm lẫn với các biểu hiện bệnh lý nhiễm trùng khác: sốt xuất huyết, thương hàn, viêm gan, cúm, viêm màng não, sốt vàng da và sốt rét, trong đó, nhiễm trùng không có triệu chứng có tỉ lệ phổ biến lên đến 60-70% trong khu vực tâm dịch. Một nghiên cứu lâm sàng về 559 trường hợp mắc bệnh Leptospirosis ở Malaysia được thực hiện hơn ba thập kỷ trước thống kê mức độ phổ biến của các biểu hiện bệnh. Cụ thể là, các triệu chứng có tỉ lệ tương ứng: bị sốt (100%), viêm kết mạc (54%), vàng da (46%), đau cơ (45%), đau bụng (29%), nhức đầu (25%), protein niệu (25%), ớn lạnh (22%) và phình đại gan (18%). Giai đoạn miễn dịch xảy ra giữa ngày thứ 6 và ngày thứ 12 của bệnh, tương quan với sự xuất hiện của kháng thể trong huyết thanh. Sốt và các triệu chứng sớm xảy ra, và viêm màng não có thể phát triển. Viêm màng bồ đào, viêm dây thần kinh thị giác, và bệnh lý thần kinh ngoại vi xảy ra không thường xuyên. Nếu người bị nhiễm bệnh Leptospirosis trong thời kỳ mang thai, thậm chí ngay cả trong giai đoạn hồi phục, có thể gây sẩy.
5 Hội chứng Weil (Leptospirosis icteric) là một dạng bệnh Leptospirosis nặng với các triệu chứng vàng da và thiếu máu cục bộ, suy giảm trạng thái cảm xúc và sốt liên tục kéo dài 5 -7 ngày, sau đó khỏi hẳn hoặc 2-5 ngày sau sốt lại. Thể bệnh này là do chủng xoắn khuẩn vàng da xuất huyết gây nên (Leptospira icterohaemorrhagiae). Hội chứng Weil ban đầu khởi phát tương tự như các dạng bệnh Leptospirosis thông thường. Tuy nhiên, các biểu hiện xuất huyết do chấn thương mao mạch và bao gồm chảy máu cam, trên da có chấm xuất huyết (petechiae), ban xuất huyết (purpura) và mảng xuất huyết (ecchymoses). Các dấu hiệu rối loạn chức năng tế bào và thận diễn ra từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 6 của thời kỳ ủ bệnh dẫn đến những bất thường về thận bao gồm protein niệu, bạch cầu niệu, tiểu máu và natri máu. Ngoài ra còn xuất huyết dạ dày - ruột nặng. Tuy hiếm nhưng cũng có thể xuất huyết thượng thận hoặc xuất huyết dưới màng nhện. Tỷ lệ tử vong tăng nếu không được điều trị tích cực, kể cả biện pháp chạy thận nhân tạo ở những trường hợp suy gan thận cấp, rối loạn mạch máu gây xuất huyết hoặc suy hô hấp, rối loạn nhịp tim do viêm cơ tim. Ca bệnh lâm sàng thường nhìn chung có 3 thể lâm sàng chủ yếu: Viêm gan-thận cấp, viêm màng não nước trong và sốt đơn thuần. Tiên lượng bệnh phụ thuộc vào tình trạng viêm gan-thận cấp, chảy máu, biến chứng cơ tim và thần kinh. Các ca bệnh xác định dựa vào hiệu giá kháng thể tăng 4 lần hoặc tăng cao hơn trong các xét nghiệm huyết thanh kép (+) hoặc phân lập xoắn khuẩn vàng da (+). Với đặc tính nguy hiểm và dễ lây lan của bệnh Leptospirosis, đã có nhiều biện pháp dự phòng và biện pháp chống dịch được khuyễn cáo. Một số biện pháp dự phòng luôn được khuyến khích có thể kể đến như: tuyên truyền cung cấp những thông tin cần thiết về bệnh xoắn khuẩn vàng da, vệ sinh các chuồng trại chăn nuôi súc vật, lò mổ v.v… sạch sẽ, đặt cao ráo, có nền cứng dễ thoát nước, thường xuyên được cọ rửa sạch sẽ và khử trùng tẩy uế khi cần thiết, bảo vệ những người làm việc trong môi trường lao động hoặc nghề nghiệp có nguy cơ bị nhiễm Leptospira bằng trang bị bảo hộ, tiêm vắc xin
6 phòng các chủng Leptospira gây bệnh. Khi có dịch xảy ra, khu vực môi trường lưu hành bệnh tuyệt đối được xử lý kĩ càng, tẩy uế và khoanh vùng nếu cần. 1.1.2. Tổng quan tình hình trong nước Tại Việt Nam, bệnh Leptospirosis lần đầu được phát hiện trên người năm 1931 bởi Ragiot và Souchard. Đến nay, bệnh đã xuất hiện ở tất cả các vùng miền trong cả nước. Khoảng 20 năm trước đây, nhiều nơi có dịch xoắn khuẩn vàng da ở súc vật nuôi, nhất là lợn trong các trại chăn nuôi, và lây sang người. Ngày nay, dịch xoắn khuẩn vàng da ở người hiếm xảy ra, nhưng bệnh vẫn xuất hiện tản phát, nhất là trong mùa mưa, lụt lội. Tổng số trường hợp mắc xoắn khuẩn được ghi nhận tại Việt Nam giai đoạn 2002-2011 là 369 ca và không có trường hợp tử vong. Tỷ suất mắc xoắn khuẩn trung bình trong 10 năm nghiên cứu là 0,05 ca/100.000 dân/năm trong đó tỷ suất mắc cao nhất vào năm 2004 với 0,25 ca/100.000 dân/năm. Tây Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ là hai vùng sinh thái tập trung nhiều nhất số trường hợp mắc Leptospira [10]. Ở mỗi nước và mỗi loài gia súc đều tồn tại các chủng xoắn khuẩn riêng biệt và mỗi chủng đều đại diện cho một nhóm [11]. Đối với từng loài gia súc khác nhau và sống ở các vùng địa lý khác nhau các chủng gây bệnh cũng khác nhau. Theo Phạm Quân, Lê Độ và Vũ Đình Hưng ở Việt Nam bộ giống chuẩn dùng để chẩn đoán gồm 12 chủng đại diện cho 12 nhóm huyết thanh. Mười hai chủng này được xếp theo thứ tự alphabet: L. Australis, L. Autumnalis, L. Bataviae, L. Canicola, L. Grippotyphosa, L. Hebdomadis, L. Icterohaemorrhagiae, L. Javanica (poi), L. Panama, L. Pomona, L. Sejroe hardjo bovis và L. Tarassovi (mitis) [12-14]. Hiện nay, người mắc bệnh Leptospirosis mang tính chất nghề nghiệp: làm vệ sinh cống rãnh, công nhân chăn nuôi, cán bộ địa chất, lâm nghiệp hay mắc bệnh. Mặc dù bệnh này luôn tiềm ẩn nguy cơ lây nhiễm cao cho người và động vật, nhưng lâu nay ít được chú ý cả về mặt pháp luật cũng như về nhận
7 thức của nhân dân. Việc mua bán gia súc bừa bãi không được kiểm tra chặt chẽ về mặt thú y làm cho nguy cơ nhiễm bệnh ở gia súc ngày một tăng, đồng thời nguy cơ lây nhiễm sang người cũng tăng theo. 1.2. VI KHUẨN LEPTOSPIRA 1.2.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn Leptospira Leptospira là xoắn khuẩn Gram âm, được xác định là một trong loài phổ biến gây ra bệnh Xoắn khuẩn vàng da Leptospirosis. Theo phân loại khoa học, Leptospira thuộc giới Bacteria, ngành Spirochaetes, lớp Spirochaetes, bộ Spirochaetales, họ Leptospiraceace, giống Leptospira. Với những nghiên cứu ban đầu vào năm 1907, Stimson đã chia chi Leptospira thành 2 nhóm: Leptospira biflexa không gây bệnh và Leptospira interrogans gây bệnh cho người và động vật dựa trên độc lực của chúng [15]. Gần đây, phân tích gen di truyền cho thấy Leptospira có thể được chia thành 20 loài: 9 loài gây bệnh (L. interrogans, L. kirschneri, L. borgpeterenii, L. santarosai, L. noguchii, L. weilii, L. alexanderi, L. alstoni và L. kmetyi), 6 loài hoại sinh (L. biflexa, L. wolbachii, L. meyeri, L. vanthielii, L. terpstrae và L. yanagawae), 5 loài trung gian (L. absai, L. broomii, L. fainei, L. wolffii và L. licerasiae) [16]. Hệ thống phân loại mới dễ bị lẫn lộn bởi vì nhiều serovar và serogroup gây bệnh cũng như không gây bệnh có thể nằm trong cùng một loài, ngược lại một serovar hoặc serogroup cũng có thể nằm trong nhiều loài khác nhau. Điều này cho thấy không có sự tương đồng giữa hệ thống phân loại dựa trên cấu trúc kháng nguyên bề mặt và hệ thống phân loại dựa trên cấu trúc gene. Leptospira được chia làm 24 serogroup huyết thanh và hơn 260 serovar gây bệnh dựa trên lớp ngoài lipopolysaccharide (LPS). Phân loại các biến thể huyết thanh học của loại vi khuẩn này được xác định thông qua phản ứng ngưng kết sau khi hấp thụ chéo giữa chúng với kháng nguyên tương đồng. Kết quả của phản ứng ngưng kết cho phép phân loại các biến thể huyết thanh học thành các nhóm huyết thanh cơ bản thông thường được kể đến như Icterohaemorrhagiae, Hebdomanis, Autumnalis, Pyrogenes, Grippotyphosa,
8 Canicola, Australis, Pomona và Javanica. Theo các nghiên cứu dịch tễ học, nhóm huyết thanh Icterohaemorrhagica có liên quan đến các ca bệnh nặng [17]. Xoắn khuẩn Leptospira là loài sinh vật hiếu khí, phát triển chậm, có kích thước nhỏ, dạng mảnh, đường kính 0,1-0,2 µm, dài 4-20 µm, hình móc câu, xoắn, chuyển động của Leptospira rất đa dạng không theo qui luật nào, có thể di chuyển thẳng, xoay tròn, theo hình sóng… Quan sát dưới kính hiển vi điện tử, Leptospira có hình ống xoắn tròn xung quanh một trục dọc theo chiều dài thân và uốn cong thành móc ở hai đầu, bộ phận di động của vi khuẩn gồm một trục ở giữa và thân xoắn như lò xo quanh trục. Ngoài cùng có một vỏ mềm co giãn được, chứa nhiều kháng nguyên, tiếp theo là màng bao bọc tế bào chất bao gồm 3-5 lớp, ở giữa là nhân không có màng ngăn cách với nguyên sinh chất đảm nhận chức năng di truyền. Do có cấu trúc đặc biệt như vậy nên Leptospira vận động rất uyển chuyển và có khả năng co giãn dễ dàng, chúng có thể chui qua da, niêm mạc của gia súc hoặc của người khi ngâm nước hoặc có vết trầy xước. Khi cho qua lọc Seitz với kích thước lổ lọc 0,1-0,45 µm, hầu hết các vi khuẩn đều bị giữ lại nhưng chỉ có xoắn khuẩn Leptospira có thể chui qua được dễ dàng. Hình 1.2. Hình dạng Leptospira interrogans dưới kính hiển vi (KHV) điện tử quét
9 Leptospira được duy trì trong tự nhiên do nhiễm trùng thận mạn tính của động vật mang mầm - thường là chuột, chó, gia súc, ngựa, cừu, dê và lợn. Sự thay đổi của các biến thể huyết thanh Leptospira tuỳ thuộc vào ổ chứa của loài súc vật như: L. icterohaemorrhagiae ở chuột, L. grippotyphosa ở chuột đồng nhỏ, L. Pomona ở lợn, L. Hardjo ở trâu bò, L. Canicola ở chó, L. Autumnali ở gấu trúc. Các vật chủ như các loài gặm nhấm hoang dã, hươu, sóc, cáo, chồn hôi, gấu trúc v.v... thường thay nhau là súc vật lành mang Leptospira. Những súc vật mang xoắn khuẩn này không có biểu hiện lâm sàng và Leptospira được tồn tại trong thời gian dài, có thể suốt đời, đặc biệt đối với súc vật là ổ chứa. Các súc vật nuôi gần người bị nhiễm Leptospira cũng không có biểu hiện triệu chứng, tuy nhiên cũng có súc vật như lợn… bị mắc bệnh, có thể thành dịch xoắn khuẩn vàng da mà dân gian gọi là bệnh lợn nghệ. Phương thức lây truyền bệnh Leptospirosis thông qua nước tiểu của súc vật hoang dã, chủ yếu là loài gặm nhấm có Leptospira được thải vào môi trường, đặc biệt là ở các đầm lầy, ao hồ, đồng ruộng để từ đó Leptospira lại xâm nhập qua da, niêm mạc vào các súc vật hoang dã khác hình thành một chu trình khép kín của ổ dịch thiên nhiên, duy trì lâu dài nguồn truyền bệnh Leptospira. Trường hợp loài gặm nhấm gần người, quan trọng là quần thể chuột và các động vật nuôi bị nhiễm Leptospira sẽ hình thành một chu trình khép kín của ổ dịch gần người. Con người bị nhiễm bệnh khi tiếp xúc trực tiếp với động vật bị nhiễm bệnh hoặc tiếp xúc với nước ngọt hoặc đất bị ô nhiễm bởi nước tiểu động vật nhiễm bệnh. Đôi khi, con người mắc bệnh do ăn phải thức ăn bị nhiễm nước tiểu của chuột. Thông thường, bệnh có tính nghề nghiệp do bị tiếp xúc qua da, niêm mạc đối với thú y, người chăn nuôi súc vật trong điều kiện vệ sinh chuồng trại kém, nhất là ở các trại nuôi lợn, ngư dân, nông dân làm việc trên những cánh đồng trũng, công nhân làm việc trên đầm lầy, hầm mỏ hoặc vệ sinh cống rãnh v. v... Bệnh cũng thường xảy ra trong mùa mưa, nhất là ở vùng lụt lội hoặc người bơi lội trong ao, hồ bị nhiễm Leptospira từ súc vật. Sự lây truyền bệnh Leptospora từ người sang người là