Luận văn Thạc sĩ sinh học: Nghiên cứu nuôi cấy in vitro và tạo rễ tơ ở cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:58

Thêm vào BST

Báo xấu

19
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung chính của đề tài là nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu nuôi cấy in vitro cây Ô đầu. Nghiên cứu tái sinh chồi in vitro cây Ô đầu. Nghiên cứu tạo cây Ô đầu in vitro hoàn chỉnh. Nghiên cứu trồng và ra cây ngoài vườn ươm. Nghiên cứu tạo dòng rễ tơ cây Ô đầu. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ sinh học: Nghiên cứu nuôi cấy in vitro và tạo rễ tơ ở cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TRẦN THỊ HỒNG NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO VÀ TẠO RỄ TƠ Ở CÂY Ô ĐẦU (Aconitum carmichaelii Debx.) Ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Ngọc Lan THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung trình bày trong luận văn đây là kết quả nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS. Nguyễn Thị Ngọc Lan. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019 Tác giả luận văn Trần Thị Hồng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này, em đã được tạo điều kiện và nhận được sự giúp đỡ quý báu từ thầy cô, cơ quan, bạn bè đồng nghiệp và gia đình. Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Ngọc Lan, người hướng dẫn khoa học đã tận tâm chỉ bảo giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn cảm ơn sâu sắc tới Quý thầy cô khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm – Đại học Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, truyền dạy kiến thức cho em trong suốt khóa học. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo trong Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, Hội đồng Khoa học của trường và Quý thầy, cô các phòng ban chức năng đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi cũng xin được chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ cả về vật chất và tinh thần cho tôi trong quá trình học tập. Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình đã luôn quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp đỡ tôi. Dù đã rất cố gắng, tuy nhiên không tránh khỏi những thiếu sót trong luận văn, rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của Quý thầy/cô để luận văn thêm hoàn thiện. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019 Tác giả luận văn Trần Thị Hồng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii MỤC LỤC............................................................................................................. ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................v DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... vi MỞ ĐẦU ...............................................................................................................1 1. Đặt vấn đề .........................................................................................................1 2. Mục tiêu nghiên cứu .........................................................................................2 3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................3 1.1. Giới thiệu chung về cây Ô đầu ......................................................................3 1.1.1. Đặc điểm phân loại và hình thái của cây Ô đầu .........................................3 1.1.2. Thu hái, chế biến và bảo quản cây Ô đầu...................................................4 1.1.3. Thành phần hóa học, giá trị dược liệu và công dụng của cây Ô đầu .........4 1.1.4. Nguồn gốc và phân bố của cây Ô đầu tại Việt Nam ..................................5 1.1.5. Vai trò của cây Ô đầu .................................................................................6 1.2. Các nghiên cứu nhân giống in vitro trên thế giới và ở Việt Nam .................7 1.2.1. Các nghiên cứu nhân giống in vitro trên thế giới .......................................7 1.2.2. Các nghiên cứu nhân giống in vitro ở Việt Nam........................................8 1.3. Các nghiên cứu tạo rễ tơ và ứng dụng ........................................................ 14 1.3.1. Tạo sinh khối rễ tơ ................................................................................... 14 1.3.2. Một số nghiên cứu tạo rễ tơ ..................................................................... 14 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 18 2.1. Vật liệu và hóa chất .................................................................................... 18 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................. 18 2.1.2. Hóa chất, thiết bị ...................................................................................... 18 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
2.2. Địa điểm nghiên cứu................................................................................... 18 2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 19 2.3.1. Phương pháp pha môi trường và nuôi cấy............................................... 19 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy in vitro ................................................................ 19 2.4. Phương pháp nuôi cấy tạo rễ tơ ở cây Ô đầu ............................................. 21 2.4.1. Chuẩn bị mẫu lây nhiễm .......................................................................... 21 2.4.2. Chuẩn bị dịch khuẩn Agrobacterium rhizogenes .................................... 22 2.4.3. Lây nhiễm mẫu với vi khuẩn ................................................................... 22 2.4.4. Diệt khuẩn và cảm ứng rễ tơ.................................................................... 22 2.4.5. Nhân nuôi rễ tơ ........................................................................................ 22 2.4.6. Xác định khối lượng rễ khô ..................................................................... 22 2.4.7. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................... 23 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................. 24 3.1. Kết quả tạo vật liệu khởi đầu nuôi cấy in vitro cây Ô đầu ......................... 24 3.2. Kết quả tái sinh chồi in vitro ở cây Ô đầu .................................................. 25 3.2.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh và sinh trưởng của chồi in vitro ở cây Ô đầu ......................................................................... 25 3.2.2. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh và sinh trưởng của chồi in vitro ở cây Ô đầu ......................................................................... 29 3.3. Kết quả tạo cây Ô đầu in vitro hoàn chỉnh ................................................. 31 3.3.1. Ảnh hưởng của α-NAA đến sự phát sinh rễ in vitro ở cây Ô đầu ........... 31 3.3.2. Ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh rễ in vitro ở cây Ô đầu ................ 33 3.4. Kết quả trồng và ra cây ngoài vườn ươm ................................................... 35 3.5. Tạo dòng rễ tơ ở cây ô đầu ......................................................................... 37 3.5.1. Kết quả tạo dòng rễ tơ ở cây Ô đầu ......................................................... 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4D-Dichlorophenoxy Acetic Acid AS : Acetosyringone BAP : 6-Benzyl Amino Purin ĐC : Đối chứng IAA : Indoly Acetic Acid IBA : Indoly Butyric Acid Kinetin : 6-furturylamino purine LB : Luria Bertani MS : Murashige – Skoog NAA : α - Napthalen Acetic Acid Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả tạo vật liệu khởi đầu nuôi cấy in vitro từ đoạn thân cây Ô đầu (n = 100 sau 4 tuần nuôi cấy) ....................................... 24 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh và sự sinh trưởng của chồi ở cây Ô đầu (n = 30) ........................................... 26 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng ở cây Ô đầu (n = 30) .......................................................... 29 Bảng 3.4. Ảnh hưởng α-NAA đến sự phát sinh rễ in vitro ở cây Ô đầu ....... 32 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh rễ in vitro ở cây Ô đầu ...... 34 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Ô đầu giai đoạn vườn ươm (n = 30) ............................................................... 36 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát vật liệu thích hợp tạo rễ tơ ở cây Ô đầu (n=150, sau 6 tuần) ........................................................................ 38 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A. rhizogenes, nồng độ AS, thời gian nhiễm khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả tạo rễ tơ từ đoạn rễ cây Ô đầu (n=150, sau 6 tuần) ....................... 41 Bảng 3.9. Xác định ngưỡng diệt khuẩn của cefotaxime sau 6 tuần .............. 42 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến sự tăng trưởng rễ tơ ở cây Ô đầu sau 6 tuần ....................................................................... 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây Ô đầu ........................................................................................ 3 Hình 3.1. Hình ảnh chồi tái sinh khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 9 phút ...... 24 Hình 3.2. Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi ở cây Ô đầu sau 8 tuần nuôi cấy ................................................................................. 27 Hình 3.3. Ảnh hưởng của Kinetin tới sự phát sinh chồi ở cây Ô đầu sau 8 tuần nuôi cấy ................................................................................. 30 Hình 3.4. Ảnh hưởng của α-NAA đến sự phát sinh rễ in vitro ở cây Ô đầu sau 8 tuần nuôi cấy ................................................................. 33 Hình 3.5. Ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh rễ in vitro ở cây Ô đầu sau 8 tuần nuôi cấy ........................................................................ 35 Hình 3.6. Hình ảnh cây Ô đầu trên giá thể đất phù sa + trấu hun ................. 36 Hình 3.7. Khảo sát vật liệu thích hợp để tạo rễ tơ ở cây Ô đầu sau 6 tuần biến nạp ......................................................................................... 38 Hình 3.8. Hình ảnh cảm ứng và nuôi cấy rễ tơ ở cây Ô đầu ......................... 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Việt Nam là một nước nhiệt đới có hệ thực vật phong phú và đa dạng. Trong đó có nhiều loài thực vật được sử dụng làm thuốc hoặc làm nguyên liệu để sản xuất thuốc chữa bệnh như: cây Xạ đen, Bình vôi, Diệp hạ châu, Giảo cổ lam và Ô đầu… Tuy nhiên, nguồn dược liệu ngoài tự nhiên đang bị suy giảm với tốc độ nhanh chóng cả về số lượng và chất lượng. Nhiều loài dược liệu quý ở trong tình trạng khan hiếm và có đang nguy cơ bị tuyệt chủng làm ảnh hưởng đến đa dạng sinh học và nguồn cung cấp dược liệu cho con người, trong đó có cây Ô đầu. Nguyên nhân chủ yếu của vấn đề này là do việc khai thác quá mức, cùng với các điều kiện bất lợi từ môi trường, sự biến đổi khí hậu và sự thu hẹp của diện tích rừng tự nhiên... Vì vậy, cần thiết phải có các biện pháp bảo vệ cũng như phát triển nguồn gen cây dược liệu nói chung và cây Ô đầu nói riêng. Cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) có chứa aconitin là một loại alkaloid có độc tính cao, tập trung chủ yếu trong củ Ô đầu. Ngoài ra, trong Ô đầu còn chứa nhiều hợp chất khác như các polysaccharide, flavonoid và các acid hữu cơ… Đối với con người, những hợp chất trong Ô đầu có tác dụng giảm đau, chống oxy hoá, tăng cường hệ miễn dịch, ngăn cản sự tăng sinh tế bào, chống ung thư, tác động lên tim mạch... Hiện nay, cây Ô đầu được nhân giống bằng củ con (phụ tử) hoặc cành giâm, nếu trồng bằng cành giâm thì tỷ lệ mọc thành cây cũng không cao. Vì vậy, cần có nghiên cứu tạo ra nguồn đồng đều, sạch bệnh để đáp ứng nhu cầu trồng và phát triển cây Ô đầu. Thực tiễn cho thấy việc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống cây trồng là một sự lựa chọn hiệu quả với nhiều ưu điểm nổi bật là nhân giống nhanh, chủ động, với số lượng lớn, thu được nguồn giống sạch bệnh và giảm chi phí. Bên cạnh đó, để đáp ứng nhu cầu về thu hợp chất thứ cấp từ cây Ô đầu, việc sản xuất sinh khối thông qua nuôi cấy rễ tơ đang là một hướng đi mới. Nuôi cấy rễ tơ có tính ổn định di truyền, sinh hóa, tốc độ sinh trưởng nhanh và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
khả năng tổng hợp các hợp chất tự nhiên ở mức tương đương so với cây còn nguyên vẹn. Do đó, nuôi cấy rễ tơ của cây dược liệu sẽ là một hệ thống hữu ích cho việc sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh dược cao, đặc biệt là cây Ô đầu. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu nuôi cấy in vitro và tạo rễ tơ ở cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.)’’. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định được môi trường thích hợp trong nuôi cấy in vitro và tạo rễ tơ ở cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.). 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu nuôi cấy in vitro cây Ô đầu 3.2. Nghiên cứu tái sinh chồi in vitro cây Ô đầu 3.3. Nghiên cứu tạo cây Ô đầu in vitro hoàn chỉnh 3.4. Nghiên cứu trồng và ra cây ngoài vườn ươm 3.5. Nghiên cứu tạo dòng rễ tơ cây Ô đầu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây Ô đầu 1.1.1. Đặc điểm phân loại và hình thái của cây Ô đầu Cây Ô đầu có tên gọi khác là Ấu tàu, Cố y, Gấu tàu. Về phân loại khoa học, cây Ô đầu có tên khoa học là Aconitum carmichaeli Debx, thuộc họ Hoàng Liên (Mao Lương, Ranuculaceae) [4]. Cây Ô đầu thuộc chi Aconitum Họ Mao lương (Ranunculaceae) Bộ Mao lương (Ranunculales) Phân lớp Mao lương (Ranunculidae) Lớp Mộc lan (Magnoliopsida) Ngành Mộc lan (Magnoliophyta) [10]. Hình 1.1. Cây Ô đầu [42] Mô tả về thực vật học, cây Ô đầu là cây thân thảo sống lâu năm, cao chừng 0,6 – 1 m, rễ phát triển thành củ mập, hình con quay, có củ mẹ, củ con. Rễ cái to mang nhiều rễ nhỏ (nên có tên là phụ tử). Thân mọc thẳng đứng, ít phân nhánh. Lá mọc so le, lá có gân hình chân vịt, lá của cây có hình tim tròn, có răng cưa to, phiến lá rộng 5 - 12 cm, xẻ thành 3 - 5 thùy to không đều nhau, 2 thùy 2 bên lại xẻ làm 3, thùy giữa lại xẻ thành 3 thùy con nữa. Mép các thùy đều có răng cửa thô, to. Hai mặt lá có lông ngắn, mặt trên lục bóng, mặt dưới Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
nhạt. Cụm hoa ở ngọn thân thành từng chù. Hoa lớn màu xanh tím mọc thành chùm dày dài 10 – 20 cm. Bao hoa gồm 5 lá đài, lá đài trên thẳng và cong hình mũi chụp kín tràng hoa đã tiêu giảm, nhị nhiều, bầu có 3 ô chứa nhiều lá noãn. Hoa nở vào tháng 6 - 7. Quả thu hoạch vào tháng 7 - 8, quả gồm 5 đài mỏng, hạt nhiều, trên mặt có nhiều vẩy nhỏ [42]. 1.1.2. Thu hái, chế biến và bảo quản cây Ô đầu Củ cây Ô đầu thường được thu hái vào cuối tháng 6, đầu tháng 7 hàng năm. Tùy theo yêu cầu muốn có ô đầu, phụ tử thì việc lựa chọn những củ và chế biến khác nhau. Theo hướng dẫn của Viện dược liệu chế biến ô đầu, phụ tử, bạch phụ gồm các bước như sau [42]: (1) Ô đầu là phần rễ củ. Muốn thu phần Ô đầu lựa chọn những củ mẹ, cắt bỏ rễ con, rửa sạch, sấy hay phơi khô. (2) Chế biến phụ tử tiến hành chọn những nhánh rễ con, to trung bình, rửa sạch đất cát, cho vào vại có chứa Mg ngâm vài ngày (bước 1). Thông thường, cứ 100 kg phụ tử sống ngâm 40 kg MgCl2 và 20 kg nước. Bước 2, đun sôi vại phụ tử khoảng 2 - 3 phút, lấy ra rửa sạch, thái thành từng miếng mỏng khoảng 5 mm. Bước 3, ngâm miếng phụ tử vào nước MgCl2, bổ sung đường đỏ và dầu hạt cải, sao cho đến khi có màu nước chè đặc. Bước 4, rửa nguyên liệu bằng nước sạch đến hết vị cay tê, phơi hoặc sấy khô trước khi bảo quản. (3) Bạch phụ là những nhánh rễ con, nhỏ. Chế biến bạch phụ tiến hành bằng cách rửa sạch, ngâm như chế biến phụ tử ở trên. Sau khi luộc sôi, bóc vỏ đen, thái thành từng miếng mỏng 3 mm. Rửa đến khi hết cay, sau đó mới hấp chín, phơi khô, xông hơi với diêm sinh và cuối cùng phơi khô là được. Tất cả Ô đầu, phụ tử và bạch phụ sau khi chế biến được bảo quản ở nơi khô ráo và thoáng mát [42]. 1.1.3. Thành phần hóa học, giá trị dược liệu và công dụng của cây Ô đầu Thành phần hóa học của cây Ô đầu trồng ở Việt Nam đã được nhiều tác giả nghiên cứu [1], [3], [4]. Cây Ô đầu trồng ở Sa Pa có hàm lượng alkaloid Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
toàn phần ở củ mẹ 0,36 - 0,8 %, củ con 0,78 - 1,17 %. Trong thành phần alkaloid có aconitin và hypaconitin, ngoài ra còn 8 vết hiện màu với thuốc thử Dragendorff trên sắc ký lớp mỏng. Aconitin dễ bị thủy phân thành acid acetic và benzoylaconin. Độ độc benzoylaconin chỉ bằng 1/400 - 1/500 aconitin. Thủy phân tiếp benzoylaconin cho một phân tử acid acetic và aconin, độ độc của aconin bằng 1/10 benzoylaconin. Với cây Ô đầu trồng ở Sa Pa - Lào Cai. Trong các bộ phận của cây như: thân cây, củ, lá, hoa, quả và hạt đều có các hợp chất alkaloid, acid hữu cơ, đường tự do, acid amin. Từ phụ tử phân lập được các chất là: karacolin, neolin, benzoylmesaconitin (nhóm alkaloid), acid benzoic, ß- sitosterol. Hàm lượng alkaloid toàn phần trong phụ tử là: 0,91 - 1,1 % [1]. Cây Ô đầu trồng ở huyện Quản Bạ, Hà Giang có hàm lượng alkaloid toàn phần trong phụ tử sống là 0,93 %, trong Ô đầu là 0,70 %. Như vậy hàm lượng alkaloid toàn phần trong Ô đầu (củ mẹ) lại thấp hơn phụ tử (củ con). Điều này có thể do alkaloid trong Ô đầu, một phần chuyển sang phụ tử, một phần bị chuyển hóa thành hợp chất khác hoặc một phần tự phân hủy. Hàm lượng flavonid toàn phần trong lá tính theo quercetin bằng phương pháp đo quang là 1,60 % [4]. Về giá trị dược liệu, Ô đầu là một loại thuốc có tính độc thuộc bảng A. Nhưng Ô đầu cũng là thuốc quý ở vùng cao dân địa phương thường hái thái mỏng, ngâm rượu dùng để xoa bóp những nơi nhức mỏi, sai khớp, dập gãy chân tay. Nếu uống quá nhiều sẽ gây ngộ độc. Theo Tây y, Ô đầu được sử dụng làm thuốc trị ho, sưng đau, ra mồ hôi; trị đau nhức, mỏi chân tay, đau các khớp, (dùng ngoài) đặc biệt dùng uống trong chứng bán thân bất toại, chân tay co quắp, mụn nhọt lâu ngày [4]. Dùng trong trường hợp mạch gần như không có, mồ hôi ra nhiều, vong dương, chân tay quờ quạng, thủy thũng [42]. 1.1.4. Nguồn gốc và phân bố của cây Ô đầu tại Việt Nam Ở Việt Nam, hiện nay cây Ô đầu được trồng có nguồn gốc từ Trung Quốc vào những năm 70 của thế kỷ trước. Cây Ô đầu thường mọc ở nơi có điều kiện khí hậu lạnh, mát. Diện tích trồng cây Ô đầu đang được phát triển góp phần đa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
dạng hóa loại cây dược liệu và cây đặc sản ở vùng núi phía Bắc, dẫn đến nhiều triển vọng lớn cho ngành y học nói riêng và nền kinh tế nói chung. Cây Ô đầu hiện nay được trồng nhiều ở những vùng núi cao thuộc các tỉnh như: Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu, Cao Bằng [21], [3]. 1.1.5. Vai trò của cây Ô đầu Ở trong cây Ô đầu có 3 thành phần hóa học chủ yếu là: alkaloid, polysaccharide, flavonoid, trong đó alkaloid là thành phần chính. Trong các bộ phận của cây như: thân cây, rễ củ, lá cây, hoa, quả và hạt đều có các hợp chất alkaloid, acid hữu cơ, đường tự do, acid amin. Aconitin là một loại alkaloid chính có trong củ Ô đầu. Ngoài ra, ở trong củ Ô đầu còn có tinh bột, đường, manit, chất nhựa, các acid hữu cơ, chất béo và sterol. Trong thân, lá và hoa cây Ô đầu có chất carotenoid, sterol và flavonoid, ở hạt có thêm chất béo [35]. Cây Ô đầu là loại dược liệu có tính độc cao [10], [36]. Trong Cây Ô đầu còn chứa chất gây độc ở hầu hết các bộ phận, nhiều nhất đó là ở củ. Ở trong Dược thư Việt Nam, củ của cây Ô đầu được chia thành hai loại là củ lớn và củ nhỏ. Củ nhỏ được gọi là phụ tử, củ lớn được gọi là Ô đầu. Phụ tử có độc tính kém hơn Ô đầu. Ô đầu có tác dụng giảm đau, tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa, gây hạ đường huyết, chống tăng sinh tế bào, chống ung thư, tác dụng trên tim mạch, chống viêm, chống tiêu chảy, kháng nấm và kháng virus [14]. Theo y học dân tộc thì cây Ô đầu có vị cay tê, tính nóng, rất độc, có tác dụng trợ dương bổ hoả, trừ phong hàn, táo thấp. Trong đông y, Ô đầu được dùng để chữa các chứng phong tê, chân tay nhức mỏi, tê bại... Thường chỉ dùng làm thuốc uống khi đã qua chế biến cẩn thận và được dùng với liều nhỏ, có sự chỉ định và theo dõi thận trọng của thầy thuốc. Tây y dùng làm thuốc ho và chữa chứng ra mồ hôi nhiều [40]. Vì vậy, trên thị trường hiện nay đã có một số sản phẩm làm từ cây Ô đầu như: Bát vị quế phụ, cồn xoa bóp Jamda của công ty Cổ phần Traphaco dùng để trị đau nhức xương khớp [40]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
1.2. Các nghiên cứu nhân giống in vitro trên thế giới và ở Việt Nam 1.2.1. Các nghiên cứu nhân giống in vitro trên thế giới Nhân giống in vitro (vi nhân giống) là một trong những ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật, sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các điểm sinh trưởng hoặc các mô phân sinh trong cây. Theo các công trình nghiên cứu thì chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi mới đảm bảo sự ổn định về di truyền, tiếp đến là đỉnh mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp xử lý nhiệt để làm sạch bệnh là nguyên liệu tốt cho nhân giống [2]. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để phát triển nguồn giống cây trồng. Cristiano và cộng sự (2015) đã đánh giá hiệu quả của 2,4-D và BAP trên sự hình thành protocorm ở một số vùng của rễ và lá cây Miltonia spectabilis moreliana, cũng như nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ sucrose và nồng độ pH đến sự tăng trưởng của protocorms. Phân đoạn rễ và lá của cây trồng trong ống nghiệm được nuôi trong môi trường nuôi cấy MS có bổ sung 2,4-D và BAP, và giữ trong bóng tối trong 210 ngày. Sự kết hợp của 2,4-D 3 mg/l và BAP 1 hoặc 3 mg/l cung cấp kết quả tốt nhất. Nồng độ sucrose 15 và 30 g/l, không liên quan với pH, có hiệu quả hơn cho việc nuôi cấy trong ống nghiệm của loài này. Nhưng chúng lại làm tăng về số lượng và chiều dài của rễ, chiều cao và trọng lượng tươi của cây con. Độ pH chỉ có ý nghĩa kết hợp với sucrose 15 g/l cho chiều dài của rễ lớn nhất và trọng lượng tươi [31]. Ritu Mahajan và cộng sự (2015) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng, phát triển thực vật đến nuôi cấy in vitro cây Aconitum heterophyllum. Kết quả đã xác định được quy trình khử trùng hiệu quả đạt tỷ lệ mẫu sạch là 73,3 %. Đồng thời xác định được môi trường tối ưu cho việc tạo mô sẹo, tạo đa chồi và ra rễ cây Aconitum heterophyllum [35]. Ayyadurai và cộng sự (2016) đã tiến hành nghiên cứu tái sinh đa chồi ở cây Cà hôi (Solanum pubescens) từ mẫu lá cấy trên môi trường MS cơ bản bổ sung chất kích thích sinh trưởng BAP, NAA, GA3. Số chồi lớn nhất đạt được là 3,5 chồi/mẫu ở nồng độ BAP 3,0 mg/l Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
+ GA31,0 mg/l [36]. Jahan và cộng sự (2009) đã tiến hành xây dựng hệ thống tái sinh đa chồi ở cây Tam phỏng (xoan leo-Cardiospermum halicacabum L.) từ đoạn thân mang mắt chồi bên trên môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP, kinetin, TDZ và 2-isopentenyladenine. Kết quả cho thấy, chồi xuất hiện nhiều nhất (14,83 chồi/mẫu) trên môi trường MS cơ bản có bổ sung TDZ 0,3 μM. Môi trường ra rễ tối ưu của các chồi là môi trường 1/3 MS cơ bản có bổ sung IAA 0,5 μM [37]. Autade và cộng sự (2014) đã tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro loài Cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bert.) từ đoạn thân mang mắt chồi bên. Mẫu được cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP với các nồng độ khác nhau kết hợp với kinetin. Sau 5 tuần cấy mẫu, hiệu quả đa chồi tốt nhất (5,16 chồi/mẫu) là môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP 1,0 mg/l + kinetin 1,0 mg/l. Chiều dài chồi tốt nhất (7,0 cm) được quan sát thấy trên môi trường MS cơ bản có chứa BAP 0,5 mg/l + kinetin 0,5 mg/l. Các chồi đơn được cấy chuyển sang môi trường ra rễ là ½ MS cơ bản bổ sung IBA. Phản ứng tạo rễ hiệu quả nhất với chiều dài 1,68 cm và số rễ (3,6 rễ/mẫu) được quan sát thấy ở môi trường ½ MS cơ bản có bổ sung IBA 1,0 mg/l. Các cây con được chuyển sang vườn ươm với tỷ lệ sống là 90 % [29]. 1.2.2. Các nghiên cứu nhân giống in vitro ở Việt Nam Ở Việt Nam, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật phục vụ nhân giống cây trồng đã được triển khai trên 20 năm nay. Hiện nay, nhân giống thương mại quy mô lớn ở một số cây trồng như nhân nhanh giống chuối (khoảng 2 triệu cây/năm), nhân nhanh giống khoai tây sạch bệnh, các giống mía mới nhập nội năng suất cao, các dòng bạch đàn chọn lọc và keo lai đạt 3 triệu cây/năm. Ngoài ra, kỹ thuật nhân giống in vitro cũng được áp dụng trên nhiều cây trồng khác nhau như dứa, dứa sợi, cà phê, tếch, các cây thuốc quý, các loài lan và cây hoa, cây cảnh, cây ăn quả… Từ việc thương mại hóa các quy trình nuôi cấy trên là chìa khóa quan trọng để mở ra sự bùng nổ ứng dụng cho công nghiệp vi nhân giống ở nước ta trong những năm tới [12]. Đối với các nguồn tài nguyên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
cây thuốc việc bảo tồn có ý nghĩa hết sức quan trọng. Nhiều loài cây thuốc đang trong tình trạng nguy cơ bị tuyệt chủng do con người khai thác quá mức. Vì vậy, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã giúp cho việc bảo tồn nguồn gen các giống cây trồng, cây dược liệu đã được nhiều tác giả quan tâm như: Tác giả Khuất Thị Hải Ninh và cộng sự (2017) khi nghiên cứu nhân giống in vitro cây Re hương (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn) đã xác định được các bước nhân giống Re hương sử dụng chồi non làm vật liệu nuôi cấy khởi đầu gồm: (1) khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 5 phút chia 2 lần (lần 1: 3 phút, lần 2: 2 phút) cho tỉ lệ mẫu sạch nảy chồi đạt 38,9 %. Môi trường MS + BAP 0,5 mg/l + kinetin 0,1 mg/l là thích hợp nhất để tái sinh chồi lần một (tỉ lệ mẫu nảy chồi đạt 100 % (với 3,2 chồi/nách lá); môi trường MS + BAP 2,2 mg/l + kinetin 0,1 mg/l + NAA 0,1 mg/l thích hợp nhất cho tạo cụm chồi (hệ số nhân chồi 3,5 lần và chiều cao trung bình chồi 2,2 cm). Môi trường tạo rễ thích hợp cho chồi Re hương in vitro là MS + NAA 0,4 mg/l (tỉ lệ chồi ra rễ trên 94,4 %, rễ có chất lượng tốt) [15]. Tác giả Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh Tư (2010) đã xác định được môi trường tái sinh chồi in vitro cây Ba kích tím là MS cơ bản có bổ sung Kinetin 0,25 mg/l, môi trường nhân chồi là MS cơ bản có bổ sung BAP 3,5 mg/l + IBA 0,2 mg/l, môi trường tạo rễ là MS cơ bản có bổ sung IBA 0,2 - 0,25 mg/l [27]. Tác giả Lê Tiến Vinh và cộng sự (2014) đã đưa ra quy trình nhân giống in vitro cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge). Nhằm xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Đan sâm với mục đích bảo tồn và phát triển loài dược liệu quý này. Khử trùng mẫu hạt và cấy trên môi trường MS + GA3 1,0 mg/l, cho tỷ lệ hạt nảy mầm 40,43 % sau 2 tuần nuôi cấy. Đoạn thân (kích thước 2 – 3 cm và có một cặp lá), cắt từ cây Đan sâm nảy mầm được sử dụng làm vật liệu nhân nhanh. Hệ số nhân chồi đạt cao nhất (5,05 chồi/mẫu) sau 4 tuần nuôi cấy. Môi trường MS + BA 0,5mg/l, α-NAA, IAA, IBA đều ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành rễ của chồi cây Đan sâm. Môi trường ra rễ thích hợp nhất là môi trường MS có Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
bổ sung IAA 0,75 mg/l, tỷ lệ chồi ra rễ đạt 100 %, số rễ trung bình đạt 6,19 rễ/cây sau 4 tuần nuôi cấy. Cây in vitro trên môi trường ra rễ 30 ngày là thích hợp để chuyển ra thích nghi ngoài vườn ươm. Trên giá thể chứa 50 % xơ dừa và 50 % cát, tỷ lệ cây sống đạt 100 %, cây sinh trưởng, phát triển tốt [28]. Tác giả Vũ Thị Lan và cộng sự (2011) đã xác định được môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng mô sẹo cây Trinh nữ hoàng cung để thu sinh khối là: SB1 (MS + NAA 2,0 mg/l + BAP 0,5 mg/l) và SB2 (MS + NAA 2,0 mg/l + 1,0 mg/l BAP); SK6 (MS + NAA 2,0 mg/l + kinetin 1,0 mg/l) và SK7 (MS + NAA 2,0 mg/l + kinetin 1,5 mg/l); SN9 (MS + NAA 2,0 mg/l + 10 % nước dừa) và SN10 (MS + NAA 2,0 mg/l + 20 % nước dừa) [9]. Tác giả Nguyễn Văn Hồng và Cộng sự (2013) đã tiến hành nghiên cứu nhân giống cây Sa nhân tím. Xác định được các bước khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 15 phút cho tỉ lệ mẫu sạch cao nhất; môi trường phù hợp cho quá trình nhân nhanh chồi là môi trường nền (MS + sucrose 30 g/l + agar 5,2 g/l + inositol 100 mg/l) bổ sung BAP ở nồng độ 4 mg/l kết hợp với IAA ở nồng độ 0,1 mg/l; môi trường phù hợp cho quá trình ra rễ là môi trường nền (MS + sucrose 30 g/l + agar 5,2 g/l + inositol 100 mg/l) bổ sung IBA 0,1 mg/l [6]. Tác giả Vũ Thị Bạch Phượng và cộng sự (2013) đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy in vitro nguồn nguyên liệu có hoạt tính kháng oxi hóa của cây Thổ tam thất và xác định được rễ in vitro của cây Thổ tam thất có hoạt tính kháng oxi hóa cao nhất, trong rễ in vitro có chứa nhóm hợp chất saponin và flavonoid, đồng thời xác định được NAA 2 mg/l thích hợp cho sự tạo rễ ở cây Thổ tam thất [17]. Tác giả Trần Ngọc Truồi và cộng sự (2017) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của hệ thống chiếu sáng đơn sắc đến quá trình nhân giống in vitro cây hoa chuông (Sinningia speciosa). Ở nghiên cứu này, đã xác định được hệ thống chiếu sáng đơn sắc với hai loại đèn LED: Ánh sáng đơn sắc đỏ có bước sóng 650 nm (R), ánh sáng đơn sắc xanh có bước sóng 450 nm (B), kết hợp ánh sáng đơn sắc đỏ và ánh sáng đơn sắc xanh theo các tỷ lệ khác nhau đã đưa ra quy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
trình nhân giống vô tính in vitro cây hoa chuông, nhằm tìm ra được nguồn chiếu sáng đơn sắc phù hợp với từng giai đoạn trong quy trình nhân giống, để nâng cao chất lượng cây giống và hạ giá thành trong sản xuất thương mại ở quy mô lớn. Kết quả thu được cho thấy: Trong quy trình nhân giống in vitro cây hoa chuông, hệ thống chiếu sáng đơn sắc sử dụng đèn LED có tính vượt trội hơn so với sử dụng đèn huỳnh quang. Giai đoạn tái sinh chồi từ mô lá dưới điều kiện chiếu sáng sử dụng đèn LED kết hợp tỷ lệ 70 % R + 30 % B cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi, số chồi/mẫu đạt giá trị cao nhất lần lượt là: 75,33 %; 1,96 chồi. Sử dụng ánh sáng đơn sắc đèn LED tỷ lệ 80 % R + 20 % B thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh chồi với hệ số nhân chồi đạt được là 7,87 lần, chiều cao chồi là 1,95 cm. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh, sử dụng ánh sáng đơn sắc đèn LED tỷ lệ 70 % R + 30 % B là thích hợp nhất. Chiều cao cây đạt được là 7,54 cm, số lá 6,80 lá, số rễ 6,13 rễ, chiều dài rễ 2,07 cm, khối lượng tươi 1,24 g/cây. Cây giống hoa chuông in vitro được nuôi cấy dưới điều kiện chiếu sáng đơn sắc LED tỷ lệ 70 % R + 30 % B khi đưa ra trồng ở giai đoạn vườn ươm thích nghi rất tốt với điều kiện tự nhiên. Tỷ lệ sống đạt 96,67 %, thời gian ra rễ sau trồng 5 ngày [25]. Tác giả Phan Xuân Huyên và cộng sự (2016) đã tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng cây lan gấm (Anoectochilus Llylei Rolfe ex downies) ở điều kiện ex vitro. Kết quả cho thấy, môi trường MS bổ sung BA 1mg/l là tốt nhất đến sự tái sinh chồi in vitro sau 60 ngày nuôi cấy, với số chồi 5,70 chồi/mẫu, chiều cao chồi 3,72 cm. Môi trường MS có bổ sung NAA 0 – 2 mg/l đều thích hợp đến sự tái sinh rễ in vitro sau 30 ngày nuôi cấy, với tỉ lệ tái sinh rễ 100 %. Chuyển cây lan gấm in vitro ra điều kiện ex vitro, giá thể 90 % vụn xơ dừa phối trộn 10 % tro trấu là tốt nhất đến sự thích nghi của cây con sau 60 ngày nuôi trồng, với chiều cao cây 7,00 cm, chiều dài rễ 4,74 cm và tỉ lệ sống đạt 100 %. Nuôi trồng cây lan ở điều kiện ex vitro, sau 120 ngày nuôi trồng, phun phân Nitrophoska®Foliar với nồng độ 2 g/l (chiều cao cây đạt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
11,00 cm, chiều dài rễ 7,60 cm, khối lượng tươi 1,81 g/cây, tỉ lệ sống đạt 100 %) tốt hơn nồng độ 1 g/l (chiều cao cây đạt 9,80 cm, chiều dài rễ 6,70 cm, khối lượng tươi 1,64 g/cây, tỉ lệ sống đạt 100 %) [7]. Tác giả Bùi Văn Thắng (2017) đã tiến hành nhân giống in vitro cây Hà thủ ô đỏ (Polygonum Multiforum Thunb) tuyển chọn tại tỉnh Hà Giang, đã đưa ra được kết quả nghiên cứu thành công việc sát khuẩn bề mặt chồi bằng cồn 70 % trong 1 phút, khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1 % trong 6 phút và cấy nuôi mẫu trên môi trường MS có bổ sung BAP 0,2 mg/l + sucrose 30g/l, cho tỷ lệ mẫu sạch nảy chồi là 48,53 %, chồi vươn cao, thân và lá xanh đậm. Cảm ứng tái sinh cụm chồi trên môi trường MS có bổ sung BAP 1 mg/l + 0,3 mg/l + kinetin + NAA 0,2 mg/l và sucrose 30 g/l cho hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu đạt cao nhất [23]. Tác giả Vũ Thị Hoài và Ninh Thị Nhíp (2019) đã tiến hành nhân giống in vitro cây rau đắng đất (Glinus oppositifolius (L.) DC.) nhằm xây dựng được quy trình khử trùng mẫu, nuôi cấy khởi động, nhân nhanh chồi, tạo rễ và ra cây ngoài giá thể. Đã xác định được thời gian khử trùng 10 phút bằng Johnson (1%) cho kết quả tốt nhất, tỷ lệ mẫu sống đạt 76,67 %. Nồng độ BA 0,5 mg/l là tốt nhất cho sự hình thành và sinh trưởng của chồi cây (5,45 chồi/mẫu). Giai đoạn nhân nhanh chồi, tổ hợp BA (0,5 mg/l) và α-NAA/IAA (0,5 mg/l) cho kết quả tốt nhất với số chồi là 8,57/8,5 chồi; số lá TB là 4,97/4,93 lá và chiều cao TB là 2,33/2,24 cm sau 4 tuần nuôi cấy. Bổ sung 0,5 mg/l α-NAA vào môi trường ra rễ đem lại hiệu quả cao với tỷ lệ ra rễ đạt 100 %. Sử dụng giá thể vụn xơ dừa cho chất lượng cây con tốt nhất, tỷ lệ xuất vườn đạt 86,67 % tại 40 ngày sau trồng [5]. Tác giả Trần Trung Hiếu và cộng sự (2017) đã tiến hành nhân giống in vitro Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guil l) đưa ra được quy trình nhân giống in vitro để bảo tồn loài dược liệu này. Các cụm chồi bất định (5 – 8 chồi/cụm) được tái sinh từ các đoạn thân mang chồi bên (cây 1 – 3 năm tuổi) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn