Luận văn thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát hiện sự gắn chèn gen E6 và E7 của Human papilomavirus Type 16 vào bộ gene người bằng kỹ thuật Multiplex RT-PCR

Chia sẻ: Trang Lê | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:112

Thêm vào BST

Báo xấu

127
lượt xem 18
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung nghiên cứu đề tài: nghiên cứu thiết kế kiểm tra mồi khuếch đại đặc hiệu gen E6 và E7 của HPV type 16, xây dựng quy trình phát hiện sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật Multiplex RT-PCR,...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát hiện sự gắn chèn gen E6 và E7 của Human papilomavirus Type 16 vào bộ gene người bằng kỹ thuật Multiplex RT-PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN TRẦN MINH ĐỊNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN SỰ GẮN CHÈN GENE E6 VÀ E7 CỦA Human papilomavirus TYPE 16 VÀO BỘ GENE NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX RT-PCR LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN TRẦN MINH ĐỊNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN SỰ GẮN CHÈN GENE E6 VÀ E7 CỦA Human papilomavirus TYPE 16 VÀO BỘ GENE NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX RT-PCR Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Võ Thị Phương Khanh BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Người cam ñoan Trần Minh Định
ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn tất khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc tới: Lãnh ñạo trường Đại học Tây Nguyên, các phòng ban và khoa chức năng ñã tổ chức Đào tạo, quản lý và tạo ñiều kiện thuận cho tôi hoàn tất khóa học và luận văn. Các Thầy, Cô giáo trong và ngoài trường ñã nhiệt tình giảng dạy và cung cấp những kiến thức quý báu trong suốt khóa học. TS. Võ Thị Phương Khanh, người luôn quan tâm, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành khóa luận. PGS. TS Nguyễn Anh Dũng ñã có những trao ñổi quý báu và tạo ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành khóa luận. Bộ môn SHTN, Bộ môn Sinh học thực vật và Phòng thí nghiệm CNSH&MT là các ñơn vị ñã tạo ñiều kiện thuận lợi ñể tôi thực hiện và hoàn tất khóa luận. Các anh, chị và các bạn học viên lớp Cao học SHTNK3; ñã luôn quan tâm, chia sẻ và ñộng viên tôi trong suốt khóa học cũng như suốt thời gian thực hiện khoa luận. Đặc biệt là bạn Hưng (Công ty CP TBR) ñã nhiệt tình và có những trao ñổi quý báu trong quá trình thực hiện ñề tài; phòng Dịch vụ, Công ty Việt Á ñã cung cấp chủng vi sinh vật tham khảo. Cô Giang (phòng khám ña khoa Nguyễn Dũng), anh Nguyện (phòng khám ña khoa Hồng Đức), bạn Việt (Bệnh viện ña khoa Thiện Hạnh), Cô Oanh (BS sản khoa, phòng khám số 120 Hồ Tùng Mậu) và các anh chị tại phòng xét nghiệm Bệnh viện ña khoa Thiện Hạnh, phòng khám ña khoa Nguyễn Dũng, phòng khám số 120 Hồ Tùng Mậu, phòng khám số 46 Phan Chu Trinh, phòng khám ña khoa Hồng Đức ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong quá trình thu thập mẫu dịch phết cổ tử cung.
iii Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới những người thân trong gia ñình ñã luôn quan tâm, ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn. Buôn Ma Thuột, ngày tháng năm 2011 Tác giả Trần Minh Định
iv MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1. Tính cấp thiết của ñề tài .................................................................................. 1 2. Mục tiêu của ñề tài .......................................................................................... 2 3. Ý nghĩa khoa học............................................................................................. 2 4. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................. 2 Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 1.1. Định nghĩa ung thư cổ tử cung ...................................................................... 3 1.2. Tác nhân gây ung thư cổ tử cung .................................................................. 4 1.21. Tác nhân ..................................................................................................... 4 1.2.2. Các type của Human papillomavirus ......................................................... 4 1.2.3. Bộ gen của virus HPV type 16 ................................................................... 5 1.2.4. Sự xâm nhiễm về mặt phân tử - hiện tượng chèn gen của virus HPV nguy cơ cao vào bộ gen người ............................................................................. 6 1.2.5. Tình hình nghiên cứu gắn chèn gen E6 và E7 của HPV vào bộ gen người hiện nay..................................................................................................... 9 1.3. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới và Việt Nam ..................... 11 1.3.1. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới....................................... 11 1.3.2. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung tại Việt Nam ..................................... 12 1.4. Các phương pháp phổ biến chuẩn ñoán ung thư cổ tử cung hiện nay .......... 13 1.4.1. Chẩn ñoán lâm sàng ................................................................................. 13 1.4.2. Các phương pháp chẩn ñoán dựa trên tế bào cổ tử cung ........................... 14 1.4.3. Các phương pháp chuẩn ñoán tác nhân HPV gây ung thư cổ tử cung....... 15 1.5. Phương pháp RT – PCR trong chuẩn ñoán gắn chèn gen gây ung thư cổ tử cung ............................................................................................................. 19 1.6. Các phương pháp ñiều trị tổn thương tiền ung thư và ung thư cổ tử cung ... 20 1.6.1. Điều trị tổn thương tiền ung thư cổ tử cung ............................................. 20 1.6.2. Điều trị ung thư cổ tử cung ...................................................................... 21
v 1.7. Các loại vaccine phòng HPV hiện nay ........................................................ 21 Phần II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 23 2.1. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 23 2.2. Địa ñiểm và thời gian nghiên cứu ............................................................... 23 2.2.1. Địa ñiểm nghiên cứu ................................................................................ 23 2.2.2. Thời gian nghiên cứu ............................................................................... 23 2.3. Vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ....................................... 23 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................. 24 2.3.2. Hoá chất nghiên cứu ................................................................................ 25 2.3.3. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu .................................................................... 27 2.3.3.1. Dụng cụ nghiên cứu .............................................................................. 27 2.3.3.2. Thiết bị nghiên cứu ............................................................................... 27 2.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 28 2.4.1. Phương pháp thiết kế và kiểm tra mồi ...................................................... 28 2.4.1.1. Thiết kế và kiểm tra mồi ...................................................................... 28 2.4.1.2. Đánh giá khả năng khuếch ñại của hệ mồi thiết kế ................................ 30 2.4.1.3. Giải trình tự kiểm tra sản phẩm khuếch ñại ........................................... 30 2.4.2. Phương pháp thu và bảo quản mẫu bệnh phẩm ........................................ 31 2.4.3. Phương pháp tách chiết tế bào thu nhận RNA tổng số.............................. 31 2.4.4. Phương pháp kiểm soát nội phản ứng ...................................................... 32 2.4.5. Phương pháp multiplex RT – PCR .......................................................... 33 2.4.5.1. Phản ứng RT ......................................................................................... 33 2.4.5.2. Phản ứng multiplex PCR....................................................................... 33 2.4.6. Phương pháp ñiện di kiểm tra sản phẩm multiplex RT – PCR.................. 34 2.4.7. Phương pháp xây dựng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR ..................... 35 2.4.7.1. Nghiên cứu nồng ñộ enzym DNase I xử lý dịch sau tách chiết thu nhận hoàn toàn RNA tổng số ............................................................................. 35 2.4.7.2. Khảo sát nhiệt ñộ lai của hệ mồi ........................................................... 36
vi 2.4.7.3. Khảo sát nồng ñộ mồi ........................................................................... 36 2.4.7.4. Khảo sát nồng ñộ Mg2+ ......................................................................... 39 2.4.7.5. Khảo sát nồng ñộ dNTP ........................................................................ 39 2.4.7.6. Khảo sát ñộ nhạy của quy trình ............................................................. 39 2.4.7.7. Khảo sát ñộ ñặc hiệu của quy trình ....................................................... 40 2.4.9. Bước ñầu ứng dụng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên các mẫu bệnh phẩm thu thập tại Tp. Buôn Ma Thuột ............................................... 40 Phần III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 41 3.1. Nghiên cứu thiết kế và kiểm tra mồi khuếch ñại ñặc hiệu gen E6 và E7 của HPV type 16 ............................................................................................... 41 3.1.1. Thiết kế và kiểm tra mồi .......................................................................... 41 3.1.2. Đánh giá khả năng khuếch ñại của hệ mồi thiết kế ................................... 44 3.1.3. Giải trình tự kiểm tra sản phẩm khuếch ñại .............................................. 45 3.2. Xây dựng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR .......................................... 47 3.2.1. Nghiên cứu nồng ñộ enzym DNase I xử lý dịch mẫu sau tách chiết ........ 47 3.2.2. Khảo sát nhiệt ñộ lai của hệ mồi .............................................................. 49 3.2.3. Khảo sát nồng ñộ mồi trong phản ứng PCR ............................................. 50 3.2.4. Khảo sát nồng ñộ Mg2+ ............................................................................ 54 3.2.5. Khảo sát nồng ñộ dNTP ........................................................................... 55 3.2.6. Khảo sát ñộ nhạy của quy trình ................................................................ 56 3.2.7. Khảo sát ñộ ñặc hiệu của quy trình .......................................................... 57 3.2.8. Quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuột multiplex RT-PCR...................................................... 58 3.3. Bước ñầu ứng dụng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên các mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp. Buôn Ma Thuột................................................ 60
vii Phần IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 65 4.1. Kết luận ...................................................................................................... 65 4.2. Kiến nghị .................................................................................................... 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... PHỤ LỤC .............................................................................................................
viii CÁC CHỮ VIẾT TẮT AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome: Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người. BLAST Basic Local Alignment Search Tool: Công cụ tìm kiếm các trình tự tương ñồng. Bp base pairs: Cặp base CIN Cervical Intraepithelial Neoplasia: Tổn thương trong tế bào biểu mô cổ tử cung. Cs Cộng sự CD Chứng dương cDNA complementary DNA: DNA bổ sung dATP Deoxyadenosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate DEPC Diethylpyrocarbonate dGTP Deoxyguanosine triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphotphate dTTP Deoxythymidine triphosphate EDTA ethylenediaminetetraacetic acid EMBL European Molecular Biology Labolatories: Hội các phòng thí nghiệm Sinh học phân tử Châu Âu. HPV Human Papilomavirus IARC International Agenecy For Research on Cancer IDT Intergrated DNA Technology Kb Kilo base mRNA Messenger Ribonucleotide acid NCBI National Center for Biotechnology Information: Trung tâm Quốc gia về thông tin Công nghệ Sinh học.
ix PCR Polymerase chain reaction: Phản ứng kéo dài chuỗi. PK Phòng khám PKĐK Phòng khám ña khoa RNA Ribonucleotide acid RT Reverse Transcriptase RT-PCR Reverse Transcriptase - Polymerase chain reaction TAE Tris acetate EDTA Taq Thermus aquaticus TE Tris acid – EDTA Tm melting Temperature: Nhiệt ñộ biến tính.
x DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1: Sự phát triển của các tế bào bất thường trong bệnh ung thư cổ tử cung .................................................................................................................... 3 Hình 1.2: Human papillomavirus type 16 ............................................................ 4 Hình 1.3: Cấu trúc bộ gene của Human papillomavirus type 16 .......................... 5 Hình 1.4: Quá trình xâm nhiễm và gây bệnh của HPV type nguy cơ cao trong tế bào chủ ............................................................................................................ 7 Hình 1.5: Sơ ñồ biểu diễn phân bố tỉ lệ ung thư cổ tử cung trên thế giới ............ 10 Hình 1.6: Tế bào cổ tử cung bình thường và nghịch sản .................................... 13 Hình 2.1: Thang DNA 100bp ............................................................................ 26 Hình 2.2: Sơ ñồ biểu thị vị trí gắn mồi E6f-E6r trên gene E6 và trên amplicon.. 31 Hình 3.1: Kết quả ñánh giá khả năng khuếch ñại của hệ mồi thiết kế................. 44 Hình 3.2: Kết quả thực hiện phản ứng multiplex PCR trên 3 mẫu chứng dương chưa xử lý enzym DNase I ..................................................................... 45 Hình 3.3: Kết quả khảo sát nồng ñộ enzym DNase I xử lý dịch sau tách chiết........ 47 Hình 3.4: Kết quả khảo sát nhiệt ñộ lai của hệ mồi ............................................ 47 Hình 3.5: Kết quả khảo sát nồng ñộ hệ mồi trong phản ứng............................... 48 Hình 3.6: Kết quả khảo sát nồng ñộ Mg2+ .......................................................... 52 Hình 3.7: Kết quả khảo sát nồng ñộ dNTP......................................................... 53 Hình 3.8: Kết quả khảo sát ñộ nhạy của quy trình.............................................. 54 Hình 3.9: Kết quả khảo sát ñộ ñặc hiệu của quy trình ........................................ 55 Hình 3.10: Kết quả kiểm chứng quy trình phát hiện gắn chèn gene E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gene người trên các mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp. Buôn Ma Thuột ..............................................................................................................61
xi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Tỷ lệ tiến triển của các giai ñoạn CIN sang ung thư cổ tử cung ........... 9 Bảng 1.2: Các phương pháp ñiều trị tổn thương tiền ưng thư cổ tử cung ........... 19 Bảng 2.1: Các chủng vi sinh vật và mẫu bệnh phẩm tham khảo sử sụng trong ñề tài ................................................................................................................. 23 Bảng 2.2: Địa ñiểm và số lượng mẫu thu thập sử dụng trong ñề tài ................... 24 Bảng 2.3: Trình tự amplicon tổng hợp làm chứng nội ........................................ 24 Bảng 2.4: Nồng ñộ của 2 cặp mồi khảo sát trong ñề tài ..................................... 36 Bảng 3.1: Kết quả thiết kế mồi .......................................................................... 41 Bảng 3.2: Đặc tính của hệ mồi thiết kế .............................................................. 42 Bảng 3.3: Cấu trúc thứ cấp của hệ mồi thiết kế .................................................. 42 Bảng 3.4: Cấu trúc hetero-dimer (kcal/mole) của hệ mồi thiết kế ...................... 42 Bảng 3.5: Kết quả khảo sát nhiệt ñộ lai của hệ mồi............................................ 48 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát nồng ñộ hệ mồi trong phản ứng .............................. 49 Bảng 3.7: Kết quả khảo sát ñộ nhạy của quy trình ............................................. 54 Bảng 3.8: Sơ ñồ quy trình phát hiện gắn chèn gene E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gene người bằng kỹ thuột multiplex RT-PCR ........................................ 56 Bảng 3.9: Kết quả giải trình tự gene E6 và E7 của HPV type 16 gắn chèn vào bộ gene người ..........................................................................................................................................58 Bảng 3.10: Kết quả kiểm chứng quy trình phát hiện gắn chèn gene E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gene người trên các mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp. Buôn Ma Thuột ..............................................................................................................62
23 Phần II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu 1. Nghiên cứu thiết kế và kiểm tra mồi khuếch ñại ñặc hiệu gen E6 và E7 của HPV type 16. 2. Xây dựng quy trình phát hiện sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR - Nghiên cứu nồng ñộ enzym DNase I xử lý dịch sau tách chiết - Khảo sát nhiệt ñộ lai của hệ mồi - Khảo sát nồng ñộ mồi - Khảo sát nồng ñộ Mg2+ - Khảo sát nồng ñộ dNTP - Khảo sát ñộ nhạy của quy trình - Khảo sát ñộ ñặc hiệu của quy trình 3. Bước ñầu ứng dụng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên các mẫu mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp. Buôn Ma Thuột. 2.2. Địa ñiểm và thời gian nghiên cứu 2.2.1. Địa ñiểm nghiên cứu - Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Bộ môn Sinh học thực nghiệm, Khoa KHTN&CN, trường Đại học Tây Nguyên. - Phòng thí nghiệm CNSH&MT, trường Đại học Tây Nguyên. 2.2.2. Thời gian nghiên cứu Đề tài thực hiện từ tháng 09/2010 tới tháng 08/2011. 2.3. Vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
24 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu + Mẫu chứng dương: 3 mẫu chứng dương (CD1, CD2, CD3) là mẫu bệnh phẩm thu nhận từ bệnh nhân ung thư cổ tử cung ñã ñược xác ñịnh do HPV type 16 gây ra, ñược cung cấp từ Khoa Ung bướu, Bệnh viện Đa khoa Cần Thơ. + 8 chủng vi sinh vật và 1 mẫu bệnh phẩm sử sụng trong ñề tài Bảng 2.1: Các chủng vi sinh vật và mẫu bệnh phẩm sử sụng trong ñề tài STT Tên vi sinh vật Nguồn gốc Số lượng DNA của người không bị Khoa Ung bướu, Bệnh viện 1 1 ung thư cổ tử cung ña khoa Cần Thơ 2 HPV type 18 1 3 HPV type 11 1 4 HPV type 6 1 5 HPV type 33 Công ty cổ phần công nghệ 1 6 HPV type 45 Việt Á, Tp. Hồ Chí Minh 1 7 E.coli 1 8 Chlamydia trachomatis 1 9 Neisseria gonorrhoeae 1 + Mẫu chứng âm: nước cất. + 86 mẫu bệnh phẩm dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp. Buôn Ma Thuột – Đăk Lăk. Bảng 2.2: Địa ñiểm và số lượng mẫu thu thập sử dụng trong ñề tài STT Địa ñiểm thu mẫu Số mẫu thu thập 1 Bệnh viện ña khoa Thiện Hạnh 64 2 Phòng khám ña khoa Hồng Đức 2
25 3 Phòng khám số 46 Phan Chu Trinh 2 4 Phòng khám ña khoa Nguyễn Dũng 7 5 Phòng khám số 120 Hồ Tùng Mậu 11 Tổng cộng 86 + Chứng nội: là yếu tố kiểm soát nội phản ứng nhằm kiểm chứng phản ứng có diễn ra bình thường hay không. Một ñoạn amplicon có kích thước 400bp ñược tổng hợp tại Công ty IDT (Hoa Kỳ) dùng làm chứng nội, trình tự amplicon ñược thiết kế với 2 vị trí lỗi (mismatch) thể hiện qua bảng 2.3 Bảng 2.3: Trình tự amplicon tổng hợp làm chứng nội Kích Trình tự amplicon (5’ – 3’) thước (bp) CACAGAGCTGCAAACAACTATCCAATTATCAACAATTACTACAT GCAGCAGTACCAGAACTCCATGGACACGCAGCTTGGTGACAACG CTATTAGCGGAGGCTCCAACGAGGGGTCCACGGACACCACCTCC ACTCACACAACCAACACTCAGAACAATGACTGGTTTTCAAAGCT GACCAGTTCCGCTTTTAGCGGTCTTTTCGGCGCTCTTCTTGCTGAC AAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTCGAGGACCGCATCCTCAC 400 TACCCGCAACGGACACACGACCTCGACAACCCAGTCGAGCGTTG GAGTCACTTACGGGTACGCAACAGCTGAGGACTTTGTGAGCGGA CCAAACACATCTGGGCTTGAGACCAACCGTCAAAAGCCACTGTG TC Ghi chú: C vị trí mismatch trên amplicon 2.3.2. Hoá chất nghiên cứu + Hóa chất dùng cho tách chiết tế bào thu nhận RNA tổng số - Dung dịch 1 (Trizol X100): phenol 38%, guanidium thyocianate 0.8M, glycerol 5%, chỉnh về pH 4.0. - Dung dịch 2: Chloroform.
26 - Dung dịch 3: Isopropanol tuyệt ñối có chứa chất trợ tủa. - Dung dịch 4: Ethanol 70%. - Dung dịch 5: Nước xử lý với DEPC. Hóa chất ñược cung cấp từ Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á – Tp. Hồ Chí Minh. + Hóa chất dùng cho phân hủy DNA thu nhận RNA tổng số Dnase I(hãng Fermentas) + Hoá chất dùng cho phản ứng multiplex RT – PCR Phản ứng RT Đề tài sử dụng bộ Kit cDNA synthesis KIT (VA.A 92-003B) của Công ty cổ phần công nghệ Việt Á. Phản ứng multiplex PCR - Mồi xuôi và mồi ngược (tổng hợp từ Công ty IDT, Hoa Kỳ) - dNTPs (dTTP, dATP, dGTP, dCTP) 2mM mỗi loại (hãng Fermentas) - Taq DNA polymerase 500 U (hãng Fermentas) - Dung dịch ñệm 10X (hãng Fermentas) - MgCl2 25 mM (hãng Fermentas) - Nước cất 2 lần ñã loại bỏ enzym Dnase, Rnase. + Hoá chất dùng cho ñiện di trên gel agarose - Agarose (hãng Biorad). - Dung dịch ñiện di TAE 50X: 40mM Tris- 20mM Acetic Acid- 1mM EDTA (hãng Fermentas) - Dung dịch nạp mẫu 6X: 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol 60 mM EDTA (hãng Fermentas) - Dung dịch nhuộm mẫu Ethidium bromide.
27 - Thang DNA 100 bp (hãng Fermentas). Hình 2.1. Thang DNA 100bp 2.3.3. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 2.3.3.1. Dụng cụ nghiên cứu - Micropipettes loại: 10µl, 100µl, 1000µl (hãng Axygen – Hoa Kỳ). - Đầu tip thường, loại: 10µl, 100µl, 1000µl (hãng Greiner) - Filter tip loại: 10µl, 100µl, 1000µl (hãng Greiner) - Eppendorf 1.5ml (loại thường và loại Biopure), eppendorf 0.2ml nắp phẳng (hãng Greiner) - Vật liệu tiêu hao: găng tay không phấn, khẩu trang, cồn 700, .... 2.3.3.2. Thiết bị nghiên cứu - Máy tính và các phần mềm chuyên dụng ñể thiết kế và ñánh giá mồi - Máy Vortex (hãng IKA) - Tủ lạnh âm 300C và tủ lạnh thường - Máy ly tâm lạnh tốc ñộ 13000 vòng/phút (hãng Hettich) - Tủ tách chiết DNA/RNA vô trùng - Tủ ñặt phản ứng PCR vô trùng
28 - Máy PCR (C1000 Thermal Cycler – hãng Biorad) - Máy ủ nhiệt khô - Nồi hấp khử trùng (hãng Study) - Lò vi sóng - Hệ thống ñiện di hãng (Biorad) - GelDoc XR với phần mềm chuyên dụng kết nối máy tính (Biorad). 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp thiết kế và kiểm tra mồi 2.4.1.1. Thiết kế và kiểm tra mồi 2.4.1.1.1. Các phần mềm hỗ trợ thiết kế và kiểm tra mồi - Clustal X 1.81 (EMBL, Châu Âu) - Annhyb 4.922, năm 2004 (Olivier Friard, Hoa Kỳ) - Phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3.0 (IDT, Hoa Kỳ) (http://scitools.idtdna.com/scitools/Applications/OligoAnalyzer/) - Phần mềm trực tuyến BLAST (NCBI, Hoa Kỳ) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 2.4.1.1.2. Kỹ thuật thiết kế và kiểm tra mồi Quy trình thiết kế và kiểm tra hệ mồi gồm 5 bước cơ bản sau: - Bước 1: Thu thập các trình tự gen của gen E6 và E7 HPV type 16 từ ngân hàng gen của NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) - Bước 2: Sắp gióng các trình tự gen thu ñược bằng phần mềm Clustal, so sánh và xác ñịnh vùng bảo tồn của gen E6 và E7 từ các vùng bảo tồn thiết kế mồi phù hợp. - Bước 3: Tham khảo các cặp mồi ñã công bố trên các bài báo uy tín quốc tế hoặc thiết kế mới.
29 - Bước 4: Sắp gióng các trình tự gen E6 và E7 với từng mồi xuôi, mồi ngược, ñánh giá mức ñộ tương ñồng của các trình tự trên bằng phần mềm clustal. - Bước 5: Phân tích và ñánh giá các thông số của mồi về Tm, %GC, hairpin (kẹp tóc), self – dimer, hetero – dimer, ñộ tương ñồng, kích thước sản phẩm PCR tạo thành bằng các phần mềm BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), Oligo Analyzer. Từ ñó, chọn cặp mồi thích hợp nhất ñể thực hiện phản ứng multiplex RT - PCR. Sau khi thiết kế và kiểm tra, các cặp mồi ñạt tiêu chuẩn về mặt lý thuyết sẽ ñược gửi tổng hợp nhân tạo tại Công ty IDT (Hoa Kỳ). 2.4.1.1.3. Một số tiêu chuẩn thiết kế và ñánh giá mồi Trong giai ñoạn thiết kế mồi, qua tham khảo một số tài liệu về thiết kế mồi của Andrew Wallace (1996), Alkami Biosystems (1999)..., một số tiêu chuẩn của mồi ñược rút ra như sau: - Chiều dài của mồi tốt nhất nằm trong khoảng 18 – 25 cặp base. - Thành phần các nucleotide của mồi phải cân bằng. Các mồi có hiệu quả khuếch ñại tốt nhất là những mồi có các base loại G, C tập trung thành nhóm và chiếm tỉ lệ khoảng từ 40% - 60%. Ngoài ra, các base cuối ở ñầu 3’hay gần ñầu 3’ của các mồi này nên là G, C, GC hoặc CG. - Nhiệt ñộ nóng chảy (Tm) của mồi là một thông số quan trọng có ảnh hưởng lớn ñến khả năng bắt cặp của mồi với DNA bản mẫu. Để ñạt hiệu quả nhân bản tốt nhất, nhiệt ñộ nóng chảy của mồi nằm trong khoảng 500C – 720C. Ngoài ra, nhiệt ñộ nóng chảy mồi xuôi và mồi ngược không ñược cách biệt quá xa, tối ña khoảng 50C. - Trong cấu trúc của mồi không ñược có những vùng trình tự có thể tự bắt cặp bổ sung với nhau vì những vùng này có thể hình thành cấu trúc kẹp tóc (hairpin loop) chặt chẽ làm giảm hiệu quả nhân bản của mồi. Ngoài ra, cần tránh chọn