Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo Biosensor xác định kháng nguyên HER2

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:78

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn tiến hành nghiên cứu sàng lọc Aptamer đặc hiệu kháng nguyên HER2; ứng dụng Aptamer đã sàng lọc để chế tạo Biosensor xác định kháng nguyên HER2 hoạt động theo nguyên lý điện hóa. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo Biosensor xác định kháng nguyên HER2

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ****************** ĐÀO MINH ĐỨC NGHIÊN CỨU TẠO BIOSENSOR XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN HER2 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội - 2014
LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Quang Huấn đã tạo điều kiện cũng như tận tình chỉ bảo và động viên trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ hết sức quý báu cả về kiến thức lẫn tinh thần từ tập thể phòng Công nghệ tế bào động vật, Trung tâm giám định ADN, Viện Công nghệ sinh học. Nhân dịp này em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô, bạn bè và gia đình đã chỉ dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên Đào Minh Đức i
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN............................................................................................................................. i MỤC LỤC ................................................................................................................................. ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT.................................................... v DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................................... vii DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................................... viii MỞ ĐẦU ................................................................................................................................ - 1 - CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... - 3 - 1. 1. UNG THƯ VÚ BIỂU HIỆN HER2 ............................................................................. - 3 - 1.1.1. Ung thư vú ................................................................................................................... - 3 - 1.1.2. HER2 ............................................................................................................................ - 3 - 1.1.2.1. Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức ADN ............................................................... - 5 - 1.1.2.2. Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức ARN ............................................................... - 7 - 1.1.2.3. Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức protein ........................................................... - 7 - 1.2. BIOSENSOR .................................................................................................................. - 9 - 1.2.1. Giới thiệu chung về Biosensor ................................................................................... - 9 - 1.2.2. Lịch sử phát triển của Biosensor ............................................................................. - 10 - 1.2.3. Đặc điểm – Yêu cầu của Biosensor .......................................................................... - 11 - 1.2.4. Nguyên lý hoạt động chung của Biosensor ............................................................. - 12 - 1.2.5. Ứng dụng của Biosensor ........................................................................................... - 13 - 1.3. TỔNG QUAN VỀ APTAMER ................................................................................... - 15 - 1.3.1. Khái niệm................................................................................................................... - 15 - 1.3.2. Lịch sử ........................................................................................................................ - 15 - 1.3.3. Đặc trưng của Aptamer ............................................................................................ - 16 - 1.3.4. Ưu điểm của Aptamer so với kháng thể. ................................................................ - 17 - ii
1.3.5. Phương pháp thu nhận Aptamer – Phương pháp SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) ................................................................................. - 18 - CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... - 23 - 2. 1. VẬT LIỆU ................................................................................................................... - 23 - 2.1.1. Sinh phẩm .................................................................................................................. - 23 - 2.1.2. Hóa chất ..................................................................................................................... - 23 - 2.1.3. Trang thiết bị ............................................................................................................. - 25 - 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................................... - 25 - 2.2.1. Sàng lọc Aptamer đặc hiệu HER2 (Phương pháp SELEX) .................................. - 25 - 2.2.1.1. Chuẩn bị thư viện ................................................................................................... - 25 - 2.2.1.2. Sàng lọc ................................................................................................................... - 27 - 2.2.1.3. Phương pháp tách dòng và giải trình tự. ............................................................... - 29 - 2.2.1.3.1. Nhân bản Aptamer đặc hiệu với HER2 bằng phương pháp PCR ......................... - 29 - 2.2.1.3.2. Phân tích điện di trên gel agarose ........................................................................ - 31 - 2.2.1.3.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm phản ứng PCR ................................................ - 32 - 2.2.1.3.4. Phản ứng gắn gen vào vector tách dòng .............................................................. - 33 - 2.2.1.3.5. Biến nạp plasmid vào E.coli chủng DH5α............................................................ - 34 - 2.2.1.3.6. Phương pháp tách ADN plasmid từ vi khuẩn E. coli ............................................ - 35 - 2.2.1.3.7. Phương pháp xác định trình tự nucleotide ........................................................... - 36 - 2.2.1.4. Phương pháp gắn Aptamer lên hạt nano vàng. .................................................... - 37 - 2.2.2. Phương pháp gắn Aptamer lên bề mặt điện cực .................................................... - 37 - 2.2.2.1. Xử lý và làm sạch điện cực Au ............................................................................... - 38 - 2.2.2.2. Tạo lớp MPA trên bề mặt điện cực vàng ............................................................... - 38 - 2.2.2.3. Gắn NHS lên bề mặt điện cực đã xử lý với MPA .................................................. - 39 - 2.2.2.4. Gắn NH2-Aptamer lên điện cực Au/MPA-NHS ................................................... - 39 - 2.2.2.5. Định lượng HER2 trong mẫu bằng điện cực Au/MPA-NHS ............................... - 39 - 2.2.2.6. Tái sử dụng điện cực Au/MPA-NHS ..................................................................... - 39 - 2.2.2.7. Đánh giá hoạt động của Aptasensor ...................................................................... - 40 - 2.2.3. Phương pháp lai Dot blot ......................................................................................... - 40 - iii
CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... - 41 - 3.1. SÀNG LỌC APTAMER ĐẶC HIỆU HER2 ............................................................. - 41 - 3.1.1. Kết quả thu nhận và xác định trình tự Aptamer ................................................... - 41 - 3.1.2. Kết quả xác định cấu trúc không gian của Aptamer ............................................. - 43 - 3.1.3. Xác định kết quả tạo phức hệ Aptamer-hạt nano vàng ........................................ - 46 - 3.1.4. Xác định gắn kết của Aptamer trên tế bào BT474 và tế bào MCF7 .................... - 48 - 3.1.5. Xác định sự gắn kết của Aptamer với HER2 bằng kỹ thuật Dot blot ................. - 50 - 3.2. CHẾ TẠO BIOSENSOR ĐIỆN HÓA ........................................................................ - 52 - 3.2.1. Làm sạch và hoạt hóa điện cực ................................................................................ - 52 - 3.2.2. Tạo đơn lớp mỏng trên bề mặt điện cực vàng ........................................................ - 52 - 3.2.3. Gắn Aptamer lên điện cực đã tạo lớp màng mỏng trên bề mặt ........................... - 54 - 3.2.4. Phong tỏa các vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt điện cực ....................... - 55 - 3.2.5. Định lượng kháng nguyên HER2 trong các mẫu phân tích .................................. - 59 - CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................... - 63 - TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. - 64 - iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Apt Aptamer Bp Cặp base BSA Bovine Serum Albumin ADN Axit deoxyribonucleic EDTA Axit ethyenediaminetetraacetic E.coli Vi khuẩn Escherichia coli SELEX Systematic Evolution of LigADNs by EXponential enrichment NST Nhiễm sắc thể dUTP 2´-Deoxyuridine, 5´-Triphosphate Kb Kilo base LB Môi trường LB PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp RT – PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp thời gian thực ARN Axit Ribonucleic mARN ARN thông tin PBS Phosphate Buffered Saline PVDF Polyvilidene Fluoride ssADN Sợi đơn ADN SDS Natri dodexyl sulphat TAE Tris – acetate – EDTA Taq polymerase Enzyme polymerase chịu nhiệt ddNTP dideoxynucleotide triphosphat HER Human epidermal growth factor receptor WHO Tổ chức y tế thế giới v
MAPK Mitogen-activated protein kinase PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase FISH Fluorescence in situ hybridization CISH Chromogenic In Situ Hybridization SISH Silver In Situ Hybridization DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindol.2 HCl l IHC Immunohistochemocal technique DAB 3,3’-diaminobenzidine chromogen TE Tris – EDTA MPA 3-Mercaptopropionic acid MES 2-(N-morpholino) ethane-sulfonic acid NHS N-hydroxy-succinimide EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride KOH potassium hydroxide H2O2 hydrogen peroxide NaBH4 sodium borohydride Au Vàng CV Cyclic voltammetry SWV Square wave voltammetry DMSO Dimethyl sulfoxide DTT Dithiothreitol SB Selex Buffer vi
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Khảo sát mức độ khuyếch đại của gen HER2 trên NST 17 của tế bào 13 mô vú bằng phương pháp FISH Hình 1.2. Khảo sát sự biểu hiện của thụ thể HER2 bằng phương pháp IHC. 16 Mức độ biểu hiện của thụ thể HER2 được đánh giá theo phương pháp DAKO Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo của Biosensor 18 Hình 1.4. Các thành phần của yếu tố nhận biết sinh học và các dạng Biosensor 20 Hình 1.5. Nguyên lý hoạt động chung của một Biosensor 21 Hình 1.6: Quy trình Phương pháp Systematic Evolution of Ligands by 27 Exponential Enrichment (SELEX). Hình 1.7. Sơ đồ Aptamer ssADN 28 Hình 2.1. Quy trình tách dòng và giải trình tự của những oligonucleotide gắn 37 đặc hiệu HER2 Hình 2.2. Sơ đồ cấu tạo vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) 41 Hình 2.3. Sơ đồ tạo lớp mỏng trên điện cực để gắn Aptamer 46 Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR tạo thư viện thứ cấp 50 Hình 3.2. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR sau khi khuếch đại ở vòng sàng lọc 52 thứ 12 và sau vòng sàng lọc loại trừ Hình 3.3. Cấu hình không gian của Aptamer-1 đặc hiệu HER2 53 Hình 3.4. Cấu hình không gian của Aptamer-2 đặc hiệu HER2 54 Hình 3.5. Phổ hấp thụ của Aptamer và phức hệ Aptamer hạt nano vàng 55 Hình 3.6. Phổ hấp thụ UV-Vis của phức hệ Aptamer-hạt nano vàng 56 Hình 3.7. Kết quả xác định ái lực của phức hệ Apt-Au đối với tế bào BT474 và 58 tế bào MCF7 Hình 3.8. Kết quả Dot Blot giữa mẫu hạt vàng có gắn Aptamer và hạt vàng 60 không gắn Aptamer. Hình 3.9. Kết quả Dot Blot tính đặc hiệu của Aptamer với HER2 60 Hình 3.10. Thế vòng (CV-cyclic voltammetry) của điện cực Au trong dung dịch 61 H2SO4, nồng độ 0,5M Hình 3.11. Thế vòng (CV) và sóng vuông (SWV) cuả điện cực Au và Au-MPA 62 ở các thời gian ủ khác nhau Hình 3.12. Thế vòng (CV) và sóng vuông (SWV) cuả điện cực Au và Au- 63 MPA-Apt ở các nồng độ khác nhau Hình 3.13. Thế vòng (CV- cyclic voltammetry) và sóng vuông (square wave 65 voltammetry - SWV) của điện cực Au và Au-MPA-Apt-BSA Hình 3.14. Thế vòng (CV) của điện cực Au tại các bước sửa đổi 66 Hình 3.15. Đồ thị liên quan giữa thế và dòng đôi với các điện cực có bề mặt biến đổi khác nhau khi xác định theo kỹ thuật quét sóng vuông (SWV) của điện 67 cực vàng tại các bước biến đổi Hình 3.16. Thế vòng (CV) và sóng vuông (SWV) cuả điện cực Au và Au- 69 MPA-Apt-BSA ủ với các nồng độ kháng nguyên HER2 khác nhau vii
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. So sánh ưu điểm của Aptamer và kháng thể 26 Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR làm giàu thư viện 34 Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR làm giàu thư viện 34 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng tạo sợi đơn ADN 35 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại các trình tự gắn 38 Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại các trình tự gắn 39 Bảng 2.6. Nồng độ gel sử dụng với kích thước ADN tương ứng 41 Bảng 2.7. Thành phần phản ứng gắn đoạn gen vào vector PCR2.1 42 Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ ADN sau sàng lọc ở bước 1 50 Bảng 3.2. Kết quả đo nồng độ (ng/µL) ADN sau các vòng sàng lọc 51 Bảng 3.3. Kết quả xác định phổ UV-Vis của phức hệ Aptamer-hạt nano 55 vàng Bảng 3.4. Phổ hấp thụ của hạt nano vàng và phức hệ hạt nano vàng- 56 Aptamer Bảng 3.5. Kết quả đo dòng (µA) của điện cực sau khi xử lý MPA 62 Bảng 3.6. Kết quả xác định dòng đối điện cực vàng sau các bước xử lý 63 Bảng 3.7. Kết quả xác định dòng đối với điện cực vàng bước xử lý BSA 64 Bảng 3.8. Kết quả xác định thế và dòng của điện cực sau các bước biến 66 đổi Bảng 3.9. Kết quả xác định thế và dòng của điện cực ủ với dung dịch 68 HER2 viii
MỞ ĐẦU Ung thư vú là bệnh hiểm nghèo thường gặp ở phụ nữ, chiếm gần 30% số trường hợp mắc bệnh ung thư mới mỗi năm, tỷ lệ mắc bệnh trung bình hàng năm xấp xỉ 1.1 triệu ca và 410,000 trường hợp tử vong vì bệnh ung thư này. Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (WHO), hiện nay Mỹ là nước có tỷ lệ mắc ung thư vú cao nhất thế giới, trung bình cứ 8 phụ nữ thì có 1 người mắc bệnh ung thư vú. Các nước châu Âu có tỷ lệ mắc ung thư vú thấp hơn Mỹ, trung bình khoảng 67,48/100.000 mỗi năm. Ở châu Á và một số nước đang phát triển, tỷ lệ mắc ung thư vú thấp hơn tại Mỹ và châu Âu nhưng đang có xu hướng tăng nhanh, trung bình khoảng 40,5/100.000 dân mỗi năm (Farooq, 2005). Trong 15 năm qua tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh ung thư vú đã vượt qua ung thư cổ tử cung và sẽ tiếp tục tăng cao trong những năm tới. Hiện nay, Hà Nội và TP Hồ Chí Minh là hai nơi có tỷ lệ phụ nữ mắc ung thư vú cao nhất. Trong 100.000 phụ nữ ở Hà Nội thì có 30 phụ nữ mắc ung thư vú mỗi năm, ở TP Hồ Chí Minh thì tỷ lệ này là 20/100.000 (Nguyễn Chấn Hùng, 2010). Một trong những chỉ thị ung thư vú được quan tâm là thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô 2 (Human epithelial growth factor receptor 2 hay HER2). Tế bào vú bình thường chỉ có 2 bản sao gen HER2 nhưng ở tế bào ung thư vú dương tính HER2, gen HER2 được khuếch đại thành nhiều bản sao dẫn đến hiện tượng HER2 biểu hiện trên bề mặt tế bào vú gấp 50-100 lần so với bình thường (siêu biểu hiện) (Venter, 1987). Bệnh nhân ung thư vú dương tính HER2 thường có tiên lượng xấu và chỉ sống sót được vài năm sau khi mắc bệnh. Như vậy, việc xác định sớm hàm lượng HER2 trong cơ thể có vai trò quan trọng trong chẩn đoán và điều trị ung thư vú. Hiện có nhiều phương pháp xác định mức độ biểu hiện quá mức của HER2. Tuy nhiên, mỗi phương pháp đã nêu đều có những ưu điểm và hạn chế nhất định. Do vậy, việc tìm kiếm phương pháp mới để có thể xác định -1-
chính xác hàm lượng HER2 trong máu cũng như trong các dịch sinh học giúp cho việc chẩn đoán và theo dõi điều trị là rất cần thiết. Trong số các phương pháp mới thì phương pháp điện hóa (Biosensor điện hóa) cho phép xác định nhanh, chính xác hàm lượng HER2 trong máu hoặc trong dịch cơ thể. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài luận văn “Nghiên cứu tạo Biosensor xác định kháng nguyên HER2”. .Mục tiêu của luận văn: Nghiên cứu chế tạo Biosensor xác định kháng nguyên HER2 trong mẫu phân tích theo nguyên lý điện hóa. Các nội dung nghiên cứu chính của luận văn: 1. Nghiên cứu sàng lọc Aptamer đặc hiệu kháng nguyên HER2. 2. Ứng dụng Aptamer đã sàng lọc để chế tạo Biosensor xác định kháng nguyên HER2 hoạt động theo nguyên lý điện hóa. -2-
CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. 1. UNG THƯ VÚ BIỂU HIỆN HER2 1.1.1. Ung thư vú Ung thư vú là bệnh hiểm nghèo thường gặp ở phụ nữ, chiếm gần 30% số trường hợp mắc bệnh ung thư mới mỗi năm, tỷ lệ mắc bệnh trung bình hàng năm xấp xỉ 1,1 triệu ca và 410.000 trường hợp tử vong vì bệnh ung thư này. Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (WHO), hiện nay Mỹ là nước có tỷ lệ mắc ung thư vú cao nhất thế giới, trung bình cứ 8 phụ nữ thì có 1 người mắc bệnh ung thư vú. Ở Mỹ, trong những năm gần đây, ước tính có khoảng 230.480 trường hợp mắc ung thư vú xâm lấn và 57.650 trường hợp mắc ung thư vú tại chỗ. Các nước châu Âu có tỷ lệ mắc ung thư vú thấp hơn Mỹ, trung bình khoảng 67,48/100.000 mỗi năm, đứng đầu là Anh. Năm 2009, ở Anh mỗi ngày có 125 ca ung thư vú mới, 35 người tử vong do ung thư vú và 12 bệnh nhân được cứu sống do phát hiện sớm. Ở châu Á và một số nước đang phát triển, tỷ lệ mắc ung thư vú thấp hơn tại Mỹ và châu Âu nhưng đang có xu hướng tăng nhanh, trung bình khoảng 40,5/100.000 dân mỗi năm (Farooq, 2005). Trong 15 năm qua tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh ung thư vú đã vượt qua ung thư cổ tử cung và sẽ tiếp tục tăng cao trong những năm tới. Hiện nay, Hà Nội và TP Hồ Chí Minh là hai nơi có tỷ lệ phụ nữ mắc ung thư vú cao nhất. Trong 100,000 phụ nữ ở Hà Nội thì có 30 phụ nữ mắc ung thư vú mỗi năm, ở TP Hồ Chí Minh thì tỷ lệ này là 20/100,000 (Nguyễn Chấn Hùng, 2010). 1.1.2. Thụ thể yếu tố sinh trưởng biểu bì (Human epithelial growth factor receptor - HER2). HER2 được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1984 bởi Schechter AL và các cộng sự. HER2 là protein xuyên màng thuộc họ thụ thể yếu tố sinh trưởng biểu bì gồm -3-
HER1, HER2, HER3 và HER4. Các thụ thể này đều có cấu trúc gồm ba vùng: vùng ngoại bào là vị trí gắn với phối tử, vùng xuyên màng và vùng nội bào có hoạt tính enzyme tyrosine kinase tham gia tương tác với các protein truyền tín hiệu nội bào. Trong đó, thụ thể HER2 không có vị trí gắn với phối tử, vùng nội bào của HER3 không có hoạt tính tyrosine kinase. Các thụ thể HER chỉ có hoạt tính khi gắn với phối tử, chúng giữ vai trò quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu nội bào và điều hòa sự phát triển, biệt hóa và tăng sinh của tế bào. HER2 luôn tồn tại ở dạng cấu hình mở nên nó có khả năng tạo dimer với các thụ thể HER khác hoặc với chính nó để tạo phân tử dị dimer hoặc đồng dimer. Khi đó các phân tử dimer liên kết được với phối tử nên thụ thể HER2 có hoạt tính. Tế bào vú bình thường chỉ có 2 bản sao gen HER2 nhưng ở tế bào ung thư vú dương tính HER2, gen HER2 được khuếch đại thành nhiều bản sao dẫn đến HER2 biểu hiện trên bề mặt tế bào vú gấp 50-100 lần so với bình thường (siêu biểu hiện) (Venter, 1987). Siêu biểu hiện HER2 làm tăng số lượng phức hợp thụ thể đồng dimer hoặc dị dimer chứa HER2. Những phức hợp thụ thể này phosphoryl hóa protein nội bào gắn với nó làm hoạt hóa các con đường truyền tín hiệu nội bào như MAPK (mitogen- activated protein kinase) và PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) dẫn tới kích thích sự tăng sinh và phân chia của tế bào. Điều này khiến tế bào phát triển và phân chia mất kiểm soát dẫn đến hình thành các khối u. Ngoài ra, các con đường truyền tín hiệu này còn ức chế quá trình apoptosis đồng thời hình thành mạch máu mang chất dinh dưỡng tới nuôi khối u, duy trì sự sống sót của các khối u giúp chúng phát triển và xâm lấn các tế bào xung quanh, di căn đến những vị trí khác (Witton, 2003). Bệnh nhân ung thư vú dương tính HER2 thường có tiên lượng xấu và chỉ sống sót được vài năm sau khi mắc bệnh. Các kỹ thuật sinh học phân tử giữ vai trò quan trọng trong việc phát hiện, dự đoán và tiên lượng ung thư vú để tìm ra liệu pháp điều trị phù hợp. Hiện nay có một số -4-
phương pháp được áp dụng phổ biến để khảo sát sự biểu hiện thụ thể HER2 ở bệnh nhân ung thư vú ở mức độ protein (IHC), mức độ ARN (q-RT-PCR), mức độ ADN (FISH) (Moelans, 2011). 1.1.2.1. Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức ADN Phương pháp sử dụng để khảo sát sự biểu hiện thụ thể HER2 ở mức ADN thường là kỹ thuật lai tại chỗ nhiễm sắc thể như FISH, CISH, SISH. Trong đó, FISH là phương pháp thường quy đánh giá mức độ khuếch đại của gen HER2/neu trên NST 17 của tế bào mô vú. Mảnh mô vú của bệnh nhân ung thư vú chứa ADN mã hóa thụ thể HER2 (ADN đích) được cố định trên bề mặt tiêu bản và làm biến tính. Mẫu dò ADN được đánh dấu bằng chất nhuộm huỳnh quang (fluorochrome) và/hoặc một hapten không nhuộm huỳnh quang (nonfluorescent hapten), biến tính và lai trước với ADN lặp lại không đánh dấu. Sau đó, mẫu dò ADN được lai với ADN đích. Sau khi rửa để loại bỏ chuỗi đơn ADN không gắn và những đoạn ADN gắn không đặc hiệu. Sau khi rửa bỏ hapten không gắn huỳnh quang và bổ sung dung dịch chống phai màu DAPI (4,6- diamidino-2-phenylindol.2 HCl l), quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi huỳnh quang (Hình 1.1). -5-
Hình 1.1. Khảo sát mức độ khuyếch đại của gen HER2 trên NST 17 của tế bào mô vú bằng phương pháp FISH. Tín hiệu màu xanh là tín hiệu của HER2/neu, tín hiệu màu xanh lục là tín hiệu của tâm động của nhiễm sắc thể số 17. Nhiều tín hiệu màu đỏ: ung thư vú, hai tín hiệu màu đỏ: bình thường. Các mẫu A là mô vú bình thường, mẫu B là mô vú của bệnh nhân ung thư vú nhưng gen HER2 không được khuếch đại, mẫu C là mô vú của bệnh nhân ung thư vú có gen HER2 được khuếch đại ở mức thấp, mẫu D là mô vú của bệnh nhân ung thư vú có gen HER2 được khuếch đại ở mức cao. Ngoài các phương pháp đã mô tả ở trên, phương pháp sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu thụ thể HER2 khảo sát sự biểu hiện HER2 ở tế bào ung thư vú dương tính đang được phát triển. Phương pháp này được coi là phương pháp hiện đại, có nhiều triển vọng cho kết quả nhạy, chính xác và được ứng dụng kết hợp với điều trị ung thư vú để kiểm tra đáp ứng của thuốc (Moelans, 2011). Cách đọc kết quả: Tìm và đếm trên 20 tế bào u các tín hiệu màu đỏ (tín hiệu của HER2) và các tín hiệu màu xanh lục (tín hiệu tâm động của nhiễm sắc thể số 17). Lấy trung bình cộng của các tín hiệu màu đỏ chia cho trung bình cộng của các tín hiệu màu xanh. Nếu kết quả > 2.2 là dương tính HER2, kết quả < 1.8 là âm tính HER2, kết quả nằm trong khoảng 1.8-2.2 thì phải đếm lại trên 60 tế bào và tính toán tương tự như trên. -6-
FISH là một phương pháp xét nghiệm cho kết quả khách quan hơn và được coi là một xét nghiệm tiêu chuẩn phát hiện sự khuếch đại của gen HER với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là giá thành khá cao, mất nhiều thời gian, phải quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang và việc đọc kết quả khó khăn hơn do khó ghi nhận được những dấu hiệu hình thái học kèm theo, đôi khi rất khó xác định vùng ung thư xâm lấn trên tiêu bản FISH. Tiêu bản không thể quan sát lại nếu thời gian lưu giữ lâu vì tín hiệu huỳnh quang bị nhạt màu dần theo thời gian (Dhillon, 2007). 1.1.2.2. Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức ARN Phương pháp định lượng real-time PCR (qRT-PCR) được sử dụng để đánh giá mức độ biểu hiện của HER2 bằng cách định lượng hàm lượng ARN trong khối u. Để tăng độ nhạy của phương pháp, các nhà khoa học thường sử dụng PCR lồng. Phương pháp qRT-PCR hiếm khi được sử dụng để đánh giá trạng thái biểu hiện HER2 do việc phân lập mARN từ tế bào khối u vú tương đối khó và phân tử ARN không bền như ADN (Moelans, 2011). 1.1.2.3. Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức protein Phương pháp hóa mô miễn dịch IHC (Immunohistochemistry) thường được sử dụng để khảo sát sự biểu hiện của thụ thể HER2 ở mức độ protein từ sinh thiết của bệnh nhân ung thư vú. Phương pháp IHC bao gồm các bước theo thứ tự: cắt mẫu được cố định trên paraffin, chuyển mẫu lên lam kính, xử lý mẫu khử paraffin, nhuộm lam kính (để bộc lộ kháng nguyên HER2), đọc kết quả. Kháng thể thứ nhất là c-erB-2, kháng thể thứ hai có gắn Biotin, Streptavidin, chất hiện màu 3,3’-diaminobenzidine chromogen (DAB). Kết quả được đọc bằng kính hiển vi quang học. Sự biểu hiện của thụ thể HER2 được đánh giá theo bảng điểm của DAKO (Moelans, 2011; Dhillon, 2007). Điểm 0: Màng tế bào không bắt màu, điểm 1+: bắt màu yếu, rải rác trên màng tế -7-
bào, điểm 2+: bắt màu vừa trên màng tế bào > 10% tế bào, điểm 3+: bắt màu mạnh trên màng tế bào > 10% tế bào (Hình 1.2). Hình 1.2. Khảo sát sự biểu hiện của thụ thể HER2 bằng phương pháp IHC. Mức độ biểu hiện của thụ thể HER2 được đánh giá theo phương pháp DAKO. Điểm 0: mẫu âm tính; điểm 1+: mẫu âm tính, điểm 2+: HER2 biểu hiện yếu, là mẫu nghi ngờ; điểm 3+: mẫu dương tính, HER2 biểu hiện mạnh. Ưu điểm của phương pháp IHC là tiện lợi, rẻ tiền, tiêu bản xét nghiệm dễ bảo quản sau khi đã phân tích, và chỉ cần sử dụng kính hiển vi quang học thông thường để quan sát. Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là kết quả không khách quan do ảnh hưởng của điều kiện bảo quản mẫu trước đó, thời gian và kỹ thuật cố định bệnh phẩm, loại kháng thể sử dụng (đơn dòng hay đa dòng), và điều quan trọng là khó khăn khi áp dụng bảng tính điểm để đưa ra kết luận chính xác. Có một tỉ lệ khá lớn trường hợp kết quả biểu hiện là 2+ khi dùng phương pháp IHC nhưng không thấy có sự khuyếch đại gen tương ứng khi dùng phương pháp FISH (lai huỳnh quang tại chỗ). -8-
Theo nghiên cứu của Tan và cộng sự (2011), trong số 126 trường hợp ung thư vú nguyên phát có 81/126 trường hợp (64,3%) là âm tính với HER2 (mức độ 0); 17/126 trường hợp (chiếm 13,6%) dương tính yếu (mức độ 1+); 19/126 trường hợp dương tính ở mức trung bình (mức độ 2+); và 9/126 trường hợp (chiếm 7,1%) dương tính mạnh với HER2 (mức độ 3+). Hàm lượng HER2 trong huyết thanh của các bệnh nhân ung thư vú được xác định từ 0,7 ng/ml đến 133,1 ng/ml, giá trị trung bình là 20,5 ng/ml. Nếu xét theo mức độ biểu hiện: Âm tính (0), thì nồng độ HER2 < 19 ng/ml; Dương tính yếu (1+) thì hàm lượng HER2 từ 19 đến 32 ng/ml; Dương tính mức độ trung bình (2+) thì hàm lượng HER2 từ 32 đến 66 ng/ml; Dương tính mạnh (3+) thì hàm lượng HER2 trong huyết thanh là >66 ng/ml. Các kết quả xác định hàm lượng HER2 trong huyết thanh bằng kỹ thuật Dot blot và hóa mô miễn dịch (immunohistochemical, IHC) trên mô ung thư có sự tương quan chặt chẽ với P=0,001, (Tan et al., 2011). 1.2. BIOSENSOR 1.2.1. Giới thiệu chung về Biosensor Biosensor thực chất là một thiết bị phân tích định tính hoặc định lượng một chất dựa trên sự chuyển đổi một tín hiệu sinh học thành một tín hiệu mầu, quang hoặc tín hiệu điện. Đối với Biosensor điện hóa thì đầu tiên, Biosensor sẽ nhận dạng hiện tượng và biên dịch thành một đặc tính có thể định lượng được, sau đó đặc tính định lượng này được chuyển đổi thành một tín hiệu điện bởi một bộ biến năng. Trong Biosensor, hiện tượng được nhận dạng bởi một hệ thống sinh học gọi là bioreceptor. Hệ thống này sẽ tiếp xúc trực tiếp với mẫu phân tích gây ra phản ứng và tạo thành hợp chất nhạy cảm cho Biosensor. Cơ quan thụ cảm sinh học có đặc tính chọn lọc đặc biệt đối với chất phân tích. Sơ đồ cấu tạo chung của một Biosensor được trình bày tại hình 1,3, và một số dạng Biosensor cũng như các yếu tố nhận biết sinh học, các bộ chuyển đổi được trình bày tại Hình 1.4. -9-
1.2.2. Lịch sử phát triển của Biosensor Năm 1956, giáo sư Leland Clark Jnr – người khai sinh về khái niệm điện cực sinh học (Biosensor) đã có công bố về điện cực Oxy. Dựa trên kinh nghiệm và tâm huyết của mình, ông đã phát triển lĩnh vực phân tích giúp có thể đo lường được trong cơ thể. Năm 1962, tại Hội nghị Khoa học ở Viện hàn lâm New York, ông đã có bài diễn thuyết: “Làm thế nào để các điện cực điện hóa (phương pháp pH, cực phổ, phép đo điện thế, phép đo độ dẫn điện) thông minh hơn”. Trong đó, ông trình bày cách làm điện cực điện hóa thông minh hơn bằng cách thêm enzyme vào máy chuyển đổi như những chiếc bánh sandwich được bao bọc bởi một lớp màng. Năm 1975, ý tưởng của Clark trở thành hiện thực với sự công bố của công ty Yellow Springs Instrument (Ohio) về máy phân tích glucose dựa trên việc đo dòng điện của hydro peroxide. Đây là lần đầu tiên các phòng thí nghiệm trên thế giới phân tích dựa trên một Biosensor. Cũng vào năm này, Biosensor tiến thêm một bước mới là khi Divis đề xuất rằng vi khuẩn có thể được dùng như một yếu tố sinh học trong điện cực vi khuẩn để đo hàm lượng rượu. Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo của Biosensor. Các bước hoạt động chính của Biosensor: Chất xúc tác sinh học (a) chuyển cơ chất (S) thành sản phẩm (P). Bộ biến năng (b) chuyển sản phẩm phản ứng thành tín hiệu điện. Bộ khuếch đại (c) nhằm khuếch đại tín hiệu điện của bộ biến năng. Bộ vi xử lý tín hiệu (d). Màn hình hiển thị (e). - 10 -
Hình 1.4. Các thành phần của yếu tố nhận biết sinh học và các dạng Biosensor. 1.2.3. Đặc điểm – Yêu cầu của Biosensor Để định lượng, Biosensor phải đáp ứng yêu cầu liên quan đến đo lường: khả năng lặp lại, khả năng tái sử dụng cao, tính chọn lọc, tính nhạy cảm, vùng trả lời tuyến tính và thời gian đáp ứng tín hiệu tốt. Các phép đo có độ lặp lại tốt nếu như hai loạt kết quả thu được tương tự nhau được thực hiện bởi cùng người phân tích, sử dụng cùng Biosensor trong cùng một mẫu phân tích. Phương pháp đo có khả năng tái sử dụng cao nếu các kết quả trước có thể đạt được khi tiến hành phân tích lặp lại lần hai. Tính chọn lọc của Biosensor thể hiện ở khả năng nhận ra một hợp chất đơn trong hỗn hợp các cấu tử của mẫu, khả năng này phụ thuộc vào cơ quan thụ cảm sinh học và - 11 -