Luận văn Thạc sĩ Sinh học thực nghiệm: Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp hoạt chất Huperzine A của chủng vi nấm nội sinh Penicillium sp.LĐL 4.4 từ cây thạch tùng răng cưa

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:76

Thêm vào BST

Báo xấu

19
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài được thực hiện nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng, từ đó tạo được nguồn nguyên liệu chủng giống gốc trong nghiên cứu, sản xuất hoạt chất HupA phục vụ cho sản xuất thuốc h trợ điều trị bệnh rối loạn trí nhớ tại Việt Nam, đặc biệt là bệnh Azheimer sau này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học thực nghiệm: Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp hoạt chất Huperzine A của chủng vi nấm nội sinh Penicillium sp.LĐL 4.4 từ cây thạch tùng răng cưa

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Họ và tên tác giả luận văn: Hoàng Thị Hồng Anh TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN NGHIÊN C U NÂNG CAO KH NĂNG INH T NG H HU IN A C A CH NG VI N M NỘI INH Penicillium sp. LĐL4.4 TỪ CÂY THẠCH TÙNG ĂNG CƯA LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội – 2019
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Họ và tên tác giả luận văn: Hoàng Thị Hồng Anh TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN NGHIÊN C U NÂNG CAO KH NĂNG INH T NG H HU IN A C A CH NG VI N M NỘI INH Penicillium sp. LĐL4.4 TỪ CÂY THẠCH TÙNG ĂNG CƯA Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Hướng dẫn 1 : TS. Lê Thị Minh Thành Hà Nội – 2019
Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Luận văn là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong các công trình khác. Mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn. Các thông tin, tài liệu trình bày trong luận văn đã được ghi rõ nguồn gốc. Nếu không đúng như nêu trên, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đề tài của mình. Tác giả luận văn Hoàng Thị Hồng Anh
Lời cảm ơn Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm chân thành tới TS. Lê Thị Minh Thành – Phó giám đốc Trung tâm Giống và Bảo tồn Nguồn gen Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ Trung Tâm Giống và Bảo Tồn Nguồn Gen Vi Sinh Vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người luôn bên cạnh, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có được kết quả như ngày hôm nay. Hà Nội, tháng 4 năm 2019 Hoàng Thị Hồng Anh
Danh mục ký hiệu và chữ viết tắt Từ viết tắt Chữ viết đầy đủ CYA Czapek yeast extract agar HPLC High-performance liquid chromatography MEA Malt Extract Agar MNNG N-methyl-N’nitro-N-nitrosoguanidine PDA Potato Dextrose Agar PDB Potato Dextrose Broth TLC Thin layer chromatography UV Ultra violet
Danh mục bảng Bảng 1.1. Sử dụng tác nhân vật lý gây đột biến ............................................ 24 Bảng 1.2. Cơ chế tác động của tác nhân hóa học gây đột biến ...................... 24 Bảng 2.1. Các môi trường nuôi cấy .............................................................. 32 Bảng 2.2. Môi trường khảo sát đặc điểm hình thái ....................................... 33 Bảng 2. . Thành phần các môi trường dinh dưỡng nuôi cấy ......................... 37 Bảng 2.4. Thành phần dung dịch môi trường MS ......................................... 39 Bảng 2.5. Nguồn C, N và chất bổ sung được lựa chọn.................................. 40 Bảng 2.6. Thành phần môi trường nhân giống .............................................. 41 Bảng .1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng Penicillium sp. LĐL 4.4 trên các môi trường nuôi cấy ................................................................ 44 Bảng .2. Các khuẩn lạc đột biến được chọn ngẫu nhiên .............................. 49 Bảng . . Kết quả định lượng HupA của chủng đột biến ........................... 51 Bảng .4. Lượng sinh khối tươi thu được và hàm lượng HupA trong dịch chiết của chủng vi nấm LĐL4.4 các môi trường nuôi cấy khác nhau . 53 Bảng .5. Ảnh hư ng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng nấm LĐL4.4 ........................................................................ 56 Bảng .6. Ảnh hư ng của hàm lượng nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng nấm LĐL4.4 ....................................................... 58 Bảng .7. Ảnh hư ng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng nấm LĐL4.4 .............................................................................. 58 Bảng . . Ảnh hư ng của chất bổ sung tới sinh khối tươi và hàm lượng HupA của chủng vi nấm nghiên cứu ............................................................... 60 Bảng .9. Ảnh hư ng của hàm lượng ethanol tới sinh khối tươi và hàm lượng HupA của chủng vi nấm LĐL 4.4 nghiên cứu ...................................... 61 Bảng .10. Khả năng sinh trư ng của chủng nấm LĐL 4.4 trên một số môi trường nhân giống ................................................................................ 63 Bảng .11. Ảnh hư ng của thời gian nhân giống đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng vi nấm LĐL 4.4 ......................................................... 64
Bảng .12. Ảnh hư ng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng LĐL 4.4 ..................................................................................... 65 Bảng .1 . Ảnh hư ng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng LĐL 4.4 ............................................................................... 66 Bảng .14. Ảnh hư ng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng chủng LĐL 4.4 ........................................................................... 66 Bảng .15. Ảnh hư ng của độ thông khí đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng LĐL 4.4 ............................................................................... 67 Bảng .16. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp HupA của chủng nấm LĐL 4.4 trên thiêt bị lên men 5 lít ........................................................ 69
Danh mục hình ảnh Hình 1.1: Cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) [6] ............................. 6 Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Huperzine A [2] ............................................ 9 Hình 1. : Nấm nội sinh phát triển trong rễ cây Cối xay và cây Phong đường [11]....................................................................................................... 10 Hình .1. Hình thái khuẩn ty của chủng LĐL 4.4 trên các môi trường sau 5 ngày nuôi cấy. ...................................................................................... 46 Hình .2. Đặc điểm vi hình thái của chủng Penicillium LĐL 4.4 trên các môi trường sau 5 ngày nuôi cấy ................................................................... 46 Hình . . Sắc ký đồ (UV 310 nm) Penicillium sp. LĐL4.4 trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ........................................................................... 47 Hình .4. Tỷ lệ sống sót chủng LĐL 4.4 sau xử lí đột biến ........................... 48 Hình .5. Khuẩn lạc các chủng đột biến 4.4hc15.2 (A), 4.4hc20.1 (B) và 4.4uv30.3 (C) trên môi trường PDA ..................................................... 50 Hình .6. Sắc kí lớp mỏng – TLC của chất chỉ thị HupA (a, b), dịch chiết nấm thể 4.4hc20.1 (d), 4.4uv 0. (e) và 4.4hc15.2 (f) trên bản silica gel Merk 0.25 mm được phát hiện bằng thuốc nhuộm KMnO4 0,5% ................... 50 Hình .7. Sắc ký đồ HPLC (UV 10 nm, Ref 90 nm) của chất chỉ thị Huperzine A (A) và các mẫu phân tích 4.4hc15.2 (B), 4.4hc20.1 (C) và 4.4uv30.3 (D) ....................................................................................... 51 Hình . . Sinh khối lên men và dịch chiết (hòa trong Chlorofom) chủng LĐL 4.4 trên môi trường MT9 ...................................................................... 54 Hình .9. Sắc kí đồ xác định hàm lượng HupA của chủng LĐL 4.4 trên môi trường MT 9 ......................................................................................... 55 Hình .10. Sinh khối chủng LĐL 4.4 trong môi trường khoai tây (A), Czapek – Dox (B) và PDA (C) .......................................................................... 63 Hình .11. Sinh khối của chủng LĐL4.4 khi nuôi cấy các pH môi trường khác nhau ............................................................................................. 66 Hình 3.12. Sinh khối của chủng LĐL 4.4 khi nuôi cấy các nhiệt độ khác nhau...................................................................................................... 67
Hình 3.13. Sinh khối của chủng khi lắc các tốc độ khác nhau ................... 68 Hình .14. Sinh khối lên men chủng LĐL 4.4 quy mô 5L các thời gian khác nhau ..................................................................................................... 70 Hình .15. Sắc ký đồ (UV 310 nm) dịch chiết chủng Penicillium sp. LĐL4.4 quy mô lên men 5L trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ............. 70
MỤC LỤC MỤC LỤC ..................................................................................................... 1 MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 6 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA VÀ HOẠT CHẤT HUPERZINE A .............................................................................. 6 1.1.1. Cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) .................................... 6 1.1.2. Hoạt chất Huperzine A (HupA) ........................................................ 7 1.2. VI NẤM NỘI SINH TRONG THỰC VẬT ......................................... 9 1.2.1. Quan hệ giữa vi nấm nội sinh và thực vật ....................................... 10 1.2.2. Một số nghiên cứu về phân lập nấm nội sinh trong các loài thực vật khác nhau ................................................................................................. 11 1.2. . Ứng dụng của vi nấm nội sinh trong thực vật ................................. 13 1. . TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI NẤM NỘI SINH CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA SINH TỔNG HỢP HOẠT CHẤT HUPERZINE A. 14 1. .1. Các nghiên cứu trên thế giới ........................................................... 14 1. .2. Các nghiên cứu trong nước ............................................................. 18 1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA VI NẤM .................................................................. 19 1.4.1. Ảnh hư ng của nuôi cấy đến sự sinh trư ng phát triển của vi nấm . 19 1.4.2. Các nguồn dinh dưỡng trong sinh trư ng của vi nấm ...................... 20 1.5. TẠO GIỐNG VI SINH VẬT BẰNG ĐỘT BIẾN .............................. 22 1.5.1. Khái niệm chung ............................................................................ 22 1.5.2. Quy trình tạo giống bằng phương pháp gây đột biến....................... 23 1.5. . Đột biến chủng bằng tia UV ........................................................... 25 1.5.4. Đột biến chủng MNNG (N-methyl-N’nitro-N-nitrosoguanidine) .... 25 1.6. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ [5] .......................................................... 25 1.6.1. Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography – TLC) ................... 25 1.6.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography – HPLC ) .................................................................................................. 27 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 31 2.1. VẬT LIỆU ........................................................................................ 31 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 31 1
2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị thí ngiệm .................................................... 31 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................... 32 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và bảo quản vi nấm ..................................... 32 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng nấm 33 2.2. . Các phương pháp gây đột biến chủng ............................................. 35 2.2.4. Các phương pháp nghiên cứu môi trường nuôi cấy thích hợp ....... 355 2.2.5. Phương pháp tách chiết hoạt chất Huperzine A từ chủng nấm ........ 42 2.2.6. Phương pháp xác định hoạt chất HupA ........................................... 42 CHƯƠNG . KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 44 .1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, VI HÌNH THÁI CỦA CHỦNG VI NẤM Penicillium sp. LĐL 4.4 .................................... 44 3.2. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP HUPA CỦA CHỦNG Penicillium sp. LĐL4.4 BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN CHỦNG .. 47 .2.1. Kết quả sàng lọc chủng đột biến có khả năng sản sinh Huperzine A ................................................................................................................. 48 .2.2. Kết quả xác định khả năng sinh tổng hợp HupA của các chủng đột biến bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC ..................... 50 . . NGHIÊN CỨU NÂNG CAO SINH TỔNG HỢP HUPA CỦA CHỦNG Penicillium sp. LĐL4.4 BẰNG PHƯƠNG PHÁP NU I CẤY CHỦNG ................................................................................................... 52 . .1. Kết quả nghiên cứu nâng cao sinh tổng hợp HupA bằng nghiên cứu môi trường nuôi cấy thích hợp .................................................................. 52 . .2. Kết quả nghiên cứu nâng cao sinh tổng hợp HupA bằng nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp...................................................................... 62 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 72 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................... 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 73 2
MỞ ĐẦU Bệnh Alzheimer (AD) là một bệnh thần kinh thoái hóa tác động đến trí nhớ, suy ngh và hành vi của con người. AD ảnh hư ng đến hơn 20 triệu người trên toàn thế giới bao gồm cả 4,5 triệu người Mỹ và được coi là nguyên nhân lớn thứ ba gây tử vong các nước phát triển sau bệnh tim mạch và ung thư [1]. Hiện tại không có phương thức chữa trị cho AD. Tuy nhiên, sử dụng các chất ức chế cholinesterase (AChEI) là một trong những hầu hết các chiến lược được chấp nhận trong điều trị AD [2]. Huperzin A (HupA), một Lycopodium alkaloid, được tách chiết lần đầu tiên từ một cây thảo dược truyền thống của Trung Quốc - Huperzia serrata (Thunb. ex Murray) Trev. (Thạch tùng răng cưa) trong những năm 19 0 [3]. Sau khi các công trình nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc được công bố, thì các nhà khoa học Phương Tây đã kết luận rằng chất này có tác dụng trong việc chữa trị các bệnh suy giảm về trí nhớ, đặc biệt đối với bệnh Alzeimer. Alkaloid này có khả năng xuyên qua hàng rào mạch máu não và tác động trực tiếp lên não bộ với liều lượng rất thấp tính bằng microgram. Trên thực tế, HupA ức chế việc sản sinh ra acetylcholinesterase, một enzym tạo ra sự suy thoái của acetylcholine. Khi mà enzym này bị thiếu hụt, hoặc chỉ có với hàm lượng rất thấp thì hàm lượng acetylcholine trong não tăng lên, giúp cho trí nhớ và các chức năng nhận thức được cải thiện. So với các loại thuốc dược phẩm tacrine, donepezil, rivastigmine và galanthamine; HupA và dẫn xuất bán tổng hợp của ZT-1 có hoạt động chống AChE tốt hơn, thời gian dài hơn, khả dụng sinh học đường uống cao hơn và ít tác dụng độc hại hơn [4, 5]. HupA đã được phê duyệt trong năm 1990 Trung Quốc như là một thuốc điều trị Alzheimer và bán trên thị trường Mỹ như một chế độ ăn uống bổ sung, và ZT-1 đã được hoàn thành giai đoạn II lâm sàng thử nghiệm cả Trung Quốc và châu Âu, năm 2007 nước Pháp coi đây là vấn đề phải quan tâm hàng đầu của quốc gia [5]. Các nghiên cứu về hoạt chất Huperzine A trong cây H. serrata làm nguyên liệu trong sản xuất thuốc chữa trị các bệnh rối loạn về trí nhớ và AD 3
đã thu được các thành tựu rất đáng quan tâm. Các kế hoạch bảo tồn, phát triển loài này được một số nước trong đó có Trung Quốc chú trọng phát triển. Ngoài phát triển trồng trọt, nhân giống invitro cũng đã được quan tâm nhằm nhân nhanh sản lượng cây và tăng cao sản lượng hoạt chất HupA [6, 7]. Tuy nhiên, do điều kiện nuôi trồng thực vật cây H. serrata cũng như nuôi cấy cây in vitro rất khó khăn (đòi hỏi phải mất nhiều thời gian kéo dài nhiều năm, chi phí nhiều cho trồng trọt nhân cây) để có thể thu được một lượng lớn cây nguyên liệu cho chiết tách được một lượng lớn HupA phục vụ việc sản xuất thuốc, nên việc tìm kiếm chủng vi nấm sản sinh ra HupA là quan trọng, cần được quan tâm và là một hướng đi mới nhằm hướng tới một nguồn nguyên liệu lớn có hiệu quả kinh tế cho ngành công nghiệp dược trong nước và trong điều trị bệnh suy giảm trí nhớ tại Việt Nam, đáp ứng cho nhu cầu thị trường trong và ngoài nước. Vi sinh vật nội sinh thường sống trong mô thực vật được tìm thấy vùng rễ, thân, lá, quả của thực vật. Nấm nội sinh trong thực vật thường sinh trư ng, phát triển nội sinh hoàn toàn hoặc một phần trong mô của các tế bào cây chủ, thường không gây triệu chứng rõ ràng của bệnh. Gần đây, nấm nội sinh được phân lập từ các loại cây trồng đã được chấp nhận như là một nguồn nguyên liệu quan trọng của ngành công nghiệp dược. Một lượng lớn các hợp chất có cấu trúc mới và hoạt tính sinh học khác nhau đã được chiết xuất từ các nấm nội sinh này [8]. Do đó, việc nghiên cứu phân lập các chủng nấm nội sinh trong cây H. serrata có khả năng sản sinh hoạt chất HupA đã được các nhà khoa học quan tâm nhằm thay thế, tăng cường lượng HupA cho ngành công nghiệp dược. Đã có nhiều kết quả nghiên cứu khả quan được công bố, đặc biệt là Trung Quốc – nơi có cây H. serrata phân bố nhiều. Hợp chất Hup A được tìm thấy sinh tổng hợp b i các loài nấm nội sinh trong cây H. serrata bao gồm các chi chủ yếu như Aspergillus, Trichoderma, Alternaria, Podospora, Penicillium, Cyphellophora, Colletotrichum, Acremonium, Blastomyces, Botrytis. Ở Việt Nam, Thạch tùng răng cưa mới được phát hiện tại Sa Pa, Lâm Đồng độ cao 1.000 m. Đây là loài cây dược liệu quý hiếm, thuộc danh sách 4
"đỏ" trong Chương trình Nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen quý hiếm về cây thuốc, nhưng chưa được quan tâm nghiên cứu và khai thác ứng dụng trong điều trị bệnh tại Việt Nam. Mặt khác, tại Việt Nam trước đây đã có nhiều nghiên cứu về vi nấm nội sinh trong một số loại cây trồng, tuy nhiên, các nghiên cứu về nấm nội sinh cây Thạch tùng răng cưa Việt Nam đến nay là chưa có công bố. Hiện tại, lần đầu tiên tại Việt Nam, từ năm 2015 đến nay, Viện Công nghệ sinh học đã và đang có các nghiên cứu trong khuôn khổ đề tài cấp cơ s và cấp Nhà nước về các chủng vi nấm nội sinh sinh tổng hợp HupA trong cây Thạch tùng răng cưa phân bố tại Việt Nam. Nhóm đề tài đã thu được các kết quả rất khả quan, trong đó chủng vi nấm Penicillium sp. LĐL4.4 được phân lập từ lá cây Thạch tùng răng cưa phân bố tại Đà Lạt là một trong những chủng giống có tiềm năng sinh tổng hợp hoạt chất HupA cao. Vì vậy, đề tài: ạ ừ y T ạ ù ư được thực hiện nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng, từ đó tạo được nguồn nguyên liệu chủng giống gốc trong nghiên cứu, sản xuất hoạt chất HupA phục vụ cho sản xuất thuốc h trợ điều trị bệnh rối loạn trí nhớ tại Việt Nam, đặc biệt là bệnh Azheimer sau này.  Mụ đí đề à : Nâng cao được khả năng sinh tổng hợp hoạt chất Huperzine A của chủng nấm Penicillium sp. LĐL4.4 nhằm tạo được nguồn nguyên liệu chủng giống gốc cho nghiên cứu, sản xuất HupA trong h trợ điều trị bệnh rối loạn trí nhớ tại Việt Nam, đặc biệt là bệnh Azheimer.  d : - Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học chủng vi nấm Penicillium sp. LĐL4.4. - Khảo sát khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng vi nấm Penicillium sp. LĐL4.4 bằng phương pháp đột biến chủng. - Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng vi nấm Penicillium sp. LĐL4.4 bằng phương pháp nuôi cấy chủng. 5
rất nhiều năm (có khi tới 15 năm) phát triển trong tự nhiên mới có thể để sử dụng làm thuốc. Chính vậy, nguồn cung cấp hoạt chất HupA từ cây Thạch tùng răng cưa làm nguyên liệu cho sản xuất thuốc là không cao (khoảng 0,1%). B i vậy, có rất nhiều sự n lực để thực hiện việc sản xuất HupA như nuôi cấy in vitro cây H. serrata và tổng hợp hóa học [6]. Họ Huperziaceae bao gồm 2 chi: Huperia và Phlegmariurus. Loài Huperzia hiện đang nằm trong danh sách tuyệt chủng của các loài thực vật, hầu hết chúng được sử dụng trong mục đích y tế. Trong các loài khác nhau của Huperziaceae, hàm lượng HupA cao nhất được tìm thấy Phlegmariurus caritus cao hơn loài Huperzia serata. Cây trồng trong điều kiện độ ẩm cao ( các khu rừng ẩm ướt) cũng cho hàm lượng HupA cao hơn đáng kể so với cây trồng trong môi trường có độ ẩm thấp. Lượng HupA cũng thay đổi đáng kể theo mùa, cao nhất giữa mùa thu và thấp nhất vào đầu mùa xuân. Hàm lượng Huperzine A cao nhất loài H. pinifolia (1765.9 µg g-1 dw), hàm lượng Huperzia elmeri từ Philippines (60 µg g-1 ) và H. carinata (1030 µg g-1) từ Queensland, Australia. Còn với H. serrata từ Trung Quốc đạt từ 80,2- 182,6 µg g-1 [5]. Trong điều kiện Việt Nam chỉ có thể nuôi trồng được H. serrata như của Trung Quốc. 1.1.2. Hoạt chất Huperzine A (HupA) Huperzine A là một Lycopodium alkaloid, hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cưa. Các nhà khoa học Trung Quốc là những người đầu tiên cô lập được chất này từ cây và tiến hành các thí nghiệm lâm sàng cũng như các ứng dụng điều trị các bệnh rối loạn trí nhớ tại Trung Quốc. Sau đó, các nhà khoa học phương Tây cũng nghiên cứu và đã kết luận HupA có tác dụng rất tốt trong việc chữa trị các bệnh về trí nhớ, đặc biệt đối với bệnh Alzeimer. 1.1 2 1 Bệ Bệnh Alzheimer (AD, SDAT) hay đơn giản là Alzheimer là một chứng mất trí phổ biến nhất. Vào năm 1906, lần đầu tiên bác s tâm thần và thần kinh học người Đức Alois Alzheimer đã chỉ ra căn bệnh này không thể chữa được, mang tính thoái hóa và gây tử vong. Căn bệnh này được đặt theo 7
tên ông. Trong những năm 1970 - 1985 khoa học nhận thấy người mất trí các lứa tuổi khác nhau lại có triệu chứng lâm sàng giống nhau. Khi bệnh tiến triển, các triệu chứng bao gồm sự nhầm lẫn, khó chịu, thay đổi tâm trạng, mất khả năng phân tích ngôn ngữ, mất trí nhớ dài hạn, suy giảm các giác quan. Dần dần, cơ thể sẽ mất đi một số chức năng, cuối cùng dẫn đến cái chết. Bệnh Alzheimer có thể phát triển tiềm tàng trong một thời gian dài trước khi xuất hiện những triệu chứng có thể phát hiện được bệnh. Thông thường khi các triệu chứng này bộc lộ, thì người bệnh chỉ có thể sống được khoảng 7 năm, dưới % bệnh nhân sống thọ thêm 14 năm sau khi phát hiện bệnh. Bệnh này thường xuất hiện người trên 65 tuổi, tuy nhiên dạng Alzheimer sớm dù không phổ biến nhưng có thể xảy ra sớm hơn rất nhiều. Năm 2006 có 26,6 triệu người mắc bệnh Alzheimer trên toàn thế giới. Dự đoán tỉ lệ mắc Alzheimer trên thế giới sẽ là 1,18% vào năm 2050. Hiện nay khoa học vẫn chưa hiểu rõ nguyên nhân và tiến triển của bệnh Alzheimer. Nghiên cứu cho thấy căn bệnh này có liên quan với các mảng và đám rối trong não. Các phương pháp điều trị hiện tại chỉ giúp giảm một phần nhỏ triệu chứng bệnh, chưa có phương pháp trị liệu nào có thể ngăn chặn hoặc làm chậm tiến triển của bệnh. Tính tới thời điểm 200 , đã có hơn 500 thử nghiệm lâm sàng nhằm tìm ra phương pháp chữa trị bệnh Alzheimer, nhưng vẫn chưa biết có kết quả nào khả quan trong các phương pháp đã được thử nghiệm. Một số thói quen sống đã được đưa ra khuyến cáo nhằm phòng ngừa bệnh Alzheimer, nhưng cũng chưa có đủ chứng cớ cho thấy những khuyến cáo này có thể làm giảm sự thoái hóa não. 1122 đề ị bệ HupA là một alkaloid, có cấu trúc hóa học là C15H18N2O (hình 1.2), có trọng lượng phân tử là 242, 2, nhiệt độ nóng chảy 2 0oC, tan trong methanol, ethanol, ít hòa tan trong nước. Cơ chế của Hup A trong điều trị bệnh là: Trong cơ thể người, não sản xuất ra một chất truyền thần kinh là acetylcholine có chức năng quan trọng trong chuyển động cơ bắp, suy ngh và trí nhớ; aceteycholine bị ức chế, gây thoái hóa b i enzym acetylcholinesterase (AChE). Hoạt chất HupA có tác 8
dụng ức chế việc sản sinh ra acetylcholinesterase, giúp cho việc làm giảm lượng enzym này và khi đó lượng acetylcholine trong não tăng lên, giúp cho trí nhớ và các chức năng nhận thức được cải thiện [10]. Trong một nghiên cứu, các nhà khoa học phát hiện ra rằng 5 % bệnh nhân Alzheimer cải thiện đáng kể cả hai chức năng nhận thức và trí nhớ khi dùng 200 mcg HupA m i ngày. Ngoài ra, tác dụng tích cực ghi nhận những bệnh nhân này về chất lượng cuộc sống cũng như khả năng tìm lại những kỷ niệm đã qua trong quá khứ, nó không chỉ h trợ điều trị hiệu quả cho não bộ của người bệnh Alzheimer, người già có biểu hiện suy giảm trí nhớ mà còn có hiệu quả trong việc cải thiện trí nhớ người lớn khỏe mạnh. Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Huperzine A [9] So với các loại thuốc dược phẩm tacrine, donepezil, rivastigmine và galanthamine; HupA và dẫn xuất bán tổng hợp của ZT-1 có hoạt động chống AChE tốt hơn, thời gian dài hơn, khả dụng sinh học đường uống cao hơn và ít tác dụng độc hại hơn [4, 5]. HupA đã được phê duyệt trong năm 1990 Trung Quốc như là một thuốc điều trị Alzheimer và bán trên thị trường Mỹ như một chế độ ăn uống bổ sung, và ZT-1 đã được hoàn thành giai đoạn II lâm sàng thử nghiệm cả Trung Quốc và châu Âu, năm 2007 nước Pháp coi đây là vấn đề phải quan tâm hàng đầu của quốc gia [4]. 1.2. VI NẤM NỘI SINH TRONG THỰC VẬT Vi nấm nội sinh – fungal endophyte sống mô sâu thực vật, thể hiện mối liên kết giữa cây và nấm bằng cách hình thành khuẩn lạc trong mô tế bào thực vật các giai đoạn sinh trư ng phát triển cây chủ, thường không gây triệu chứng bệnh rõ ràng cho cây [12, 13]. 9
1 2 1 3 Sự yề ự ậ Vi nấm nội sinh có thể lây nhiễm từ phần này sang phần khác trong cây chủ (truyền ngang), hoặc các cây di truyền cho các thế hệ sau (truyền dọc). Ví dụ cho cơ chế truyền ngang: một số nghiên cứu chỉ ra rằng, trong hạt giống và cây hầu như không chứa nấm nội sinh, tuy nhiên tỷ lệ nấm nội sinh tăng lên khi lá hay hạt lớn lên [16, 17]. Còn số nấm nội sinh loài Neotyphodium và Epichloë lại được truyền theo chiều dọc lưu trữ trên thế hệ con cháu [18]. 1.2.2. Một số nghiên cứu về phân lập nấm nội sinh trong các loài thực vật khác nhau Mặc dù nấm nội sinh trong thực vật đã được biết đến thế kỷ trước, nhưng chúng mới chỉ được quan tâm chú trọng tới trong vòng hơn 0 năm tr lại đây. Năm 19 1, Webber là nhà nghiên cứu đầu tiên công bố phát hiện nấm nội sinh Phomopisis oblonga cây Du (Ulmus). Loài nấm này sau đó được Clayton và cộng sự xác định thuộc Xylariaceae [12]. Từ đó đến nay, một loạt các nhóm cây cũng đã được phát hiện là có vi nấm nội sinh sống trong cây. Một số nghiên cứu vi nấm nội sinh thực vật trong những năm gần đây: - Nấm nội sinh cây thông đỏ (Taxus brevifolia): Năm 1995 – 1996, các nghiên cứu ngoài nước đã phân lập được hàng trăm loài nấm nội sinh từ các cây thông đỏ Châu Âu, Châu Á và Bắc Mỹ. Có thể nói các cây thông đỏ là một kho báu chứa nhiều vi sinh vật chưa từng được phát hiện và rất đáng chú ý, chúng tương tác với nhau và với cây chủ. Những nấm đã được phân lập từ cây thuộc các chi: Taxomyces sp., Pestolotiopsis sp., Penicillium sp. và Truncatella sp [13]. Năm 2010, các nhà nghiên cứu thuộc phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên đã đưa ra biểu đồ về quy luật phân bố của các chủng nấm nội sinh trên các bộ phận của cây thông đỏ (Taxus wallichiana). Theo đó, vi nấm nội sinh được phân bố trên tất cả các bộ phận khác nhau, nhiều nhất lá (50 chủng), thân (4 chủng), cành ( 9 chủng), rễ (24 chủng) và ít nhất là quả (1 chủng). Bằng phương pháp phân loại hình 11
thái và sinh học phân tử đã định tên được 4 chủng nấm là Trichoderma aureoviride SHT06; Daldinia fissa SHT46; Eupenicillium ehrlichii SHT101và Gongroniella butleri SHT106 [13]. - Nấm nội sinh trong cây thầu dầu (Ricinus communi): Sardul và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phân lập nấm nội sinh trong cây thầu dầu Ấn Độ. Các nhà khoa học cho rằng các nấm nội sinh này có khả năng sản sinh hoạt chất Hypericin (C30H16O8) có hoạt tính kháng sinh chống vi khuẩn E.Coli, các loài Samonella sp., Staphylococus sp. và các nấm Candida sp.. Kết quả, từ 46 mẫu (16 lá, 16 thân và 14 rễ) đã phân lập được 10 chủng nấm nội sinh thuộc các chi Aspergillus sp. , Fusarium sp., Curvularia sp., Alternaria sp., Dreschslera sp [8]. - Nấm nội sinh trong chi cỏ xạ hương (Thymus): Cỏ xạ hương được biết đến như một loại gia vị, ngoài ra nó còn là một cây thuốc có tác dụng giảm đau, kháng viêm. Tại tỉnh Hameda – Iran, Sahar và cộng sự thu nhập các mẫu cây từ 6 loài cỏ xạ hương khác nhau vào ba thời điểm mùa xuân, hè, thu năm 2011 để tiến hành phân lập các chủng nấm nội sinh trong cây. Từ 00 mẫu cây thu được đã phân lập được 95 chủng thuộc 11 chi nấm khác nhau, ngoài ra còn có 6 loại nấm men. Gồm các chi: Fusarium sp., Aspergillus sp., Alternaria sp., Stemphylium sp., Ulocladium sp., Phoma sp., Curvularia sp., Cylindrocarpon sp., Cylindrocarpon sp; trong đó , các chi Alternaria sp., Phoma sp., Fusarium sp. là phong phú nhất. - Nấm nội sinh trong cây kiwi (Actinidia macrosperma): Ở Trung Quốc, cây Kiwi là một cây thuốc dùng trong điều trị nhiều bệnh khác nhau như bệnh phong, áp xe, viêm thấp khớp, viêm khớp, vàng da, và huyết trắng bất thường. Trong nghiên cứu điều tra vi nấm nội sinh trong kiwi và xác định hoạt tính sinh học của chúng thu được 17 chủng vi nấm nội sinh phân lập được từ cây Kiwi Trung Quốc, có 11 chủng thuộc 5 chi khác nhau: Acremonium sp., Cylindrocarpon sp., Trichoderma sp., Paecilomyces sp., và Chaetomium sp. Sáu chủng với các đặc điểm hình thái và dữ liệu phân tử còn giới hạn nên mới chỉ xác định thuộc lớp Ascomycete [19]. 12
1.2.3. Ứng dụng của vi nấm nội sinh trong thực vật 1231 T ô ệ Các chất có hoạt tính sinh học được sản xuất trực tiếp từ vi nấm nội sinh, hay là sản phẩm kết hợp giữa mối quan hệ tương tác giữa nấm và thực vật, giúp cho vi nấm nội sinh thích ứng tốt hơn và thực hiện một số chức năng bảo vệ, cung cấp các chất có lợi cho cây chủ [13]. Bên cạnh đó, vi nấm nội sinh cũng có thể là nguyên nhân gây biến đổi sinh lý cây chủ giúp cây chủ chống lại được với điều kiện sống bất lợi. Acremonium sp. là một dạng nấm nội sinh được biết đến khả năng có thể kiểm soát côn trùng gây hại. Lợi dụng tính chất này, Koga và cộng sự đã thực hiện cấy nhiễm nấm chi Acremonium vào các cây để chúng có thể truyền cho cây chủ khả năng kháng lại sự cạnh tranh với các loài gây hại cho cây. Kết quả nghiên cứu công bố đã cấy nhiễm thành công vào cây cỏ đuôi trâu (Festuca arundinacea) và cỏ hắc mạch (Lolium perenne), các cây này đã kháng lại được sâu kéo màng cỏ Poa P. teterrella [12]. Năm 1999, Pereira và cộng sự đã áp dụng trên cây chuối.Việc cấy nhiễm nấm nội sinh vào cây chuối không chỉ giúp cây có khả năng kháng lại thuốc diệt nấm mà nó còn đột biến để duy trì sự đối kháng [12]. Beauveria bassiana là loại nấm diệt côn trùng bằng cách gây bệnh lên côn trùng giai đoạn ấu trùng và trùng. Nấm này được cấy nhiễm vào một số hạt ngũ cốc để chống lại các côn trùng tấn công cây chủ trong một số giai đoạn sinh trư ng và phát triển. Tuy nhiên, trong một số cây đã tìm thấy sự có mặt của loài này, chứng tỏ nấm này có dạng nội sinh tự nhiên không liên quan tới quá trình nấm xâm nhập vào cây. Ngoài ra, một số nấm gây bệnh trên côn trùng cũng đã được phân lập trên một số cây trồng khác [12]. 1232 T y dư Các chất có hoạt tính sinh học được sản sinh b i các vi nấm nội sinh được đánh giá là có tiềm năng phát triển trong l nh vực y dược. Theo các nghiên cứu đánh giá, vi nấm nội sinh cung cấp hàng loạt các chất chuyển hóa thứ cấp hoạt tính sinh học có cấu trúc độc đáo, bao gồm: alkaloid, 13