Luận văn Thạc sĩ Sinh học thực nghiệm: Ứng dụng công nghệ giải trình tự thế mới Ion Torrent S5XLTM trong việc giám định hài cốt lâu năm

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:87

Thêm vào BST

Báo xấu

44
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình chạy và bước đầu áp dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới (NGS) để giám định ADN hài cốt lâu năm; phân tích được dữ liệu vùng siêu biến ADN ty thể của các mẫu nghiên cứu từ các kết quả thu được thông qua hệ thống giải trình tự thế hệ mới (NGS). Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học thực nghiệm: Ứng dụng công nghệ giải trình tự thế mới Ion Torrent S5XLTM trong việc giám định hài cốt lâu năm

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Hoàng Thị Thúy ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI ION S5XLTM TRONG GIÁM ĐỊNH HÀI CỐT LÂU NĂM LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội - tháng 10 năm 2020
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Hoàng Thị Thúy ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI ION S5XL TM TRONG GIÁM ĐỊNH HÀI CỐT LÂU NĂM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS Chu Hoàng Hà Hà Nội - tháng 10 năm 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả thể hiện trong bản luận văn này là công trình nghiên cứu thực tế. Toàn bộ số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực, khách quan, chƣa đƣợc công bố công khai bởi một ai khác. Học Viên Hoàng Thị Thúy
LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà – Viện trƣởng Viện Công nghệ Sinh học, đã hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn ThS. Hoàng Hà giám đốc Trung tâm Giám định ADN, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Trần Minh Đức và ThS. Lê Thị Dung cùng tập thể cán bộ trung tâm Giám định ADN, Viện Công nghệ Sinh học, đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luân văn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo và Ban đào tạo Học viện Khoa học và Công nghệ đã hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè và gia đình đã giúp đỡ và chia sẻ, động viên trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 08 tháng 10 năm 2020 Học Viên Hoàng Thị Thúy
BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tên đầy đủ và ý nghĩa bp Base pair CR Control region D-loop Displacement Dloop mtADN mitochondrial DNA HV Hypervariable region PCR Polymerase chain reaction NGS Next-generation sequencing dNTP Deoxyribonucleotide triphosphat PGM Personal genome machine qPCR quantitative PCR STR Short tandem repeat. SNP Single nucleotide polymorphism SDS Sodium dodecyl sulphate HA Hydroxyapatite
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3 1.1 ĐẶC ĐIỂM GIẢI PHẪU VÀ MÔ HỌC XƢƠNG .............................. 3 1.1.1 Thành phần và cấu trúc của bộ xƣơng ............................................... 3 1.1.2. Phân bố ADN trong xƣơng ............................................................... 7 1.1.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến cấu trúc và sự tồn tại của ADN hài cốt ........ 9 1.1.4. Cơ sở khoa học của phân tích ADN trong giám định nhận dạng cá thể .............................................................................................................. 11 1.2. PHÂN TÍCH ADN TY THỂ TRONG NHẬN DẠNG CÁ THỂ ...... 13 1.2.1 Cấu trúc hệ gen ty thể ...................................................................... 13 1.2.2 Vùng gen điều khiển CR (Control Region hay Displacement Dloop) . 14 1.2.3 Cơ sở khoa học đánh giá tính đa hình vùng D-loop ở ngƣời .......... 15 1.2.4 Đặc điểm trình tự ADN ty thể ứng dụng trong giám định .............. 17 1.2.4.1. Trình tự tham chiếu rCRS............................................................ 17 1.2.4.2. Sự biến đ i nucleotide ................................................................. 17 1.2.5 Ứng dụng phân tích ADN trong giám định nhận dạng cá thể ................ 18 1.2.5.1 Trên thế giới ................................................................................. 18 1.2.5.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ............................................... 20 1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ ......................................... 21 1.3.1 Công nghệ giải trình tự Sanger ........................................................ 21 1.3.2. Công nghệ đọc trình tự thế hệ mới (NGS_Next Generation Sequencing)............................................................................................... 22 1.3.3. Công nghệ đọc trình tự bán dẫn Ion bằng Ion Torrent ................... 25 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 29 2.1 VẬT LIỆU .......................................................................................... 29 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu ...................................................................... 29
2.1.2 Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài ............................................. 30 2.1.3. Hóa chất .......................................................................................... 30 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................. 33 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................. 33 2.2.2. Quy trình thực hiện ......................................................................... 33 2.2.2.1 Xử lý vật lý và hóa học mẫu hài cốt ............................................. 34 2.2.2.2 Tách chiết thu ADN từ mẫu hài cốt .............................................. 34 2.2.2.3 Định lƣợng ADN t ng số .............................................................. 35 2.2.3.4 Chuẩn bị thƣ viện ADN cho giải trình tự thế hệ mới ................... 37 2.2.2.5. Tiến hành cài đặt và chạy máy ................................................... 40 2.2.2.6. Phân tích kết quả .......................................................................... 41 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 42 3.1. TÁCH CHIẾT VÀ XÂY DỰNG NỒNG ĐỘ ADN BẰNG REALTIME PCR ......................................................................................................... 42 3.1.1 Xây dựng đƣờng chuẩn nồng độ ADN bằng realtime ..................... 42 3.1.2 Định lƣợng gADN mẫu tách chiết ................................................... 43 3.2 NGHIÊN CỨU TẠO THƢ VIỆN ...................................................... 48 3.2.1 Khuếch đại thƣ viện ......................................................................... 48 3.2.2 Loại bỏ sản phẩm không đặc hiệu và sản phẩm dƣ thừa từ thƣ viện .. 49 3.2.3 Gắn các đầu nối và tinh sạch thƣ viện ADN ................................... 50 3.2.4 Định lƣợng thƣ viện ADN bằng qPCR ............................................ 52 3.3 GIẢI TRÌNH TỰ BẰNG HỆ THỐNG ION TORRENT S5 ............. 56 3.3.1 Giải trình tự trên thiết bị Ion Torrent S5......................................... 56 3.3.2 Kết quả phân tích vùng tƣơng đƣơng bằng Hệ thống S5 trùng khớp với Sanger ................................................................................................. 59 3.3.3 Thông qua hệ thống S5 phát hiện trình tự bị phân hủy ................... 64 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 67 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................ 67 4.2. KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 68 PHỤ LỤC ....................................................................................................... 75
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Bộ xƣơng ngƣời (nhìn từ phía trƣớc) ............................................... 3 Hình 1.2 Cấu trúc xƣơng ống .......................................................................... 4 Hình 1.3: Ba loại tế bào xƣơng ........................................................................ 5 Hình 1.4. Cấu trúc nucleotide (Encyclopaedia Britannica, 2015) .................. 13 Hình 1.5. Bản đồ hệ gen ty thể ngƣời ............................................................ 14 Hình 1.6. Vùng D-loop ADN ty thể ................................................................ 15 Hình 1.7. Kết quả đọc trình tự và so sánh trình tự thu đƣợc với rCRS .......... 18 Hình 1.8. Phân tử ddNTP huỳnh quang trong Sanger Sequencing................. 21 Hình 1.9. Công nghệ đọc trình tự bán dẫn Ion bằng Ion Torrent .................. 27 Hình 2.1. Sơ đồ mẫu đọc trên chip 1 và chip 2 ............................................... 29 Hình 2.2. Vị trí 14 cặp mồi dùng cho Pool 1 và Pool 2 .................................. 30 Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm ............................................................................. 33 Hình 2.4. Thiết bị Ion Chef ............................................................................. 40 Hình 2.5. Hệ thống Ion Chef (trái) và máy đọc trình tự Ion Torrent S5 (phải) .... 41 Hình 3.1: Đƣờng chuẩn nồng độ ADN đầu vào.............................................. 43 Hình 3.2: Đồ thị đƣờng cong realtime trong quá trình khuếch đại ADN A: Chip 1, B: Chip 2 ............................................................................................ 44 Hình 3.3. Biểu đồ kết quả định lƣợng nồng độ ADN đầu vào ở Chip 1 ........ 45 Hình 3.4 Biểu đồ kết quả định lƣợng nồng độ ADN đầu vào ở Chip 2 ........ 46 Hình 3.5. Biểu đồ đánh giá nồng độ ADN đầu vào ........................................ 47 Hình 3.6. Biểu đồ đánh giá nồng thƣ viện chip 1 và chip 2............................ 54 Hình 3.7. Báo cáo trích xuất dữ liệu từ máy Ion S5 của chip 1 ...................... 57 Hình 3.8. Báo cáo trích xuất dữ liệu từ máy Ion S5 của chip 2 ...................... 58 Hình 3.9. Phần mềm Converge Analysis của hãng Appliedbiosystems ......... 60 Hình 3.10 Ví dụ kết quả giải trình tự vùng CR ở S5 và HV1 của Sanger mẫu hài cốt B11-H10-12. (A: Kết quả giải trình tự S5; B: kết quả giải trình tự Sanger) ............................................................................................................ 61 Hình 3.11 Phần mềm Converge phát hiện các vùng/điểm bị phân hủy và chất lƣợng kém của mẫu hài cốt B11-H10-02 ........................................................ 65 Hình 3.12 Ví dụ về vị trí phát hiện các vùng/điểm bị phân hủy và chất lƣợng kém thông qua phần mềm phân tích Converge mẫu hài cốt B11-H10-02...... 66
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thống kê tỷ lệ đột biến ở hệ gen ty thể .......................................... 16 Bảng 1.2 T ng hợp một số công nghệ giải trình tự thế hệ mới ..................... 24 Bảng 2.1. Danh sách 14 cặp mồi dùng cho Pool 1 và Pool 2 ........................ 31 Bảng 2.2: Danh sách các loại Kit sử dụng trong chuẩn bị thƣ viện................ 32 Bảng 2.3: Nồng độ mẫu xây dựng đƣờng chuẩn: ........................................... 35 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng Realtime PCR ............................................. 35 Bảng 2.5: Qui trình chuẩn bị thƣ viện thủ công .............................................. 38 Bảng 2.6 Phƣơng pháp khuếch đại với các loại mẫu khác nhau ................... 38 Bảng 3.1: Thành phần PCR khuếch đại các đoạn geb để tạo thƣ viện ........... 49 Bảng 3.2: Nồng độ pha loãng thƣ viện ........................................................... 52 Bảng 3.5. Nồng độ ADN của 15 mẫu có nồng độ thấp sau làm giàu thƣ viện lần 2 ................................................................................................................. 55 Bảng 3.6. Bảng t ng hợp kết quả giải trình tự NGS của chip 1 và chip 2 ...... 59 Bảng 3.7: Tiêu chí đánh giá chất lƣợng giải trình tự ...................................... 62 Bảng 3.8: Phân loại đánh giá kết quả Sanger và S5........................................ 63 Bảng 3.9: Bảng t ng hợp các mẫu phát hiện có vùng bị phân hủy thông qua phƣơng pháp đọc trình tự Ion Torrent S5 ....................................................... 66
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay trên thế giới có hàng triệu ngƣời mất tích do chiến tranh, thiên tai, tai nạn máy bay… chƣa xác định đƣợc danh tính. Riêng ở Việt Nam, dù chiến tranh đã kết thúc hơn 40 năm, nhƣng hậu quả chiến tranh để lại vô cùng nặng nề. Theo số liệu của Cục Ngƣời có công, Bộ Lao Động, Thƣơng binh và Xã hội có 1,1 triệu liệt sĩ hy sinh có khoảng 500.000 hài cốt liệt sĩ chƣa đƣợc định danh, trong đó hơn 300.000 hài cốt đã đƣợc quy tập và an táng tại các nghĩa trang liệt sĩ và khoảng 200.000 hài cốt chƣa đƣợc quy tập về các nghĩa trang liệt sĩ mà nằm rải rác ở các tỉnh phía Nam, Lào và Campuchia [1][2]. Thông thƣờng, hệ gen nhân cho phép định danh chính xác đến từng cá thể thông qua các đoạn lặp từ 2-6 nucleotide STR (Short Tandem Repeat) trên các locus khác nhau của bộ nhiễm sắc thể. Tuy nhiên, đối với các mẫu hài cốt lâu năm, các phần mô, xƣơng bị phân hủy mạnh do ảnh hƣởng bởi các điều kiện môi trƣờng (nhiệt độ, UV, pH, các thành phần vô cơ và hệ vi sinh vật), dẫn đến toàn bộ ADN của hệ gen nhân gần nhƣ bị phân hủy hoàn toàn và không có khả năng phân tích. Chính vì vậy, hiện nay, việc giám định hài cốt liệt sĩ hoàn toàn dựa vào phân tích ADN ty thể (Mitochondiral DNA - mtADN), bởi cấu trúc dạng vòng giúp loại ADN này bền hơn dƣới tác động của môi trƣờng [3]. Việc xác định danh tính dựa trên việc so sánh các nucleotide ở vùng siêu biến (HV1, HV2 và HV3) thuộc hệ gen ty thể của hài cốt với thân nhân. Phƣơng pháp giải trình tự ADN ty thể dùng trong giám định đang đƣợc sử dụng ph biến ở Việt Nam hiện nay, cũng nhƣ ở một số phòng thí nghiệm trên thế giới đều dựa trên nguyên lý Sanger. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là dễ thực hiện, giá thành rẻ. Tuy nhiên, giải trình tự Sanger đọc đƣợc ít mẫu, độ lặp lại thấp, chất lƣợng tín hiệu không n định nên gây rất nhiều khó khăn cho việc phân tích các điểm Heteroplasmies và Poly-Cytosine. Hơn nữa, nồng độ ADN sử dụng cho phản ứng giải trình tự bằng phƣơng pháp Sanger tƣơng đối cao (~10 ng/µl) [4]. Do đó, nhằm nâng cao năng suất, độ chính xác cũng nhƣ tận dụng đƣợc các ƣu thế vƣợt trội của hệ thống đọc trình tự thế hệ mới (NGS) trong công
2 tác giám định hài cốt liệt sĩ ở Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài “Ứng dụng công nghệ giải trình tự thế mới Ion Torrent S5XLTM trong việc giám định hài cốt lâu năm” . Nghiên cứu này sử dụng bộ kit Precision ID mtADN Control Region Panel (Thermofisher) dựa trên hệ thống giải trình tự thế hệ mới (NGS) IonS5-XL. Thông qua việc sử dụng 14 cặp mồi với các biến thể khác nhau, đã tạo điều kiện thuận lợi cho đọc trình tự 1,2 kb cả 3 vùng HV1, HV2 và HV3. Không những vậy, phƣơng pháp vẫn cho kết quả tối đa từ các mẫu với nồng độ ADN đầu vào chỉ khoảng 2 pg. Với coverage ~ 200x, phƣơng pháp này có thể giải quyết khó khăn khi phân tích các điểm Heteroplasmies and Poly-Cytosine [5]. Đề tài đƣợc thực hiện tại Trung tâm Giám định ADN, Viện Công nghệ Sinh học với hai mục tiêu: 1. Xây dựng quy trình chạy và bước đầu áp dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới (NGS) để giám định ADN hài cốt lâu năm. 2. Phân tích được dữ liệu vùng siêu biến ADN ty thể của các mẫu nghiên cứu từ các kết quả thu được thông qua hệ thống giải trình tự thế hệ mới (NGS).
3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẶC ĐIỂM GIẢI PHẪU VÀ MÔ HỌC XƢƠNG 1.1.1 Thành phần và cấu trúc của bộ xƣơng Bộ xƣơng ngƣời trƣởng thành gồm 206 xƣơng (phần lớn là xƣơng đôi) đƣợc phân thành 3 nhóm chính [6]: Hình 1.1: Bộ xương người (nhìn từ phía trước) [7] + Xƣơng mình gồm có: - Cột sống: có 32 đốt sống, trong đó có 5 đốt sống cùng dính liền nhau tạo nên xƣơng cùng và 3 đốt sống cụt cũng dính liền nhau tạo nên xƣơng cụt (hình 1.1).
4 - Lồng ngực: Gồm có đoạn cột sống ngực, xƣơng ức và 12 đôi xƣơng sƣờn. + Xƣơng sọ mặt: Gồm 8 xƣơng sọ và 14 xƣơng mặt họp thành hộp sọ và khối xƣơng mặt. + Xƣơng chi trên và xƣơng chi dƣới: Chi trên dính vào thân bởi đai vai (gồm xƣơng đòn và xƣơng vai); Chi dƣới dính vào thân bởi đai chậu (gồm 2 xƣơng chậu dính thẳng vào xƣơng cùng của cột sống). Mỗi chi có 3 đoạn: cánh tay hoặc đùi, cẳng tay hoặc cẳng chân, bàn tay hoặc bàn chân (gồm có c tay hoặc c chân, bàn tay hoặc bàn chân, ngón tay hoặc ngón chân) [6]. Cấu trúc xƣơng đƣợc tạo thành từ hai loại mô xƣơng: xƣơng vò và xƣơng ống Hình 1.2 Cấu trúc xương ống [8] Xƣơng là loại mô liên kết đặc biệt đã bị canxi hóa và có cấu trúc dạng lá. Cấu tạo xƣơng gồm tế bào, chất căn bản và sợi liên kết (chất căn bản và sợi liên kết gọi chung là chất nền ngoại bào xƣơng hay chất nền xƣơng hay chất căn bản xƣơng), chiếm tỷ lệ lớn. Lá xƣơng là đơn vị cấu tạo của mô xƣơng, cấu tạo gồm tế bào xƣơng và chất nền xƣơng [9].
5 Xƣơng có chức năng chống đỡ và vận động, ngoài ra còn bảo vệ, hỗ trợ quá trình tạo huyết và chuyển hóa phospho-calci. Mô xƣơng là thành phần quan trọng nhất trong cấu tạo của bộ xƣơng. Về mặt đại thể xƣơng gồm 2 dạng (loại) cấu tạo: - Xƣơng dẹt và đầu của xƣơng dài: gồm có một lớp bên ngoài vững chắc (vỏ xƣơng) bao quanh một mạng lƣới chịu lực hình thành từ lá xƣơng tạo thành một hệ thống vách mỏng không đều đƣợc gọi là bè xƣơng, xếp theo nhiều hƣớng khác nhau và có thể nối với nhau gọi là mô xốp. Giữa các bè có những hốc chứa tủy xƣơng. - Xƣơng dài: Phần thân xƣơng có các lá xƣơng xếp đồng tâm tạo thành những cấu trúc đặc biệt đƣợc gọi là hệ thống Havers. Mỗi hệ thống có dạng hình trụ, gồm những lá xƣơng xếp vòng, ở chính giữa khối trụ đó là ống Havers chứa mạch máu, mô liên kết. Ở mức độ hiển vi, xƣơng cấu tạo từ vật liệu cứng, đồng nhất, bên trong hoặc xen lẫn giữa chúng là ba loại tế bào đặc trƣng bao gồm: tạo cốt bào, cốt bào và hủy cốt bào. Những tế bào này phân bố đều khắp các bề mặt của xƣơng, tùy thuộc vào trạng thái sinh lý của mô xƣơng (đang trong quá trình hình thành bè xƣơng, khoáng hóa chất nền xƣơng hay sửa chữa). Hình 1.3: Ba loại tế bào xương [6] Tạo cốt bào (osteoblast – nguyên bào xƣơng) là những tế bào đơn nhân chƣa trƣởng thành chịu trách nhiệm cho sự hình thành xƣơng, về sau tự nằm trong xƣơng khi đã tạo ra chất nền xung quanh nó và trở thành cốt bào. Nằm
6 trên bề mặt của giá đỡ tạo xƣơng, chúng tiết osteoid (một loại hỗn hợp các protein) mà sau này bị canxi hóa bằng cách liên kết với hydroxyt apatite (HA - một chất carbon chƣa cân bằng hóa học) để hình thành các bè xƣơng. Tạo cốt bào cũng sản xuất enzyme tham gia vào quá trình canxi hóa, nhƣ prostaglandin (ức chế hoạt động của hủy cốt bào) hoặc alkaline phosphate (tăng khả năng di động của hủy cốt bào làm tăng hủy xƣơng). Nguồn gốc của chúng là từ một loại tế bào trung mô chƣa biệt hóa gọi là tế bào sinh xƣơng [10]. Cốt bào (Osteocyte) là những tế bào xƣơng trƣởng thành hình ngôi sao nằm trong một hốc nhỏ của chất gian bào gọi là xƣơng (lacunae). Chúng có nguồn gốc từ các tạo cốt bào. Hủy cốt bào (osteoclasts) là những tế bào đa nhân lớn, có thể từ 3 đến vài chục nhân, nằm trên vách xƣơng trong một cấu trúc gọi là Howship (hay hố tái hấp thu), trong bào tƣơng có nhiều ti thể, các bào quan khác kém phát triển. Chúng là tế bào tiêu hủy xƣơng và hủy sụn nhiễm can xi với cƣờng độ cao, đóng vai trò quyết định trong việc tu sửa xƣơng. Các hủy cốt bào có nguồn gốc từ một dòng tế bào đơn nhân (mono bào) đặc biệt trong tủy xƣơng. Thành phần hóa học của xƣơng chứa 70% là chất vô cơ (gồm thành phần vô định hình là muối phốtphát canci [Ca9(PO4)6], và thành phần tinh thể dạng hình que hoặc hình ống là hydroxytapatít - HA) và 30% chất hữu cơ (osteroid) bao gồm chủ yếu collagen loại I, các protein không collagen và các glycoprotein nhƣ: glycosaminoglycan, osteocalcin, osteonectin, ostepontin, sialoprotein xƣơng và các bào quan khác). Xƣơng cứng chắc là do chất nền xƣơng chứa collagen đã bị calci hóa và glycosaminoglycan [11]. Calci hóa collagen ban đầu diễn ra tại các vùng GZ, các tinh thể HA dạng tiểu cầu điền vào các vùng trống và mở rộng dọc theo các kênh trong những sợi giữa các phân tử tropocollagen liền kề. Trong giai đoạn cuối của calci hóa, tinh thể HA phát triển và lấp đầy khoảng giữa các sợi, các ion khoáng thay thế dần các phân tử nƣớc liên kết trên các sợi. Do đó phần lớn các chất khoáng sẽ nằm trong không gian này. Mô xƣơng hoàn toàn trƣởng thành chứa khoảng 46% collagen, 46% HA (hydroxytapatít) và 8% nƣớc [12].
7 1.1.2. Phân bố ADN trong xƣơng Thời gian tồn tại của mô xƣơng sau khi cơ thể chết phụ thuộc điều kiện môi trƣờng nhƣ chôn trong đất, phơi trực tiếp trong không khí hay ngâm trong nƣớc (mặn hoặc ngọt)... Dƣới tác động của các tác nhân, quá trình phân hủy xƣơng diễn ra theo một cơ chế xác định, ví dụ nhƣ trong đất thì xƣơng phân hủy do nấm, vi khuẩn trong đất xâm nhập vào các khe hở màng xƣơng và bắt đầu phân hủy ma trận khoáng, chất nền xƣơng sau một vài năm, trong môi trƣờng nƣớc thì vi khuẩn lam có vai trò quyết định, chúng đẩy nhanh sự phân hủy bằng cách tăng độ xốp của xƣơng. Mặc dù cơ chế phân hủy của mô xƣơng đã đƣợc nghiên cứu rõ ràng nhƣng sự thoái hóa của ADN trong xƣơng theo thời gian, đặc biệt là nguồn gốc và vị trí ADN nằm trong xƣơng lại chƣa đƣợc làm rõ. Hiện nay còn tồn tại nhiều giả thuyết khác nhau, đôi khi trái ngƣợc nhau. Tuy nhiên, hầu hết các giả thuyết đều thống nhất rằng ADN trong mô xƣơng mới phần lớn có nguồn gốc từ các tế bào xƣơng, còn với các xƣơng lâu năm ADN có nguồn gốc từ ma trận khoáng. Sự tồn tại ADN lâu dài trong xƣơng là nhờ vào ma trận khoáng và quá trình calci hóa đóng vai trò quan trọng trong việc “lƣu trữ, bảo quản” ADN. Đây cũng là cơ sở khoa học của bƣớc decalci (khử khoáng) đƣợc áp dụng trong hầu hết các phƣơng pháp tách chiết ADN từ xƣơng [13]. Các tác giả Lindahl, 1993 và Okazaki, 2001 cho rằng ADN đƣợc hấp thụ trên các HA (hydroxyapatite) trong quá trình hình thành tinh thể của ma trận khoáng xƣơng [14]. Các tác giả này giả thuyết trong xƣơng tồn tại loại tinh thể bioapatite tạo thành từ sự hấp thụ của ADN trên bề mặt HA. Chính nhờ sự tƣơng tác này mà cấu trúc của ADN có thể đƣợc bảo tồn trong thời gian dài. Ở cơ thể sống, sự hình thành bioapatite diễn ra trong quá trình calci hóa tạo xƣơng hoặc quá trình tiêu sụn tái cấu trúc của xƣơng. Một cơ chế tạo bioapatite khác ở xƣơng sau khi cơ thể bị chết là các thành phần tế bào của mô xƣơng sau khi phân hủy sẽ giải phóng các đoạn ADN có độ dài khác nhau vào các khe hở cực nhỏ của xƣơng, ở đó chúng đƣợc trộn lẫn trong dung dịch bão hòa các ion calci và phosphate, và sau đó đƣợc hấp thụ hoặc bị gói gọn trong quá trình kết tinh HA. Hỗ trợ thêm cho giả thuyết này là bằng chứng các
8 trình tự ADN tìm thấy trong xƣơng c hoặc xƣơng lâu năm thƣờng có kích thƣớc 60-150 bp xấp xỉ 25-54 nm tƣơng đƣơng với kích thƣớc điển hình của tinh thể HA đƣợc tìm thấy trong xƣơng là: dày 2-5 nm; rộng 5-24 nm; dài 15- 55 nm [15]. Các thực nghiệm invitro của Kitamura năm 2011 và mô hình lý thuyết của Mrevlishvili và Svintradze năm 2005 lại đặt giả thuyết rằng ADN nhân từ các tế bào xƣơng liên kết chủ yếu với các phân tử collagen, ngoài ra ADN nhân còn hoạt động nhƣ một “giàn giáo” trong việc tập hợp các phân tử collagen thành sợi. Lực tƣơng tác giữa collagen và ADN chủ yếu đƣợc hình thành bằng các liên kết hydro, mối liên kết này rất chặt chẽ [16][17]. Orgel và cộng sự năm 2005 cho rằng các mảnh ngắn ADN nhân, ADN ty thể sẽ mắc kẹt lại trong quá trình t ng hợp sợi và calci hóa collagen, chủ yếu liên kết phân tử tropocollagen, một phần khác hấp phụ lên bề mặt HA và sau đó sẽ „đóng gói‟ trong tinh thể của ma trận xƣơng [18]. Điều này hoàn toàn có thể xảy ra vì trong quá trình calci hóa tạo xƣơng hoặc quá trình tiêu sụn, một lƣợng lớn ADN ty thể, ADN nhân đƣợc giải phóng vào chất nền xƣơng sau khi hủy cốt bào hoặc tạo cốt bào bị chết (apoptosis). Những sợi hay đoạn ADN này sau đó có thể liên kết trực tiếp với bề mặt các sợi collagen hoặc hấp phụ lên bề mặt của tinh thể HA (HydroxytApatit) đang trong quá trình hình thành. Áp dụng các phƣơng pháp phân tích hiện đại, năm 2012 nhóm nghiên cứu của Paula F.Campos và cộng sự đã đƣa ra giả thuyết về 4 vị trí ADN có thể tồn tại trong xƣơng c , dựa vào sự liên kết của ADN với HA và collagen [19][20]: a) ADN liên kết với các sợi collagen và sau đó phủ bởi HA hình thành các sợi calci hóa. b) ADN bị ràng buộc chặt chẽ và đóng gói trong quá trình phát triển của tinh thể HA ở khu vực bên trong các sợi collagen trong quá trình calci hóa. c) ADN hấp phụ lên các sợi collagen tự do hình thành trong quá trình
9 mất nƣớc của xƣơng khi calci hóa (thay thế phân tử nƣớc bằng các sợi khoáng) dƣới sự tác động của hóa chất hoặc tấn công của vi sinh vật khi xƣơng thoái hóa. d) ADN liên kết hoặc bọc trong tinh thể HA khi xƣơng tái kết tinh hoặc tiêu hủy. Cơ chế (a) và (b) diễn ra trong cơ thể còn (c) và (d) diễn ra sau khi chết. Mô hình lý thuyết này đƣợc ủng hộ nhiều hơn cả, đặc biệt khi kết quả của các phƣơng pháp tách chiết ADN từ xƣơng sử dụng cả bƣớc khử khoáng hoàn toàn lẫn phân giải protein bằng proteinase K cho kết quả khả quan nhất. 1.1.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến cấu trúc và sự tồn tại của ADN hài cốt ADN trong các mẫu hài cốt cũng có thể bị biến đ i do tác động của các yếu tố môi trƣờng không thuận lợi nhƣ tia UV, nhiệt độ, độ ẩm cao. Cấu trúc phân tử ADN cũng bị ảnh hƣởng tiêu cực từ các quá trình oxy hóa, thủy phân. Các yếu tố môi trƣờng (nhƣ acid humic từ đất, ADN vi khuẩn…) khi tách chiết mà không loại bỏ đƣợc sẽ ảnh hƣởng xấu đến quá trình PCR do đó làm giảm sự thành công của phân tích ADN. Mức độ phân huỷ sinh học phụ thuộc chủ yếu vào hai yếu tố: thời gian và điều kiện môi trƣờng [21]. Hài cốt thƣờng tiếp xúc với điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt, ảnh hƣởng rất nhiều đến mức độ bảo quản mẫu. Sau khi tế bào chết, ADN bắt đầu phân mảnh. Tiến trình này tích lũy theo thời gian, các điều kiện môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, độ ẩm và độ pH khác nhau sẽ làm thay đ i tốc độ và mức độ của sự phân mảnh. Tác động khác từ bên ngoài nhƣ: nhiệt độ cao, (đôi khi là cháy), ngâm trong nƣớc, chôn trong đất và vi sinh vật phát triển là những yếu tố làm gia tăng sự phân hủy của hài cốt và sự đứt gãy của chuỗi ADN [22][23]. Sự gia tăng nhiệt độ và độ ẩm dẫn đến một sự tăng trƣởng về số lƣợng vi sinh vật và tăng cƣờng hoạt động của enzym ADNse. Suy thoái ADN bởi sự kết hợp của các yếu tố môi trƣờng chứ không phải bất kỳ sự tác động đơn lẻ của từng yếu tố [24]. Cơ chế biến đ i cấu trúc và t n thƣơng phân tử ADN là do cơ chế nội sinh của tế bào và do các yếu tố ngoại cảnh tác động [25]. Nhƣng dù là cơ chế nào, sự phá hủy cấu trúc ADN cũng ảnh hƣởng lớn đến quá trình nhân bội
10 ADN (PCR), do đó làm giảm khả năng thành công của phân tích dữ liệu ADN cá thể, có khi sự biến đ i này làm cho xét nghiệm không thể thực hiện đƣợc hoặc đạt kết quả không nhƣ mong muốn [22]. Các dạng t n thƣơng ADN gồm có: quá trình oxy hóa, thủy phân, nhị trùng hợp pyrimidin, khử amin cytosine và liên kết chéo tại các mối liên kết ADN - ADN và ADN - Protein. Trong số những cơ chế đó thì quá trình oxy hóa, thủy phân là ph biến nhất trong các mẫu hài cốt đƣợc chôn trong môi trƣờng đất [26]. Phản ứng oxy hóa dở dang bởi các gốc tự do sẽ dẫn đến các t n thƣơng ADN. Các vị trí chính bị tấn công trong phản ứng oxy hóa trên ADN là các liên kết đôi carbon-carbon của pyrimidine và vòng imidazole purin, cả hai đều dẫn đến sự đứt gãy. Các tác động gây các biến đ i của phân tử đƣờng, chuyển đ i của cytosine và thymine, loại bỏ các base và tạo liên kết chéo. Các loại phản ứng oxy hóa nhƣ superoxide và hydrogen peroxide đƣợc tạo ra bởi bức xạ ion hóa hoặc chuyển hóa sinh học các vi khuẩn kỵ khí xâm nhập mô tử thi. Các base bị oxy hóa sẽ ngăn cản quá trình bắt cặp mồi hoặc quá trình t ng hợp sợi của Taq Polymerase khiến PCR thất bại [15]. Phản ứng thủy phân tác động đến liên kết dễ bị t n thƣơng nhất của ADN là liên kết N-glycosyl [27]. Kết quả thủy phân liên kết này sẽ làm mất một base để lại một vị trí Apurinic/Apyrimidinic (AP) mà cuối cùng sẽ tạo thành điểm đứt trên một sợi của phân tử ADN sợi đôi. Các điểm này sẽ khiến quá trình kéo dài sợi trong PCR bị dừng một phần, nếu những t n thƣơng này xảy ra liên tiếp trên cả hai sợi trong khoảng cách từ 10-20 cặp base thì quá trình PCR chắc chắn sẽ bị dừng hoàn toàn. Bởi vì đây là phản ứng thủy phân, các mẫu hài cốt trong điều kiện môi trƣờng ẩm ƣớt sẽ tích lũy nhiều vị trí AP. Thủy phân và oxy hóa đƣợc gia tăng bởi nhiệt độ và độ ẩm. Điều kiện nhƣ vậy thƣờng gặp phải trong trƣờng hợp thiên tai, lũ lụt, sóng thần và các khu vực chôn lấp ngập úng ở vùng khí hậu nhiệt đới. Tác động của enzyme của vi khuẩn: Vi sinh vật và hệ động vật, thực vật (bao gồm nấm, nấm mốc và tảo) là chất gây nhiễm ph biến của hài cốt ở hiện trƣờng vụ án, thảm họa hàng loạt và các xƣơng chôn trong đất [28]. Số
11 lƣợng vi sinh vật gia tăng sẽ là một nguyên nhân đáng kể gây t n thƣơng ADN và cạnh tranh ADN đích dẫn đến việc không thể giám định ADN của các mẫu hài cốt. Vi sinh vật tiết ra các enzym tiêu hóa đẩy nhanh quá trình oxy hóa và phá vỡ sợi kép ADN của ngƣời. Các sản phẩm trao đ i chất của vi sinh vật đã làm tăng tỷ lệ đứt gãy sợi ADN đôi lên tới 25 lần. Nhiệt độ và độ ẩm thúc đẩy sự tăng trƣởng của vi sinh vật là những yếu tố môi trƣờng đóng vai trò quan trọng cần lƣu ý trong thu, bảo quản mẫu nhằm ngăn ngừa sự gia tăng phân hủy của mẫu và cụ thể là sự phân hủy của ADN. Cơ chế gây ra sự suy thoái ADN có thể khác nhau nhƣng kết quả cuối cùng vẫn là chuỗi ADN xoắn kép bị phân cắt thành trình tự ngắn. Điều này làm cho nhân bội ADN khó khăn và thƣờng trình tự chỉ đƣợc một phần hoặc bị mất hoàn toàn. Khi chiều dài đoạn ADN trung bình giảm xuống dƣới 300 bp [29], một lƣợng thông tin ADN đáng kể bị mất do không có trình tự đích để nhân bội. Mặc dù ADN có thể phải chịu nhiều dạng t n thƣơng nhƣng phân cắt do phá vỡ sợi đơn và đôi đƣợc cho là vấn đề chính của các mẫu xƣơng lâu năm. Tế bào chết ở hai dạng: chết theo chƣơng trình (apoptosis) hoặc hoại tử. Apoptosis là quá trình chết tế bào đƣợc lập trình sẵn, đặc trƣng bởi sự mất màng plasma, ngƣng tụ tế bào chất và phân tán rộng rãi của ADN thành các oligomer khoảng 180bp thông qua kích hoạt các endonuclease nội sinh. Hoại tử là do ngừng sự trao đ i chất thụ động, mất nguồn dinh dƣỡng và ô xy dẫn đến gia tăng khối lƣợng của tế bào, bào quan trƣơng lên, nhiễm sắc ngƣng tụ, tiếp theo là sự vỡ màng tế bào và bào quan, đồng thời các enzyme lysosome giải phóng gây ra sự đứt gẫy ADN một cách ngẫu nhiên. Dù cơ chế chết tế bào là nhƣ thế nào thì ADN đều bị chia thành các mảnh nhỏ do enzym nội sinh gây ra làm cho mẫu phân hủy mạnh và rất khó để tiến hành các phân tích. 1.1.4. Cơ sở khoa học của phân tích ADN trong giám định nhận dạng cá thể Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ nói chung thì công nghệ sinh học ngày càng có những bƣớc phát triển. Đặc biệt, sự kiện toàn bộ hệ gen của con nguời đuợc giải trình tự và công bố vào tháng 2 năm 2001 đã tạo ra một cột mốc vô cùng quan trọng trong sinh học. Kết quả quan trọng nhất đó là