Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Tuyển chọn và khảo sát khả năng sinh Amylase của một số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:127

Thêm vào BST

Báo xấu

93
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Tuyển chọn và khảo sát khả năng sinh Amylase của một số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh được thực hiện nhằm phân lập các chủng NS thu nhận được từ RNM Cần Giờ; tuyển chọn một số chủng NS có khả năng sinh Amylase cao; nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại đến loài các NS đã tuyển chọn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Tuyển chọn và khảo sát khả năng sinh Amylase của một số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SỰ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ------------------------ Nguyễn Thị Lan Hương TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH AMYLASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ TP. HỒ CHÍ MINH CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT Mã số: 604240 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS.TRẦN THANH THỦY Tp.Hồ Chí Minh - 2009
Trang 1 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thanh Thủy đã dìu dắt giúp đỡ tôi từ khi thực hiện luận văn tốt nghiệp đến khi thực hiện luận văn thạc sĩ sinh học. Cô luôn có mặt bên cạnh, giúp đỡ những khi em gặp khó khăn trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin ghi nhớ công ơn PGS.TS. Lương Đức Phẩm đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi cũng gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, trường Đại học Sư phạm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành công viêc nghiên cứu thực hiện luận văn này. Xin chân thành cảm ơn các bạn học viên Cao học khóa 17 và 18 ngành Vi sinh vật học, trường Đại học Sư phạm TpHCM đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. TpHCM, tháng 8 năm 2009. NGUYỄN THỊ LAN HƯƠNG
Trang 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những số liệu trong luận văn này là trung thực thể hiện qua kết quả thí nghiệm và chưa ai công bố. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Lan Hương
MỞ ĐẦU RNM Cần giờ là một quần thể TV đa dạng sinh học. Chiến tranh, bom đạn và các loại chất độc hóa học đã hủy hoại gần như hoàn toàn khu rừng này. Từ năm 1978 đến nay, Thành ủy và UBND Tp.HCM đã phục hồi thành công HST RNM đa dạng độc đáo này. Đồng thời, cũng từ đó tạo nên một địa điểm lý tưởng phục vụ cho nghiên cứu khoa học và du lịch sinh thái. Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là nơi lưu giữ nhiều nguồn gen SV quý hiếm, bền vững và có khả năng chịu đựng được điều kiện khắc nghiệt của MT sống. Trong đó, ĐV và TV đã được nghiên cứu và thống kê rất chi tiết. Riêng hệ VSV phong phú của RNM Cần Giờ vẫn còn nhiều bí ẩn và chưa được khai thác đúng mức. Trong số các VSV tại đây thì NS chiếm số lượng rất lớn, giữ vai trò quan trọng trong tuần hoàn vật chất và năng lượng nhờ có hệ enzym phong phú như cellulase, protease, amylase,… Nổi bật nhất cũng như được ứng dụng nhiều nhất trong hệ enzym thủy phân của NS là amylase. Loại enzym phân giải tinh bột này mang lại vị ngọt cho thiên nhiên và con người đã được nghiên cứu từ rất lâu, đến nay các nhà khoa học đã biết khá rõ về nó. Hiện nay amylase là một trong những hệ enzym quan trọng nhất của ngành công nghệ sinh học vì chúng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, công nghiệp lên men, công nghiệp dệt,..Tiếp tực tìm hiểu, khám phá những bí ẩn về cấu trúc và đặc tính của amylase để nâng cao hiệu suất xúc tác của chúng là đề tài hấp dẫn đối với nhiều nhà nghiên cứu. Tuy vậy, nước ta chưa lưu ý nhiều đến lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm amylase từ VSV cũng như NS. Việc sản xuất amylase từ NS có rất nhiều ưu việt như rút ngắn quá trình sản xuất, tận dụng được các nguồn nguyên liệu, phế phẩm nông nghiệp góp phần giảm ô nhiễm MT, enzym có hoạt tính cao và giảm giá thành sản phẩm.... so với các enzym có nguồn gốc từ TV và ĐV. Đặc biệt nếu thu được các chủng NS có khả năng sinh amylase cao và sinh trưởng trong những điều kiện khắc nghiệt như RNM Cần Giờ sẽ rất có ích vì bổ sung thêm được những
chủng NS có đặc tính quý, đầy tiềm năng và ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi. Mặc dù vậy, việc nghiên cứu NS sinh amylase từ RNM hiện vẫn chưa được khai thác đúng mức. Trước thực tế này, nhằm đa dạng hóa nguồn thu nhận amylase từ NS, cũng như mong muốn thu nhận được nguồn amylase mang đặc tính quý, chúng tôi tiến hành đề tài “Tuyển chọn và khảo sát khả năng sinh amylase của một số chủng NS từ RNM Cần Giờ Tp.HCM”. Mục đích của đề tài. Tuyển chọn được các chủng NS sinh amylase cao từ RNM Cần Giờ. Nhiệm vụ của đề tài. - Phân lập các chủng NS thu nhận được từ RNM Cần Giờ. - Tuyển chọn một số chủng NS có khả năng sinh amylase cao. - Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại đến loài các NS đã tuyển chọn. - Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, tổng hợp amylase của các chủng NS đã chọn. - Nghiên cứu một số tính chất của enzym thu được. - Khảo sát các đặc tính sinh học khác. - Thu nhận amylase bán tinh khiết và so sánh với enzym thương mại trên thị trường. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Các chủng NS phân lập từ 5 xã: Long Hòa, Lý Nhơn, An Thới Đông, Tam Thôn Hiệp và Bình Khánh ở RNM Cần Giờ, Tp.HCM. - Đề tài được tiến hành nghiên cứu tại PTN Vi sinh – Sinh hóa, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Tp.HCM trong thời gian từ tháng 9 năm 2008 đến tháng 5 năm 2009.
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vài nét khái quát về RNM Cần Giờ . RNM (Mangrove) là thuật ngữ dùng để chỉ các loài TV hoặc một khu rừng có nhiều loài sống ở vùng giao thoa giữa đất liền và biển. Chúng có thể mọc tốt ở những vùng khí hậu nóng ẩm [4]. Theo GS. Phan Nguyên Hồng (1995), diện tích RNM trên thế giới khoảng 16.670.000 ha, và khu vực Châu Á chiếm diện tích lớn nhất trong đó. Theo số liệu Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cho thấy, năm 1943 diện tích RNM Việt Nam trên 400.000 ha, đến năm 1996 giảm còn 290.000 ha và 279.000 vào năm 2006. Với diện tích này thì RNM Việt Nam cũng chiếm một phần khá lớn trong khu vực. RNM nguyên sinh tự nhiên hiện nay hầu như không còn. Đa số RNM hiện nay là rừng trồng (62%) còn lại là rừng thứ sinh nghèo hoặc rừng mới tái sinh trên bãi bồi. HST RNM phân bố dọc bờ biển Việt Nam thuộc 28 tỉnh và thành phố, tập trung chủ yếu ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, bán đảo Cà Mau và hai tỉnh phía Bắc là Nam Định và Thái Bình. Các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long có diện tích RNM chưa đến 100.000 ha. Riêng RNM Cần Giờ hay rừng Sác, sau những nỗ lực khôi phục thành công, hiện nay có diện tích rừng và đất rừng là 38.664 ha [74]. Với diện tích đạt được như trên, cùng với độ đa dạng sinh học bậc nhất trong các RNM ở Đông - Nam Á , RNM Cần Giờ đã được Tổ chức Văn hóa, Khoa học và Giáo dục LHQ (UNESCO) công nhận là Khu dự trữ sinh quyển của thế giới từ tháng 1-2000. Đây cũng là Khu dự trữ sinh quyển RNM đầu tiên của nước ta và cũng được xem lá “lá phổi” rất quan trọng của Tp.HCM [69]. Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sông Đồng Nai – Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam Tp.HCM: Về tọa độ địa lý: vĩ độ Bắc 10o22’ – 100o40’09”, kinh độ Đông 106046’ – 107°00’59”. Về ranh giới, phía Bắc Cần Giờ giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển Đông, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An, phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Chiều dài khu vực từ Bắc xuống Nam là 35km, từ Đông sang Tây là
30km. Tổng diện tích Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là 75.740 ha, trong đó: vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha, và vùng chuyển tiếp 29.880 ha [5]. RNM Cần Giờ phát triển trên nền một đầm mặn mới, do phù sa sông mang đến và lắng đọng tạo thành nền đất. Đất được tạo ra bởi tổng hợp các quá trình lắng tụ trầm tích đất sét, phèn hóa và nhiễm mặn. Cho đến nay các lớp đất sâu chưa kết chặt nên không có khả năng tạo thành đất nền rắn chắc, có hàm lượng lưu huỳnh dạng khử khá cao và một lượng muối cao không có lợi cho nông nghiệp [21]. Khí hậu nóng ẩm và chịu chi phối của quy luật gió mùa cận xích đạo với mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khô từ tháng 1 đến tháng 4. Lượng mưa trung bình từ 1300 đến 1400mm hàng năm. Độ ẩm cao hơn các nơi khác trong khu vực Tp.HCM: mùa mưa là 79 – 83%, mùa khô là 74 – 77%. Nhiệt độ trung bình là 25,8oC, biên độ dao động nhiệt trong ngày từ 5 đến 7oC. Chế độ bán nhật triều không đều. Độ mặn dao động 1,8 – 3% [5]. RNM Cần Giờ có trên 150 loài TV, các loài chủ yếu như bần trắng, mấm trắng, các quần hợp đước đôi - bần trắng cùng xu ổi, trang, đưng v.v… và các loại nước lợ như bần chua, các quần hợp mái dầm – ô rô, dừa lá, ráng, v.v… Thảm cỏ biển với các loài ưu thế Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia sp.; đất canh tác nông nghiệp được trồng lúa, khoai mỡ, các loại đậu, dừa v.v…; các vườn cây ăn trái. Thảm TV này là MT sống cho nhiều loài ĐV, theo thống kê năm 1999 như: trên 700 loài ĐV thuỷ sinh không xương sống, 9 loài lưõng thê, 31 loài bò sát, trên 137 loài cá, khoảng 130 loài chim và nhiều ĐV có xương sống có trong sách đỏ Việt Nam. Ngoài ra còn có 63 loài phiêu SV, 130 loài tảo [4]. Tuy chưa có nhiều số liệu thống kê về hệ NS RNM Cần Giờ, nhưng chúng ta có thể thấy các loài TV và ĐV trên chính là nguồn thức ăn tốt nhất cung cấp cho hệ NS RNM Cần Giờ. NS chính là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là tác nhân phân giải các chất hữu cơ, cung cấp thức ăn cho các SV khác trong HST, là một nhân tố không thể thiếu tham gia khép kín chu trình sinh địa hóa của RNM Cần Giờ. HST này nằm ở lưu vực ven bờ có nhiều thành phần C phức tạp do thủy triều
đưa vào. NS có khả năng sinh các loại amylase, protease, cellulase, chitinase,...phân hủy các chất hữu cơ đó để sử dụng và đồng thời góp phần làm giảm ô nhiễm MT ở RNM Cần Giờ. Đặc biệt nơi đây có nguồn tinh bột sẵn có trong lá cây, thân cây (nhất là lá mục và thân mục) sẽ là nguyên liệu cho amylase phân giải tạo glucose cho hoạt động sống của chúng. Hình 1.1. Bản đồ tổng quan về RNM Cần Giờ và vị trí 5 xã thu mẫu [65] Ký hiệu : vị trí thu mẫu. Do những đặc điểm trên, RNM Cần Giờ có vai trò là “lá phổi xanh” làm giảm ô nhiễm MT, giảm sự nóng lên của Trái đất và ngăn ngừa tình trạng dâng lên của nước biển. RNM Cần Giờ còn là “chiếc lọc sinh học” trong xử lý chất thải, xử lý chất dinh dưỡng từ đất liền và giữ vai trò vùng đệm chống lại các dòng chảy ô nhiễm đồng thời lọc thức ăn cho các ĐV biển; giúp bảo vệ các loài ĐV trên đất liền khi nước triều lên cao và sóng lớn; bảo vệ bờ biển và cửa sông tránh tình trạng tác hại và xói lở của bão, sóng đối với hệ thống đê biển, giảm chi phí tu bổ đê điều hàng năm; là nơi có lợi nhuận kinh tế cao, cung cấp nguồn hải sản phong phú để sử dụng trong nước và xuất khẩu cũng như các nguồn lợi khác từ rừng,....RNM chính
là HST có năng suất sinh học cao nhất trong các HST, nơi hội tụ sự đa dạng của cả SV biển và đất liền. Vì thế, nó còn là PTN sống để nghiên cứu về khả năng chịu đựng và phục hồi của các tổ hợp gen, khả năng phát tán và định cư của các dạng sống [74]. 1.2. Sơ lược về NS. 1.2.1. Hình thái và cấu trúc NS. NS là VSV có nhân chuẩn, dị dưỡng. Sợi nấm có thể có vách ngăn như các lớp nấm bậc cao như Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes hay không có vách ngăn như các nấm bậc thấp Oomycetes và Zygomycetes. Các sợi nấm vừa phát triển theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn và phân nhánh tạo hệ sợi nấm còn gọi là khuẩn ty. Hệ sợi nấm phát triển thành các dạng KL khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm. KL NS phát triển từ một bào tử có dạng tròn hay gần tròn. Bề mặt KL có thể mượt, nhung mịn, nhẵn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, có vết khía xuyên tâm, có rãnh hay lồi lõm không đều; mép KL có thể trơn hay răng cưa tùy vào từng loại nấm khác nhau [11, 13, 61, 78]. Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số sợi nấm mang sắc tố tạo nên màu tối hay màu sặc sỡ. Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài MT và làm đổi màu khu vực có nấm phát triển. Một số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo nên các tinh thể trên bề mặt KL. Vì bào tử của nấm thường cũng có màu nên cả KL thường có màu. Hình thái, kích thước màu sắc, bề mặt của KL…có ý nghĩa nhất định trong việc định tên nấm [3, 61]. NS sinh sản chủ yếu bằng bào tử. Bào tử của NS có thể hình thành theo kiểu vô tính hay hữu tính. Bào tử vô tính gồm các dạng bào tử trần hay bào tử kín, trong đó bào tử trần là phổ biến nhất. Trong sinh sản hữu tính, NS có các hình thức đẳng giao, dị giao và tiếp hợp [11]. NS ngày càng được quan tâm nghiên cứu ngày càng sâu rộng hơn do chúng có khả năng sinh nhiều các chất có hoạt tính sinh học cao được ứng dụng rộng rãi đem lại nhiều nguồn lợi kinh tế cao như tạo ra các loại enzym, các chất KS, các axit
hữu cơ, các chất có khả năng phân giải các nguồn cacbuahydro (ứng dụng trong xử lý ô nhiễm MT do tràn dầu),... Hình 1.2. Sự phát triển của sợi nấm [61] Hình 1.3. KL của chủng Penicillium [64] Hình 1.4. Một số dạng bào tử của NS [68, 70, 79]  Khả năng sinh các enzym ngoại bào. Enzym được sản xuất từ VSV ngày càng nhiều. VSV là nhóm đối tượng duy nhất được sử dụng như nguồn sản xuất enzym theo quy mô công nghiệp. So với ĐV và TV, việc thu nhận enzym từ VSV nói chung và NS nói riêng có rất nhiều ưu điểm như: tốc độ sinh sản nhanh, enzym thu được có hoạt tính rất cao, quá trình sinh trưởng phát triển và tổng hợp enzym của VSV hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài, nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzym theo quy mô công nghiệp rẻ tiền và dễ kiếm (đây là lợi thế rất quan trọng) và VSV có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzym khác nhau. Ngày nay, nhiều loại enzym ngoại bào của NS đã được nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng phổ biến như: amylase, protease, cellulase, pectinase, chitinase,....[9, 25].
 Khả năng sinh các chất KS. KS là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện tượng một VSV với sản phẩm trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác. KS được tạo ra từ VSV đang rất được quan tâm và ngày càng phát triển mạnh mẽ trong thời đại hiện nay. Các chất KS có nguồn gốc từ NS chiếm tỉ lệ khá lớn, đa số thuộc lớp Nấm bất toàn. Các chất KS được sử dụng chủ yếu trong y tế hiện nay như Penicillin, Cephaco-sporin-C,...[11].  Khả năng sinh các axit hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng [19,73]. Ngày nay, nhu cầu sử dụng các axit hữu cơ ngày càng nhiều trong thực phẩm, công nghiệp. Một số axit hữu cơ phổ biến được sản xuất từ NS như: axít xitric từ Asp.niger; axít gluconic thu nhận từ Asp.niger và Asp. foetidus; axít lactic sản xuất từ Rhizopus oryzae (Mattey, 1992). Tại Nhật Bản, các nhà khoa học đã tổng hợp được chất kích thích sinh trưởng Giberelin từ hai chủng NS Furasium monoforme và Furasium oxysporum. Ngoài lên men sản xuất KS, enzym, các axit hữu cơ,..., Penicillium chrysogenum và Asp. niger còn tạo ra một lượng lớn sản phẩm phụ của sự lên men. Khuẩn ty của nấm không độc là một thành phần thức ăn lý tưởng bởi vì nó có hàm lượng đạm thô cao (xấp xỉ 12% trên trọng lượng tươi). Khuẩn ty được sử dụng như thành phần thức ăn gia súc. NS cũng được sử dụng làm giàu thêm đạm cho thức ăn gia súc,.... Tuy vậy, rất nhiều loài NS cũng gây ra những tác hại cho đời sống như mọc trên các nguyên vật liệu, đồ dùng, thực phẩm là hư hỏng hay giảm chất lượng sản phẩm. Một số NS cũng tiết ra độc tố gây ung thư (Asp.flavus sinh độc tố Aflatoxin gây ung thư gan), gây bệnh cho người, ĐV và TV,...[56, 72, 73, 74]. 1.2.2. Phân loại NS. Hiện nay chỉ mới định tên được khoảng 10.000 chi và 70.000 loài trong số khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm có trong tự nhiên. Riêng các loài nấm thuộc Nấm bất toàn ở nước ta hiện mới chỉ phát hiện được 338 loài thuộc 306 chi khác
nhau (Bùi Xuân Đồng, 2004). Bảo tàng giống chuẩn VSV (VTCC) thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội đang hợp tác với Viện NITE của Nhật Bản điều tra nghiên cứu khu hệ vi nấm ở Việt Nam và có nhiều khả năng tìm thấy những loài mới nữa. Về phân loại nấm, hiện nay tồn tại các hệ thống phân loại nấm không thống nhất với nhau, chủ yếu là các hệ thống phân loại theo Ainsworth và cộng sự (1973), V.Arx (1981), Ainsworth & Bisby (1983), Kendrich (1992), Ainsworth & Bisby (1995), Alexopoulos & Mins (1996). Trong luận văn này, chúng tôi phân loại nấm dựa vào các đặc điểm mô tả theo hệ thống phân loại của Ainsworth và cộng sự (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984, 2004), Đặng Hồng Miên, Nguyễn Lân Dũng (2006) [61]. Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, để phân loại VSV nói chung, NS nói riêng, người ta thường dùng phương pháp nhân gen và giải trình tự gen (PCR – Plymerase Chain Reaction) để thu được kết quả nhanh và chính xác. Nguyên tắc của phương pháp PCR là khuếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng một cặp mồi chuyên biệt. Phản ứng PCR là một chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: - Bước 1 (biến tính): trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tmax của phân tử, thường là 94 – 95oC trong vòng 30 giây đến 1 phút. - Bước 2 (lai): nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 – 70oC và kéo dài 30 giây đến 1 phút. - Bước 3 (tổng hợp): nhiệt độ được nâng lên đến 72oC để DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài ngắn của trình tự DNA, thường kéo dài khoảng 30 giây đến vài phút. Sau đó, người ta sẽ tiến hành giải trình tự các axit nucleic Các phương pháp nhằm xác định trình tự axit nucleic đều dựa vào 2 nguyên tắc.
- Nguyên tắc hóa học (Phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản ứng thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử DNA tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh nhau 1 nucleotid. - Nguyên tắc enzym học (phương pháp Sanger và phương pháp cải biên) : dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase. Với việc tổng hợp thêm các deoxynucleotid cùng với các deoxynucleotid thông thường. Kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước chênh nhau 1 nucleotid. Ở cả 2 phương pháp, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel polyacrylamid. Nếu sử dụng đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình tự cần xác định sẽ được đọc trên bản phóng xạ ghi từ bản điện di [61]. 1.2.3. Tình hình nghiên cứu NS sinh amylase. Ở nước ta và trên thế giới đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu về NS sinh amylase đặt nền móng cho việc sản xuất chế phẩm enzym này và là cơ sở để ứng dụng vào đời sống. Trên thế giới, trong thời gian gần đây có một số công trình nghiên cứu về amylase của NS khá nổi bật như: Từ năm 1990, Marianne Graber và Didier Combes đã có công trình nghiên cứu “Kiểu hoạt động của anpha-amylase từ chủng Asp.oryzae trong MT đậm đặc” [52]. Trong công trình nghiên cứu năm 1997, P.Woloshuk đã nghiên cứu về các chất gây cảm ứng sự sinh tổng hợp aflatoxin từ hạt ngô bị xâm nhập tạo ra bởi hoạt tính amylaza từ Asp. flavus [56]. Để tận dụng các phế phẩm nông nghiệp trong sản xuất men phân giải tinh bột, Akpan M.o.Bankole A.M.Adesemowo, đã sử dụng Asp.niger trong công trình nghiên cứu năm 1999 [50]. Năm 2001, nhà khoa học Nhật Bản B. N. Okolo đã tiến hành tinh sạch và xác định một số tính chất của amylaza phân giải tinh bột sống mới từ Asp.carbonarius vào năm 2001 [55].
Gần đây, tạp chí khoa học United States Patent Application có đăng công trình nghiên cứu “Nghiên cứu về alpha amylase ngoại bào của chi Aspergillus”, (2008) của Baldwin, Toby M,.. cho thấy sự liên quan giữa việc sinh alpha amylase và glucoamylase của chi nấm này. [42] Tại Việt Nam, vào năm 1974, D.V. Hợp nghiên cứu sản xuất chế phẩm glucoamylase từ Asp.niger và L.V Chứ, Đ.T.T Thu nghiên cứu với đối tượng Asp.awamorii năm 1977 [14]. Đến năm 1984, N.B.Ngà và N.L.Dũng nghiên cứu chọn lọc các chủng thuộc các loài Asp.awamorii, Asp.niger và Asp.oryzae có hoạt tính α – amylase và glucoamylase cao để thủy phân tinh bột sắn [14]. Năm 1977, cũng với đối tượng nghiên cứu Asp.niger, L.V.Nhương và cộng sự đã thành công khi thu nhận và sử dụng pectinase, amylase để xử lý dược liệu nguồn gốc TV [14]. Nghiên cứu về glucoamylase có công trình “Nghiên cứu chọn lọc được chủng Asp.niger TH3 – 19K của Nhật Bản có hoạt tính glucoamylase cao dùng để thủy phân tinh bột sống” của D.V.Hợp và cộng sự, năm 1993 [14]. Asp.niger BS cũng được Đặng Văn Lợi, Lê Văn Hoàng đưa vào nghiên cứu nhằm tối ưu hoá quá trình sinh tổng hợp enzim amylase và cellulase [23]. Năm 1998, Hoàng Kim Anh, Ngô Kế Sương, Nguyễn Thị Phương Thủy có công trình “Thu nhận amylase từ nấm mốc Asp. sp”. [2] Nổi bật nhất trong các nghiên cứu gần đây nhất là các nhà khoa học thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới đã nghiên cứu và sản xuất thành công hai loại thức ăn kích thích tăng trưởng cho mọi vật nuôi (kể cả thuỷ sản) là sản phẩm lên men từ bã sắn và góp phần giải quyết ô nhiễm MT. Hai sản phẩm đó có tên gọi là ProBio-S và Bio-E (quá trình lên men tạo ra ba loại enzym là α – amylase, glucoamylase và cellulase) . Kết quả thử nghiệm sơ bộ trên 15-20 lợn con một tháng tuổi cho thấy sau ba tháng được ăn hai chế phẩm trên, lợn tăng trọng nhanh hơn 1,1-1,3kg so với những con đối chứng [14, 40].
1.3. Tinh bột và hệ enzym amylase. 1.3.1. Tinh bột. Tinh bột gồm hai cấu tử là amylose (chiếm 20 – 30%) và amilopectin (chiếm khoảng 70 – 80%). Amylose có phân tử lượng thấp, phân bố phía bên trong hạt tinh bột, cấu trúc thẳng, các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết α-1,4-glucoside, dài khoảng 300 – 1000 gốc glucose xoắn theo kiểu lò xo, mỗi vòng xoắn có khoảng 6 gốc glucose. Nhờ cấu trúc xoắn amylose có thể kết hợp với các nguyên tử khác, tạo màu xanh khi kết hợp với iod. Nếu đun nóng liên kết hydro bị cắt đứt, chuỗi amylose duỗi thẳng iod tách khỏi amylose và dung dịch mất màu xanh. Amilopectin có các gốc glucose gắn với nhau không chỉ nhờ liên kết α-1,4- glucoside mà còn nhờ liên kết α-1,6-glucoside, chính liên kết này hình thành cấu trúc nhánh trong amilopectin. Phân tử amilopectin chứa khoảng 200.000 đến 1.000.000 phân tử glucose, phân bố ở mặt ngoài hạt tinh bột. Amilopectin chỉ hoà tan khi đun nóng và tạo nên dung dịch có độ nhớt cao, amilopectin tạo màu đỏ với iod. [7, 8, 29, 33] 1.3.2. Hệ enzym amylase. Amylase là tên gọi của một nhóm enzym có tác dụng xúc tác thủy phân liên kết glucoside trong polysaccharide (tinh bột) và các dextrin cuối. Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen. Sản phẩm tạo thành của quá trình thủy phân là glucose, maltose và dextrin. [8,11] Cơ chất chủ yếu của amylase là tinh bột. Đây là một polysaccharide phổ biến ở TV, được tích lũy nhiều trong các hạt hòa thảo, trong củ, thân cây và lá cây . Tinh bột có vai trò dinh dưỡng đặc biệt lớn vì trong quá trình tiêu hóa chúng bị thủy phân thành đường glucose là chất tạo nên nguồn năng lượng chính cho SV. Các amylase chủ yếu thủy phân tinh bột thường gặp là: a. α – amylase hay α-1,4-glucohydrolase là enzym phân cắt các liên kết α-1,4- glucoside trong mạch amylose và amilopectin một cách ngẫu nhiên. Đây là enzym có ở TV, ĐV và đặc biệt có nhiều ở VSV, thủy phân tinh bột chủ yếu tạo thành
maltose và glucose. Dưới tác động của α – amylase, tinh bột sẽ mất khả năng tạo màu với iod và độ nhớt của tinh bột giảm nhanh. Nếu thời gian tác dụng dài thì sản phẩm thủy phân amylose chứa 13% glucose và 87% maltose, còn với amilopectin sẽ tạo thành maltose, maltotriose và dextrin phân tử thấp cùng 5-10% glucose. Enzym này hầu như không tác dụng trên tinh bột nguyên thủy nhưng thủy phân hồ tinh bột rất nhanh. Một số đặc tính của α – amylase: - Dễ tan trong nước, dung dịch muối, rượu loãng. Phân tử lượng α – amylase giảm (14.000 – 15.000) còn canxi tăng theo nhiệt độ nuôi cấy VSV. Nếu tách hoàn toàn canxi khỏi phân tử enzym thì α – amylase mất khả năng thủy phân cơ chất vì canxi tham gia hình thành và ổn định enzym. Canxi còn có tác dụng đảm bảo α – amylase có độ bền cực lớn với các tác động gây biến tính và phân hủy bởi các protease. [7, 29] - pH tối thích α – amylase từ NS là 4,5 – 4,8 (hoạt động 4,5 – 5,8), từ đại mạch và thóc mầm là 5,3 (4,7 – 5,4), và VK là 5,8 – 6,0 (5,8 – 7,0). pH tối thích của α – amylase từ Asp.oryzae là 4,8 – 5,8. pH
nó. Vì vậy người ta còn gọi loại amylase này là amylase dextrin hay amylase dịch hóa. Những chủng VSV có khả năng tổng hợp α – amylase có ý nghĩa công nghiệp: Baccillus subtilis, Baccillus licheniformis, Asp.oryzae [7]. b. β – amylase (α -1,4 – glucan – mantohidrolase) chỉ phân cắt các liên kết α – 1,4 glucoside ở đầu mạch. Enzym này phổ biến ở TV, nhiều ở hạt nảy mầm. β – amylase kém bền ở nhiệt độ cao, vô hoạt hoàn toàn ở 70oC nhưng trong dịch nấu thì nhiệt độ tối thích là 60 – 65oC. Enzym này khá bền trong MT axit ở pH 3 – 4. Đa số β – amylase hoạt động mạnh hơn ở MT pH 4,5 – 5 và vẫn giữ được hoạt tính khi không có canxi. Điểm khác biệt cùa enzym này so với α – amylase là hầu như không tác dụng lên tinh bột sống mà chỉ phân giải mạnh hồ tinh bột. Chúng phân giải 100% amylose và 54 – 58% amylopectin thành maltose. β – amylase vẫn giữ được hoạt tính khi không có canxi. [15, 29]. c. Glucoamylase (γ – amylase hay α – 1,4 – glucan – glucohydrolase) thủy phân liên kết α-1,4 glucosid và α-1,6 glucosid trong chuỗi polysaccharide. Enzym này có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin dextrin cuối, panose, isomatose và maltose tới glucose (Azarova, 1981; Jerebtxov, Pankratov, 1977; Dobrolinxkaia, Rodzevits, 1974; Logina Karpukhina, 1978). Phân tử lượng gucoamylase thường không ổn định, dao động từ 50.000 đến 95.000 dalton. Đa số chế phẩm glucoammylase của VSV đều hoạt động tốt ở vùng axit, pH tối thích 4,5 – 5,0. Tuy hoạt động tốt trong vùng axit nhưng glucoamylase của một số chủng VSV cũng bền ở pH kiềm. Ví dụ glucoamylase của loài Coniphora cerebella và Corticum rolfsii tương đối bền ở pH 9, glucoamylase của Mucor rouxianus bền ở pH 8 [25]. Nhiệt độ tối thích của glucoamylase 50 – 60oC. Hầu hết các glucoamylase bị mất hoạt tính khi đun nóng trên 70oC. Tuy nhiên cũng có trường hợp glucoamylase hoạt động tốt nhất ở 65 – 70oC, ví dụ như ở loài C. thermosaccharolytium. Enzym
này bị ức chế mạnh bởi Hg+ nhưng các ion Mn2+ và Fe2+ lại có tác dụng kích thích. Sản phẩm của giai đoạn đường hóa chủ yếu tạo ra glucose. Một số VSV có khả năng tổng hợp glucoamylase có ý nghĩa công nghiệp: nấm mốc Rhizopus, Asp.awamori, Asp.niger; nấm men Endomycopsis. [25, 29] 1.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp amylase của VSV. a. Giống VSV Giống VSV là điều kiện đầu tiên và cơ bản nhất quyết định sự hình thành và lượng amylase. Không phải tất cả các chủng VSV đều có khả năng tổng hợp amylase như nhau. Các chủng cùng chi và thậm chí cùng loài vẫn rất khác nhau về lượng enzym tổng hợp được. Vì thế, để thu được lượng amylase cao, công việc tuyển chọn chủng NS có khả năng sinh enzym này cao là điều quan trọng đầu tiên. Ngoài ra chủng NS thu được cũng cần được bảo quản và nuôi cấy trong những điều kiện tốt nhất, nhằm hạn chế việc bị biến tính, nhất là trong điều kiện NS phân lập từ RNM. Trong nghiên cứu cũng như sản xuất, việc tuyển chọn và bảo quản giống là điều rất quan trọng. Vì nếu chủng VSV tuyển chọn không giữ được hoạt tính ban đầu thì những thành quả thu được cũng vô ích. Vì tầm quan trọng như vậy, nhiều nước trên thế giới đã đưa công tác này lên tầm cỡ quốc gia và đã thành lập các trung tâm, các chi nhánh giữ giống gọi là bảo tàng VSV [31,33]. b. Nguồn dinh dưỡng. Các yếu tố trong thành phần MT ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống và tạo thành enzym của VSV. MT nuôi cấy VSV phải bảo đảm có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng và tỉ lệ các chất dinh dưỡng hợp lý, phù hợp với nhu cầu của từng VSV cụ thể.  Ảnh hưởng của nguồn C. Thành phần và hàm lượng C có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp enzym. Nhiều tác giả cho rằng: muốn thu được hàm lượng amylase cao thì trong MT nuôi cấy VSV không được chứa nguồn C dễ hấp thu. Nói chung amylase thủy phân tinh
bột là enzym cảm ứng nên sự có mặt của cơ chất tinh bột thường thúc đẩy quá trình tạo amylase [25]. Theo Grigorev, ảnh hưởng nguồn C đến cường độ sinh tổng hợp amylase có thể xếp theo thứ tự sau: - Đối với α – amylase: tinh bột > dextrin > maltose > lactose > glucose > saccharose > galactose > manose > arabinose. - Đối với glucoamylase: tinh bột > dextrin > maltose > saccharose > glucose > lactose > arabinose > galactose > manose [31]. Nồng độ nguồn C trong MT cũng ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành enzym. Mỗi loài VSV chỉ có thể tạo lượng amylase cao nhất ở một nồng độ hydratcacbon nhất định. Ví dụ trên MT Czapek, nồng độ tinh bột ảnh hưởng rõ rệt đến sinh tổng hợp enzym amylase. Nồng độ tinh bột tối thích cho sinh tổng hợp α – amylase là 6% , đối với glucoamylase là 3%. Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy NS thu amylase thường là những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác. Trong đó, cám gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả vì có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát triển. Mặt khác khi tạo MT, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu [25]. Bảng 1.1. Ảnh hưởng cơ chất đến sinh tổng hợp α – amylase và glucoamylase của Asp.oryzae [25]. Hoạt độ enzym (đv/100ml) Hoạt độ enzym (đv/100ml) Nguồn C Nguồn C α - amylase glucoamylase α - amylase glucoamylase Tinh bột % Bột 6 300 800 Ngô 250 760 4 220 800 Mì 250 760 2 110 800 Mì đen 300 770 1 70 710 Đậu nành Vết 810
Ngoài ra, để giảm giá thành sản phẩm khi ứng dụng sản xuất amylase cho chăn nuôi, người ta có thể dùng khoai mì hay bã khoai mì như một chất cảm ứng rẻ tiền và thường có sẵn trong thức ăn gia súc. Ở nước ta, các phụ phẩm nông nghiệp trên như: rơm, cám gạo, cám mì, bã khoai mì, trấu,.. có đến hàng 20 – 30 tấn/năm. Đây là nguồn thức ăn tốt cho chăn nuôi cũng như là các cơ chất lên men rẻ tiền trong công nghệ lên men VSV [47,56].  Ảnh hưỏng của nguồn N. N cần cho sự hình thành các axit amin để cấu tạo nên protein cấu trúc cũng như các enzym. Nguồn N bổ sung vào MT nuôi cấy có thể là N vô cơ hay N hữu cơ. Việc chọn nguồn N bổ sung vào MT nuôi cấy là rất cần thiết để bảo đảm hiệu suất sinh tổng hợp cao đồng thời có lợi về mặt kinh tế. Nguồn N vô cơ thường dùng là nitrat amon, nitrat natri (có hiệu quả hơn các loại khác) hay sulfat amon, urê,..Nitrat natri là nguồn dinh dưỡng N thường dùng để nuôi nhiều loại NS sinh amylase với hàm lượng 0,91%. Các hợp chất N hữu cơ có thể là nguyên liệu giàu đạm như cao ngô, bột đậu tương, khô lạc, khô đâu,..Ngoài ra, một số axit amin cũng thường được bổ sung vào MT nuôi cấy VSV. [7]. Khi sử dụng nguồn N nhất định cho vào MT nuôi cấy VSV có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Theo mức độ tiêu thụ muối, MT bị acid hóa, quá trình tổng hợp enzym sẽ chuyển theo hướng tích cực tổng hợp glucoamylase và ức chế tổng hợp α – amylase. Sự cân bằng giữa C và N trong MT có ý nghĩa lớn đối với sinh tổng hợp sinh khối VSV và sự tạo thành amylase. Khi MT có đủ lượng C và N cần thiết sẽ tích lũy được lượng amylase cực lớn. Tỉ lượng tối ưu của C và N cho sinh tổng hợp amylase là 10:1 đến 40:1. Trong MT Czapeck, tỉ lượng giữa tinh bột và NaNO3 tối ưu cho sinh tổng hợp các amylase vào khoảng 18:1.[25]  Các nguồn dinh dưỡng khoáng. Magie ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzym. Thiếu MgSO4 sẽ ảnh hưởng xấu đến tổng hợp mọi amylase của NS (Fenikxova, Muxaeva, 1967). Nồng độ tối ưu của muối này cho sự tổng hợp α – amylase và glucoamylase là 0,05%.