Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập từ loài Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis ở Việt Nam

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:62

Thêm vào BST

Báo xấu

18
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm khảo sát hoạt tính sinh học cơ bản (kháng vi sinh vật, chống oxy hóa, gây độc tế bào) của một số hợp chất phân lập từ loài A. cochinchinensis tại Việt Nam. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập từ loài Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis ở Việt Nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGÔ THỊ HUỆ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ LOÀI TRUNG QUÂN Ancistrocladus cochinchinensis Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2016 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGÔ THỊ HUỆ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ LOÀI TRUNG QUÂN Ancistrocladus cochinchinensis Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Quỳnh Liên THÁI NGUYÊN - 2016 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn tốt nghiệp với đề tài “Đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập từ loài Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis ở Việt Nam” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Lê Quỳnh Liên và sự hỗ trợ của đề tài nghiên cứu cơ bản “Nghiên cứu đa dạng các loài thuộc chi Trung quân (Ancistrocladus) ở Việt Nam dựa vào phân tích hóa sinh và di truyền”, mã số: 104.01-2013.53, do tiến sĩ Lê Quỳnh Liên là chủ nhiệm đề tài, không sao chép của bất cứ ai. Tôi xin chịu trách nhiệm về công trình nghiên cứu của mình. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016 Người cam đoan Ngô Thị Huệ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
ii LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc của mình, tôi xin cảm ơn TS. Lê Quỳnh Liên - Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và các anh/chị làm việc tại Phòng Tài Nguyên sinh vật đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn đề tài Nghiên cứu cơ bản: “Nghiên cứu đa dạng các loài thuộc chi Trung quân (Ancistrocladus) ở Việt Nam dựa vào phân tích hóa sinh và di truyền”, mã số: 104.01-2013.53, do TS. Lê Quỳnh Liên chủ nhiệm đề tài đã hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong khoa Khoa học sự sống, các thầy cô giảng dạy tại trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên và các thầy cô công tác tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong 2 năm học tập tại trường. Trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tôi luôn nhận được sự động viên của bạn bè, đồng nghiệp và người thân trong gia đình. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016 Người cam đoan Ngô Thị Huệ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii MỤC LỤC ....................................................................................................... iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.......................................................................... v DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ .................................................................... vii MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1 2. Mục tiêu của đề tài ........................................................................................ 2 3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3 1.1. Hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học từ thực vật ................................... 3 1.1.1. Khái niệm ................................................................................................ 3 1.1.2. Phân loại .................................................................................................. 3 1.1.3. Những nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên từ thực vật trên thế giới ..... 5 1.1.4. Tình hình nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên từ thực vật tại Việt Nam..... 7 1.2. Một số hoạt tính sinh học cơ bản của thực vật ........................................... 8 1.2.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật ..................................................................... 8 1.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa ....................................................................... 10 1.2.3. Hoạt tính gây độc tế bào........................................................................ 11 1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu về Chi Trung quân (Ancistrocladus) ... 13 1.3.1. Đặc điểm, phân bố................................................................................. 13 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 14 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .......................................................... 16 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................... 19 2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 19 2.2. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................. 21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
iv 2.2.1. Phạm vi .................................................................................................. 21 2.2.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 21 2.2.3. Thời gian: Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 09/2015-09/2016 ...... 22 2.3. Đối tượng, thiết bị nghiên cứu ................................................................. 22 2.3.1. Các hóa chất, thiết bị chuyên dùng ....................................................... 22 2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 24 2.4.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh: ................................................. 24 2.4.2. Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa thu dọn gốc tự do DPPH ... 25 2.4.3. Phương pháp thử độc tính tế bào .......................................................... 26 2.5. Phương pháp xử lý số liệu........................................................................ 28 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 29 3.1. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của cây Trung quân (Ancistrocladus cochinchinensis) .............................................................................................. 29 3.1.1. Đánh giá hoạt tính kháng sinh của các hợp chất phân lập từ loài Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis ............................................................. 29 3.1.2. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ loài Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis................................................... 37 3.1.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ loài Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis................................................... 38 KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ ............................................................................ 45 1. Kết luận ....................................................................................................... 45 2. Kiến nghị ..................................................................................................... 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Thuật ngữ ADN Axit Deoxyribo Nucleotit DMSO Dimethylsulfoxide DPPH 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl LU Human lung carcinoma Ung thư phổi IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% cá thể SRB Sulforhodamine B OD Optical Density Mật độ quang học Khả năng trung hòa gốc SA Scavenging Activities oxy hóa tự do Nồng độ trung hòa được SC Scavenging Concentration at 50% 50% gốc tự do HL-60 Human promyelocytic leukima Tế bào ung thư bạch cầu SK-MEL-2 Human skin caner Tế bào ung thư da TCA Trichloroacetic acid Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số loài thực vật có hoạt tính kháng vi sinh vật.......................... 9 Bảng 1.2. Một số hợp chất chống oxy hóa từ thực vật ................................... 11 Bảng 1.3. Một số hợp chất có khả gây độc tế bào từ thực vật ........................ 13 Bảng 2.1. Tên gọi, ký hiệu các hợp chất nghiên cứu ...................................... 20 Bảng 2.2. Danh sách và đặc điểm chính của các loài vi sinh vật thử nghiệm 23 Bảng 3.1. Khả năng ức chế vi khuẩn E.coli của 6 hợp chất phân lập ............. 30 Bảng 3.2. Khả năng ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus ........................ 31 Bảng 3.3. Khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella tiphymurium ...................... 32 Bảng 3.4. Khả năng ức chế nấm Candida albicans ........................................ 35 Bảng 3.5. Khả năng ức chế nấm A. fumigatus ................................................ 36 Bảng 3.6. Khả năng chống oxy hóa của hợp chất thử nghiệm ....................... 37 Bảng 3.7. Hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư LU-1 ................................... 39 Bảng 3.8. Hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư HL-60 ................................. 40 Bảng 3.9. Hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư SK-MEL-2 ......................... 41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
vii DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ HÌNH Hình 1.1. Cây trung quân (Ancistrocladus cochinchinensis) ....................... 14 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của một số naphthylisoquinonline alkaloids tách từ Ancistrocladus .......................................................................... 15 Hình 1.3. Các Napthylisoquinoline alkaloid tách chiết từ Cây Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis .................................................... 18 Hình 2.1. Mẫu lá dùng để phân lập hợp chất nghiên cứu ............................. 19 Hình 2.2. Mô hình cấu trúc hóa học của các hợp chất nghiên cứu ............... 21 Hình 3.1. Hoạt tính ức chế của hợp chất AC1 (M1), AC4 (M4) đối với 3 loài vi khuẩn ......................................................................................... 33 BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Giá trị SC50 của 6 hợp chất thử nghiệm và đối chứng .............. 38 Biểu đồ 3.2: Phần trăm tế bào khối u bị ức chế ở nồng độ: 20µg/ml đối với chất thử và 10µg/ml đối với đối chứng dương Ellipticine ........... 41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Từ xa xưa con người đã biết sử dụng một số loại thực vật để làm thực phẩm và làm thuốc chữa trị bệnh tật, vết thương. Ngày nay, cùng với sự phát triển của các kỹ thuật tách chiết các hợp chất thiên nhiên, con người càng có xu hướng sử dụng những sản phẩm từ thiên nhiên trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe. Việt Nam là nước có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng. Tổng số loài thực vật đã ghi nhận ở Việt Nam khoảng 10.500 loài trong tổng số 12.000 loài theo ước tính. Trong số đó, nguồn tài nguyên cây làm thuốc chiếm khoảng 30%. Kết quả điều tra nguồn tài nguyên cây thuốc của Viện Dược liệu (2006) cho biết ở Việt Nam có 3.948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp và nấm lớn được dùng làm thuốc. Trong thời gian qua, nước ta đã có hơn 3.000 loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược được cấp số đăng ký, chiếm gần 1/3 trong tổng số thuốc mới được cấp số đăng ký lưu hành hàng năm. Như vậy, nhu cầu sử dụng cây dược liệu chế xuất thuốc trong nước là rất lớn. Không những vậy, việc sử dụng dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên cũng đang được các nước trên thế giới hết sức quan tâm. Trong đó có các loài thuộc chi Trung quân (Ancistrocladus) hiện được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm bởi thành phần hóa học đặc trưng và các tác dụng sinh học của chúng. Chi Trung quân phân bố phổ biến ở vùng nhiệt đới châu Á và Tây Phi, người ta đã tìm thấy ở loài thực vật này một số hợp chất có alkaloid giá trị và naphthoquinon có độc tính tế bào, tác dụng trên một số tế bào ung thư, kháng vi khuẩn và kháng nấm. Theo y học cổ truyền, cây Trung quân có vị đắng, chát, tính bình, không độc, có công năng hành huyết, hóa ứ, trừ phong thấp, mạnh gân xương, giải nhiệt, trục ứ huyết, trừ đờm, giải độc. Thường được dùng trị đau lưng, đau xương khớp, phong thấp, chân tay tê mỏi; nhất là trường hợp phụ nữ sau đẻ, người mệt mỏi, đau nhức toàn thân, yếu sức [1]. Ngoài ra, lá Trung quân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
2 còn dùng trị đau bụng do lỵ và sốt rét. Loài thực vật thuộc họ Trung quân Ancistrocladaceae này mọc khắp các khu rừng ở vùng Đông Dương, cũng gặp tại Trung Quốc (đảo Hải Nam) và Ấn Độ, mọc hoang ở miền rừng núi khắp nước ta như Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, Bà Rịa Vũng Tàu [25]. Tuy nhiên tại Việt Nam những nghiên cứu về cơ sở khoa học để sử dụng chi Trung quân làm thuốc còn rất hạn chế, chưa có nhiều công trình khoa học đánh giá đầy đủ về hoạt tính của các hợp chất tách chiết từ chi Trung quân. Nhằm tạo tiền đề cho việc tìm kiếm các hợp chất mới có giá trị y dược học trong chi Trung quân ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập từ loài Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis ở Việt Nam”. 2. Mục tiêu của đề tài Khảo sát hoạt tính sinh học cơ bản (kháng vi sinh vật, chống oxy hóa, gây độc tế bào) của một số hợp chất phân lập từ loài A. cochinchinensis tại Việt Nam. 3. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật (vi khuẩn và nấm) của các hợp phân lập từ loài A.cochinchinensis; - Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ loài A.cochinchinensis; - Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ loài A.cochinchinensis. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học từ thực vật 1.1.1. Khái niệm Hợp chất thiên nhiên (natural product) là các chất hóa học được sản sinh trong các cơ thể sống và có hoạt tính sinh học, dược học nhất định. Các chất thứ cấp này hầu như không có chức năng trong quá trình sinh trưởng, phát triển của thực vật mà được sản xuất như là kết quả của sự thích nghi của sinh vật với môi trường xung quanh hoặc hoạt động như một cơ chế bảo vệ chống lại kẻ thù để đảm bảo sự tồn tại của bản thân sinh vật đó [9]. Trong số các loài sinh vật, thực vật được đánh giá là nguồn cung cấp các hợp chất có hoạt tính sinh học đa dạng và phong phú. Theo ước tính sơ bộ, có khoảng 200 nghìn loài thực vật tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong vòng đời của chúng.Với độ đa dạng cao về cấu trúc hóa học, các hợp chất thứ cấp thực vật này đã và đang đóng vai trò vô cùng quan trọng trong việc tìm kiếm các chất có tiềm năng y dược phục vụ bảo vệ sức khỏe cho con người. 1.1.2. Phân loại Các hợp chất có hoạt tính sinh học thường được phân loại dựa vào cấu trúc hóa học, các con đường sinh tổng hợp ra các nhóm hợp chất và hoạt tính cơ bản của chúng. Dựa vào tiêu chí đó, Bernhoft (2010) đã phân nhóm một số hợp chất có dược tính từ thực vật như sau: Nhóm Glycoside: nhóm hợp chất này có cấu trúc cơ bản là gồm một hoặc nhiều nhóm saccharide (nhóm đường). Các nhóm hợp chất chính gồm cardiac glycoside, cyanogenic glycoside, saponin và anthraquinone glycoside [14]. Một hợp chất nổi tiếng thuộc nhóm này là ginseng saponin được phân lập từ các loài nhân sâm như Panax Ginseng C. A. Meyer và Panax quinquefolius. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
4 Nhóm Flavonoid và Proanthocyanidin: Flavonid là nhóm hợp chất có cấu trúc vòng 3 mạch vòng trung tâm, và các oligomer của Flavonoid tạo thành Proanthocyanidin. Flavonid thành phần các sắc tố và phổ biến trong hầu hết các thực vật bậc cao. Hoạt tính nổi trội của các hợp chất Flavonoid là ngăn chặn sự hình thành của các gốc oxy hóa tự do, từ đó làm giảm quá trình oxy hóa [14]. Có thể kể đến hợp chất rutin thuộc nhóm Flavonid được tách chiết từ nhiều loại thực vật họ cam chanh Citrus có tác dụng bảo vệ thành mạch [24]. Nhóm Tanin: là hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết bền vững với các proteinvà các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác như các amino axit và alkaloid. Tanin kết hợp với protein tạo thành màng trên niêm mạc nên thường dùng làm thuốc săn da. Tanin có tác dụng kháng khuẩn dùng làm thuốc súc miệng khi viêm niêm mạc miệng hoặc chỗ loét khi nằm lâu hoặc chữa viêm ruột, tiêu chảy. Tanin kết tủa với kim loại nặng và alkaloid thường dùng để chữa ngộ độc đường tiêu hoá [14]. Nhóm Terpenoid: Terpenoid, đôi khi được gọi là isoprenoid, là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn và rất đa dạng, có nguồn gốc từ các đơn vị isoprene (năm carbon) lắp ráp và biến đổi theo hàng ngàn cách khác nhau. Hầu hết là những cấu trúc đa vòng này khác nhau không chỉ ở nhóm chức năng mà còn ở bộ khung carbon cơ bản của chúng [14]. Terpenoid là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng nhất và có số lượng lớn nhất và được sử dụng rộng rãi từ công nghiệp thực phẩm và đồ uống đến công nghiệp dược.Có thể kể đến những ví dụ nổi trội về ứng dụng của các hợp chất terpenoid như menthol chiết xuất từ cây bạc hà, hay artemisinin là thành phần chính của thuốc chống sốt rét và taxol có tác dụng diệt các tế bào ung thư người [15]. Nhóm Resin: có cấu trúc hóa học gồm lipid kết hợp với một nhóm có khả năng tan trong nước. Các hợp chất này thường tồn tại ở dạng lỏng, có đặc tính dính nên thường có đặc tính ức chế vi sinh vật, làm lành vết thương [14]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
5 Nhóm Lignan: là những hợp chất có bộ khung 18 carbon hình thành từ sự kết hợp 2 nhóm phenylpropanoid và những nhóm chức khác. Nhóm lignans thực vật thường có hoạt tính ức chế vi sinh vật, chống oxy hóa [14]. Nhóm Alkaloid: là nhóm hợp chất chứa Nitơ dị vòng, có hàm lượng rất thấp trong thực vật. Các hợp chất alkaloid gồm nhiều phân nhóm như: trophane alkaloid, pyrrolizidine alkaloid, isoquinoline alkaloid, methylxanthine alkaloid, pseudoalkaloid. Hầu hết các hợp chất thuộc nhóm alkaloid có hoạt tính mạnh, thường lên hệ thần kinh và gây độc tế bào nên được sử dụng làm các thuốc giảm đau và tiêu diệt khối u [14]. Nhóm Furocoumarine và naphthodianthrone: đây là những hợp chất nhạy sáng ở thực vật, do vậy một số hợp chất nhóm này tách từ thực vật có thể được sử dụng để điều chế thuốc chống trầm cảm [14]. 1.1.3. Những nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên từ thực vật trên thế giới Theo Tổ chức y tế thế giới (WHO), có đến 80% dân số thế giới sử dụng thảo dược làm thuốc để chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe. Thống kê cho thấy, khoảng hơn 100 hợp chất từ 90 loài cây có thể được xem là các thuốc quan trọng hiện đang được sử dụng tại một hoặc nhiều nước, với khoảng 70% trong số này có nguồn gốc từ các loài thực vật đươc dùng trong y học truyền thống [7]. Từ lâu, vỏ cây canh kina đã được dùng làm thuốc trị sốt rét ở Nam Mỹ. Từ năm 1630, người ta đã biết dùng vỏ cây này để trị sốt và từ năm 1677 đã được sử dụng ở Luân Đôn (Anh) với tên “Vỏ Peru”. Từ cây mọc hoang, năm 1792, các nhà khoa học đã tổ chức trồng trọt cây canh kina ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới, nhất là ở Angeri, Peru, Java sau đó là ở Malaysia, Việt Nam và Châu Phi (Camorun, Ghine). Đây là cây thuốc với 2 loại alkaloid chính là quinin và quinidin. Hóa học các hợp chất thiên nhiên thực sự bắt đầu bởi công trình của Serturner người đầu tiên phân lập được morphine, hợp chất nhóm alkaloid từ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
6 cây thuốc phiện (Papaver somniferum) vào năm 1803. Năm 1817, Emetine được phân lập từ Ipecacuanha [41]. Một số alkaloid khác như strychnine (Strychnos nuxvomica) [50], quinine (Cinchona officinalis) [23], colchinne (Colchicum autumnale), atropin (Atropa belladonna) [9], papaverine (Papaver somniferum) [44],…cũng đã được phân lập. Vào năm 1876, Maclagan giới thiệu salicin từ dịch chiết của cây dương liễu (Spiraea ulmaria) [42]. Đến năm 1971, Wani và cộng sự đã tìm ra một diterpene amide mới có khả năng chống ung thư gọi là “taxol” chiết từ cây thông đỏ Pacific (Taxus brevifolia) [53]. Đến năm 1983, taxol được Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung thư buồng trứng. Sau đó, FDA đã cho phép sử dụng taxol trong điều trị các trường hợp ung thư buồng trứng và ung thư vú. Ngoài ra, taxol cũng có tác dụng đối với các bệnh nhân có khối u ác tính, ung thư phổi và các dạng u bướu khác và nó được xem như là chất đầu tiên của một nhóm mới trong hóa trị liệu ung thư [26]. Tuy nhiên, sử dụng taxol trong điều trị bị hạn chế do chỉ tách chiết được một lượng rất ít từ vỏ của cây thông đỏ tự nhiên. Lớp vỏ mỏng này chứa khoảng 0,001% taxol tính theo khối lượng khô. Ở cây 100 năm tuổi trung bình chỉ thu được 3kg vỏ (khoảng 300mg taxol), lượng này ứng với một liều trong toàn đợt điều trị ung thư. Sở dĩ nguồn taxol khan hiếm như vậy là do các cây tự nhiên sinh trưởng rất chậm [26]. Do đó, cần có những nguồn khác để thay thế mới đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng trong y học. Do vậy, hiện nay việc nuôi cấy tế bào các loài Taxus được xem như một phương pháp tối ưu để cung cấp nguồn taxol ổn định, được ứng dụng rộng rãi và tạo ra giá trị lớn. Hiện nay, rất nhiều nghiên cứu về các hợp chất thiên nhiên dùng trong y học đang tiếp tục được thực hiện. Tuy nhiên để tạo ra được lượng lớn các chất này thì phương pháp chủ yếu là nuôi cấy tế bào để thu sinh khối rồi tiến hành tách chiết. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
7 1.1.4. Tình hình nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên từ thực vật tại Việt Nam Ở Việt Nam, công nghệ tách chiết các hợp chất thứ cấp chủ yếu gắn liền với công nghệ nuôi cấy tế bào và được phát triển từ những năm 1970. Đến nay đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể như là quy trình sản xuất sâm Ngọc Linh do Học viện Quân Y khai thác. Sâm Ngọc Linh là loại sâm thứ 20 được tìm thấy trên thế giới, có tác dụng phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan, kích thích hệ miễn dịch, chống stress và trầm cảm, chống oxy hóa, lão hóa. Công trình của Học viện Quân Y đã hoàn thành quy trình nuôi cấy tế bào rễ củ sâm, quy trình định tính và định lượng thành phần ginsenoid trong sinh khối sâm Ngọc Linh bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Phương pháp sản xuất sinh khối tế bào rễ sâm Ngọc Linh được cấp bằng sáng chế số 7523 ngày 11/2/2009 tại Việt Nam [58]. Từ kinh nghiệm y học cổ truyền sử dụng các bộ phận của cây cà độc dược để điều trị các bệnh đường hô hấp, tiêu hóa và giảm đau, nhóm tác giả Đặng Thị Hồng Vân, Phan Quốc Kinh, Nguyễn Văn Long đã chiết được scopolamin thuộc nhóm alkaloid chủ yếu trong loài thực vật này. Tiếp đó, Viện dược liệu đã chiết được hyoscyamin và atropine. Atropine dùng trong điều trị các cơn đau thắt đường tiêu hóa và tiết niệu [6]. Berberin là alkaloid chính của các cây Hoàng liên gai (Berberis wallichiana D.C), Hoàng liên chân gà (Coptis teeta Wall), Hoàng bá (Phellodendron amurense) mọc hoang và được trồng ở quanh dãy Hoàng Liên Sơn). Berberin là một loại thuốc có hoạt tính kháng sinh, chống viêm. Gần đây, các nhà y học phương tây lại rất chú ý đến các hoạt tính sinh học mới của Berberin. Những nghiên cứu mới nhất đã xác định berberin có tác dụng chống lại nhiều loại vi khuẩn Gram (+), Gram (-) và các vi khuẩn kháng acid. Bên cạnh đó nó còn có tác dụng chống lại một số loại nấm men và một số động vật nguyên sinh. Ở nước ta, từ năm 1972 Phan Quốc Kinh và Đặng Thị Hồng Vân (Trường Đại học Dược Hà Nội) đã nghiên cứu điều chế Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
8 berberin từ cây hoàng liên gai, hoàng bá để góp phần chủ yếu dập tắt dịch lỵ trong thời gian đó. Sau năm 1975 thì nhiều nơi đã sản xuất được berberin từ vàng đắng để dùng trong nước và xuất khẩu [6]. Việt Nam cũng đang triển khai các dự án nuôi cấy và chiết xuất taxol từ cây thông đỏ ở Lâm Đồng. Ngoài ra còn có “Nghiên cứu sản xuất arteminisin dùng kỹ thuật nuôi cấy tế bào từ cây thanh hao hoa vàng” của Viện Sinh học Nhiệt đới trong nghị định thư hợp tác với Malaysia (2007-2010) hay đại học Huế “Nghiên cứu khả năng tích lũy glycoalkaloid ở mô sẹo cây cà gai leo Solanum hainanense”. Tuy nhiên, những dự án nói trên vẫn còn ở quy mô phòng thí nghiệm [6]. Ngoài ra, hai hợp chất flavonoid là isoquercitrin và vitexin phân lập được từ phân đoạn etyl acetat của lá chum ngây đã thể hiện khả năng ức chế các chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 50 µg/ml [2]. Hiện nay có rất nhiều những công trình nghiên cứu về các tác dụng sinh học của các hợp chất tách chiết từ thực vật và cũng có các sản phẩm thuốc hoặc thực phẩm chức năng được sản xuất và tiêu thụ có nguồn gốc từ thực vật. Đây là một lĩnh vực có nhiều triển vọng dựa trên nguồn tài nguyên thực vật phong phú của Việt Nam. 1.2. Một số hoạt tính sinh học cơ bản của thực vật 1.2.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật 1.2.1.1. Hợp chất kháng vi sinh vật Là các hợp chất hữu cơ có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau, với nồng độ hoạt tính khác nhau nhưng thường rất nhỏ. Những tính chất này có thể thuộc nhiều cấu trúc hóa học khác nhau như alkaloid, tanin, flavonoid, tinh dầu…[43]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
9 Các chất kháng khuẩn ức chế, tiêu diệt vi sinh vật theo một số cơ chế chủ yếu như: ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn, do tác động lên quá trình tổng hợp vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu; ức chế chức năng của màng tế bào hoặc làm mất chức năng của màng làm cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion bị thoát ra ngoài; ức chế quá trình sinh tổng hợp protein hoặc ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic [55]. 1.2.1.2. Một số chất có hoạt tính kháng vi sinh vật từ nguồn gốc thực vật Thực vật do không có hệ miễn dịch chuyên biệt nên trong quá trình sinh trưởng và phát triển đã sản sinh ra nhiều các hợp chất có khả năng tiêu diệt hay ức chế các vi sinh vật và nấm bệnh xâm hại. Có thể kể ra rất nhiều các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn tốt như nhóm hợp chất terpenoid từ cây thực vật thuộc chi nghệ, xa nhân; hợp chất flavonid từ cây trà xanh hay các alkaloid trong tỏi, mao lương, vỏ bưởi,…[43] (Bảng 1.1). Bảng 1.1. Một số loài thực vật có hoạt tính kháng vi sinh vật Tên thông STT Tên khoa học Hợp chất Nhóm Hoạt tính kháng thường 1 Cỏ linh lăng Alfalfa - - Vi khuẩn gram dương Nấm, Lactobacillus, Micrococcus, 2 Tỏi đen Piper nigrum Poiperine Alkaloid E.coli Hydrastis Berberine, Vi khuẩn, Gardia duodenale , 3 Mao lương alkaloids canadensis hydrastine trypanosomes 4 Trà xanh Camellia sinensis catechin flavonoid Nấm, vi khuẩn, virus, Shigella 5 Bưởi Citrus Paradisa - terpenoid Nấm 6 Củ hành Allium cepa Allicin sulfoxide Vi khuẩn, nấm Hỗn hợp của terpenoid, 7 Đu đủ Carica papaya Mủ Vi khuẩn, nấm, virus axit hữu cơ, alkaloid 8 Nghệ Curcuma longa Curcumin terpenoid Vi khuẩn, động vật nguyên sinh Anthemic Phenolic M.tuberculosis, S. typhimurium, 9 Hoa cúc la mã Matricaria acid acid S.aureus, giun Sán 10 Xạ hương Thymus vulgaris Caffeic acid Terpenoid Virus, nấm, vi khuẩn Nguồn: Marjorie Murphy Cowan (1999) [43] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
10 1.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa 1.2.2.1. Hợp chất chống oxy hóa Là các hợp chất có khả năng chống lại hay làm chậm sự phá hủy tế bào do các gốc tự do có hại có trong cơ thể [56]. Oxy được xem như một nguyên tố quan trọng giúp con người duy trì sự sống, chúng tham gia vào quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lượng cung cấp cho mọi hoạt động sống của con người. Oxy vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa và trong các quá trình đó oxy tạo ra những hợp chất trung gian gọi là các gốc tự do. Các gốc tự do có nguồn gốc oxy này có hoạt tính cao, kém bền vững và được gọi chung là các gốc dạng oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen species) [56], [57]. Các dạng oxy hoạt động này dễ dàng phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, DNA, … gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời, khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể [56]. Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thủy tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan [57]. Các nghiên cứu cũng phát hiện rằng các gốc dạng oxy hóa hoạt động (ROS) sẽ được loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể như enzyme superoxid dismutase (SOD), enzyme glutathion peroxidase (GSP-Px), enzyme catalase (CAT)… để tạo sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa trong cơ thể con người hay gọi là cân bằng nội mô (homeostasis). Do ảnh hưởng của nhiều yếu tố tác động từ bên ngoài hay bên trong cơ thể, làm cân bằng này di chuyển theo hướng gia tăng các dạng oxy hoạt động. Trạng thái sinh lý này gọi là stress oxy hóa (oxidative stress). Hay nói cách khác, stress oxy hóa là sự rối loạn cân bằng giữa các chất chống oxy hóa và các chất oxy hóa theo hướng tạo ra nhiều các chất oxy hóa [39], [57]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
11 1.2.2.2. Một số hợp chất chống oxy hóa có nguồn gốc thực vật Thực vật là nguồn cung cấp một lượng lớn các chất chống oxy hóa. Vitamin A, C hay E là những chất chống oxy hóa điển hình được tìm thấy trong rất nhiều chi thực vật khác nhau trên thế giới. Các hợp carotene, carotenoid, flavonoid cũng có hoạt tính chống oxy hóa mạnh được tìm thấy ở nhiều thực vật có màu đỏ như cà chua, cà rốt…[30] Gupta và cộng sự đã tổng kết một số loài thực vật và hợp chất chống oxy hóa điển hình như sau (bảng 1.2) . Bảng 1.2. Một số hợp chất chống oxy hóa từ thực vật Tên thông Tên STT Hợp chất Hoạt tính thường khoa học Curcumin, eugenol, β- Làm sạch máu, điều trị sốt rét, rối Curcuma 1 Nghệ pinene, camphene, β- loạn tiêu hóa liên quan đến dạ dày, domestica sitpsterol kháng nấm, diệt côn trùng Flavonoids, dulcitol, Long đờm, diệt giun sán, làm Cuscuta 2 Tơ hồng bergenin, coumarins, thuốc xổ, lợi tiểu, chữa vàng da, reflexa glycosides, lactone bệnh lý về mật Chữa viêm phổi, phế quản, đau Carotens, carotenoids, ngực, nhiễm trùng đường niệu, 3 Cà rốt Daucus carota glycosides, flavonoids, bệnh trĩ, bệnh phong, vàng da, đường khối u Glycyrhizin, flavonoids, Lợi tiểu, điều kinh, chữa hen, Glycyrrhiza liquiritin, isoliquiritin, viêm phổi phế quản, viêm màng 4 C am thảo glabra rhamnoliquiritin, 2- kết cấp tính, loét đường tiêu methylisoflavones hóa, lành vết thương Cyanogenetic glycosides, Chữa lỵ, viêm phổi, nhiễm trùng Mangifera polyphenols, vitamin A, 5 Xoài đường niệu, xuất huyết tử cung, indica C, β-sitosterol, quercetin, phổi, ruột ellagic acid, gallic acid Rễ giúp nhuận tràng, hạ sốt, Mormodica Stearic acid, triterpene, chữa viêm phổi, bệnh tả, vết loét 6 Mướp đắng chanratia glycosides Quả có tác dụng giảm đầy hơi, tiêu hóa tốt, trị tiểu đường Long đờm, chữa viêm phổi, một Ocimum Dầu bay hơi, terpenoids, 7 húng quế số bệnh về da, tiêu hóa tốt, rối sanctum eugenol, thymol, estragole loạn tiêu hóa ở trẻ em, đau tai Tầm bóp Solanum Polyphenolic, Lợi tiểu, nhuận tràng, bệnh ngủ, 8 quả đen nigrum flavonoids, steroids chữa kiết lỵ, bảo vệ gan Nguồn: Gupta V.K.et al (2006) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn