Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.)

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:51

Thêm vào BST

Báo xấu

44
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống loài lan rừng Dendrobium anosmum Lindl. (Hoàng thảo phi điệp tím) nhằm bảo tồn nguồn gene quý hiếm và nhân giống lan rừng Việt Nam bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THU HƢỜNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HOÀNG THẢO PHI ĐIỆP TÍM (DENDROBIUM ASOMUM LINDL.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2016
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THU HƢỜNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HOÀNG THẢO PHI ĐIỆP TÍM (DENDROBIUM ASOMUM LINDL.) Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Hải Yến THÁI NGUYÊN - 2016
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hải Yến. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng có ai công bố trong một công trình nào khác. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2016 Tác giả luận văn Nguyễn Thu Hƣờng
ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Hải Yến, Giảng viên Khoa Khoa học Sự sống, Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên, người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình chu đáo và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn này. Đồng thời, tôi xin được cảm ơn các thầy, cô giáo và các cán bộ kỹ thuật viên Phòng thí nghiệm Sinh học của Khoa Khoa học Sự sống đã tạo điều kiện về thời gian cũng như cơ sở vật chất cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn thạc sĩ. Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè cùng tất cả các thầy cô luôn luôn động viên, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong tiến trình tôi học tập và làm luận văn này. Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi mong nhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè để tôi có thể có được kết quả tốt hơn. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2016 Tác giả luận văn Nguyễn Thu Hƣờng
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................... vii MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3 1.1. Giới thiệu chung về phong lan ................................................................... 3 1.1.1. Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium).......................................................... 4 1.1.2. Lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) ............... 7 1.1.3. Các phương pháp nhân giống trên cây lan .............................................. 9 1.2. Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................... 10 1.2.1. Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy mô - tế bào ....................................................................................................... 10 1.2.2. Các phương thức nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống vô tính ........... 11 1.2.3. Các giai đoạn của nhân giống in vitro................................................... 12 1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô ................................ 13 1.3. Một số nghiên cứu nhân giống in vitro lan Dendrobium ......................... 14 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 15 1.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ...................................................... 16 Chƣơng 2: ................. 18 2.1. Vật liệu ..................................................................................................... 18 .................................................................................... 18 2.1.2. Dụng cụ và hóa chất .............................................................................. 18
iv 2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu......................................................... 19 2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 19 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................ 19 2.2.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy............................................................... 20 2.2.3. Chuẩn bị một số thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy ........... 21 2.2.4. Chuẩn bị giá thể và ra cây ..................................................................... 21 2.2.5. Điều kiện nuôi cấy in vitro .................................................................... 21 2.2.6. Bố trí thí nghiệm ................................................................................... 21 2.2.7. Các chỉ tiêu theo dõi .............................................................................. 24 2.2.8. Xử lý số liệu .......................................................................................... 24 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 25 3.1. Kết quả khử trùng mẫu đưa vào nuôi cấy ................................................ 25 3.1.1. Kết quả khử trùng mẫu hạt phong lan ................................................... 25 3.2. Kết quả tái sinh chồi ................................................................................. 26 3.2.1. Kết quả tái sinh chồi từ hạt lan Hoàng thảo phi điệp tím ..................... 26 3.2.2. Kết quả nhân chồi từ protocorm lan Hoàng thảo phi điệp tím ............. 28 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số kích thích sinh trưởng nhóm Cytokinin đến sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím ............ 29 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây và chuối xanh đến sự nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium Anosmum Lindl.) .............................................................................................................. 33 3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng α - NAA đến khả năng ra rễ Hoàng thảo phi điệp tím ............................................................................................................ 35 3.6. Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng đến sinh trưởng và phát triển của cây lan sau khi ra chai trồng trong bầu ........................................................... 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 40 1. Kết luận ....................................................................................................... 40 2. Kiến nghị ..................................................................................................... 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 41
v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đủ ABA Abscisic acid ADN Acid deoxyribonucleic APG III Angiosperm Phylogeny Group III B1 Thiamine B2 Riboflavin BAP 6 - Benzyl adenin purine ĐC Đối chứng EAC Ehrlich ascites cells GA3 Gibberellic acid IAA Indol - 3 - acetic acid IBA Indol - 3 - butyric acid Kinetin 6 - furfurryl - aminopurin KTST Kích thích sinh trưởng MS Murashige and Skoog PM Phytamax RE Robert Ernst THT Than hoạt tính VW Vacin Went USA United States of America 2,4 - D 2,4 - Dichlorophenoxy acetic acid α - NAA α - Naphthalene acetic acid CT Công thức TG Thời gian KT Khử trùng
vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt lan Hoàng thảo phi điệp tím bằng HgCl2 0,1% ..................................................................................... 25 Bảng 3.2. Kết quả protocorm phát sinh từ hạt Hoàng thảo phi điệp tím ........ 27 Bảng 3.3. Kết quả nhân chồi từ protocorm loài lan Hoàng thảo phi điệp tím sau 50 ngày cấy chuyển ............................................................ 29 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nhóm Cytokinin đến sự nhân nhanh chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím.................................................................. 30 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng chuối xanh và khoai tây nghiền đến sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím sau 30 ngày ............................................................................................ 34 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng tạo rễ của lan Hoàng thảo phi điệp tím ............................................................................. 36 Bảng 3.7. Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng đến sự sinh trưởng phát triển của cây .................................................................................... 38
vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hoa và cây phong lan Hoàng thảo phi điệp tím ................................ 9 Hình 2.1. Quả loài lan Hoàng thảo phi điệp tím ............................................. 20 Hình 3.1. Hạt Hoàng thảo phi điệp tím nảy mầm trên môi trường MS chứa 2,0 mg/l BAP sau 30 ngày nuôi cấy ....................................... 26 Hình 3.2. Protocorm của lan Hoàng thảo phi điệp tím được tạo thành từ hạt trên môi trường MS chứa 2,0 mg/l BAP ................................... 27 Hình 3.3. Chồi phát sinh từ protocorm trên môi trường MS chứa 1,5 mg/l BAP .... 29 Hình 3.4. Ảnh hưởng của BAP và kinetin tới sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím sau 60 ngày ....................................... 33 Hình 3.5. Ảnh hưởng của chuối xanh và khoai tây lên sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím sau 60 ngày ........................ 35 Hình 3.6. Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng tạo rễ của lan sau 30 ngày.... 37 Hình 3.7. So sánh sự ảnh hưởng từ chế độ tưới ½ MS tới sinh trưởng và phát triển của cây lan con so với đối chứng sau 60 ngày ............... 38
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ngày nay, hoa cảnh không những đóng vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần mà còn ảnh hưởng sâu sắc đến tâm hồn con người và làm đẹp cho cảnh quan môi trường. Do đó, quan tâm phát triển hoa cảnh là vấn đề cần thiết. Hoa lan là một trong những loại hoa được ưa chuộng nhất vì hình dáng, màu sắc, kích thước phong phú, đa dạng nên chúng được trồng, sản xuất khá phổ biến và đã trở thành một mặt hàng có giá trị trong kinh doanh, xuất khẩu trên thế giới. Các nước có ngành nuôi trồng hoa lan phát triển, hàng năm kim ngạch xuất khẩu lên đến hàng trăm triệu USD [15]. Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng khí hậu nhiệt đới thích hợp cho sự phát triển của các loài phong lan. Theo cuốn Phong lan Việt Nam của Trần Hợp thì nước ta có 137 - 140 chi với trên 1000 loài phong lan, mỗi loài lan đều có vẻ đẹp riêng. Lan rừng tuy không rực rỡ về màu sắc như những giống lan ngoại nhập nhưng lại có vẻ đẹp tự nhiên thanh thoát và phần lớn có hương thơm vì vậy luôn được người chơi lan ưa chuộng. Thế giới lan rừng rất phong phú với nhiều chủng loại, một trong những chi phổ biến nhất là chi Hoàng thảo (Dendrobium). Hiện nay, Dendrobium được trồng nhiều và có giá trị kinh tế cao bởi bên cạnh giá trị thẩm mỹ mà Dendrobium đem lại thì Dendrobium còn được tách chiết để phục vụ cho một số ngành công nghiệp mỹ phẩm, y học. Với giá trị như vậy hoa lan Dendrobium hứa hẹn sẽ mang lại nguồn doanh thu to lớn cho ngành sản xuất, kinh doanh mặt hàng này. Trên thị trường hiện nay, phong lan chủ yếu được cung cấp dưới dạng cây giống khai thác từ rừng, còn hạt lan rất khó nảy mầm ở điều kiện tự nhiên vì vậy số lượng cây con mọc ra không nhiều. Ngày nay, với công nghệ nhân giống in vitro, người ta có thể tạo ra từ vài nghìn đến hàng triệu cây con ổn định về mặt di truyền từ một quả lan, từ đó góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen của các loài lan Việt Nam. Nhờ ứng dụng nhân giống in vitro vào chi Dendrobium đã làm cho nó trở thành một loài hoa cắt cành hiệu quả.
2 Từ các lý do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.)” nhằm mục đích góp phần bảo tồn và nhân nhanh giống lan rừng bằng phương pháp in vitro. 2. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống loài lan rừng Dendrobium anosmum Lindl. (Hoàng thảo phi điệp tím) nhằm bảo tồn nguồn gene quý hiếm và nhân giống lan rừng Việt Nam bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đưa mẫu lan Hoàng thảo phi điệp tím vào nuôi cấy in vitro. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng thực vật lên quá trình tái sinh chồi từ phôi hạt của loài lan Hoàng thảo phi điệp tím. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin lên quá trình nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.). - Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây và chuối xanh đến sự nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium Anosmum Lindl.) - Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin lên quá trình hình thành rễ lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.). - Tìm hiểu tác dụng của một số chế phẩm lên sự sinh trưởng và phát triển của lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) sau khi ra cây trồng trong bầu. Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh học thuộc Khoa Khoa học Sự sống, trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên.
3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về phong lan Họ Lan, hay họ Phong lan (Orchidaceae) là một họ thực vật có hoa, thuộc ngành thực vật hạt kín, lớp một lá mầm (Monocotylendons), phân lớp hành (Liliidae), họ Lan (Orchidaceae). Họ phong lan đã biết khoảng 850 chi (APG III, 2009) và có trên 25000 loài chiếm khoảng 10% của các loài thực vật có hoa (Dressler, 1993) [12]. Bên cạnh đó còn có hơn 30000 loài lan lai. Ngày nay, dựa vào đặc tính di truyền các nhà khoa học đã chia họ lan thành 6 họ phụ: Apostasioideae, Cypridioideae, Neottioideae, Orchidioideae, Epidendroideae, Vandoideae. Họ Lan là một họ thực vật lớn và phân bố gần như trên toàn thế giới (ngoại trừ châu Nam Cực). Danh sách dưới đây liệt kê gần đúng sự phân bố của họ này [18] Nhiệt đới châu Mỹ: 250 - 270 chi Nhiệt đới châu Á: 260 - 300 chi Nhiệt đới châu Phi: 230 - 270 chi Châu Đại Dương: 50 - 70 chi Châu Âu và ôn đới châu Á: 40 - 60 chi Bắc Mỹ: 20 - 25 chi Ở Việt Nam có 137-140 chi gồm trên 1000 loài lan rừng, bao gồm cả địa lan, thạch lan và phong lan, phân bố rộng khắp cả nước, hầu hết đều có hoa đẹp nên được trồng làm cây cảnh [3]. Dựa theo đặc điểm của thân cây, phong lan được chia ra làm hai nhóm là nhóm cây đơn thân (monopodial) và nhóm cây đa thân (sympodial). Nhóm cây đơn thân: lá mầm từ đỉnh mọc thêm hàng năm kéo theo thân cây phát triển dài ra có thể đạt kích thước tối đa đến vài mét. Ví dụ như chi lan Vanda, Vanilla... Nhóm cây đa thân thì một thân mầm chỉ phát triển đến kích thước nhất định, sau đó ngừng phát triển và có các thân mầm khác phát triển thay thế. Thân mầm phát triển từ thân gốc gọi là “mắt” cây. Các mắt cây phát triển
4 đến một kích thước nào đó sẽ phát triển thêm lá và rễ tạo nên một thân cây. Thân cây cứ phát triển theo cách này tạo nên một tập hợp phân nhánh các thân cây mọc từ cây gốc ban đầu gọi là cây đa thân, ví dụ như chi lan Cattleya, Dendrobium…[4], [17]. Dựa theo khả năng thích nghi với điều kiện môi trường họ lan được chia thành 4 nhóm chính: Phong lan (Epiphyte): Là loài sống ký gửi nhờ vào thân cây cao ẩm mục ở trong rừng hoặc trên núi cao, rễ bám vào các cây to, thân rủ xuống. Địa lan (Terrestrial): Là loài có thân giả dạng củ, rễ chùm sống nhờ đất ở sườn núi, bờ suối hay dưới tán rừng ẩm ướt. Địa lan có nhiều loài với hình dáng, màu sắc phong phú đẹp mắt. Hoại lan (Saprophyte): Gồm những loại mọc trên rêu và gỗ mục. Thạch lan (Lithophyte): Gồm một số loại mọc trên đá. 1.1.1. Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) 1.1.1.1. Phân loại chi lan Hoàng thảo Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) là chi lan lớn thứ 2 trong họ hoa lan đứng sau lan lọng. Lan Hoàng thảo rất phong phú và đa dạng với hơn 1600 loài, phân bố ở các vùng Châu Úc, Châu Á tập trung nhiều nhất ở Đông Nam Á. Lan Hoàng thảo rất đa dạng về cấu tạo sinh học, hình thái và phong phú về dạng cây, dạng hoa. Vì vậy các nhà khoa học đã chia thành 40 nhóm nhỏ để tiện cho việc nghiên cứu và trồng trọt. Trong đó tiêu biểu nhất là các nhóm: Nhóm thứ nhất có đặc điểm là lá xanh quanh năm, hoa thường mọc ở gần ngọn có nhiều màu sắc sặc sỡ như: Dendrobium bigibbum, Dendrobium phalaenopsis…[17] Nhóm thứ hai có đặc điểm là các giả hành buông thõng xuống, mang nhiều lá xanh hai bên, hoa mọc thành từng chùm hoặc từng hoa như: Dendrobium anosmum, Dendrobium aphyllum… Nhóm thứ ba có đặc điểm là hoa mọc ở đỉnh, buông thõng xuống và có
5 mùi thơm như: Dendrobium farmeri, Dendrobium chrysotoxum… Nhóm thứ tư có đặc điểm là chùm hoa mọc thẳng đứng, màu xanh hoặc màu vàng như: Dendrobium atroviolaceum, Dendrobium spetabile… Nhóm thứ năm có đặc điểm là giả hành mọc thẳng đứng có một lớp lông bao phủ như: Dendrobium draconis, Dendrobium formosum…[17] Bên cạnh đó, có thể căn cứ vào đặc điểm sinh trưởng và dạng thân, lan Dendrobium được chia thành 2 nhóm chính: Nhóm thân mềm: Có đặc điểm là các giả hành buông lõng hoặc rủ xuống, thường thấy ở vùng khí hậu lạnh, gồm các giống được lấy ở vùng cao nguyên Việt Nam, Miến Điện…, trên độ cao 1000 m. Nhóm thân cứng: Mọc thẳng đứng thường ở vùng nóng hơn (Malaysia, Indonexia…). Ngoài ra còn một nhóm Dendrobium trung gian có thể sống ở cả vùng nóng lạnh như: Dendrobium primulimun, Dendrobium farmeri… [17]. 1.1.1.2. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng lan Dendrobium Ánh sáng: Lan cần nhiều ánh sáng gần như có thể để ở ngoài trời nhưng cần phải có lưới che phòng khi lá non bị cháy nắng. Khi thấy cây quặt quẹo, đó là dấu hiệu thiếu nắng, nếu thiếu nắng cây khó ra hoa. Nhiệt độ: Lan cần nuôi trong nhiệt độ từ 8 - 25°C tuy nhiên lan có thể chịu nóng tới 38°C và có thể chịu lạnh tới 3,3°C. Ngoài ra nếu vào mùa đông lạnh dưới 15,6°C trong vòng 4 - 6 tuần lan sẽ khó ra nụ. Độ ẩm và thoáng gió: Lan mọc mạnh nếu độ ẩm từ 60 - 70%. Nếu độ ẩm quá thấp cây non sẽ không lớn được và bị teo đi. Cây cũng không mọc mạnh nếu không thoáng gió và trong thời kỳ lan ra nụ nếu không thoáng gió nụ sẽ ít đi. Giá thể: Với một số loài lan trồng không cần dùng đến giá thể vẫn sinh trưởng tốt, nhưng nếu môi trường sống có giá thể vẫn tốt hơn. Giá thể của lan gồm những thứ dễ kiếm, có sẵn trong tự nhiên. Những chất liệu này không
6 phải vùng nào cũng giống nhau và chúng được chọn tùy theo điều kiện ngoại cảnh, nhân lực, loài lan và quy mô sản xuất. Những loại giá thể thường sử dụng như vỏ thông, vỏ dừa, rêu... Tưới nước: Vào mùa hè khi lan ra mầm non và mọc mạnh, tưới 2 - 3 lần một tuần. Vào mùa thu, khi cây đã ngừng tăng trưởng nên tưới nước thưa đi, mỗi tuần chỉ cần tưới 1 lần cho thân cây khỏi bị teo lại. Vào mùa đông, đây là thời gian lan chuẩn bị để ra hoa, ngưng hẳn việc tưới nước. Nếu độ ẩm quá thấp nên phun sương mỗi tháng 1 - 2 lần [19]. 1.1.1.3. Sâu bệnh và các vấn đề khác Vì lan Dendrobium cần được bón nhiều loại phân hữu cơ khác nhau và môi trường giá thể sẽ mục nát sau một thời gian trồng cây nên đã tạo điều kiện cho nhiều loài sâu bệnh gây hại, một số bệnh thường gặp và cách điều trị: Bệnh đen thân cây lan: Do nấm Fusarium gây nên, cách phòng trị là tách những cây bị bệnh để riêng và dùng thuốc phòng trừ hay nhúng cả cây vào thuốc trị nấm. Với cây lớn hơn thì cắt bỏ phần thối rồi phun thuốc diệt nấm như Carboxin 1/2000; Zineb 3/2000; Benlat 1/2000 [18]. Bệnh đốm lá: Do nấm Cercospora gây nên, bệnh thường phát sinh mạnh trên cây lan Dendrobium, gây hại trong mùa mưa ở những vườn lan có độ ẩm cao, phòng trừ bằng các thuốc diệt nấm như Carboxin 1/2000; Zineb 3/2000; Benlat 1/2000 [18]. Bệnh thán thư: Do nấm Collectotrichicum gây ra. Bệnh phát triển mạnh vào mùa mưa nên phải phòng trừ trước, thường cắt bỏ lá vàng rồi phun thuốc diệt nấm 5 - 7 ngày/lần [18]. Bệnh thối mềm vi khuẩn: Do vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây ra. Vết bệnh có hình dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thường lan rộng theo chiều rộng của lá. Gặp thời tiết ẩm ướt mô bệnh bị thối úng, thời tiết khô hanh mô bệnh khô tóp có màu trắng xám [18]. Để phòng trừ bệnh do nấm, trước hết cần bảo đảm cho cây đủ dinh dưỡng và tỷ lệ N:P:K cân đối. Dư N và thiếu K thường làm cho lá mềm, dễ
7 nhiễm bệnh. Ánh sáng phải đầy đủ để giữ độ cứng cho lá. Lá bị gãy do dư N, thiếu K hay do thiếu ánh sáng. Không tưới dư nước vì dễ làm cho rễ úng và thối. Phun thuốc phòng ngừa thường xuyên 1 tháng 1 - 2 lần. Nếu thấy bệnh xuất hiện cần phun nhiều hơn (2 - 3 lần/tuần) cho đến khi triệu chứng bệnh giảm thì trở lại phun theo cách phòng ngừa [18]. Sâu hại lan: Rệp vảy thường bám trên các thân giả hành còn non, phòng trị bằng cách dùng bàn chải chà xát rồi phun dung dịch thuốc Malathion 50 pha loãng; Bọ trĩ gây hại chủ yếu trong mùa nắng, dùng Malathion 5 mg/bình 4 lít nước, phun 1lần / tuần, phun liên tiếp liên tục trong 3 tuần [19] . 1.1.2. Lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) 1.1.2.1. Phân loại Có nhiều cách phân loại cho Hoàng thảo phi điệp tím, theo hệ thống APG III thì lan được phân loại như sau: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Thực vật hạt kín (Angiospermae) Lớp: Một lá mầm (Monocotylendons) Bộ: Măng tây (Asparagales) Họ: Phong lan (Orchidaceae) Phân họ: Lan biểu sinh (Epidendroideae) Chi: Hoàng thảo (Dendrobium) Loài: Phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) Tên khoa học của lan Hoàng thảo phi điệp tím được nhiều nhà khoa học công nhận là Dendrobium anosmum Lindl.[3]. 1.1.2.2. Đặc điểm sinh học - Rễ của Hoàng thảo phi điệp tím thuộc loại rễ bì sinh, xung quanh rễ thật được bao bọc bởi một lớp mô xốp giúp cây dễ dàng hút nước, muối
8 khoáng và ngăn chặn ánh sáng mặt trời gay gắt. Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần rễ có các sắc lạp không bị ngăn bởi mô xốp nên có thể giúp cây quang hợp. - Thân của Hoàng thảo phi điệp tím thuộc nhóm lan thân có giả hành. Giả hành chứa diệp lục, dự trữ nước và chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của giả hành mới. Cấu tạo của giả hành gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ để tránh sự mất nước do mặt trời hun nóng. Củ giả hành có màu xanh bóng nên cùng với lá nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp [4]. - Lá là cơ quan dinh dưỡng của hoa lan, là xưởng chế tạo chất dinh dưỡng bằng quang hợp. Xếp thành hai dãy đối nhau trên thân (lá đối), lá có hình xoang, các gân lá chính chạy song song và các khe lõm xuống, lá rụng tạo thành các giả hành. - Hoa không những mọc trên những giả hành mới mà còn mọc trên các giả hành cũ. Trên cánh có phủ lông mịn và có ánh kim, trên lưỡi thường có hai mặt tím đậm, hương thơm ngào ngạt. Bên trong hoa có cột nhị nhụy nằm chính giữa hoa mang phần đực ở phía trên và phần cái ở phía trước mặt. Nhị gồm hai phần bao phấn và hốc phấn. Bao phấn nằm ở cột nhị nhụy còn hốc phấn thì lõm lại mang khối phấn và thường song song với bao phấn. Khối phấn gồm toàn bộ hạt phấn dính lại với nhau, rất cứng. - Quả của Hoàng thảo phi điệp tím thuộc loại quả nang nở ra theo 3 - 6 đường nứt dọc, khi chín quả nở ra, mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc. Bên trong chứa rất nhiều hạt, khi chín hạt có màu vàng. Hạt cấu tạo bởi một phôi chưa phân hóa, trên một máng lưới nhỏ, xốp chứa đầy không khí. Hạt rất nhiều và nhỏ, toàn bộ hạt trong một quả nặng chỉ bằng một phần mười mg, rất nhẹ nên dễ phát tán nhờ gió [4], [5]. 1.1.2.3. Phân bố Hoàng thảo phi điệp tím có nguồn gốc rộng lớn khắp châu Á, từ miền Nam Nhật Bản đến các chân đồi phía Himalaya, bán đảo Đông Dương,
9 Malaysia, Indonexia… Ở Việt Nam, loài này phân bố trên khắp các núi rừng từ Bắc tới Nam: Đô Lương, Đà Lạt, Đắk Lắc, Hòa Bình… [16]. Hình 1.1. Hoa và cây phong lan Hoàng thảo phi điệp tím 1.1.3. Các phương pháp nhân giống trên cây lan 1.1.3.1. Các phương pháp nhân giống truyền thống Nhân giống vô tính Tách bụi: Phương pháp này dùng để tách các chậu lan quá đầy, đồng thời làm tăng số lượng cây mới. Các giả hành già được tách ra khi hoa đã tàn và chỉ tách khi đã trồng được từ 2 - 3 năm. Giả hành già được ươm lại trên giá thể ẩm để tạo chồi con, các chồi con được nuôi cùng với giả hành cho đến lúc đã tạo ra rễ mới, đủ sức phát triển mới tách lần thứ hai, từ một giả hành có thể cho mỗi đợt 1 - 2 cây con [5]. Chiết cành: Ở Dendrobium thường tạo ra cây con trên giả hành một cách tự nhiên. Khi các cây con phát triển khá mạnh, có rễ tốt có thể tách ra khỏi giả hành để trồng. Phương pháp chiết tách đảm bảo được tính chất di truyền của cây bố mẹ nhưng lại cho một thế hệ cây con sinh trưởng không đồng đều nên khó cung cấp một số lượng cây con lớn để phục vụ cho nuôi trồng với quy mô lớn.
10 Nhân giống hữu tính: Trong thiên nhiên sự thụ phấn ở lan do côn trùng thực hiện do cấu trúc của hoa lan là hoàn toàn để thích nghi cho sự thụ phấn ấy. Có 2 phương pháp thụ phấn: Sự tự thụ phấn: Khi phấn hoa của bông hoa này được rơi trên núm nhụy của chính hoa ấy. Điều này hiếm khi xảy ra trong tự nhiên ở hoa lan vì cấu trúc của bộ phận sinh dục đực và cái ở hoa lan. Sự thụ phấn chéo: Khi phấn hoa ở hoa này rơi vào núm nhụy của hoa hác của cùng một cây hay cùng loài hoặc khác loài, khác giống. Nếu sự thụ phấn có kết quả thì có thể ngay trong ngày hay sang ngày hôm sau, các phiến hoa co lại nhưng không rụng và để tránh sự thụ phấn khác do côn trùng người ta dùng bao nilon trùm lại nhưng không buộc kín miệng vì hầm hơi sẽ làm hư trái. Sau khi thụ phấn, bầu noãn từ từ trương, phình to ra thành trái, mỗi trái có thể chứa hàng ngàn đến triệu hạt. Khi trái từ màu xanh lục chuyển sang màu vàng lục thì nên hái trái. Trong thiên nhiên muốn hạt lan nảy mầm được thì hạt lan phải được nhiễm một số loại nấm cộng sinh. Người ta đã khám phá ra một số loài nấm giúp hạt lan nảy mầm, mỗi loài chỉ giúp nảy mầm ở một số giống lan như: Rhizoctonia repens giúp nảy mầm Cattleya, Cypripedium, Dendrobium; Rhizoctonia mucoroudes giúp nảy mầm Vanda, Phalaenopsis; Rhizoctonia lanugiosa giúp cho hạt nảy mầm ở Oncidium [3]. Nhân giống in vitro Ngày nay với công nghệ nhân giống in vitro, từ một quả lan có thể tạo ra từ vài nghìn đến hàng triệu cây con ổn định về mặt di truyền, đồng thời có chất lượng tốt và đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường. 1.2. Sơ lƣợc về nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1. Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy mô - tế bào Nhân giống in vitro là một trong những ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật, sử dụng môi trường nhân tạo để nhân đỉnh sinh trưởng hoặc các mô phân sinh trong cây[1].
11 Mục đích của kĩ thuật nhân nhanh giống đó là: (1) Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác chọn giống; (2) Duy trì và nhân nhanh các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các cây trồng khác nhau; (3) Nhân nhanh với điều kiện vô trùng cách ly tái nhiễm kết hợp với việc làm sạch bệnh cho cây; (4) Rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loài tự nhiên có đặc điểm tốt vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sản xuất; (5) Bảo quản tốt tập đoàn giống vô tính về các loài cây giao phấn trong ngân hàng gen [1]. Vì vậy, nuôi cấy mô - tế bào đã mang lại hiệu quả hết sức to lớn nhờ có các ưu thế, đó là: (1) Hệ số nhân giống cao rút ngắn thời gian đưa con giống vào sản xuất. Trong phần lớn các trường hợp công nghệ nuôi cấy mô tế bào đảm bảo tốc độ nhân nhanh, từ một cây trong vòng 1 - 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây; (2) Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ; (3) Làm sạch bệnh cây trồng và cách ly chúng với các nguồn bệnh; (4) Thuận tiện việc vận chuyển và bảo quản; (5) Sản xuất quanh năm, quy trình sản xuất có thể được vận hành trong bất cứ thời gian nào trong ngày, mùa nào trong năm. 1.2.2. Các phương thức nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống vô tính Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng: Ở lan có sự phát triển cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocrom sau đó tiếp tục phân chia cho ra các protocrom mới hay các chồi mới tạo thành cây hoàn chỉnh. Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây: Ngoài mô phân sinh và đỉnh sinh trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công, các bộ phận còn lại của một cơ thể thực vật đều có thể ứng dụng cho nuôi cấy mô - tế bào như các đoạn thân, cuống lá, các bộ phận của hoa, nhánh củ... Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo: Trong khuôn khổ mục đích nhân giống vô tính, nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà các cây cũng khá đồng nhất về mặt di truyền.