Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: So sánh trình tự gen liên quan đến tổng hợp isoflavone của 2 giống đậu tương

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:66

Thêm vào BST

Báo xấu

26
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: So sánh trình tự gen liên quan đến tổng hợp isoflavone của 2 giống đậu tương được thực hiện với mục tiêu nhằm xác định được đặc điểm trình tự gen tổng hợp isoflavone phân lập từ 2 giống đậu tương có hàm lượng isoflavone khác nhau. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: So sánh trình tự gen liên quan đến tổng hợp isoflavone của 2 giống đậu tương

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ––––––––––––––––––––––– ĐẶNG KIỀU TRANG SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP ISOFLAVONE CỦA 2 GIỐNG ĐẬU TƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2016 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC –––––––––––––––––––––––– ĐẶNG KIỀU TRANG SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP ISOFLAVONE CỦA 2 GIỐNG ĐẬU TƯƠNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh THÁI NGUYÊN - 2016 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh và sự giúp đỡ của các cán bộ Khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này. Thái Nguyên, ngày 20 tháng 11 năm 2016 Tác giả luận văn Đặng Kiều Trang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian nghiên cứu thực hiện luận văn này tôi luôn nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, người trực tiếp hướng dẫn luận văn cho tôi. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới cô. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Trịnh Đình Khá cũng như các thầy cô giáo Khoa Khoa học sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Văn Sơn và các cán bộ, kỹ thuật viên phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tốt nhất để tôi có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, chia sẻ khó khăn cùng tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thiện luận văn này. Thái Nguyên, ngày 20 tháng 11 năm 2016 Tác giả luận văn Đặng Kiều Trang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ......................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................... vii MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 2 1.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3 1.1. Cây đậu tương ............................................................................................ 3 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu tương ................................................... 3 1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây đậu tương ........................................... 4 1.1.3. Thành phần dinh dưỡng trong hạt đậu tương .......................................... 7 1.2. Thành phần và hoạt tính của isoflavone đậu tương ................................. 10 1.2.1. Thành phần của isoflavone đậu tương .................................................. 10 1.2.2. Hàm lượng isoflavone trong thực phẩm ............................................... 13 1.2.3. Hoạt tính của isoflavone đậu tương ...................................................... 14 1.2.4. Tác dụng của isoflavone ....................................................................... 15 1.3. Sinh tổng hợp isoflavone.......................................................................... 21 1.3.1. Con đường sinh tổng hợp isoflavone .................................................... 21 1.3.2. Các enzyme tổng hợp isoflavone .......................................................... 22 1.3.3. Gen tổng hợp isoflavone IFS2 ở cây đậu tương ................................... 23 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 24 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
iv 2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 24 2.2. Hóa chất thiết bị và địa điểm nghiên cứu................................................. 25 2.2.1. Hóa chất................................................................................................. 25 2.2.2. Thiết bị .................................................................................................. 26 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 26 2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 27 2.3.1. Phương pháp phân tích hàm lượng isoflavone trong các mẫu đậu tương nghiên cứu............................................................................................. 27 2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số................................................... 27 2.3.3. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số ........................ 28 2.3.4. Kỹ thuật PCR ........................................................................................ 28 2.3.5. Tinh sạch sản phẩm PCR ...................................................................... 30 2.3.6. Kĩ thuật tách dòng gen .......................................................................... 30 2.3.7. Phương pháp xác định trình tự nucleotide ............................................ 33 2.3.8. Phương pháp phân tích trình tự gen ...................................................... 33 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 34 3.1. Hàm lượng isoflavone của các giống đậu tương nghiên cứu................... 34 3.2. Kết quả nhân dòng và xác định trình tự gen IFS2 ................................... 35 3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ........................................................... 35 3.2.2. Kết quả nhân gen IFS2 ở cây đậu tương ............................................... 36 3.2.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR .......................................................... 37 3.2.4. Kết quả tách dòng gen ........................................................................... 37 3.2.5. Kết quả giải trình tự gen........................................................................ 39 3.3. So sánh trình tự nucelotide của gen IFS2 ................................................ 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 51 1. Kết luận ....................................................................................................... 51 2. Đề nghị ........................................................................................................ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
v DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT bp base pair (cặp bazơ) cDNA complementary DNA CHI Chalcone isomerase cs cộng sự DEPC diethyl pyrocarbonate DNA deoxyribosenucleic acid dNTP deoxynucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid E. coli Escherichia coli IFS Isflavone synthase IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb kilo base kDa kilo Dalton mRNA messenger ribonucleic acid PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) RNA Ribonucleic acid TAE Tris-acetate-EDTA X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galacto-pyranoside Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học của hạt đậu tương ........................................... 7 Bảng 1.2. Hàm lượng amino acid không thay thế trong protein đậu tương ......... 8 Bảng 1.3. Thành phần vitamin trong đậu tương ............................................... 8 Bảng 1.4. Hàm lượng isoflavone trong thực phẩm ........................................ 13 Bảng 2.1. Đặc điểm các giống đậu tương nghiên cứu .................................... 24 Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị đã sử dụng................................................... 26 Bảng 2.3. Cặp mồi nhân gen IFS2 .................................................................. 29 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nhân gen IFS2 ............................................. 29 Bảng 2.5. Chu kì nhiệt của phản ứng PCR nhân gen IFS2 ............................. 29 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối gen IFS2 vào vector pBT...................... 31 Bảng 2.7. Thành phần của phản ứng colony - PCR ........................................ 32 Bảng 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng colony- PCR................................... 33 Bảng 3.1 . Hàm lượng Isoflavone ở các giống đậu tương .............................. 34 Bảng 3.2. Giá trị mật độ quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm và 280nm của hai giống đậu tương DT84 và DT22 ............................ 35 Bảng 3.3 Số lượng và tỷ lệ các nucleotide trong gen IFS2 của giống đậu tương DT84 và DT22 ...................................................................... 39 Bảng 3.4. Các trình tự đoạn mã hoá của gen IFS2 mang mã số trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI được sử dụng để phân tích ....................... 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của các aglucon ................................................... 12 Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của các ß-Glucozit ............................................. 12 Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp isoflavone ............................................. 21 Hình 1.4. Sơ đồ mô tả gen IFS2 ở cây đậu tương ........................................... 23 Hình 2.1. Cấu trúc vector pBT ........................................................................ 31 Hình 3.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose ............................. 35 Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen IFS2 của 2 mẫu đậu tương DT84 và DT22 ...................................................................... 36 Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR tinh sạch ....................... 37 Hình 3.4. Hình ảnh sản phẩm colony-PCR ...................................................... 38 Hình 3.5. Hình ảnh điện di plasmid tái tổ hợp BT-IFS2 của giống đậu tương DT22 và DT84 ...................................................................... 39 Hình 3.6. Trình tự gen DT22 ........................................................................... 40 Hình 3.7. Trình tự gen DT84 .......................................................................... 41 Hình 3.8. Hệ số tương đồng dựa vào trình tự mã hóa (CDS) của DT 84, DT22 và các trình tự tương đồng trên NCBI ............................................... 43 Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotide gen IFS2 của giống DT84 và DT2 và trình tự tương đồng trên GenBank ............................................. 44 Hình 3.10. Hệ số tương đồng trình tự amino acid suy diễn của giống đậu tương DT22 và DT84 với các trình tự tương đồng trên GenBank ...... 48 Hình 3.11. So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein IFS2 giống đậu tương DT22, DT84 và trình tự tương đồng trên NCBI............ 49 Hình 3.12. Cây quan hệ di truyền gen IFS2 và protein suy diễn của giống đậu tương DT22 và DT84 với các trình tự tương đồng trên GenBank.......................................................................................... 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Đậu tương từ lâu đã được biết đến là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao vì nó chứa hàm lượng protein cao hơn bất kì loại nông sản nào, không những thế trong đậu tương còn chứa rất nhiều khoáng chất, các chất sinh tố B đặc biệt là các hoạt chất thảo mộc có khả năng ngăn ngừa và trị liệu bệnh tật. Trong những năm gần đây, đậu tương đã và đang chuyển biến từ thực phẩm thành dược phẩm, là cây thuốc quí được sử dụng trong đông y. Nhiều nghiên cứu khoa học đã chỉ ra sử dụng đậu tương có tác dụng giảm nguy cơ các bệnh liên quan đến tim mạch, ngăn cản sự phát triển một số dạng tiền ung thư và ung thư, ngăn ngừa bệnh thận, bệnh tiểu đường, bệnh loãng xương, bệnh nhiếp hộ tuyến đàn ông, các triệu chứng rối loạn tiền mãn kinh phụ nữ… Hàm lượng protein cao trong hạt đậu tương cũng như nhiều hợp chất có giá trị khiến đậu tương trở thành một trong những thực phẩm quan trọng trên thế giới, đậu tương còn được mệnh danh là “thần dược” của phụ nữ [3]. Điều làm các nhà khoa học say mê nghiên cứu là khám phá ra các hoạt chất thảo mộc có trong đậu tương và những ứng dụng của chúng trong lĩnh vực y khoa trị liệu, trong đó các isoflavones là loại hoạt chất sinh học mang lại nhiều hứng thú nhất [3]. Isoflavone là một enyme có nguồn gốc từ thực vật có cấu trúc tương tự như hormone kích thích tố sinh dục phái nữ và sự vận hành giống như estrogen. Vì thế các nhà khoa học còn gọi nó là estrogen thảo mộc (phytoestrogens). Những nghiên cứu đã chỉ ra rằng isoflavone đậu tương không chỉ có tác dụng phòng mà còn có khả nãng điều trị nhiều căn bệnh nan y của thời đại [8], [9], [10], [11]. Đã có nhiều nghiên cứu về hoạt tính và tác dụng của isoflavone đậu tương cũng như phương pháp tách chiết, sản xuất, ứng dụng sản phẩm này, nhưng những nghiên cứu sâu hơn về di truyền đối với gen isoflavone vẫn còn rất hạn chế. Hàm lượng isoflavone trong hạt đậu tương khá cao, cao nhất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
2 trong các loại hạt đậu. Tuy nhiên, để đáp ứng nhu cầu ứng dụng hoạt chất isoflavone làm dược phẩm của con người, yêu cầu đặt ra là phải nâng cao hơn nữa hàm lượng isoflavone trong hạt đậu tương. Phân lập và xác định trình tự gen tổng hợp isoflavone là bước đầu tiên tạo tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo như nghiên cứu về chức năng của gen, thiết kế vector chuyển gen… nhằm đạt mục đích nâng cao hàm lượng isoflavone trong hạt đậu tương. Xuất phát từ đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “So sánh trình tự gen liên quan đến tổng hợp isoflavone của 2 giống đậu tương”. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định được đặc điểm trình tự gen tổng hợp isoflavone phân lập từ 2 giống đậu tương có hàm lượng isoflavone khác nhau. 1.3. Nội dung nghiên cứu - Xác định hàm lượng isoflavone có trong một số giống đậu tương nghiên cứu. - Khuếch đại, chọn dòng và xác định trình tự gen tổng hợp isoflavone của 2 giống đậu tương có hàm lượng isoflavone khác nhau. - So sánh trình tự gen đã phân lập của 2 giống đậu tương nghiên cứu với nhau và với trình tự đã công bố trên GenBank. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cây đậu tương 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu tương Cây đậu tương hay còn gọi là cây đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill, là loại cây ăn hạt, thân thảo thuộc họ đậu (Fabaceae), có bộ nhiễm sắc thể 2n=40. Cây đậu tương thuộc: Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ : Fabales Họ : Fabaceae Phân họ : Faboideae Giống gt : Glycine Loài : max Cây đậu tương là cây trồng có lịch sử lâu đời. Theo các tài liệu nghiên cứu thì cây đậu tương có nguồn gốc từ vùng Mãn Châu phía Bắc Trung Quốc từ thời các triều đại Phong kiến, trong đó nhiều tài liệu cho rằng cây đậu tương được thuần hoá dưới triều đại Shang, hay còn gọi là triều đại nhà Thương, vào khoảng thế kỉ XVII đến thế kỉ XI trước Công Nguyên. Từ đây cây đậu tương được lan truyền sang Nhật Bản, Triều Tiên vào khoảng thế kỷ thứ VIII, sau đó truyền bá sang các nước châu Á khác như Thái Lan, Malaysia, Hàn Quốc, Việt Nam.. [2], [4]. Đến thế kỷ XVII, cây đậu tương được giới thiệu vào Châu Âu bởi các nhà thực vật học và được đặt tên là Glicine max. Thế kỷ XVIII cây đậu tương mới được du nhập vào Mỹ trên những thuyền hàng có hành trình từ Trung Quốc. Cây đậu tương được du nhập vào Châu Âu trước nhưng do khí hậu và đất đai ở đây không mấy phù hợp nên việc trồng trọt đậu tương tại Mỹ phát Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
4 triển nhanh chóng hơn nhiều. Cho đến ngày nay, Mỹ vẫn là một trong những quốc gia đứng đầu về sản xuất sản phẩm hạt đậu tương chiếm 50% sản lượng trên toàn thế giới, tiếp theo là Trung Quốc, Ấn Độ. Cây đậu tương là một trong năm cây thực phẩm quan trọng ở Hoa Kì, theo số liệu thống kê của bộ nông nghiệp Hoa Kì năm 2008 diện tích trồng cây đậu tương chuyển gen chiếm 92% trong tổng diện tích trồng cây đậu tương trên cả nước [5], [6], [10]. Ngày nay, cây đậu tương đã trở nên phổ biến và được trồng ở rất nhiều nước trên thế giới, trở thành cây thực phẩm có giá trị kinh tế cao, quan trọng nhất trong các loại cây thuộc họ đậu, nhờ vào những đặc điểm ưu việt vượt trội so với các loại cây đậu khác, như hàm lượng protein, lipid cao, chứa nhiều vitamin, các khoáng chất và nhiều loại hoạt chất thảo mộc có lợi cho sức khoẻ con người. 1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây đậu tương Cây đậu tương là loại cây thân thảo, hằng năm. Thân cây mảnh, cao từ 0,8m đến 0,9m, có lông, cành hướng lên phía trên. Một cây đậu tương hoàn chỉnh bao gồm rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt [6]. Rễ Đậu tương là cây rễ cọc, bộ rễ gồm có rễ cái (rễ chính) và các rễ bên (rễ phụ). Rễ cái có thể ăn sâu vào đất đến 150 cm hoặc sâu hơn, nhưng trong điều kiện bình thường chỉ ăn sâu vào khoảng 20-30 cm. Điểm đặc biệt của bộ rễ đậu tương là trên rễ, cả rễ cái và rễ bên, có chứa các nốt sần. Nốt sần là phần vỏ rễ phình ra và trong đó có hàng tỷ vi khuẩn Rhizobium japonicum sinh sống. Vi khuẩn này hình gậy, sống trong đất, có khả năng đi vào rễ và cố định đạm từ khí trời, với lượng đạm cung cấp cho cây khoảng 30-60kg/ha [10]. Thân, cành Đậu tương là cây thân thảo, thân hình tròn, chia đốt, ít phân cành. Trên thân đậu tương có nhiều lông nhỏ. Thân đậu tương thường đứng, cũng có khi thân bò hay nửa bò, thường có màu xanh hoặc màu tím, chiều cao trung bình 0,5-1,2m, cao nhất có thể lên đến 1,5m. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
5 Cành mọc ra từ các đốt trên thân, hướng lên trên. Số cành trên thân nhiều hay ít phụ thuộc vào giống, đất đai và kỹ thuật canh tác. Nhiều giống đậu tương chỉ có 1-2 cành hoặc không có cành. Các cành mọc ra ở đốt thứ nhất hoặc đốt thứ 2 trên cây sẽ mập và khoẻ hơn các cành bên trên. Cành cùng với thân chính sẽ tạo thành tán cây đậu tương [6], [10]. Lá Lá mọc cách, có 3 loại chính là lá mầm, lá đơn, lá kép. Lá có nhiều hình dạng khác nhau như hình trái xoan, trứng, tròn, dài, ô van, mũi lá gần nhọn, không đều ở gốc. Mặt lá thường có nhiều lông trắng. Lá mầm (lá tử diệp): Lá mầm mới mọc có màu vàng hay xanh lục, khi tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh. Hạt giống to thì lá mầm chứa nhiều dinh dưỡng nuôi cây mầm, khi hết chất dinh dưỡng lá mầm sẽ khô héo đi. Lá nguyên (lá đơn): Lá nguyên xuất hiện sau khi cây mọc từ 2-3 ngày và mọc phía trên lá mầm. Lá đơn mọc đối xứng nhau. Lá đơn to màu xanh bóng là biểu hiện cây sinh trưởng tốt. Lá đơn nhọn gợn sóng là biểu hiện cây sinh trưởng không bình thường. Lá kép: Mỗi lá kép có 3 lá chét, có khi 4-5 lá chét. Lá kép mọc so le, lá kép thường có màu xanh tươi khi già biến thành màu vàng nâu. Cũng có giống khi quả chín lá vẫn giữ được màu xanh. Phần lớn trên lá có nhiều lông tơ. Số lượng lá kép nhiều hay ít, diện tích lá to hay nhỏ chi phối rất lớn đến năng suất và phụ thuộc vào thời vụ gieo trồng. Các lá nằm cạnh chùm hoa nào giữ vai trò chủ yếu cung cấp dinh dưỡng cho chùm hoa ấy. Nếu vì điều kiện nào đó làm cho lá bị úa vàng thì quả ở vị trí đó thường bị rụng hoặc lép [1], [6]. Hoa Đậu tương có hoa dạng cánh bướm, ống đài năm cánh không bằng nhau. Hoa có màu trắng hay tím xếp thành chùm ở nách lá, đầu cành hoặc thân, mỗi nách lá mang một chùm hoa, mỗi chùm hoa có từ 1-10 hoa, thường là 7-8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
6 hoa. Đậu tương là cây có hoa lưỡng tính, hoàn toàn tự thụ phấn. Cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian ra hoa tuỳ thuộc vào giống và thời vụ gieo do chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ. Điều kiện thích hợp cho sự nở hoa là ở nhiệt độ 25-280C, ẩm độ không khí 75-80%, ẩm độ đất 70-80%. Cây đậu tương cho nhiều hoa nhưng tỷ lệ hoa không thành quả chiếm 20-80% [6]. Quả và hạt Quả thõng, hình lưỡi liềm, gân bị ép, trên quả có nhiều lông mềm màu vàng, thắt lại giữa các hạt. Quả đậu tương thuộc loại quả giáp, khi chín thì quả chuyển sang màu vàng hoặc xám. Mỗi quả có từ 1-4 hạt. Quả đậu tương gồm 2 nửa của lá noãn, nối với nhau ở phần bụng và lưng. Trên cả 2 đường nối biểu bì của quả cong vào phía trong tạo nên một lớp nhu mô thẳng đứng, lớp nhu mô này tách mô dẫn thành 2 vùng giúp quả tách ra khi quả chín. Hạt đậu tương cũng như hạt của nhiều loại họ đậu khác là không có nội nhũ mà chỉ có một lớp vỏ bao quanh một phôi lớn. Trong hạt, phôi thường chiếm 2%, 2 lá tử điệp chiếm 90% và vỏ hạt 8% tổng khối lượng hạt. Hình dạng hạt có nhiều hình như hình cầu, dẹt, dài và oval. Màu sắc rốn hạt khác nhau đặc trưng cho từng giống. Hạt có kích thước to nhỏ khác nhau tuỳ theo từng giống, khối lượng hạt trung bình khoảng 200-400mg/hạt [2], [3], [6]. Đặc điểm sinh thái học của cây đậu tương Nhiệt độ thích hợp ở giai đoạn nẩy mầm và giai đoạn cây con là từ 24 - 300C, độ ẩm ở giai đoạn nẩy mầm khoảng từ 75 - 80% nhưng đến giai đoạn cây non độ ẩm lại giảm xuống 50 - 60%. Nhiệt độ 24 -340C là nhiệt độ thích hợp cho giai đoạn ra hoa kết trái, ở giai đoạn này nhu cầu độ ẩm tăng gần như giai đoạn nẩy mầm từ 70 -80%, sang đến giai đoạn quả chín nhiệt độ thích hợp giảm còn 20 - 250C và độ ẩm cũng giảm mạnh xuống mức 35 - 45%. Ở cây đậu tương lượng mưa cần phải đạt từ 700 mm là tốt nhất. Đa số các giống đậu tương có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau như: đất phù sa, đất xám, đất giồng cát, những loại đất này thường có thành phần cơ giới nhẹ, độ PH từ 5-8 [8]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
7 1.1.3. Thành phần dinh dưỡng trong hạt đậu tương  Thành phần hóa học trong đậu tương. Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, giàu protein, lipid, vitamin và muối khoáng. Đậu tương là loại hạt mà giá trị của nó được đánh giá đồng thời cả về protein và lipid. Bảng 1.1. Thành phần hóa học của hạt đậu tương [7] Thành phần, % trọng lượng khô Các phần của Protein Lipid Tro Carbohydrat hạt đậu tương (%) (%) (%) (%) Hạt nguyên 40 20 4,9 35 Tử diệp 43 23 5 29 Vỏ hạt 8,8 1 4,3 86 Phôi 41 11 4,4 43 Protein Đậu tương được nhiều nhà khoa học xem như là chìa khóa để giải quyết nạn thiếu protein trong dinh dưỡng của con người. Protein trong hạt đậu tương chứa khoảng trên 38% tùy loại. Hiện nay nhiều giống đậu tương có hàm lượng protein đặc biệt cao tới 40-45%. Có những chế phẩm của đậu tương mang tới 90-95% protein, đây là nguồn thực vật có giá trị cao cung cấp cho con người. Protein đậu tương dễ tiêu hóa hơn thịt và không có các thành phần tạo thành cholesterol, không có các dạng acid uric,…ngày nay người ta mới biết nó chứa chất Leucithine có tác dụng làm cơ thể trẻ nâu, sung sức, làm tăng thêm trí nhớ, tái sinh các mô, làm cứng xương và tăng sức đề kháng cho cơ thể. Protein đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong các protein thực vật bởi vì nó đươc tạo bởi các amino acid, trong đó có đủ các loại amino acid không thay thế [50]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
8 Bảng 1.2. Hàm lượng amino acid không thay thế trong protein đậu tương [24] Amino acid Trp Leu Ile Val Thr Lys Met Phe Giá trị 1,1% 8,4% 5,8% 5,8% 4,8% 6,0% 1,4% 3,8% Lipid Ở đậu tương, hàm lượng lipid chiếm từ 12 - 25% khối lượng khô, trong đó hàm lượng các axit béo no thấp, khoảng 13%, không có cholesterol, 30% là các axit béo chưa no một nối đôi. Lượng axit béo không no cần thiết: axit linoleic 50% và đặc biệt có 7% axit anpha linolenic là nguồn cung cấp axit béo chuỗi mạch dài omega 3 quan trọng cho cơ thể như DHA (Docosa Hexaenoic Acid) và EPA (Eicosa Pentaenoic Acid) [47]. Hàm lượng lipid do đậu tương cung cấp có chất lượng cao vì vậy đậu tương được sử dụng rộng rãi trong công nghệ chế biến thực phẩm. Hiện nay, mức sống ngày càng được cải thiện nên con người chuộng dầu thực vật hơn mỡ động vật. Vitamin Hạt đậu tương cũng chứa khá nhiều các loại vitamin, cả tan trong dầu và tan trong nước, đặc biệt là hàm lượng của vitamin B2 và B1. Ngoài ra, trong đậu tương còn có các loại vitamin như: PP, A, E, K, C, D,…Trong hạt đậu tương khô chứa khoảng 5% khoáng, với các nguyên tố khoáng đa lượng như muối của K, P, Mg, S, Ca, Cl, Na. Hàm lượng trung bình của các nguyên tố khoáng này nằm trong khoảng 0,2-2,1%. Những nguyên tố khoáng vi lượng gồm có: Cu, Zn, Fe, Co, Pb, I, Se, Mn, Cd,… Hàm lượng của những nguyên tố khoáng vi lượng này dao động khoảng 0,01-140 ppm [10], [24]. Bảng 1.3. Thành phần vitamin trong đậu tương [24] Thành phần Đơn vị Hàm lượng Thiamine g/g 6,25-6,85 Riboflavine g/g 0,92-1,19 -tocopherol g/g 10,9-28,4 Vitamine E -tocopherol g/g 150-190 -tocopherol g/g 24,6-72,5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
9  Thành phần hoạt chất thảo mộc trong đậu tương Lecithin (phosphatidyl choline) Trong đậu tương lecithin chiếm khoảng 0,5-1,5%. Lecithin là một nguồn quan trọng của choline. Lecithin là nguồn cung cấp nhóm methyl cần thiết cho sự trao đổi chất bình thường, tham gia xây dựng cấu trúc tế bào. Lợi ích về mặt chữa bệnh của lecithin bao gồm: giảm nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch, ngăn ngừa sự phát triển bất thường của bào thai, giúp tăng cường trí nhớ, ngăn ngừa hoặc làm giảm tác dụng phụ của một số loại thuốc [24]. Saponins Trong protein đậu tương có chứa 0,1-0,3% saponins. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng saponins có nhiều công dụng tích cực như: giảm lượng cholesterol trong máu, ngăn ngừa sự phát triển của các tế bào ung thư, tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể [24]. Trypsin inhibitors Có 2 loại chất ức chế trypsin được phân lập ra từ đậu tương là: Kunitz trypsin inhibitor và Bowman-Birk (BB) inhibitor. Hai chất này đều có khả năng ức chế enzyme trypsin trong cơ thể người, riêng BB inhibitor còn có khả năng ức chế chymotrypsin. Các trypsin inhibitors này dễ bị phá hủy bởi nhiệt. Nhiều nghiên cứu mới đây cho thấy rằng, các trypsin inhibitors có thể là nguyên nhân gây ra chứng phình to tuyến tụy ở trẻ nhỏ. Bên cạnh đó, người ta cũng thấy được rằng BB inhibitor cũng có khả năng ngăn ngừa các tác nhân gây ra ung thư [5], [24]. Lectins Lectins hay còn được biết với tên là hemagglutinins, lectins được hình thành từ sự liên kết của 4 hyroxyproline. Lectins rất tốt cho sức khỏe như: làm giảm lượng insulin trong máu, giảm suy thoái của gan và thận [5]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
10 Phenolic acid Phenolic axit là một hoạt chất chống oxy hoá (anti - oxidant) và phòng ngừa các nhiễm sắc thể khỏi bị tấn công bởi những tế bào ung thư. Omega - 3 fatty acid Omega - 3 fatty axit là loại chất béo không bão hoà có khả năng làm giảm luợng cholesterol xấu đồng thời giúp làm gia tăng lượng cholesterol tốt trong máu [5]. Phytosterols Hạt đậu tương chứa khoảng 0,3-0,6 mg/g là phytosterols, trong đó stanol chiếm khoảng 2%. Campesterol, -sitosterol, stigmasterol là 3 phytosterol chính. Khi các sterols bị hydro hóa ta sẽ thu được stanol. Cấu trúc của sterol và stanol thì tương tự với cấu trúc của cholesterol động vật. Mặc dù phytosterol có cấu trúc tương tự như cholesterol, nhưng chúng lại có khả năng làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu giúp giảm nguy cơ về các bệnh tim mạch [5], [24]. Isoflavone Trong số các hoạt chất thảo mộc trong đậu tương thì isoflavone đang được quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học vì những tính năng vượt trội trong phòng và điều trị nhiều căn bệnh [5], [24]. 1.2. Thành phần và hoạt tính của isoflavone đậu tương 1.2.1. Thành phần của isoflavone đậu tương Các isoflavone trong đậu tương đã được biết đến với tác dụng estrogen yếu hoặc hoạt tính giống với hormone nên còn được gọi là hormone thực vật - phytoestrogen. Các chất có tác dụng “phytoestrogen” trong hạt đậu tương gồm chủ yếu là daidzin, genistin. Năm 2005, các nhà khoa học Brazil đã tiến hành phân tích 18 mẫu đậu tương. Mục đích của thí nghiệm là xác định thành phần lớp chất isoflavon từ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
11 đó so sánh tỉ lệ các chất trong 18 mẫu. Qua phân tích, cho thấy isoflavon trong đậu tương là một hợp chất phenolic gồm có: aglucone (daidzein, genistein và glyxitein), ß - glucozit (genistin, daidzin, glyxitin), ß - glucozit kết hợp với nhóm malonyl (6” - O - malonyldaidzin, 6” - O - malonylgenistin và 6” - O - malonylglycitin), ß - glucozit kết hợp với nhóm axetyl (6” - O - axetyldaidzin, 6” - O - axetylgenistin và 6” - O - axetylglycitin) [31]. Bằng các phương pháp sắc kí HPLC/DAD và phổ UV các nhà khoa học Bồ Đào Nha cũng đã xác định thành phần của isoflavone trong 40 mẫu hạt Đậu tương. Sau khi so sánh với các kết quả nghiên cứu đã được thực hiện trước đó với kết quả phân tích trong thí nghiệm, các khoa học gia khẳng định trong hạt Đậu tương các aglucone chiếm một lượng nhỏ, hợp chất chính trong hạt Đậu tương là các dẫn xuất malonyl và dẫn xuất axetyl của ß - glucozit. Báo cáo còn chỉ ra trong hạt Đậu tương còn chứa các aglucone : sissotrin, ononin; các dẫn xuất axetyl của ß - glucozit : 6” - axetylsissotrin, 6” - axetylononin; các dẫn xuất malonyl của ß - glucozit : 6” - malonylsissotrin, 6” - malonylononin [27]. Năm 2006 các nhà khoa học Hàn Quốc đã thực hiện một nghiên cứu so sánh thành phần isoflavone trong phôi, lá mầm, hạt và vỏ hạt Đậu tương. Kết quả nhận được, tổng tỉ lệ trung bình của isoflavone là 2887μg/g trong phôi, 575μg/g trong hạt, 325μg/g trong lá mầm, 33μg/g trong vỏ hạt. Các khoa học gia cũng đã phân tách được 12 đồng phân isoflavone trong 90 phút/mẫu thí nghiệm bằng phương pháp HPLC - PDA [16]. Cấu trúc cơ bản của isoflavon gồm 2 vòng bezen: A và B nối với một dị vòng pyron. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn