Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Tối ưu một số điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng nấm Aspergillus oryzae VTCC - F - 0187

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:59

Thêm vào BST

Báo xấu

37
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Tối ưu một số điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng nấm Aspergillus oryzae VTCC - F - 0187 được thực hiện với mục tiêu nhằm tạo quy trình sản xuất protease ngoại bào của chủng A. oryzae VTCC-F-0187 từ nguyên liệu rẻ và sẵn có trong nước. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Tối ưu một số điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng nấm Aspergillus oryzae VTCC - F - 0187

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ------------------------------------------ LÝ THỊ HUYỀN TỐI ƯU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE VTCC – F - 0187 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2018
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC -------------------------------------------------- LÝ THỊ HUYỀN TỐI ƯU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE VTCC – F - 0187 Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 8 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS. Trịnh Đình Khá THÁI NGUYÊN - 2018
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và nhóm nghiên cứu. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Mọi sự giúp đỡ của các cá nhân và tập thể đều được ghi nhận trong lời cám ơn. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những gì đã cam đoan ở trên. Tác giả Lý Thị Huyền
ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trịnh Đình Khá giảng viên trường Đại học Khoa học, đã định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hóa chất cũng như trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện chu đáo cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có được kết quả như ngày hôm nay. Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó ! Thái Nguyên, tháng 10 năm 2018 Học viên Lý Thị Huyền
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii MỤC LỤCDANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................... iii DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................v DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... vii MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1. Lý do chọn đề tài .....................................................................................................1 2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................................2 3. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................................2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................3 1.1. Protease ................................................................................................................3 1.1.1. Khái niệm ..........................................................................................................3 1.1.2. Phân loại protease .............................................................................................4 1.1.3. Cơ chế xúc tác ...................................................................................................8 1.1.4. Nguồn thu protease ...........................................................................................9 1.1.5. Ứng dụng .........................................................................................................11 1.2. Sinh tổng hợp protease .......................................................................................14 1.2.1. Chủng giống ....................................................................................................14 1.2.2. Môi trường nuôi cấy ........................................................................................14 1.2.3. Các phương pháp nuôi cấy ..............................................................................14 1.2.4. Thu nhận protease ...........................................................................................15 1.2.5. Các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp protease của A. oryzae ...............................................................................................................17 1.3. Sản xuất protease từ Aspergillus oryzae ............................................................19 1.3.1. Aspergillus oryzae ...........................................................................................19 1.3.2. Sản xuất chế phẩm protease ............................................................................20 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............24 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu .....................................................................................24
iv 2.1.1. Chủng giống ....................................................................................................24 2.1.2. Môi trường nuôi cấy ........................................................................................24 2.1.3. Hóa chất ..........................................................................................................24 2.1.4. Thiết bị, dụng cụ .............................................................................................25 2.1.5. Dung dịch và đệm ...........................................................................................25 2.2. Địa điểm và thời gian .........................................................................................26 2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................26 2.3.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp protease .....................................................................26 2.3.2. Xác định hoạt độ protease ...............................................................................26 2.3.3. Tối ưu một số yếu tố môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease ......................................................................................................29 2.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp protease .............................................................................................................30 2.3.5. Xử lý số liệu ....................................................................................................31 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................32 3.1. Khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187 .............32 3.2. Tối ưu các điều kiện sinh tổng hợp protease ......................................................33 3.2.1. Tối ưu tỉ lệ bột lõi ngô và bột đậu tương ........................................................33 3.2.2. Tối ưu tỉ lệ cám gạo bổ sung ...........................................................................34 3.2.3. Tối ưu độ ẩm ...................................................................................................35 3.2.4. Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy .................................................................................36 3.2.5. Tối ưu pH nuôi cấy .........................................................................................37 3.2.6. Tối ưu thời gian lên men .................................................................................39 3.3. Sản xuất chế phẩm .............................................................................................40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................44 PHỤ LỤC .................................................................................................................48
v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại protease theo pH hoạt động tối ưu ..............................................4 Bảng 2.1. Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm ...........................................24 Bảng 2.2. Thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm ...................................................25 Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm được sử dụng trong thí nghiệm ...........25 Bảng 2.4. Nồng độ pha loãng Tyrosine ....................................................................27 Bảng 2.5. Tỉ lệ tương ứng giữa bột đậu tương và bột lõi ngô ...................................29 Bảng 2.6. Tỉ lệ tương ứng giữa bột đậu tương, bột lõi ngô và bột cám gạo .............30
vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.2. Sơ đồ phân loại protease ............................................................................5 Hình 1.3. Mô hình phân tử enzyme protease (papain) ...............................................6 Hình 1.4. Mô hình phân tử enzyme protease (renin) .................................................7 Hình 2.1. Đường chuẩn Tyrosine ..............................................................................28 Hình 3.1. Hoạt tính phân giải casein của dịch chiết enzyme ngoại bào từ cơ chất lên men xốp chủng A. oryzae VTCC-F-0187 ..........................................32 Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất bột đậu tương/lõi ngô đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187..........................33 Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ cám gạo đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187 ........................................................35 Hình 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm tới khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187..........................................................................36 Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187 ...............................................................37 Hình 3.6. Ảnh hưởng của pH môi trường tới khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187 ...............................................................38 Hình 3.7. Khả năng sinh protease theo thời gian của chủng A. oryzae VTCC-F- 0187 .........................................................................................................39 Hình 3.8 Lên men chủng A. oryzae VTCC-F-0187 sản xuất chế phẩm protease .....41 Hình 3.9. Khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187 trong điều kiện tối ưu sau các lần lên men ..............................................42
vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ BĐT Bột đậu tương LN Lõi ngô CG Cám gạo TCA Tricloacetic acid OD Optical density (Độ hấp thụ ánh sáng) Hdp Hoạt độ protease hspl Hệ số pha loãng HT Hoạt tính HTtb Hoạt tính trung bình SS Sai số
1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Enzyme là chất xúc tác sinh học được tổng hợp trong các tế bào sống của cơ thể sinh vật. Enzyme tham gia các phản ứng sinh hóa trong cơ thể làm tăng tốc độ của phản ứng nhưng không bị thay đổi sau phản ứng. Enzyme không chỉ có ý nghĩa với quá trình sinh trưởng, sinh sản của sinh vật mà enzyme còn có vai trò rất quan trọng với con người trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường. Nhiều quốc gia đã sử dụng phổ biến enzyme trong sản xuất và đời sống mang lại lợi nhuận kinh tế lớn cho con người [2]. Protease là nhóm enzyme có khả năng thủy phân liên kết peptide được úng dụng nhiều trong công nghiệp, nông nghiệp và công nghệ sinh học [31]. Protease có vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp dược phẩm, y tế, thực phẩm và công nghệ sinh học, chiếm gần 60% thị trường enzyme [27], trong đó protease từ vi sinh vật ước tính chiếm khoảng 40% tổng lượng enzyme bán ra trên toàn thế giới [28]. Aspergillus oryzae là một loại nấm sợi được liệt kê như là một sinh vật "thường được công nhận là an toàn (GRAS)" của Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ. A. oryzae có một lịch sử sử dụng lâu dài trong ngành công nghiệp thực phẩm trong sản xuất thực phẩm lên men truyền thống, do hoạt tính phân giải protein cao [16, 24]. A. oryzae có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme ngoại bào như amylase, protease, pectinase, lipase, xylanase, cellulase, catalase, phytase, glucose oxidase [23]. Sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, chế phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên, giá thành chế phẩm protease còn khá cao do nhu cầu sử dụng enzyme ngày càng nhiều. Để phát triển các dây truyền sản xuất protease đạt hiệu quả cao, có nhiều công trình nghiên cứu đã được tiến hành để chọn lọc chủng giống, tìm kiếm cơ chất mới
2 thích hợp cho sinh tổng hợp protease. Bên cạnh đó thì việc tối ưu các điều kiện môi trường (nhiệt độ, độ pH, oxy hòa tan, thành phần môi trường) cũng được các nhà nghiên cứu rất quan tâm, mục đích tìm ra điều kiện nuôi cấy phù hợp nhất để thu được lượng protease nhiều và hạ giá thành sản phẩm. Để có thể chủ động sản xuất enzyme protease bằng các nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Tối ưu một số điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng nấm Aspergillus oryzae VTCC – F - 0187” 2. Mục tiêu của đề tài Tạo quy trình sản xuất protease ngoại bào của chủng A. oryzae VTCC - F - 0187 từ nguyên liệu rẻ và sẵn có trong nước. 3. Nội dung nghiên cứu - Khảo sát khả năng sinh protease của chủng A. oryzae VTCC - F – 0187 sau thời gian bảo quản chủng giống. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thành phần môi trường và điều kiện lên men đến khả sinh tổng hợp protease của A. oryzae VTCC - F - 0187. - Thử nghiệm lên men sản xuất chế phẩm protease thô.
3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Protease 1.1.1. Khái niệm Protease (peptide – hidrolase 3.4) là nhóm enzyme xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptide (-CO-NH-)n, polypeptide trong phân tử protein đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển amino acid [1]. Hình 1.1. Sơ đồ enzyme protease thủy phân phân tử Protein [7] Protease hay các enzyme proteolytic xúc tác các phản ứng thuỷ phân protein và peptide. Protease có trong nấm mốc, nấm men, vi khuẩn và trong các hạt ngũ cốc nảy mầm. Protease có 2 loại: proteinase và peptidase. Proteinase thuỷ phân protein thành các peptide và amino acid, peptidase thuỷ phân các peptide thành amino acid. Sự phân chia protease thành hai loại enzyme ở đây là điều ước lệ vì protease cũng thuỷ phân peptide [6]. Protease được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (có trong gan, dạ dày...). Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu. Quá trình thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nhiều loại chế phẩm. Quá trình này có thể được thực hiện nhờ các protease vi sinh vật được đưa vào trong quá trình lên men thu protease để sản xuất chế phẩm [7].
4 1.1.2. Phân loại protease Theo ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử, protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống phân loại các nhóm enzyme; Tuy nhiên, việc định tên cho các protease không dễ dàng tuân theo cách định tên phổ biến của hệ thống enzyme bởi sự đa dạng về cấu trúc và khả năng hoạt động. 1.1.2.1. Phân loại dựa vào pH hoạt động tối ưu Trước đây, protease được phân loại một cách đơn giản dựa vào pH hoạt động tối ưu thành ba nhóm: Protease acid, protease trung tính và protease kiềm [1]. Bảng 1.1. Phân loại protease theo pH hoạt động tối ưu Protease Đặc điểm Protease acid Hoạt động ở pH 2-6, gồm phần lớn là aspartic protease, một số cysteine protease và metalloprotease Protease trung Hoạt động ở pH 7-8, gồm cysteine protease, tính metalloprotease và một số serine protease Protease kiềm Hoạt động ở pH 8-13, chủ yếu là serine protease 1.1.2.2. Phân loại dựa vào các tiêu chí cơ bản Phân loại dựa trên ba tiêu chí cơ bản: loại phản ứng xúc tác, bản chất hóa học của trung tâm xúc tác và mối quan hệ giữa sự tiến hóa có liên quan đến cấu trúc, protease được chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase [1].
5 Hình 1.2. Sơ đồ phân loại protease [7] * Exopeptidase Phân loại dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide exopeptidase được phân chia thành hai loại: Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide; Carboxypeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide. * Endopeptidase Dựa vào động học của cơ chế xúc tác endopeptidase được chia thành bốn nhóm: Serin proteinase: Là những protease chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động
6 xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như Subtilisin Carlsberg, Subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các protease thực vật như papain, bromelin, một vài protein động vật và protease ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. Hình 1.3. Mô hình phân tử protease (papain) [11] Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, rennin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
7 Hình 1.4. Mô hình phân tử protease (renin) [17] Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA. Trong bốn nhóm protease kể trên, các cysteine proteinase và protease- tiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn suất acid của amino acid. Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase và amidase đối với các dẫn suất của amino acid. Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về câu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đổi bé, nhất là các cysteine proteinase. Các cysteine proteinase có trọng lượng phân tử vào khoảng 20.000- 27.000 dalton. Tuy nhiên, cũng có một số cysteine proteinase có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzyme của Penicillium cyoneo’fulvum (44.000), A. oryzae OUT 5038 (52.000) (Martin 1962, Morihara và Tsuzuki 1969). Trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với cysteine proteinase (khoảng 33.800 - 48.400). Protease tiol và nhiều protease-acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30.000 - 40.000 [8].
8 1.1.3. Cơ chế xúc tác Một chất xúc tác dù là hóa học hay sinh học đều có tác dụng làm tăng vận tốc của phản ứng. Vận tốc của phản ứng enzyme là lượng cơ chất bị chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm được tạo thành trong một đơn vị thời gian. Thông thường, lượng cơ chất hoặc lượng sản phẩm được biểu diễn bằng nồng độ phân tử (M) và đơn vị thời gian là giây [8]. Sự xúc tác của enzyme thường được thực hiện bằng cách tạo ra ít nhất một phức hợp tạm thời giữa enzyme và cơ chất. Mô hình đơn giản nhất là mô hình của Michaelis. Mô hình này thừa nhận rằng phản ứng chỉ xảy ra với một cơ chất và tạo thành chỉ một sản phẩm [8]: E + S → ES → P + E Trong đó: E là Enzyme, S là cơ chất (Substrate), ES là phức hợp enzyme - cơ chất, P là sản phẩm (Product) * Giai đoạn đầu: phức hợp enzyme cơ chất dược tạo thành một cách nhanh chóng và thuận nghịch nhờ các tương tác phi đồng hóa trị giữa cơ chất và các amino acid nhận biết của tâm hoạt động của enzyme [8]. E (enzyme) + S (cơ chất)→ ES (hợp chất trung gian) * Giai đoạn 2 (giai đoạn xúc tác ): gồm một chuỗi các phản ứng trung gian nhằm biến đổi phức ES thành trạng thái quá độ trong đó cơ chất được liên kết với các gốc amino acid xúc tác của tâm hoạt động enzyme (thường bằng liên kết đồng hóa trị). Rồi trạng thái quá độ này sẽ tự chuyển hóa thành phức enzyme - sản phẩm và cuối cùng phức enzyme - sản phẩm sẽ phân ly thành enzyme tự do và sản phẩm [8]. Protease là enzyme xúc tác thủy phân protein, về cơ bản cơ chế xúc tác sinh học của enzyme người ta đề ra nhiều giả thuyết để giải thích, nhưng đều thống nhất ở chỗ quá trình xúc tác bắt đầu bằng sự kết hợp giữa enzyme và cơ chất thành hợp chất trung gian [2]. E (enzyme) + S (cơ chất)→ ES (hợp chất trung gian)
9 1.1.4. Nguồn thu protease 1.1.4.1. Protease động vật Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều enzyme nhất. Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ phomat. Renin làm biến đổi casein thành paracasein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+. Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiểm pepsin (trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì. Khi đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepsin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi. Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài Eudothia parasitica và Mucor purillus [1]. 1.1.4.2. Protease thực vật Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein. Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hoá. Ficin thu được từ nhựa cây sung (Ficus carica). Enzyme được sử dụng thuỷ phân protein tự nhiên [1]. 1.1.4.3. Protease vi sinh vật Enzyme protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số và một số loại nấm men.
10 * Vi khuẩn: Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng. Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein. Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ 20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12 [1]. * Nấm: Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum)… Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3 [1]. Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti...
11 cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho mát. * Xạ khuẩn: Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. Trerimosus... Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là protease được tách chiết từ S. grieus, enzyme này có tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid. Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Protease từ S. fradiae cũng có hoạt tính elastase cao nên còn được dùng trong công nghiệp chế biến thịt. Như vậy, vi sinh vật được coi là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính như sau: Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật; Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16-100 giờ nên có thể thu hoặc nhiều lần quanh năm; Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi); Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dể tổ chức sản xuất. Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc, gây bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp [1]. Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó [1]. 1.1.5. Ứng dụng Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công