Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Xác định gen kháng thuốc của các chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm được phân lập từ thịt tươi tại một số địa điểm ở Hà Nội

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:62

Thêm vào BST

Báo xấu

40
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm xác định được gen kháng thuốc của các chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm được phân lập từ thịt tươi tại một số địa điểm ở Hà Nội. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Xác định gen kháng thuốc của các chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm được phân lập từ thịt tươi tại một số địa điểm ở Hà Nội

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ NHÃ QUYÊN XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG THUỐC CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ THỊT TƯƠI TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM Ở HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2017
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ NHÃ QUYÊN XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG THUỐC CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ THỊT TƯƠI TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM Ở HÀ NỘI Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh THÁI NGUYÊN - 2017
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện với sự giúp đỡ của cán bộ, nhân viên phòng Hệ gen học vi sinh - Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố ở bất kỳ công trình nào khác. Thái Nguyên, tháng 5 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Nhã Quyên
ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất của mình tới PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh - Trưởng phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu; phòng Đào tạo; khoa Công nghệ sinh học Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, các quý thầy, cô trực tiếp giảng dạy, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Võ Thị Bích Thủy, ThS. Nguyễn Hoài Thu và các anh chị em, cán bộ phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè cùng tất cả các thầy cô luôn luôn động viên, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong tiến trình tôi học tập và làm luận văn này. Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi mong nhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè để tôi có thể có được kết quả tốt hơn. Thái Nguyên, tháng 5 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Nhã Quyên
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii MỤC LỤC ....................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................. vi DANH MỤC BẢNG ...................................................................................... vii DANH MỤC HÌNH ...................................................................................... viii MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ....................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................. 2 3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2 4. Ý nghĩa khoa học của đề tài ...................................................................... 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3 1.1.Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella ....................................... 3 1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.................................................. 3 1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.................................................... 5 1.2. Một số đặc điểm của vi khuẩn Salmonella ............................................ 7 1.2.1. Đặc điểm hình thái .......................................................................... 8 1.2.2. Đặc tính nuôi cấy ............................................................................ 8 1.2.3. Đặc tính hóa sinh........................................................................... 10 1.2.4. Cấu trúc của Salmonella ............................................................... 10 1.2.5 Các yếu tố gây bệnh của Salmonella ............................................. 12 1.3. Tình hình ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella ....................... 13 1.3.1. Ngộ độc thực phẩm ....................................................................... 13 1.3.2. Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella ................................ 14 1.4. Hiện tượng kháng kháng sinh của Salmonella..................................... 15 1.4.1. Hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn .................................. 15
iv 1.4.2. Hiện tượng kháng kháng sinh của Salmonella ............................. 15 1.5. Gen kháng kháng sinh .......................................................................... 16 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 19 2.1. Vật liệu ................................................................................................. 19 2.1.1. Thu thập và phương pháp lấy mẫu ................................................ 19 2.1.2. Hóa chất nghiên cứu ..................................................................... 19 2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 20 2.1.1. Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Salmonella................................... 20 2.2.2. Định type vi khuẩn Salmonella ..................................................... 21 2.2.3. Thử khả năng kháng kháng sinh ................................................... 21 2.2.4. Phương pháp xác định một số gen kháng kháng sinh của chủng Salmonella Typhimurium bằng phương pháp RT-PCR ......................... 22 2.3. Phương pháp xử lý số liệu.................................................................... 25 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 26 3.1. Thu thập mẫu ở một số loại thịt tươi .................................................... 26 3.2. Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella spp. trên các môi trường cơ bản .......................................................................................................... 27 3.1.1. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. trong mẫu thịt lợn, gà, bò ................................................................................. 27 3.1.2. Kết quả giám định các đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được ............................................................... 29 3.2. Kết quả định type vi khuẩn Salmonella phân lập được ....................... 30 3.3. Kết quả xác định tính kháng kháng sinh của các chủng Salmonella Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập được ................................ 32 3.4. Kết quả phát hiện và đánh giá gen kháng thuốc của các chủng Salmonella Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập được ............. 35 3.4.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số: Lựa chọn 3 chủng Salmonella Typhimurrium S181, S360, S384 để tiến hành tách chiết RNA. ............ 35
v 3.4.2. Kết quả RT-PCR phát hiện các gen kháng kháng sinh của chủng Salmonella Typhimurium. ...................................................................... 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 43 1. Kết luận ................................................................................................... 43 2. Kiến nghị ................................................................................................. 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 45
vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp : Base pair cs : Cộng sự dH2O : Nước khử ion DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : deoxyribonucleotide triphosphates EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetace Axit EtBr : Ethidium Bromide Kb : Kilobase OD : Optical density PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic acid RT-PCR : Reverse transcription - Polymerase Chain Reaction TAE : Tris-acetate-EDTA
vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Trình tự mồi và nhiệt độ gắn mồi của các gen sử dụng trong nghiên cứu .......................................................................... 24 Bảng 3.1 Danh sách thu thập mẫu thịt tươi tại một số địa điểm ở Hà Nội 26 Bảng 3.2. Tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella spp. từ các mẫu thịt ........... 27 Bảng 3.3. Kết quả giám định đặc tính nuôi cấy và hình thái khuẩn lạc của các chủng Salmonella spp. trong quá trình phân lập .................. 29 Bảng 3.4. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được ........................................ 30 Bảng 3.5. Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. .......................................................................... 31 Bảng 3.6. Tổng hợp kết quả kháng các nhóm kháng sinh của 3 type Salmonella Typhimurium (ST) phân lập được ........................... 33 Bảng 3.7. Kết quả đánh giá gen kháng kháng sinh của các chủng Salmonella Typhimurium S181, S360, S384 ............................. 41
viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Vi khuẩn Salmonella ............................................................... 8 Hình 2.1. Sơ đồ nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Salmonella theo tiêu chuẩn ISO 6579 - 2005.......................................................... 20 Hình 3.3. Kết quả mức độ kháng các nhóm kháng sinh của 3 type Salmonella Typhimurium (ST) phân lập được ....................... 33 Hình 3.4. Kết quả điện di đồ sản phẩm RNA tổng số của 3 chủng Salmonella 1,2,3: S181, S360, S384 ...................................... 35 Hình 3.5. Kết quả RT-PCR phát hiện sự có mặt của gen 16S (550 bp) của chủng Salmonella Typhimurium S181, S360, S384............... 36 Hình 3.6. Kết quả RT-PCR phát hiện sự có mặt của gen tetA (494bp), sull II (434bp, avrA (192bp), aadA (228bp), blaTEM (310bp), gyrB (219bp), prmA (187bp) của chủng Salmonella Typhimurium S181, S360, S384 M: thang chuẩn (DNA 1Kb).................................... 37 Hình 3.7. Tỷ lệ biểu hiện gen tetA, sull II, avrA, aadA, blaTEM, gyrB, prmA/16S rRNA của chủng Salmonella Typhimurium được phân tích bằng phương pháp RT-PCR. Gen 16S rRNA được dùng để so sánh ..................................................................... 39
1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Trong những năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày càng trở nên cấp thiết, các báo cáo cho thấy phần lớn các vụ ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật. Đã có nhiều cảnh báo nhưng ngộ độc thực phẩm vẫn đang gia tăng và ngày càng nghiêm trọng. Theo số liệu thống kê của Cục vệ sinh An toàn thực phẩm, Bộ Y tế, mỗi năm Việt Nam có chừng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000-10.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong. Tính riêng năm 2008, có 205 vụ ngộ độc thực phẩm, với 7828 người mắc, 161 người chết, trong đó 7,8% số vụ do nguyên nhân vi sinh vật gây ra. Sáu tháng đầu năm 2014, có 67 vụ ngộ độc thực phẩm với 2048 người mắc, 24 trường hợp tử vong. Có rất nhiều loài vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm như Clostridium butolinum, Escherichia coli, Listeria monocytogenes... Trong đó, Salmonella được biết đến là vi khuẩn hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm trên thế giới với các triệu chứng như buồn nôn, nhức đầu, sốt nhẹ, sau đó xuất hiện nôn mửa và tiêu chảy nhiều lần, có thể lẫn máu. Thường thì bệnh nhân có thể tự khỏi, nhưng đối với trẻ em, người già hoặc người bị suy giảm miễn dịch bệnh có thể gây nguy hiểm đến tính mạng. Mặc dù nhiễm trùng đường ruột do các chủng Salmonella thường tự khỏi, nhưng việc điều trị kháng sinh để ngăn chặn quá trình lây lan nhiễm trùng vẫn là điều cần thiết. Việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị cả người và động vật có thể ảnh hưởng đến khả năng kháng thuốc của Salmonella. Các chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm kháng thuốc phân lập được là mối đe dọa trực tiếp đến sức khỏe của con người do các chủng kháng thuốc này sẽ cản trở việc điều trị và là mối đe dọa gián tiếp khi sự kháng có thể được chuyển giao cho các mầm bệnh khác ở người. Do vậy việc giám sát tính mẫn cảm kháng sinh là quan trọng và cần thiết.
2 Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn và tầm quan trọng của việc bảo vệ sức khỏe con người chúng tôi đã tiến hành đề tài "Xác định gen kháng thuốc của các chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm được phân lập từ thịt tươi tại một số địa điểm ở Hà Nội”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định được gen kháng thuốc của chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm phân lập từ thịt tươi tại một số địa điểm ở Hà Nội. 3. Nội dung nghiên cứu - Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella trong các mẫu thịt tươi (gồm: thịt lợn, thịt gà, thịt bò) thu thập tại các địa điểm khác nhau trên địa bàn Hà Nội. - Nuôi cấy, phân lập và định type các chủng Salmonella từ các mẫu thịt, xác định các chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm. - Kiểm tra sự biểu hiện của gen kháng thuốc từ chủng Salmonella Typhymurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập được. 4. Ý nghĩa khoa học của đề tài Xác định được các gen kháng thuốc của chủng vi khuẩn Salmonella gây ngộ độc thực phẩm giúp cho việc nghiên cứu các bộ kit chẩn đoán nhanh vi khuẩn Salmonella trong thực phẩm.
3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella 1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Năm 1891, Jensen đã phân lập được Salmonella Dublin từ bệnh phẩm của bê bị tiêu chảy. Cũng vào năm đó Salmonella typhimurium được phát hiện ở vùng Greiswald và Breslau (Đức). Vào năm 1983, tại Breslau đã xảy ra một vụ ngộ độc thịt do ăn phải thịt bò ốm, kết quả ngộ độc đã xảy ra ở người [61]. Vi khuẩn Salmonella được phân lập từ thịt lợn chết bởi bệnh phó thương hàn thường gặp ở miền Tây của nước Mỹ là S. choleraesuis var kunzendorf, S. typhimurium và S. typhisuis [28]. Trong một vài trường hợp, ở lợn còn tìm thấy S. dublin và S. enteritidis. Hai serotype S. dublin và S. enteritidis cũng gặp ở lợn con đang theo mẹ. Từ những năm 1990 trở lại đây tỷ lệ nhiễm Salmonella ở Châu Âu đều không giảm, trong năm 2007 có khoảng 152.000 ca nhiễm Salmonella trên người được phát hiện tuy nhiên con số thực tế có thể cao gấp 10 lần. Salmonellosis là bệnh nhiễm trùng đường ruột phổ biến thứ hai tại Hoa Kỳ. Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) ước tính có hơn 1 triệu người nhiễm Salmonella, ơ Mỹ mỗi năm và trung bình có khoảng 20.000 ca nhập viện và gần 400 trường hợp tử vong do nhiễm Salmonella, theo một báo cáo năm 2011 [60]. Tháng 11/2013, tại thành phố Brisbane của Queensland (Australia) cũng xảy ra vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng do vi khuẩn Salmonella khiến 1 phụ nữ 77 tuổi thiệt mạng và hơn 220 người nhiễm bệnh. Nguyên nhân gây ra vụ việc do vi khuẩn Salmonella có trong trứng, thịt gia cầm và các loại thịt chưa được nấu chín [40]. Theo thông tin mới nhất được công bố vào 2/4/2015 bởi tổ chức Y tế thế giới (WHO), cho thấy mối đe dọa từ các bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm do vi khuẩn gây lên. Những con số được
4 công bố khiến người tiêu dùng trên toàn thế giới không khỏi hoang mang. Bao gồm 582 triệu các ca mắc phải một trong 22 căn bệnh truyền qua thực phẩm; 351.000 số ca tử vong liên quan đến an toàn thực phẩm trong đó có 52.000 ca tử vong do vi khuẩn Salmonella gây nên, 37.000 số ca tử vong do vi khuẩn E.coli, 35.000 người chết do norovirus (loại virus là nguyên nhân hàng đầu gây nên dịch bệnh từ thực phẩm bị ô nhiễm tại Hoa Kỳ), và 40% là tỷ lệ người ở độ tuổi dưới 5 mắc các bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm. Điều đáng chú ý nhất ở vi khuẩn Salmonella là sự gia tăng khả năng kháng thuốc của vi khuẩn này. Trong những năm gần đây, tốc độ gia tăng tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella đã được báo cáo nhiều ở các nước phát triển và cả những nước đang phát triển (Báo cáo của Bộ Y tế, 2008). Các nhà nghiên cứu của Wellcome Trust đã lập bản đồ mã gen trên 1.832 đối tượng nhiễm khuẩn Salmonella typhimurium thu thập từ 63 quốc gia trong khoảng thời gian từ năm 1992 đến 2013 cho thấy gần một nửa số vi khuẩn không hề bị tiêu diệt bởi những loại kháng sinh theo quy chuẩn. Trong nghiên cứu mô tả các dữ liệu từ các chương trình giám sát tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc trong thịt gà của Brazil (PREBAF) từ thời gian tháng 9/2004 đến tháng 7/2006 cho thấy trong 2.679 mẫu thịt gà thu thập được tại 15 bang thuộc 5 khu vực địa lý của đất nước có tới 8,9% (trung bình 2,7%) mẫu nhiễm Salmonella spp. Trong đó chủ yếu nhiễm 4 loài Enteritidis (48,8%), Infantis (7,6%), Typhimurium (7,2%) và Heidelberg (6,4%), nhưng nguy hiểm là các chủng đa kháng thuốc xuất hiện với tỷ lệ cao 53,2% (133 chủng/250 chủng thử nghiệm kháng thuốc) [43]. Trong nghiên cứu 236 mẫu nước sông ở Đài Loan, có 54 mẫu (chiếm 22,9%) nhiễm Salmonella ssp, 15 chủng Salmonella được phân lập xuất hiện cả một số typ thường gây nhiễm trùng cho người và gia súc, bao gồm Albany (27,8%), Newport (14,8%), Bareilly (13,0%), Derby (11,1%) và Typhimurium (7,4%). Đặc biệt 51,9% các mẫu kháng với ít nhất 1
5 trong 8 loại kháng sinh được thử nghiệm do trong các chủng vi khuẩn này tồn tại các gen kháng thuốc [43]. Các nhà khoa học cũng đã chứng minh rằng trong bộ gen của các loài vi khuẩn Salmonella gây bệnh có một loạt các gen liên quan đến việc ứng phó với điều kiện thiếu dưỡng chất, sức đề kháng kháng sinh, sự trao đổi chất sắt và các phản ứng sốc nhiệt [58]. Một số gen hilA, prgH, invF được phát hiện có mối quan hệ rất lớn đến khả năng kháng tetracycline của 2 chủng vi khuẩn Salmonella Typhimurium DT 104 và DT 193 [32]. Ngoài ra, amR là một yếu tố phiên mã của protein Rama, một yếu tố đa kháng quan trọng cũng được tìm thấy trong vi khuẩn [72] hoặc các gen kháng thuốc của Salmonella Typhimurium và Salmonella Newport thường được đặt trên plasmid CMY-2 [39]. Sahu (2013) cũng đã phát hiện ra 1 vùng đột biến tại locus 1 có khả năng đa kháng thuốc ở vi khuẩn S. typhimurium [59]. Hiện nay, trên thế giới vẫn tiếp tục có các nghiên cứu về các gen kháng thuốc của vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm, đặc biệt là vi khuẩn Salmonella nhằm xác định chính xác cơ chế đa kháng thuốc của các vi khuẩn Salmonella gây ngộ độc thực phẩm. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Tại Việt Nam, một số nghiên cứu về sự ô nhiễm Salmonella đã được thực hiện và công bố. Salmonella thường được tìm thấy trên thịt gà, thịt lợn, đồ nguội, trứng sống, nghêu sò ... là nguyên nhân của 70% vụ ngộ độc. Trong tổng số 1.416 mẫu thịt và sản phẩm từ thịt qua kiểm tra đã phát hiện tới 40,9% số mẫu nhiễm khuẩn Salmonella gây các bệnh về đường tiêu hóa. Vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra cho người và gia súc cũng đã được bắt đầu từ những năm 50. Viện Parteur Sài gòn trong những năm 1951- 1953 đã phân lập được 6 chủng Salmonella ở người (4 chủng từ máu, 2 chủng từ nước tiểu). Cũng ở Sài gòn, trong thời gian này cũng đã phân lập được 35 chủng từ 360 lợn, trong đó có 23 mẫu là S. choleraesuis [1].
6 Lê Văn Tạo và Nguyễn Thị Vui (1994) đã phân lập và xác định serotype của vi khuẩn Salmonella gây bệnh ở lợn, kết quả cho thấy: 50% các chủng được phân lập thuộc S. Choleraesuis; 12,5% S. Enteritidis; 6,25% S. Typhimurium và một số loại còn lại thuộc các serotype khác [18]. Trần Xuân Hạnh (1995) đã phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella ở lợn tại Thành phố Hồ Chí Minh cho kết quả: S. Typhisuis ở lợn bệnh là 16,9%; ở lợn bình thường 6-16 tuần tuổi là 4,2%; S. Paratyphi ở lợn 6-16 tuần tuổi là 2,8% [6]. Năm 2003, Võ Thị Bích Thủy nghiên cứu tình hình nhiễm Salmonella trên thực phẩm tại Hà Nội thấy tỷ lệ nhiễm cao nhất ở giò sống là 46,67%, tiếp theo là thịt bò 40%, thịt gà 39,29%, thấp nhất là thịt lợn 33,33% [25]. Cũng trong năm này, Lê Minh Sơn đã xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella trong thịt lợn giết mổ tiêu dùng nội địa từ 10,91-16,67% và thịt lợn xuất khẩu trung bình 1,42% [15]. Tô Liên Thu (2005) đã xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella của các mẫu thịt gà ở Hà Nội là rất cao 33% các mẫu lấy tại siêu thị, 40% các mẫu lấy tại chợ [22]. Tại các lò mổ là một trong những địa điểm rất quan trọng có nguy cơ cao ô nhiễm Salmonella vào thân thịt sau khi giết mổ. Trần Thị Hạnh và cs (2009) đã công bố tỷ lệ nhiễm Salmonella tại các cơ sở giết mổ lợn công nghiệp và cho kết quả: Chất chứa manh tràng của lợn là 59,18%, ở mẫu lau thân thịt là 70%, mẫu lau hậu môn là 66%, mẫu lau nền chuồng nhốt lợn chờ giết mổ là 40%, mẫu lau sàn nhà giết mổ là 28%, còn các mẫu nước kiểm tra không phát hiện Salmonella. Tại các cơ sở giết mổ lợn theo phương thức thủ công cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chất chứa manh tràng của lợn chờ giết mổ là 87,5%, ở các mẫu lau thân thịt là 75%, mẫu lau hậu môn là 55%, mẫu lau nền chuống nhốt lợn chờ giết mổ là 70%, mẫu lau sàn giết mổ là 80%, mẫu nước là 50% [7].
7 Ở nước ta, chăn nuôi lợn, gia cầm và thủy sản thường được bổ sung nhiều loại kháng sinh với mục đích kích thích tăng trưởng, phòng bệnh và điều trị, do vậy nồng độ kháng sinh tồn dư trong thịt thường cao gấp vài lần so với các quốc gia khác. Các nhà nghiên cứu Nhật Bản và Việt Nam đã thực hiện nghiên cứu về sự lan tràn của các chủng Salmonella kháng kháng sinh trong thịt lợn và thịt gia cầm bán lẻ ở miền Bắc Việt Nam. Kết quả phát hiện được 118 mẫu dương tính với vi khuẩn Salmonella phân lập từ 283 mẫu thịt bán lẻ (135 mẫu thịt lợn, 148 mẫu thịt gà) [65]. Cùng với các quá trình nghiên cứu chi tiết về vi khuẩn, các biện pháp phòng bệnh đã được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, trong đó có vacxin phòng bệnh. Nguyễn Văn Lãm (1968) đã tiến hành nghiên cứu chế vacxin phó thương hàn lợn con từ chủng Salmonella chuẩn của Trung Quốc. Hiện nay, các loại vacxin phòng bệnh phó thương hàn đã được một số công ty, xí nghiệp thuốc thú y sản xuất như vacxin nhược độc chủng TS-177, vacxin có bổ trợ như vacxin keo phèn hay vacxin nhũ hóa có bổ trợ dầu [8]. Trong những năm gần đây, ở Việt Nam hầu hết các nghiên cứu chỉ tập trung vào tìm hiểu tính kháng kháng sinh và các gen kháng kháng sinh ở các vi sinh vật gây bệnh phân lập từ các mẫu bệnh phẩm hoặc động vật. Các nghiên cứu về gen cũng như cơ chế kháng kháng sinh của các vi sinh vật gây bệnh phân lập từ thực phẩm chưa được đề cập nhiều, đặc biệt là nhóm vi khuẩn Salmonella Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm. Như vậy, việc nghiên cứu vi khuẩn Salmonella Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm một cách toàn diện để từ đó đề ra biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả, giữ gìn vệ sinh an toàn thực phẩm, bảo vệ sức khỏe con người là một yêu cầu cần thiết. 1.2. Một số đặc điểm của vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột do Salmon và Smith phát hiện vào năm 1886 khi xác định Salmonella Choleraesuis là
8 nguyên nhân gây bệnh dịch tả lợn (Hog Cholera) [17]. Trực khuẩn Salmonella thuộc bộ Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae. Giống Salmonella gồm hai loài: S. Enterica và S. Bongori đã được phân chia thành trên 3000 serotype theo bảng phân loại Kauffmann-White trên cơ sở cấu trúc của kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và đôi khi có cả kháng nguyên vỏ (kháng nguyên K). 1.2.1. Đặc điểm hình thái Vi khuẩn Salmonella là trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, có kích thước khoảng 0,4 - 0,6 x 1 - 3 m, không hình thành giáp mô và nha bào, có lông và di động được (trừ Salmonella Pullorum-gallinarum). Hình 1.1. Vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn bắt màu gram âm. Vi khuẩn có cả kháng nguyên thân O (Ohne Hauch) và kháng nguyên lông H (Hauch), chỉ có một số loài như Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi, Salmonella Dublin có thể chứa kháng nguyên Vi (là loại kháng nguyên có khả năng ngưng kết kháng thể O khi nó phát triển nhiều). 1.2.2. Đặc tính nuôi cấy Salmonella là trực khuẩn vừa hiếu khí vừa yếm khí, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 37oC, độ pH 7,2 - 7,6. Vi khuẩn có sức chịu đựng tốt
9 trong các điều kiện nuôi cấy. Chúng có thế sống sót trong môi trường thạch ở nhiệt độ -10oC trong 115 ngày, sống từ 4-8 tháng trong thịt ướp muối với tỷ lệ 29% ở nhiệt độ 6-12oC. Có rất nhiều môi trường dinh dưỡng chọn lọc được dùng trong phân lập Salmonella, hiện nay thường dùng như Brilliant Green Agar (BGA), Bismuth Sulfite Agar (BSA), Triple Sugar Ion (TSI), Xylose Lysine Deroxycholate (XLD), Mueller Kauffmann, Xylose Lysine Tetrathionate 4 (XLT4), Modified Semisolid Rappaport Vassiliadis (MSRV), Rambach, Kligler [58]. Khi nuôi cấy vi khuẩn Salmonella trong môi trường nước thịt: Sau vài giờ đã vẩn đục, sau 18 giờ canh trùng đục đều. Nếu nuôi lâu trong ống nghiệm thì đáy có cặn, trên bề mặt môi trường có màng mỏng. Trên môi trường BSA: Sau 18 giờ nuôi cấy ở 37 oC, vi khuẩn Salmonella mọc lên những khuẩn lạc đặc trưng, xung quanh khuẩn lạc màu nâu thẫm, càng vào giữa khuẩn lạc càng đậm chuyển gần sang màu đen, khuẩn lạc có màu ánh kim. Trên môi trường thạch thường: Khuẩn lạc dạng S (smooth) tròn, trong sáng hoặc xám, nhẵn bóng, rìa gọn và hơi lồi ở giữa, đường kính từ 1 - 1,5mm, thi thoảng thấy khuẩn lạc dạng R (rough), nhám, mặt trong mờ. Trên môi trường BGA: Vi khuẩn Salmonella thể hiện tính kiềm, hình thành khuẩn lạc màu đỏ. Trên môi trường XLD: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đen do H2S được tạo ra từ phản ứng điển hình của vi khuẩn Salmonella. Trên môi trường TSI: Vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc nhạt màu, mặt nghiêng trên môi trường có màu đỏ, màu hồng ở đáy cùng với sản sinh ra H2S làm cho môi trường có màu đen. Trên môi trường MSRV: Là môi trường chọn lọc những Salmonella có khả năng di động, vi khuẩn di động ra xung quanh môi trường tạo thành vòng màu trắng có thể quan sát được.
10 Trên môi trường XLT4: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc trung bình, màu đen, bóng, hơi lồi. Trên môi trường Rambach: Vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc trung bình, màu đỏ tím, bóng. Trên môi trường Kligler: Mặt nghiêng môi trường không đổi màu do vi khuẩn không lên men đường lactose, phần thạch đứng môi trường đổi màu do vi khuẩn lên men đường glucose làm thay đổi pH của môi trường và sinh H2S có màu đen. 1.2.3. Đặc tính hóa sinh Không len men đường : lactose, sucrose, andonitol, ... Lên men sinh hơi các loại đường: glucose, mannitol, sorbitol, ... Phản ứng indol âm tính (-), urease âm tính (-), Voges - Proskauer (VP) âm tính (-), H2S dương tính (+), Metyl - Red (MR) dương tính (+). Khả năng trao đổi chất đặc trưng của Salmonella là phân hủy nitrat thành nitrit, phân hủy đường glucose sinh hơi, phân hủy H2S và sử dụng citrat làm nguồn cung cấp cacbon duy nhất. Đặc tính sinh hóa có ý nghĩa lớn trong quá trình phân lập và giám định vi khuẩn, chính vì vậy khi xét nghiệm mẫu vật xác định sự có mặt của Salmonella cần thiết phải tiến hành các phản ứng sinh hóa. 1.2.4. Cấu trúc của Salmonella Vi khuẩn Salmonella có 3 loại kháng nguyên, đó là những chất khi xuất hiện trong cơ thể thì tạo ra kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợp đặc hiệu với những sản phẩm của sự kích thích đó, gồm: kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và kháng nguyên vỏ K. Vi khuẩn thương hàn (S. Typhi) có kháng nguyên V (Virulence) là yếu tố chống thực bào giúp cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu. * Kháng nguyên thân O (O - Antigen) Kháng nguyên thân O nằm ở thành tế bào vi khuẩn, có cấu trúc lipopolysaccharide (LPS) là thành phần chính cấu tạo nên lớp màng ngoài của