Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:61

Thêm vào BST

Báo xấu

41
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu công thức khử trùng hạt Đông hầu vàng; nghiên cứu ảnh hưởng của chất phụ gia đến sự sinh trưởng của cây Đông hầu vàng; nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinin, tổ hợp nhóm cytokinin và auxin, 2,4- D đến khả năng tạo đa chồi cây Đông hầu vàng; nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm auxin đến khả năng tạo rễ cây Đông hầu vàng; nghiên cứu giá thể thích hợp để đưa cây Đông hầu vàng ra ngoài tự nhiên.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHAN THỊ THÚY XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY ĐÔNG HẦU VÀNG (TURNERA ULMIFOLIA) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN, NĂM 2018
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHAN THỊ THÚY XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY ĐÔNG HẦU VÀNG (TURNERA ULMIFOLIA) Ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. PHẠM THỊ THANH NHÀN THÁI NGUYÊN, NĂM 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn: “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia)” là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Mọi kết quả thu được là trung thực, không sao chép từ kết quả nghiên cứu khác. Tất cả những tham khảo và kế thừa đều được trích dẫn đầy đủ. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018 Tác giả luận văn Phan Thị Thúy iii
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ tận tình của nhiều cá nhân, cơ quan đơn vị. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Thị Thanh Nhàn, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin được cảm ơn các thầy giáo, cô giáo thuộc khoa Sinh học, bộ phận Sau đại học của Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giảng dạy và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học. Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới cô Trần Thị Hồng, cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi tiến hành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người thân trong gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã tạo điều kiện, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018 Tác giả luận văn Phan Thị Thúy iv
MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN ...............................................................................................iii LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... iv MỤC LỤC ........................................................................................................... v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. v DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. vi MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2 3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1.1. Giới thiệu chung về cây Đông hầu vàng ...................................................... 3 1.1.1. Đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học ....................................................... 3 1.1.2. Giá trị cây Đông hầu vàng ................................................................................ 5 1.1.3. Tình hình nghiên cứu cây Đông hầu vàng trên thế giới và ở Việt Nam ........ 7 1.2. Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng ....................................... 8 1.2.1. Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật......................... 9 1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro .................................................... 9 1.2.3. Các phương pháp nhân giống vô tính in vitro ............................................... 12 1.3. Thành tựu của nhân giống in vitro ............................................................. 15 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 17 2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu .................................... 17 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................... 17 2.1.2. Hóa chất nghiên cứu ....................................................................................... 17 2.1.3. Thiết bị nghiên cứu ......................................................................................... 17 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu ....................................................................................... 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 17 2.2.1. Phương pháp pha môi trường ......................................................................... 17 v
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy in vitro ....................................................................... 17 2.2.3. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu........................................................... 22 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 23 3.1. Nghiên cứu công thức vô trùng mẫu .......................................................... 23 3.2. Nghiên cứu môi trường kích thích hạt Đông hầu vàng nảy mầm .............. 24 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất phụ gia đến sự sinh trưởng của cây Đông hầu vàng ................................................................................................... 25 3.4. Nghiên cứu tạo đa chồi cây Đông hầu vàng ............................................... 28 3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh chồi cây Đông hầu vàng ..................................................................................................................... 28 3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng phát sinh chồi cây Đông hầu vàng ........................................................................................................... 30 3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng phát sinh chồi cây Đông hầu vàng .................................................................................... 32 3.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến khả năng phát sinh chồi cây Đông hầu vàng ............................................................................................ 34 3.4.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4- D đến khả năng phát sinh chồi cây Đông hầu vàng ........................................................................................................... 36 3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm auxin đến khả năng tạo rễ cây Đông hầu vàng ............................................................................................................. 39 3.5.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây Đông hầu vàng .. 39 3.5.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Đông hầu vàng.... 40 3.6. Nghiên cứu giá thể thích hợp đưa cây Đông hầu vàng ra ngoài tự nhiên .. 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................... 45 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .............................................................. 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 47 vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt MS Murashige and Skoog Môi trường MS KT Khử trùng CT Công thức BAP 6- Benzylamino purine Kinetin 6- Fururolamino purine GA3 Gibberellic acid 3 NAA α- Naphthaleneacetic acid IBA 3- Indolebutyric acid 2,4- D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid NXB Nhà xuất bản cs Cộng sự iv
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Công thức khử trùng hạt cây Đông hầu vàng ................................... 18 Bảng 2.2. Công thức giá thể ra cây Đông hầu vàng .......................................... 22 Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt cây Đông hầu vàng ....................................... 23 Bảng 3.2. Tỷ lệ nảy mầm của hạt Đông hầu vàng ở các môi trường ................ 25 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của chất phụ gia đến sự sinh trưởng của cây Đông hầu vàng .......................................................................................... 26 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh chồi cây Đông hầu vàng . 29 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tạo đa chồi cây Đông hầu vàng.... 31 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng phát sinh chồi cây Đông hầu vàng .......................................................................... 33 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến khả năng phát sinh chồi cây Đông hầu vàng .......................................................................... 35 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của 2,4- D đến khả năng tạo mô sẹo ở lá Đông hầu vàng.... 37 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo cây Đông hầu vàng ................................................................................. 38 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây Đông hầu vàng ...... 40 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Đông hầu vàng ....... 41 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của giá thể đến cây trồng trong bầu sau 8 tuần ............ 43 v
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây Đông hầu vàng ............................................................................. 3 Hình 1.2. Hoa và hạt cây Đông hầu vàng ............................................................ 4 Hình 3.1. Hạt Đông hầu vàng sau khử trùng ..................................................... 24 Hình 3.2. Ảnh hưởng của nước dừa 100 ml/l và than hoạt tính 1,5 g/l đến sự sinh trưởng của cây Đông hầu vàng .................................................. 27 Hình 3.3. Hình ảnh cây Đông hầu vàng trên môi trường CT2 sau 4 tuần......... 30 Hình 3.4. Hình ảnh cây Đông hầu vàng trên môi trường CT3 .......................... 30 Hình 3.5. Hình ảnh cây Đông hầu vàng trên môi trường CT2 .......................... 34 Hình 3.6. Hình ảnh mô sẹo và chồi tái sinh từ mô sẹo sau 4 tuần .................... 38 Hình 3.7. Kết quả tạo rễ cây Đông hầu vàng trên môi trường CT3 .................. 42 Hình 3.8. Cây Đông hầu vàng sau khi lấy ra khỏi bình .................................... 43 Hình 3.9. Cây Đông hầu vàng in vitro trong vườn ươm ................................... 43 Hình 3.10. Sơ đồ quy trình nuôi cấy in vitro cây Đông hầu vàng ..................... 44 vi
MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Dược liệu có vai trò rất quan trọng trong đời sống con người. Từ xưa, ông cha ta đã biết sử dụng, chế biến dược liệu để chăm sóc và bảo vệ sức khỏe. Ngày nay, nhu cầu sử dụng dược liệu của người dân ngày càng gia tăng bởi ít tác dụng phụ và phù hợp với quy luật sinh lý của cơ thể. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 80% dân số hiện nay trên thế giới vẫn dựa vào thuốc có nguồn gốc tự nhiên trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng [43]. Theo số liệu thống kê của ngành Y tế, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30-50 tấn các loại dược liệu khác nhau để sử dụng trong y học cổ truyền làm nguyên liệu cho công nghiệp Dược và xuất khẩu. Trong đó, trên 2/3 khối lượng này được khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên và trồng trọt trong nước. Riêng từ nguồn cây thuốc tự nhiên đã cung cấp tới trên 20.000 tấn mỗi năm [1]. Do không có chính sách quản lí chặt chẽ nên nhiều loài cây dược liệu tự nhiên bị khai thác ồ ạt, không chú ý tới bảo vệ, tái sinh làm cho nguồn tài nguyên dược liệu giảm sút nghiêm trọng, nhiều loài đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng. Yêu cầu đặt ra là cần phải bảo tồn nguồn gen, nhân nhanh các loài cây dược liệu quý hiếm và tìm ra những loài cây dược liệu thay thế. Hiện nay, nhu cầu làm đẹp của phái nữ ngày một gia tăng mạnh mẽ. Tuy nhiên, các mỹ phẩm tổng hợp và pha chế được bán trên thị trường thường gây hại cho da sau một thời gian sử dụng. Vì vậy, các công ty dược- mỹ phẩm phải tìm đến những hợp chất được chiết xuất từ những cây cỏ tự nhiên. Ở Việt Nam có rất nhiều cây thuốc quý được sử dụng để cải thiện sắc đẹp như: trinh nữ hoàng cung, ngưu tất, hà thủ ô, cây rau sam, diệp hạ châu, cây lá bỏng, lá dâu tằm, lá trầu không,…[47]. Cây Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia) là loài cây có nhiều công dụng đối với cơ thể, đặc biệt có tác dụng làm đẹp cho phụ nữ như làm trắng da, kéo dài tuổi thanh xuân. Tuy nhiên, ở nước ta hiện nay, cây 1
Đông hầu vàng là cây nhập nội với số lượng hạn chế, cần được nhân nhanh để tạo nguồn giống. Nuôi cấy mô tế bào là một kỹ thuật rất quan trọng của công nghệ sinh học thực vật. Những thành tựu mà nuôi cấy mô tế bào đạt được đã chứng tỏ khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là nhân nhanh và bảo tồn những loài quý hiếm. Từ các lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia)” nhằm phát triển cây Đông hầu vàng làm thuốc ở Việt Nam. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cây Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia). 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu công thức khử trùng hạt Đông hầu vàng. - Nghiên cứu ảnh hưởng của chất phụ gia đến sự sinh trưởng của cây Đông hầu vàng. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinin, tổ hợp nhóm cytokinin và auxin, 2,4- D đến khả năng tạo đa chồi cây Đông hầu vàng. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm auxin đến khả năng tạo rễ cây Đông hầu vàng. - Nghiên cứu giá thể thích hợp để đưa cây Đông hầu vàng ra ngoài tự nhiên. 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây Đông hầu vàng 1.1.1. Đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học Cây Đông hầu vàng có tên tiếng Anh là Yellow Turnera, Yellow Alder, Yellow Elder, West Indian Holly hay Sage Rose. Tên tiếng Việt là Đông hầu vàng, Kim ngân, Dừa thái vàng hay Dừa vàng. Tên khoa học là Turnera ulmifolia, là một loài thực vật thuộc chi Đông hầu (Turnera), phân họ Hoa thời chung hay phân họ Đông hầu (Turneroideae), họ Lạc tiên (Passifloraceae) (trước đây chi này được đặt trong họ Đông hầu (Turneraceae), bộ Sơ ri (Malpighiales) [2], [6]. Cây Đông hầu vàng có nguồn gốc từ Châu Mỹ. Ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nhất là châu Mỹ và châu Phi có 20 họ và 120 loài. Một số loài thuộc chi Đông hầu như Turnera arcuata, Turnera angustifolia Mill., Turnera aurelii, Turnera caerulea, Turnera candida, Turnera chamaedryfolia, Turnera difusa Willd. Ex Schult., Turnera ulmifolia L., Turnera velutina, Turnera weddelliana…[44]. Hình 1.1. Cây Đông hầu vàng Các cây thuộc họ Đông hầu từ lâu đã được biết đến như một loại thảo dược nổi tiếng ở châu Mỹ với công dụng tăng cường sức khỏe sinh sản, được người Maya cổ và người Mexico sử dụng rộng rãi. Y học hiện đại thì coi đây như một loại trà kích thích khả năng sinh lý. Lá Đông hầu còn có lợi ích tốt cho phụ nữ trong thời kỳ kinh nguyệt, giảm chuột rút, mệt mỏi, lo lắng và đau đầu 3
do khả năng điều tiết và cân bằng nội tiết tố nữ [40]. Đại diện duy nhất của họ này tại Việt Nam là cây Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia) có nguồn gốc ở Mexico và Tây Ấn [42]. Cây Đông hầu vàng là một loại cây có phân bố địa lý rộng. Cây được nhập cư rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Cây thích nghi với nhiều loại đất, điều kiện môi trường và có khả năng sinh sản cao nên định cư được ở các môi trường sống mới. Sự phân tán hạt trong loài này là do khả năng thu hút kiến làm cho những con kiến vận chuyển hạt giống trong khoảng cách tương đối ngắn tạo thuận lợi cho việc hình thành quần thể dày đặc và tăng khả năng tạo ra hạt [16], [18], [45]. Cây Đông hầu vàng là cây bụi nhỏ, cao khoảng 1m, phân nhiều cành. Lá đơn, mọc so le, hình trái xoan hẹp, dài khoảng 5-6cm, rộng 2,5cm, hai đầu nhọn, mép khía răng cưa nhọn, gân lá hình lông chim, nổi rõ, gốc phiến lá có 2 tuyến nhỏ, cuống ngắn có lông mềm, vò lá có mùi hăng nhẹ [6]. Hoa cây Đông hầu vàng là hoa đơn, thường nở vào buổi sáng, tàn vào buổi trưa, hoa mẫu năm, đường kính hoa 5-6cm, cuống ngắn, mọc ra từ cuống lá, 2 lá bắc hẹp dài, 5 lá đài hình mũi mác nhọn, do các lá đài và cánh hoa họp lại tạo thành, các thùy của tràng xếp vặn, nhị 5 xen kẽ với cánh hoa và không có vành phụ, vòi nhụy rời và xẻ nhiều ở đỉnh (mỗi vòi có dạng bút lông), 5 cánh hoa hình bầu dục, màu vàng, mặt trong gốc cánh hoa màu vàng nâu, có 5 nhị rời và bầu nhẵn. Ra hoa quanh năm, rộ nhất vào mùa hè [6]. Hình 1.2. Hoa và hạt cây Đông hầu vàng 4
Quả Đông hầu vàng có hình cầu, nhiều hạt, quả bế, khi già nở tung tạo điều kiện cho hạt phát tán ở khảng cách ngắn [41]. Hạt Đông hầu vàng nhỏ, màu nâu sẫm, nảy mầm vào mùa xuân, được bảo quản ở nhiệt độ thường. 1.1.2. Giá trị cây Đông hầu vàng Cây Đông hầu vàng có hương thơm nồng, vị hơi đắng. Lá được dùng làm hương liệu cho mùi rượu. Ở Mexico, người ta dùng để thay thế cho cây trà. Tác dụng của cây là bồi bổ, xổ nhẹ và lợi tiểu, chống suy nhược, làm thuốc kéo dài tuổi thanh xuân cho cả nam và nữ [41], [46]. Thành phần chính của cây Đông hầu vàng gồm: Flavonoid (22 hợp chất khác nhau), arbutin (chiếm 7%), tinh dầu (khoảng 0,5%), deltacadinee (10%), thymol (4%), cyanogenic glycosides (tetraphyllin, 7 hợp chất khác nhau), maltol glucoside, phenolics, monoterpenoids, sesquiterpenoid, triterpenoid, polyterpene ficaprenol-11, axit béo, caffeine, ethanol, nhựa thông, chất nhựa, alkaloid [34], [38], [46]. Flavonoid có tác dụng chống đông máu, phòng ngừa viêm loét niêm mạc dạ dày và tá tràng, giảm thương tổn dạ dày do sự kết hợp của indomethacin và bethanechol, giảm chứng loét dạ dày do stress gây ra [24]. Khả năng kích thích tình dục có thể do một loại alkaloid trong cây thuốc có tác dụng như hormone sinh dục testosterone ở nam [48]. Dịch chiết Đông hầu vàng có khả năng bảo vệ gan, chống lại tổn thương gan gây bởi carbon tetrachloride [46]. Arbutin trong cây Đông hầu vàng có tác dụng làm trắng da nhờ khả năng ức chế enzyme sản sinh melanin mà không có tác dụng phụ, chống lão hóa và ngăn các gốc tự do. Tinh dầu giúp tinh thần sảng khoái, giảm đau bụng kinh, kinh nguyệt không đều, chống nhiễm trùng, làm căng da, mịn da [41]. Cây Đông hầu vàng chứa chất thymol có tác dụng kích thích lên cơ thể và giúp hồi phục hệ thần kinh. Chất này được dùng cho các bệnh nhân bị bệnh suy nhược hay suy nhược thần kinh ở mức độ nhẹ cho đến vừa phải [41]. 5
Cây Đông hầu vàng có khả năng cải thiện sức khỏe sinh sản, giúp trị xuất tinh sớm và bất lực ở nam, điều hòa nội tiết và kinh nguyệt ở nữ [41]. Cây Đông hầu vàng có đặc tính lợi tiểu và khử trùng nước tiểu, do đó nó được dùng để trị các bệnh nhiễm trùng các cơ quan tiết niệu như bệnh viêm bàng quang, viêm ống dẫn nước tiểu. Bên cạnh đó, chất nhựa trong cây có tác dụng như dịch vị dạ dày giúp tiêu hóa tốt, do đó, cây cũng được dùng để trị bệnh táo bón do cơ ruột co bóp kém [24], [46]. Chiết xuất của Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia) cùng với Parkia platycephala Benth và Dimorphandra Gardneriana được sử dụng trong chống nhiễm trùng giun sán ở các loại gia súc nhai lại nhỏ như ở dê [31]. Chiết xuất từ Đông hầu vàng và Mentha arvensis L. khi kết hợp với thuốc chống nấm Metronidazole làm cho khả năng kháng nấm Candida tropicalis được tăng cường [36]. Cao Đông hầu được cô đặc từ hơn 7 loại cây thuốc quý hiếm như Đông hầu vàng, Thành ngạnh, Dây cóc,… có tác dụng làm căng da, mờ nhăn, kích thích quá trình tăng sinh collagen gấp 8 lần so với bình thường, phục hồi da, làm trẻ hóa da và chống lão hóa, làm se khít lỗ chân lông, cân bằng độ ẩm và trị mụn hiệu quả cao [49]. Ngoài ra, các loài trong chi Đông hầu còn được sử dụng để điều trị các bệnh như thiếu máu, viêm phế quản, ho, tiểu đường, giảm đau, phổi và các bệnh đường hô hấp, rối loạn da [46]. Cây thuốc, vị thuốc Đông hầu vàng có thể có những dạng bào chế như thuốc viên, bột, cao, trà, rượu thuốc. Cây thuốc này thường được dùng kết hợp với các thuốc khác để tăng cường tác dụng của thuốc. Liều dùng khác nhau đối với từng bệnh nhân, lứa tuổi và tình trạng sức khỏe. Thuốc không được dùng cho trẻ em, phụ nữ mang thai hoặc đang cho con bú, những người bị bệnh gan, tiểu đường hoặc quá mẫn cảm với các thành phần trong cây [48]. 6
1.1.3. Tình hình nghiên cứu cây Đông hầu vàng trên thế giới và ở Việt Nam Công trình nghiên cứu đầu tiên về đặc tính viagra của cây Damiana (thuộc họ Đông hầu) (1999) cho thấy rằng sức khỏe sinh sản của chuột được cải thiện khi được uống chất chiết từ cây này[41]. Năm 2002, theo các nhà khoa học Brazil, hoạt chất chủ yếu của cây Đông hầu vàng (ở thân và lá) là các hợp chất flavonoid, có tác dụng chống oxy hóa và chống các vết loét. Thử trên chuột, cho thấy hoạt chất của cây này có tác dụng phòng chống viêm loét dạ dày và hành tá tràng. Trong bệnh viêm loét dạ dày do stress, chất chiết trong môi trường nước của cây này cũng có tác dụng làm giảm từ 50-58% với liều 0,5-1 g/kg thể trọng. Các kết quả nghiên cứu trong phòng thí nghiệm phù hợp với kinh nghiệm dân gian ở Brazil là dùng trà Đông hầu vàng để chữa các bệnh chủ yếu liên quan đến viêm loét dạ dày và hành tá [24]. Năm 2006, các nhà khoa học thuộc Khoa Phân tích lâm sàng và Chất sinh học Brazil đã nghiên cứu sơ bộ về hoạt động chống oxi hóa của Turnera ulmifolia. Nghiên cứu sử dụng chiết xuất hydroethanol 50% được đánh giá bằng hệ thống oxy hóa kết hợp axit beta-carotene/linoleic để ức chế quá trình oxy hóa và ức chế peroxidation lipid ở chuột đồng, có sử dụng các chất phản ứng thiobarbituric acid và chemiluminescence. Kết quả cho thấy chiết xuất này có hoạt tính chống oxy hoá (77,4 ± 10%) cao hơn alpha-tocopherol (vitamin E) (58,4 ± 3,7%) [30]. Cũng trong năm 2006, các nhà khoa học thuộc Khoa Dược, Đại học Granada, Tây Ban Nha đã nghiên cứu về hoạt tính kháng viêm đường ruột của thân, lá Đông hầu vàng. Nghiên cứu được thử nghiệm trong mô hình viêm đại tràng chuột do axit trinitrobenzenesulphonic (TNBS) gây ra. Kết quả thu được cho thấy việc sử dụng chiết xuất Turnera ulmifolia đối với chuột cống ở 250 và 500 mg/kg, làm giảm đáng kể tổn thương đại tràng gây ra bởi TNBS. Tác dụng có lợi này có liên quan đến sự cải thiện tình trạng oxy hóa đại tràng, hiệu quả 7
phòng ngừa do truyền tĩnh mạch của Turnera ulmifolia trong mô hình TNBS của bệnh viêm đại tràng ở chuột có lẽ liên quan đến tính chất chống oxy hoá do hàm lượng flavonoid có trong cây [23]. Năm 2009, hai nghiên cứu về khả năng kháng sinh trên các chủng vi khuẩn đã kháng thuốc kháng sinh nhóm aminoglycosides. Dựa trên các kết quả thực nghiệm đã chứng minh, dịch chiết từ cây Đông hầu vàng có khả năng diệt các chủng Escherichia coli và Staphylococcus aureus đã kháng kháng sinh nhóm aminoglycosides và có tác dụng hiệp đồng khi dùng kết hợp cùng với các loại thuốc kháng sinh như kanamycin, gentamicin, neomycin, tobramycin và amikacin [20], [21]. Năm 2012, Brito và cs (Đại học Liên bang Rio Grande do Norte, Brazil) đã nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa (chống carbon tetrachloride gây oxy hóa) và tác dụng bảo vệ của Đông hầu vàng ở chuột. Kết quả nghiên cứu cho thấy, các chất glutathione và hoạt động của enzyme chống oxy hóa (glutathione peroxidase, superoxide dismutase và catalase) đã được tăng cường đáng kể trong chuột do uống thuốc được chiết từ lá Đông hầu vàng và có sự hiện diện của chất flavonoid, là chất trung gian ảnh hưởng của stress oxy hóa [19]. Ở Việt Nam, nghiên cứu của các bác sĩ và giáo sư tại Viện nghiên cứu Y học Bản địa Việt Nam (Thái Nguyên và Hà Giang) đã tạo ra sản phẩm cao Đông hầu với nhiều tác dụng tốt cho da [49]. 1.2. Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật quan trọng của công nghệ sinh học, là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Trải qua hơn 100 năm phát triển và đã đạt được những thành tựu nhất định trong lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng. 8
1.2.1. Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đó phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cơ thể sinh vật. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Như vậy, kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng. Đây là một điểm rất quan trọng bởi vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện những kĩ thuật tiên tiến cho việc lựa chọn, cải thiện và lai tạo giống cây trồng [5]. 1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro Mẫu nuôi cấy Các nhân tố khi chọn lọc mẫu cấy bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu [5]. Điều kiện nuôi cấy Điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng phát triển của mẫu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là từ 20-27oC. Điều kiện ánh sáng từ 1000-3000lux. Độ pH là 5,7-5,8 [5]. Chất kích thích sinh trưởng thực vật Các chất kích thích sinh trưởng có vai trò rất quan trọng trong kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bằng cách cung cấp các chất kích thích ở một mức hợp lý thì chúng ta có thể điều khiển được quá trình phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Auxin và cytokinin là hai nhóm chất kích thích sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất hiện nay. Cytokinin là hormone phân bào ảnh hưởng đến 9
sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là: BAP, kinetin và zeatin. Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin dao động từ 0,5-2 mg/l. Ở nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Hoạt lực của BAP cao hơn và bền vững hơn zeatin dưới tác dụng của nhiệt độ cao. BAP có khả năng làm tăng hình thành các sản phẩm thứ cấp và tăng kích thước của tế bào ở các lá mầm, kích thích sự nảy mầm của hạt và quá trình trao đổi chất [5], [7], [37]. GA (Gibberellic acid) là loại gibberellin được sử dụng thường xuyên nhất, muốn sử dụng GA ta thường phải lọc qua màng lọc vô trùng, sau đó đưa vào môi trường nuôi cấy. Trong số hơn 20 chất thuộc nhóm gibberellin, GA3 là chất được sử dụng nhiều nhất trong thực tiễn. GA3 kích thích kéo dài chồi và nảy mầm của phôi vô tính, kéo dài thân và đòng lúa, kéo dài đốt thân (với các cây lùn), phá ngủ hạt giống hoặc củ giống (phá ngủ khoai tây sau khi thu hoạch) [5], [7], [28]. Agar Agar có vai trò rất cần thiết đối với mẫu nuôi cấy, làm đặc môi trường, giúp mô không bị chìm. Agar thường được sử dụng ở nồng độ 0,6 đến 1% [5]. Chất phụ gia Nước dừa chứa hàm lượng dinh dưỡng cao, được sử dụng để cung cấp dinh dưỡng cho mẫu nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nước dừa được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây. Nước dừa thường được lấy từ quả để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản. Nước dừa được một số công ty hóa chất bán dưới dạng đóng chai sau chế biến và bảo quản. Thông thường nước dừa được xử lý để loại trừ các protein, sau đó được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh. Tồn dư protein trong nước dừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng có 10
thể dẫn tới kết tủa dung dịch khi bảo quản lạnh. Chất cặn có thể được lọc bỏ hoặc để lắng dưới đáy bình rồi gạn bỏ phần cặn [5]. Ngoài nước dừa, chuối xanh, khoai tây và cà chua cũng là những chất tự nhiên giàu dinh dưỡng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật. Ngày nay, nhiều nghiên cứu để giảm thiểu chi phí cần thiết cho công nghệ nuôi cấy mô được tiến hành, trong đó có nghiên cứu của Daud và cs. Mục đích của nghiên cứu này là khảo sát ảnh hưởng các chất phụ gia (nước dừa già, nước dừa non, dịch chiết đu đủ, dịch chiết chuối và dịch chiết cà chua) ở 4 nồng độ (20; 30; 50 và 70 ml/l) đến khả năng tạo đa chồi của cây Celosia sp. (chi Mào gà) trong 8 tuần nuôi cấy. Trong số các dịch chiết được sử dụng, nước dừa non với nồng độ 70 ml/l tạo ra tỷ lệ phát sinh chồi cao nhất (14,21 ± 8,26 chồi/mẫu), tiếp theo là nước dừa già với nồng độ 50 ml/l cho tỷ lệ phát sinh chồi là 13,14 ± 10,33 chồi/mẫu. Dịch chiết chuối và dịch chiết cà chua ở nồng độ 50 ml/l cho tỷ lệ chồi thấp (9,57 ± 4,68 và 9,28 ± 5,82 chồi/mẫu). Trong khi nồng độ thấp nhất của nước đu đủ (20 ml/l) cho thấy tỷ lệ phát sinh chồi là 10,50 ± 3,45 chồi/mẫu [22]. Than hoạt tính cũng là một chất phụ gia có nhiều tác dụng tích cực trong nuôi cấy mô, có tác dụng hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp, kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ (Vũ Văn Vụ, 2006). Trong thí nghiệm ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tạo rễ của Lan kim tuyến, các tác giả Nguyễn Thị Nhật Linh và cs đã sử dụng than hoạt tính với các nồng độ khác nhau bổ sung vào môi trường Knud + sucrose 20 g/l và agar 7g/l. Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy, nồng độ than hoạt tính khác nhau rõ ràng có ảnh hưởng đến tỷ lệ tạo rễ, chiều dài rễ và số lượng rễ của lan Kim tuyến nuôi cấy mô theo hướng tích cực. Ở tất cả các môi trường bổ sung than hoạt tính đều cho tỷ lệ tạo rễ là 100%. Bổ sung than hoạt tính ở nồng độ 5% cho số lượng rễ nhiều nhất (4,22 rễ/mẫu) và chiều dài rễ là 3,5cm, rễ mập và rất khỏe [8]. 11