Luận văn Thạc sĩ Thú y: Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:82

Thêm vào BST

Báo xấu

63
lượt xem 14
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của Luận văn nhằm xác định một số đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò trên địa bàn tỉnh Quảng Ninh. Khảo sát sự lưu hành vi khuẩn P. multocida ở trâu, bò khỏe và trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết trùng. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học, yếu tố gây bệnh và serotype kháng nguyên của vi khuẩn P. multocida phân lập được. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Thú y: Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LƯƠNG NGỌC MINH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT, HÓA HỌC CỦA VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG TRÂU, BÒ TẠI BA HUYỆN THUỘC TỈNH QUẢNG NINH VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Thái Nguyên - 2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LƯƠNG NGỌC MINH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT, HÓA HỌC CỦA VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG TRÂU, BÒ TẠI BA HUYỆN THUỘC TỈNH QUẢNG NINH VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ Ngành: THÚ Y Mã số ngành: 8.64.01.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Người hướng dẫn khoa học: TS. ĐỖ QUỐC TUẤN Thái Nguyên - 2020
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng: - Các kết quả nghiên cứu trong luận văn là do tôi trực tiếp nghiên cứu dưới sự hướng dẫn của TS. Đỗ Quốc Tuấn, sự giúp đỡ của cán bộ Trạm Chẩn đoán xét nghiệm bệnh động vật - Cơ quan Thú y vùng II và Chi cục Thú y tỉnh Quảng Ninh. - Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, khách quan, được rút ra từ tình hình thực tế của tỉnh Quảng Ninh trong những năm qua và chưa hề được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. - Mọi sự giúp đỡ trong quá trình thực hiện nghiên cứu và viết luận văn đã được cảm ơn. Tất cả các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được ghi rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, tháng 8 năm 2020 TÁC GIẢ Lương Ngọc Minh
ii LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực tập và thực hiện Luận văn này, tôi đã nhận được sự quan tâm, chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè và sự động viên khích lệ của gia đình. Nhân dịp này, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, Ban chủ nhiệm khoa và các thầy cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Thầy giáo TS. Đỗ Quốc Tuấn đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi hết sức tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận văn. Trân trọng cảm ơn Chi cục Chăn nuôi - Thú y và Cục thống kê tỉnh Quảng Ninh đã cung cấp số liệu giúp tôi hoàn thành luận văn này. Xin trân trọng cảm ơn các hộ gia đình nuôi trâu, bò, lợn nái tại Quảng Ninh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình điều tra và thu thập mẫu. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc về sự ủng hộ, động viên, giúp đỡ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Thái Nguyên, tháng 8 năm 2020 TÁC GIẢ Lương Ngọc Minh
iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT BHI: Brain Heart Infusion BL: Bình Liêu Cs: Cộng sự DNA: Deoxyribonucleic Acid FAO: Food and Agriculture Oganization HSND: Hệ số năm dịch MR: Methylen Red OIE: Office International Epizooties Tổ chức dịch tễ thế giới PCR: Polymerase Chain Reaction PRRSV: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus PƯ: Phản ứng QY: Quảng Yên THT: Tụ huyết trùng TSI: Triple sugar iron agar. TT: Thể trọng. TW: Trung ương VK: Vi khuẩn VP: Voges Proskauer YPC: Yeast extract Pepton-L-Cystin
iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và chết do tụ huyết trùng giai đoạn 2016 - 2019 tại Quảng Ninh ...............................................................................33 Hình 3.1. Biểu đồ về tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và chết do bệnh tụ huyết trùng tại Quảng Ninh qua các năm 2016 - 2019 ..............................................34 Bảng 3.2. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và chết do tụ huyết trùng tại Quảng Ninh theo mùa vụ .............................................................................................35 Bảng 3.3. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và chết do tụ huyết trùng tại Quảng Ninh theo tuổi ..................................................................................................38 Bảng 3.4. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và chết do tụ huyết trùng tại Quảng Ninh theo loài ...................................................................................................40 Bảng 3.5. Triệu chứng lầm sàng ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng ....................43 Bảng 3.6. Các bệnh tích đại thể ở trâu, bò chết do tụ huyết trùng .........................44 Bảng 3.7. Kết quả phân lập vi khuẩn P. multocida từ dịch ngoáy mũi của trâu, bò khoẻ ...........................................................................................46 Bảng 3.8. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ mẫu bệnh phẩm trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết trùng ..........................................................................49 Bảng 3.9. Giám định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi khuẩn P. mutocida phân lập được ...........................................................50 Bảng 3.10. Kết quả thử phản ứng lên men đường của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được .........................................................................52 Bảng 3.11. Kết quả xác định serotype kháng nguyên của các chủng P. multocida phân lập được .........................................................................53 Bảng 3.12. Xác định độc lực của các chủng P. multocida 55phân lập được .........55 Bảng 3.13. Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng P. multocida phân lập được .........................................................................57 Bảng 3.14. Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ....................................................................................................59 Bảng 3.15. Kết quả tiêm phòng vaccine tụ huyết trùng cho trâu, bò của tỉnh Quảng Ninh trong các năm 2018 - 2019 .................................................61
v DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ Hình 2.1. Sơ đồ phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida ......................................30 Hình 3.1. Biểu đồ về tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và chết do bệnh tụ huyết trùng tại Quảng Ninh qua các năm 2016 - 2019 ..............................................34 Hình 3.2. Biểu đồ về tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng theo mùa vụ ............36 Hình 3.3. Biểu đồ về tỷ lệ trâu, bò chết do tụ huyết trùng tại Quảng Ninh theo mùa vụ trong năm ...................................................................................38 Hình 3.4. Biểu đồ về tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng tại Quảng Ninh theo loài ...................................................................................................41 Hình 3.5. Biểu đồ về tỷ lệ trâu, bò chết do bệnh tụ huyết trùng ............................42 Hình 3.6. Biểu đồ về tỷ lệ mẫu dịch ngoáy mũi của trâu, bò khoẻ dương tính với vi khuẩn P. multocida .......................................................................47
vi MỤC LỤC MỞ ĐẦU ...................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài .........................................................................................1 2. Mục tiêu đề tài ........................................................................................................2 3. Ý nghĩa của đề tài ...................................................................................................2 3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ................................................................................2 Chương 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU .............................................................4 1.1. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ........................................4 1.1.1. Vi khuẩn Pasteurella multocida ......................................................................4 1.1.2. Bệnh tụ huyết trùng do vi khuẩn P. multocida gây ra ...................................10 1.2. TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI .........................18 1.3. TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM ..............................21 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................................................24 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................24 2.1.1. Đối tượng .......................................................................................................24 2.1.2. Nguyên vật liệu dùng cho nghiên cứu ............................................................24 2.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ..................................................24 2.2.1. Thời gian nghiên cứu .....................................................................................25 2.2.2. Địa điểm nghiên cứu ......................................................................................25 2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .............................................................................25 2.3.1. Một số đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở tỉnh Quảng Ninh từ năm 2016 - 2019 .........................................................................................25 2.3.2. Triệu chứng, bệnh tích điển hình ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng ...........25 2.3.3. Phân lập và xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn P. multocida ..................................................................................................................25 2.3.4. Thử nghiệm phác đồ điều trị và đề xuất biện pháp phòng bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò tại tỉnh Quảng Ninh ....................................................................26 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................................................................26 2.4.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ...............26
vii 2.4.2. Phương pháp lấy mẫu .....................................................................................26 2.4.3. Phương pháp xác định triệu chứng, bệnh tích ở trâu, bò mắc bệnh và chết do tụ huyết trùng ...............................................................................................26 2.4.4. Phương pháp nuôi cấy, phân lập và xác định vi khuẩn P. multocida ............27 2.4.5. Kiểm tra độc lực của vi khuẩn P. multocida phân lập được ..........................29 Hình 2.1. Sơ đồ phân lập vi khuẩn P. multocida .....................................................30 2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu ..............................................................................31 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................33 3.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG TRÂU, BÒ TẠI TỈNH QUẢNG NINH ................................................................................33 3.1.1. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và chết do tụ huyết trùng giai đoạn 2016 - 2019 tại Quảng Ninh ................................................................................................33 3.1.2. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và chết do tụ huyết trùng tại Quảng Ninh theo mùa vụ ......................................................................................................................35 3.1.3. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng tại Quảng Ninh theo tuổi .................38 3.1.4. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Quảng Ninh theo loài ..........40 3.2. TRIỆU CHỨNG, BỆNH TÍCH ĐIỂN HÌNH Ở TRÂU, BÒ MẮC BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG ...................................................................................42 3.2.1. Triệu chứng lâm sàng ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng ............................42 3.2.2. Bệnh tích đại thể ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng ....................................44 3.3. PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT, HÓA HỌC CỦA VI KHUẨN P. MULTOCIDA ..............................................................45 3.3.1. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ dịch ngoáy mũi của trâu, bò khỏe mạnh tại các địa điểm nghiên cứu ............................................................................45 3.3.2. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ bệnh phẩm trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết trùng tại các địa phương nghiên cứu ..........................................................48 3.3.3. Giám định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi khuẩn P. mutocida phân lập được ...........................................................................................50 3.3.4. Xác định serotype kháng nguyên của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được ...........................................................................................................53 3.3.5. Xác định độc lực của các chủng P. multocida phân lập được .......................54
viii 3.3.6. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của vi khuẩn P. multocida phân lập được với một số loại kháng sinh và hóa dược ..........................................................57 3.4. THỬ NGHIỆM PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ VÀ ĐỀ XUẤT BIỆN PHÁP PHÒNG BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG CHO TRÂU, BÒ TẠI QUẢNG NINH ........................................................................................................................58 3.4.1. Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ..............................................................................................................................58 3.4.2. Đề xuất biện pháp phòng bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Quảng Ninh ........ 60 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................64 1. KẾT LUẬN ..........................................................................................................64 2. ĐỀ NGHỊ .............................................................................................................65 TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................66
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Chăn nuôi trâu, bò đang phát triển mạnh trên cả nước và là một ngành quan trọng trong nền nông nghiệp Việt Nam. Chăn nuôi trâu, bò không chỉ cung cấp sức kéo mà còn cung cấp lượng phân bón lớn cho ngành trồng trọt, cung cấp rất lớn nguồn thực phẩm như: thịt, sữa có chất lượng và giá trị dinh dưỡng cao cho nhu cầu sử dụng của con người. Chăn nuôi trâu, bò muốn phát triển tốt và cho hiệu quả kinh tế, ngoài công tác giống, thức ăn, quản lý chăm sóc thì công tác phòng chống dịch bệnh là rất quan trọng. Trong thực tế những năm qua, ngành thú y cả nước hoạt động rất mạnh mẽ đã hạn chế nhiều bệnh truyền nhiễm và các bệnh khác. Nhưng do đặc điểm của từng vùng, từng khu vực và từng địa phương, do nhiều yếu tố và nguyên nhân khác nhau nên vẫn còn một số bệnh truyền nhiễm xảy ra. Quảng Ninh là tỉnh nằm ở phía Đông Bắc Việt Nam, địa bàn kinh tế động lực trong vùng trọng điểm kinh tế Bắc Bộ. Dân số 1,415 triệu người (Chi cục Thống kê tỉnh Quảng Ninh, 2020) sinh sống tại 186 xã, phường, thị trấn thuộc 14 huyện, thị xã, thành phố. Đây cũng là tỉnh duy nhất của cả nước có 4 thành phố (Uông Bí, Hạ Long, Cẩm Phả, Móng Cái) và 2 thị xã (Đông Triều, Quảng Yên). Cùng với sự phát triển kinh tế, xã hội của tỉnh thì nhu cầu về thực phẩm sạch và an toàn tại Quảng Ninh là rất lớn. Hằng năm, chăn nuôi trong tỉnh mới đáp ứng khoảng 60% nhu cầu tiêu dùng của người dân và khách du lịch, phần thiếu hụt phải nhập từ nơi khác về. Đây là điều kiện cho dịch bệnh trên gia súc, gia cầm xâm nhập, phát sinh và lây lan. Một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm mà ngành chăn nuôi tỉnh Quảng Ninh thường gặp phải đó là bệnh tụ huyết trùng trâu, bò. Bệnh tụ huyết trùng trâu, bò thể bại huyết (Hemorrhagic Septicemia) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính xảy ra ở hầu hết các lứa tuổi trâu, bò. Hằng năm, trên địa bàn các tỉnh miền núi phía Bắc nước ta, bệnh tụ huyết trùng trâu, bò gây ra những thiệt hại kinh tế to lớn cho ngành chăn nuôi.
2 Do đặc điểm, vị trí địa lý, khí hậu, thời tiết, đất đai và điều kiện kinh tế xã hội, phong tục tập quán và trình độ tiếp thu khoa học kỹ thuật vào sản xuất và chăn nuôi của người dân ở tỉnh Quảng Ninh, tình hình chăn nuôi trâu, bò đang rất phát triển. Tuy nhiên, hằng năm bệnh tụ huyết trùng vẫn xảy ra khá phổ biến, gây ốm, chết số lượng đáng kể trâu, bò của địa phương và đã trở thành vấn đề bức xúc, cần được nghiên cứu. Vì vậy, ngoài việc áp dụng các biện pháp chăn nuôi an toàn sinh học thì việc nghiên cứu sự lưu hành của vi khuẩn gây bệnh, chọn vaccine tiêm phòng và thuốc điều trị có hiệu quả là vấn đề cấp thiết để hạn chế thiệt hại do dịch bệnh gây ra. Xuất phát từ yêu cầu của thực tiễn sản xuất chăn nuôi, trên cơ sở kế thừa kết quả nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước, căn cứ vào cơ sở vật chất, trang thiết bị tại đơn vị thí nghiệm, chúng tôi tiến hành đề tài "Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị”. 2. Mục tiêu đề tài - Xác định một số đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò trên địa bàn tỉnh Quảng Ninh. - Khảo sát sự lưu hành vi khuẩn P. multocida ở trâu, bò khỏe và trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết trùng. - Giám định đặc tính sinh vật, hóa học, yếu tố gây bệnh và serotype kháng nguyên của vi khuẩn P. multocida phân lập được. - Đề xuất các biện pháp phòng và trị bệnh hiệu quả. 3. Ý nghĩa của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài Bổ sung tư liệu khoa học về đặc điểm dịch tễ, sự lưu hành của vi khuẩn P. multocida gây bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò tại tỉnh Quảng Ninh. Bổ sung thêm tư liệu về đặc tính sinh vật, hóa học, yếu tố gây bệnh và serotype kháng nguyên của vi khuẩn P. multocida phân lập được. Đề xuất biện pháp phòng chống và điều trị bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò có hiệu quả cao.
3 3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Việc đánh giá tình trạng mang khuẩn P. multocida ở trâu, bò khỏe là cơ sở cho việc điều chỉnh chiến lược phòng bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Quảng Ninh. Đề xuất biện pháp phòng chống và điều trị bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò có hiệu quả cao.
4 Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1.1. Vi khuẩn Pasteurella multocida 1.1.1.1. Phân loại vi khuẩn Theo phân loại của Bergey’s (1994), vi khuẩn P. multocida thuộc bộ (order) Eubacteriales, họ (family) Parvobacteriaceae, tộc (tribe) Pasteurelliae, giống (genus) Pasteurella, loài (species) P. multocida. 1.1.1.2. Hình thái, kích thước và đặc tính nuôi cấy Vi khuẩn Pasteurella multocida (P. multocida) là vi khuẩn có dạng cầu trực khuẩn nhỏ, gram âm, kích thước khoảng 0,25 - 0,4 × 0,4 - 1,5 µm, vi khuẩn có thể đứng riêng lẻ, thành đôi hoặc thành chuỗi, có giáp mô, không sinh nha bào, không có lông, không di động, bắt màu lưỡng cực. Khi nuôi cấy nhiều lần trong phòng thí nghiệm hoặc trên các môi trường nuôi cấy lâu ngày, với các điều kiện không thuận lợi vi khuẩn có khuynh hướng biến dạng, thay đổi hình thái từ trực khuẩn dài hơn cho tới dạng sợi mảnh De Alwis (1999). P. multocida dễ dàng bắt màu với thuốc nhuộm fucxin hoặc xanh methylen. Tính chất bắt màu lưỡng cực của vi khuẩn P. multocida có thể thấy khi nhuộm bằng xanh methylen và chỉ thấy ở những tiêu bản làm từ máu động vật hay vi khuẩn phân lập từ con vật mới chết. Vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường nhân tạo ít thấy tính chất này (Nguyễn Như Thanh, 2001). Theo OIE (2012) sử dụng kỹ thuật nhuộm Leishman, nhuộm xanh metylen, hoặc kỹ thuật nhuộm Giemsa cho thấy vi khuẩn được nhuộm bắt màu lưỡng cực. Vi khuẩn P. multocida có thể nuôi cấy ở nhiều loại môi trường, môi trường nuôi cấy lỏng, đặc hoặc bán cố thể. Tùy vào mục đích nghiên cứu, người ta cho thêm vào môi trường các loại đường, axit amin và hóa chất khác nhau. Peter và cs (1996) sử dụng môi trường dinh dưỡng tối thiểu để nuôi cấy chủng sinh độc tố và không sinh độc tố của P. multocida. Môi trường này gồm có 17 thành phần, trong
5 đó có cystein, glutamic axit, leucine, methionine, muối vô cơ, nicotinamide, pantothenate, thiamine. Kết quả 40/46 chủng đem thử (87%) mọc tốt trên môi trường này, sau 10 lần cấy chuyển vẫn giữ nguyên khả năng sinh độc tố hoặc không sinh độc tố như lúc đầu. Môi trường BHI và môi trường Hottinger cải tiến là những môi trường thích hợp để sản xuất kháng nguyên tụ huyết trùng theo phương pháp lên men (Đào Trọng Đạt, 1994). P. multocida có nhiều loại hình dạng khuẩn lạc, trên môi trường thạch huyết thanh P. multocida có thể tạo thành 3 dạng khuẩn lạc: + Khuẩn lạc dạng S (Smooth): có rìa gọn, bóng láng, có dung quang mạnh và vi khuẩn có độc lực mạnh. + Khuẩn lạc dạng M (Mucoid): nhày, ướt, có kích thước lớn nhất, bề mặt khuẩn lạc ẩm ướt, có dung quang yếu, vi khuẩn có độc lực trung bình. + Khuẩn lạc R (Rough): có rìa xù xì, thường không có dung quang, vi khuẩn có độc lực yếu. Trên môi trường thạch thường: vi khuẩn hình thành khuẩn lạc dạng S, nhỏ long lanh như giọt sương, mặt khuẩn lạc vồng. Nuôi cấy lâu, khuẩn lạc có màu trắng ngà dính vào môi trường. Trên môi trường thạch máu hay BHI có bổ sung máu: vi khuẩn phát triển mạnh, không gây dung huyết, kích thước khuẩn lạc lớn hơn trên môi trường thạch thường, có màu tro xám, hình giọt sương và có mùi tanh nước dãi khô rất đặc trưng. Đặc điểm này rất dễ nhận ra và được nhiều tác giả công nhận như một đặc điểm để chẩn đoán. Trên môi trường thạch có huyết thanh và huyết cầu tố: khuẩn lạc nhỏ, rìa gọn, có hiện tượng phát huỳnh quang khi xem khuẩn lạc bằng kính hiển vi có hai thị kính với độ phóng đại thấp và góc phản quang của ánh sáng đèn điện là 45o, thấy xung quanh mép khuẩn lạc có hiện tượng phát sắc cầu vồng. Khuẩn lạc dạng S có dung quang màu xanh lơ, khuẩn lạc dang R có dung quang vàng, khuẩn lạc dạng M không có đặc điểm nói trên. Hiện tượng phát quang của khuẩn lạc P. multocida có
6 liên quan đến tính chất của một số hợp chất có khả năng hấp thụ những tia sáng nhất định có trong vi khuẩn (Heddleston, 1966). Theo De Alwis (1999), tuỳ theo độc lực của vi khuẩn mà màu sắc huỳnh quang của khuẩn lạc khác nhau: + Nếu vi khuẩn có độc lực cao: khuẩn lạc có màu xanh lơ, xanh lá mạ chiếm 2/3 diện tích khuẩn lạc về phía đèn, còn 1/3 diện tích khuẩn lạc là màu vàng kim loại, khuẩn lạc này gọi là Fg (Greenish Fluorescent). + Nếu vi khuẩn có độc lực vừa: khuẩn lạc màu xanh lơ ít hơn diện tích màu vàng da cam, khuẩn lạc loại này là Fo (Orange Fluorescent). + Nếu vi khuẩn có độc lực yếu: khuẩn lạc của chúng không có hiện tượng phát quang, khuẩn lạc loại này là Nt (Not Fluorescent). Khuẩn lạc nhỏ tròn trong. Theo đặc tính dung quang này còn có quan hệ chặt chẽ với sự tạo giáp mô của vi khuẩn P. mutocida. Dựa vào tính chất này, có thể chọn những chủng P. multocida có tính kháng nguyên và miễn dịch cao (Smith, 1990). 1.1.1.3. Đặc tính sinh hóa P. multocida lên men các đường glucose, mannitol, saccarose, fructose, galactose, không lên men các loại đường lactose, mantose, arabinose. Dương tính với phản ứng sinh Indol, oxidase, catalase. Phản ứng urease âm tính, không mọc trên môi trường MacConkey (Đặng Xuân Bình, 2010; Lê Văn Dương, 2013). 1.1.1.4. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn P. multocida * Kháng nguyên Kháng nguyên P. multocida rất phức tạp và cấu trúc từng loại kháng nguyên cũng luôn thay đổi. Những nghiên cứu về cấu trúc, số lượng và sự phân bố kháng nguyên P. multocida rất quan trọng trong việc chế tạo vaccine. Cho đến nay, người ta đã xác định được kháng nguyên của P. multocida có 3 loại là: Kháng nguyên vỏ K, kháng nguyên thân O, kháng nguyên màng ngoài OMP (outer membrane protein). - Kháng nguyên vỏ (K): chỉ có ở P. multocida tạo khuẩn lạc dạng S, không gặp ở vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng M và R. Kháng nguyên K bao bọc xung quanh thân vi khuẩn, giúp cho vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào và ngăn cản sự tiếp
7 xúc giữa kháng nguyên O và kháng thể O. Thành phần và cấu trúc kháng nguyên K khá phức tạp, theo Price và Smith (1966) chúng gồm có 3 loại là α, β, γ. Kháng nguyên có cấu tạo dạng phức giữa protein và polysaccharide. Kháng nguyên protein của vỏ (giáp mô) có khả năng gây miễn dịch mạnh. Kháng nguyên protein đã được nhiều tác giả nghiên cứu và cho rằng nó rất thông dụng, được coi là yếu tố miễn dịch quan trọng. - Kháng nguyên thân (O): vi khuẩn P. multocida có kháng nguyên thân là phức hợp protein - lipid - polysaccharide chiết xuất được nhờ acid trichoaxetic, dung dịch phenol và siêu âm. Phát hiện được bằng phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch. Các chủng vi khuẩn tụ huyết trùng có serotype khác nhau theo kháng nguyên O, chỉ có serotype B hầu như chỉ thuộc một nhóm kháng nguyên O. Những chủng vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng S chuyển sang dạng R vẫn giữ được kháng nguyên O. Hiện nay, nhiều thực nghiệm xác nhận rằng, kháng nguyên O đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành miễn dịch bảo hộ gia súc chống bệnh (Phan Thanh Phượng, 1994). - Protein màng ngoài (Outer membrane proteins - OPM): kháng nguyên màng ngoài gồm 3 protein chính là 27kDa, 34kDa và 36kDa được tìm thấy ở hầu hết các chủng (không phụ thuộc vào type của chủng đó). Một trong những protein độc tính quan trọng của protein màng ngoài này là protein gắn huyết cầu tố (hemoglobin-binding protein), protein này có một receptor đặc hiệu trên màng hemoglobin. Đoạn gen mã hóa hemoglobin binding protein (hgbA) đã được giải trình tự (Seleim, 2005). Ba loại protein màng ngoài đã được phát hiện ở các chủng gây viêm teo mũi được đặt tên là là OMP type I, OMP type II, và OMP type III. Kháng nguyên của P. multocida rất phức tạp, xét về quan hệ hoá học, các kháng nguyên protein và lipopolysaccharid của P. multocida có vai trò chính trong quá trình hình thành miễn dịch bảo hộ gia súc chống bệnh và kháng nguyên là polysaccharid đóng vai trò hỗ trợ. * Giáp mô của vi khuẩn P. multocida
8 Giáp mô là lớp vỏ nhày bao bọc ngoài tế bào, được sinh ra ở điều kiện nhất định trong quá trình sinh trưởng. Giáp mô có tác dụng bảo vệ vi khuẩn chống lại sự thực bào và các tác động có hại của môi trường. Giáp mô cũng là nơi dự trữ chất dinh dưỡng cho vi khuẩn, đồng thời là yếu tố độc lực của vi khuẩn, vi khuẩn có giáp mô thường có độc lực cao. Carter (1955) cho biết, khi nuôi cấy vi khuẩn ở 370C trong môi trường nhân tạo qua một đêm thấy vi khuẩn phát triển giáp mô đầy đủ, sau đó mất dần đi. Điều này chứng tỏ giáp mô chỉ tồn tại ở những vi khuẩn mới phân lập từ gia súc mắc bệnh hoặc nuôi cấy trong thời gian ngắn. Vi khuẩn phân lập được từ động vật mắc bệnh cấp tính đa số đều thấy có giáp mô và có độc lực, khi nuôi cấy những vi khuẩn này lâu trong môi trường nhân tạo, giáp mô của vi khuẩn sẽ mất và vi khuẩn không còn độc lực. Nhưng nếu cấy những vi khuẩn đã mất giáp mô trên môi trường có thêm máu hoặc tiêm truyền qua động vật thì vi khuẩn có thể tái tạo lại giáp mô và thể hiện độc lực. Đặc tính kháng nguyên giáp mô của P. multocida xác định theo type huyết thanh A, B, D, E và F (Wilson và cs, 1992). Giáp mô của chủng type A được cấu tạo bởi axit hyaluronic và polysaccharide. Axit hyaluronic không bị thực bào phát hiện do nó không cótính miễn dịch, nhưng khi tinh chế kháng nguyên K của P. multocida serotype A có một protein (300kDa) có thể ức chế đại thực bào của bò (Seleim, 1993). * Độc lực của vi khuẩn Độc lực của P. multocida được biết từ thời Pasteur, đầu thế kỷ 20, Baldrey đã nhắc đến ảnh hưởng của chất lọc canh trùng già trên thỏ và cho rằng vi khuẩn có độc tính của lipopolysaccharide. Các nghiên cứu về độc lực của vi khuẩn P. multocida trên thế giới cho thấy độc lực của vi khuẩn này không ổn định, nó thay đổi tùy thuộc vào chủng vi khuẩn, loài vật mà nó ký sinh, cấy chuyển nhiều lầntrong môi trường nhân tạo độc lực của nó cũng yếu đi. Khả năng xâm nhập và nhân lên trong cơ thể vật chủ được tăng cường bởi sự hiện diện của kháng nguyên và polysaccharide đó là một trong những yếu tố độc lực quan trọng nhất đối với loài này (Wilkie và cs, 2012).
9 Độc lực của P. multocida rất phức tạp và không ổn định, tuỳ thuộc vào chủng vi khuẩn và loài vật kí sinh. Nghiên cứu về độc lực của vi khuẩn P. multocida các tác giả cho thấy ở những gia súc, gia cầm chết do P. multocida gây ra người ta tìm thấy dấu hiệu tác động của độc tố. * Độc tố của vi khuẩn P. multocida Độc tố của P. multocida là chất phân bào mạnh, có khả năng hoạt hóa men phospholipase C beta. Độc tố này cũng thúc đẩy hoạt động của RhoA và tác động tới các protein nhóm G như: G alpha (q), G alpha (12/13) (Orth và cs, 2005). Những độc tố có bản chất từ protein không chịu nhiệt đã được tìm thấy ở một số chủng P. multocida thuộc type huyết thanh A và D, đặc tính kháng nguyên của những độc tố này tương đối giống nhau. Các vi khuẩn thuộc serotype B hiếm khi có độc tố bản chất là protein, chưa có thí nghiệm nào chứng minh độc tố có bản chất protein của serotype E. - Nội độc tố (Lipopolysaccharide): Lipopolysaccharide là yếu tố độc lực chính và đóng một vai trò chủ yếu trong việc gây bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò. Các chủng P. multocida thuộc type D gây viêm teo mũi sau khi tiến hành điện di phát hiện thấy có ít nhất 6 loại lipopolysaccharide đồng nhất với protein màng ngoài. - Ngoại độc tố (Exotoxin): Ngoại độc tố là sản phẩm của giáp mô P. multocida, đặc biệt là của các chủng thuộc type D. Yếu tố này là nhân tố gây hoại tử niêm mạc (dermonecrotic toxin - DNT). * Serotype của vi khuẩn P. multocida Năm 1943 Little và Lyon đã tìm cách phân loại serotype vi khuẩn P. multocida nhưng không thành công. Roberts (1947) đã dựa trên phản ứng chéo bảo hộ trên chuột để phân loại. Tác giả dùng kháng huyết thanh chuẩn bị trên thỏ để bảo vệ chuột khi công cường độc bằng các chủng P. multocida khác nhau, trên cơ sở chuột được bảo hộ, chia vi khuẩn này thành 4 type là I, II, III và IV, đây là hệ thống phân loại đầu tiên được công nhận. Kể từ đó tất cả các chủng gây bại huyết, xuất huyết độc lực cao được xếp vào Roberts type I, các chủng phân lập được từ trâu, bò thuộc type I. Điều này giúp ích khá nhiều cho việc phát hiện các chủng độc lực cao.
10 Tiếp đó, Carter sử dụng phản ứng kết tủa và phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp, xác định được 4 serotype (được ký hiệu là A, B, C, D). Phản ứng ngưng kết hồng cầu này được thực hiện trên tế bào hồng cầu người nhóm O, thành phần tách từ màng tế bào này được chuẩn bị bằng cách đun tế bào sống P. multocida ở 56 °C/30 phút, loại bỏ tế bào bằng ly tâm sau đó thu lấy dịch nổi phía trên. Dựa trên phản ứng này, tác giả đã phân loại P. multocida thành 4 loại kháng nguyên vỏ là A, B, C và D. Các chủng gây bại huyết, xuất huyết theo cách phân loại của Carter chủ yếu thuộc type B. * Sức đề kháng của vi khuẩn P. multocida Theo Nguyễn Bá Hiên và cs (2009), vi khuẩn tụ huyết trùng dễ bị tiêu diệt bởi nhiệt độ, ánh sáng mặt trời và các chất sát trùng thông thường. Vi khuẩn bị diệt khi đun ở 580C trong 20 phút, 800C trong 10 phút, 1000C chết ngay. Ánh nắng mặt trời chiếu trực tiếp, diệt vi khuẩn trong canh trùng sau 1 ngày. Trong tổ chức của động vật bệnh bị thối nát, vi khuẩn sống được 1 - 3 tháng. Trong máu, mô bào, nước tiểu của súc vật chết, vi khuẩn giữ được độc lực trong vòng 5 - 9 ngày. Trong tuỷ xương vi khuẩn giữ được độc lực ít nhất 8 ngày sau khi con vật chết. Vì vậy, bệnh phẩm được gửi đi chẩn đoán tốt nhất là tuỷ xương. Các chất sát trùng thông thường diệt vi khuẩn nhanh chóng như axit phenic 5% trong 1 phút, creolin 3%, crezyl 3%, nước vôi 1% trong 3-5 phút. Vi khuẩn sống khá lâu và sinh sản trong đất ẩm, thiếu ánh sáng có nhiều muối nitrat và chất hữu cơ. Trong chuồng, trên đồng cỏ, trong đất, vi khuẩn có thể sống hàng tháng có khi hàng năm. 1.1.2. Bệnh tụ huyết trùng do vi khuẩn P. multocida gây ra 1.1.2.1. Đặc điểm bệnh tụ huyết trùng trâu, bò Bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra thường ở 2 thể chủ yếu là nhiễm trùng huyết, xuất huyết (Haemorrhagic septicaemia - HS) và viêm phổi ở bò (Bovine Pneumonia). Thể viêm phổi ở bò thường gặp tại các nước châu Âu và khu vực Bắc Mỹ do vi khuẩn P. multocida type A gây ra (Frank, 1989). Ở một số nước châu Á như Malaysia, Ấn Độ, Sri Lanka... bệnh tụ huyết trùng thể bại huyết ở lợn quan hệ với serotype B:2 (Gamage và cs, 1995). Chính từ nghiên cứu này, các tác giả cho