Luận văn tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát khả năng thủy phân bã mía và carboxymethyl Cellulose của vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu (Ovis aries)

Chia sẻ: Phan Phuong Dung | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:85

Thêm vào BST

Báo xấu

68
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn này nhằm phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có hoạt tính cellulase cao trên cơ chất CMC và bã mía. Mời các bạn cùng tham khảo luận văn để nắm chi tiết hơn nội dung nghiên cứu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát khả năng thủy phân bã mía và carboxymethyl Cellulose của vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu (Ovis aries)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN BÃ MÍA VÀ CARBOXYMETHYL CELLULOSE CỦA VI KHUẨN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ DẠ CỎ CỪU (Ovis aries) CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS. Võ Văn Song Toàn Phan Thị Mỹ Dung TS. Trần Nhân Dũng MSSV:3082499 LỚP:CNSH K34 Cần Thơ, Tháng 5/2012 1 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS. Võ Văn Song Toàn Phan Thị Mỹ Dung TS. Trần Nhân Dũng DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ............................................................................................................................................................ ............................................................................................................................................................ ............................................................................................................................................................ ............................................................................................................................................................ ............................................................................................................................................................ ............................................................................................................................................................ ......................................................................................................................... Cần Thơ, ngày tháng năm 2012 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp 2 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
LỜI CẢM TẠ š› & •œ Đề tài luận văn được hoàn thành không chỉ với quá trình làm việc, học tập và nghiên cứu của tôi, mà còn có sự quan tâm giúp đỡ của rất nhiều người. Tôi xin ghi nhớ và gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Gia đình, đã giúp đỡ tôi về mặt vật chất, và ủng hộ về mặt tinh thần trong suốt quá trình tôi học đại học. - Thạc sĩ Võ Văn Song Toàn đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ cho tôi rất nhiều. - Tiến sĩ Trần Nhân Dũng, đã quan tâm và cho tôi nhiều lời khuyên bổ ích để thực hiện tốt đề tài. - Các thầy cô và anh chị cán bộ ở các phòng thí nghiệm Vi sinh Vật, thực phẩm… đã tạo điều kiên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học việc và làm đề tài. - Các anh chị lớp Công nghệ Sinh học khóa 32TT và 33 đã tận tình chỉ dẫn tôi giúp tôi nắm được những kiến thức căn bản trong phòng thí nghiệm. - Các bạn và các em sinh viên trong Viện đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. - Thầy cô đã tận tình truyền dạy những kiến thức trong suốt quá trình học tập của tôi, để tôi có thể nắm vững và vận dụng tốt trong quá trình thực hiện đề tài cũng như trong công việc sau này. Xin chân thành cảm ơn tất cả! ¶¶¶ 3 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
TÓM LƯỢC Đề tài “Khảo sát khả năng thủy phân bã mía và carboxymethyl cellulose của vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu” được tiến hành nhằm khảo sát và tuyển chọn các dòng vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu có khả năng thủy phân mạnh cơ chất bã mía và CMC trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Kết quả phân lập được 46 dòng vi khuẩn trên cơ chất bã mía, trong đó có 21 dòng vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí và 25 dòng vi khuẩn trong điều kiện kỵ khí, kết quả khảo sát đường kính thủy phân cho thấy 4 dòng vi khuẩn CD 22, CD 26, CD 11 và CD 15 có khả năng thủy phân mạnh cơ chất CMC và cơ chất bã mía. Đặc biệt, dòng vi khuẩn hiếu khí CD 22 có hiệu suất thủy phân CMC và bã mía sau 5 ngày cao nhất trong nhóm hiếu khí, lần lượt là 21,581%, 9, 3147%, dòng vi khuẩn kỵ khí CD 11 có hiệu suất thủy phân CMC và dòng CD 15 có hiệu suất thủy phân bã mía cao nhất lần lượt là 30,049% và 8,8867%. Tiến hành định danh bằng phương pháp sinh hóa các dòng vi khuẩn tuyển chọn, cho thấy, dòng CD 22 tương đồng ở mức 99% với dòng vi khuẩn Pediococcus pentosaceus và dòng CD 26 tương đồng ở mức 73% với dòng Clavibacter agropygi (Corynebacterium). Từ khóa: Clavibacter agropygi (Corynebacterium), Pediococcus pentosaceus, dạ cỏ cừu, thủy phân cellulose,... i PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT ........................................................................................................ LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................ TÓM LƯỢC ................................................................................................................. i MỤC LỤC ................................................................................................................... ii DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................. v DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................. vi CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................................... viii CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU ........................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu đề tài..................................................................................................... 2 CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................................. 3 2.1. Tổng quan về cellulose, CMC, bã mía ................................................................. 3 2.1.1. Cellulose .................................................................................................. 3 2.1.2. CMC......................................................................................................... 5 2.1.3. Bã mía ...................................................................................................... 6 2.2. Hệ enzyme cellulase ............................................................................................. 7 2.2.1. Phân loại.................................................................................................. 7 2.2.2. Cơ chế tác động thủy phân cellulose ....................................................... 9 2.2.3. Nguồn enzyme cellulase .......................................................................... 9 2.2.4. Ứng dụng enzyme cellulase .................................................................. 10 2.3. Tổng quan về dạ cỏ cừu ...................................................................................... 10 2.3.1. Cấu tạo chung dạ cỏ cừu ....................................................................... 10 2.3.2. Vi sinh vật phân hủy cellulose trong dạ cỏ .......................................... 12 2.4. Các phương pháp vi sinh ..................................................................................... 13 2.4.1. Phân lập vi khuẩn....................................................................................... 13 2.4.2. Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập ......................................... 13 2.4.3. Phương pháp kiểm tra catalase .................................................................. 14 2.4.4. Phương pháp xác định đường kính vòng tròn thủy phân .......................... 15 ii PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
2.5. Tình hình nghiên cứu ......................................................................................... 15 2.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ......................................................... 15 2.5.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ...................................................... 16 CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 17 3.1. Địa điểm, thời gian, hóa chất, phương tiện nghiên cứu ...................................... 17 3.1.1. Địa điểm, thời gian, hóa chất và thiết bị ............................................... 17 3.1.2. Vật liệu thí nghiệm .............................................................................. 18 3.1.2.1. Bã mía ....................................................................................... 18 3.1.2.2. Dạ cỏ cừu ................................................................................... 18 3.1.3. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật ........................................ 18 3.1.3.1. Môi trường đặc Delafield (2002) cải tiến .................................. 18 3.1.3.2. Môi trường lỏng Delafield (2002) cải tiến ................................ 19 3.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 19 3.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần bã mía .......................................... 19 a. Khảo sát hàm lượng cellulose bột bã mía........................................... 19 b. Khảo sát hàm ẩm trong bã mía .......................................................... 20 c. Khảo sát hàm lượng tro tổng số trong bột bã mía ............................. 20 3.2.2. Thí nghiệm 2: Phân lập vi khuẩn từ dạ cỏ cừu ..................................... 21 3.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát hoạt tính thủy phân CMC................................ 22 3.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía.............................. 22 3.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát hiệu suất thủy phân CMC ............................... 23 3.2.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát hiệu suất thủy phân bã mía.............................. 23 3.2.7. Thí nghiệm 7: Định danh vi khuẩn ........................................................ 24 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 25 4.1. Kết quả khảo sát thành phần bã mía ................................................................ 25 4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn từ dạ cỏ cừu............................................................ 27 4.2.1. Kết quả mô tả đặc điểm khuẩn lạc............................................................ 27 4.2.2. Kết quả mô tả đặc điểm vi khuẩn ............................................................. 30 4.3. Kết quả khảo sát sơ bộ hoạt tính vi khuẩn trên môi trường cơ chất CMC ....... 33 4.4. Kết quả khảo sát sơ bộ hoạt tính vi khuẩn trên môi trường cơ chất bã mía ..... 36 iii PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
4.5. Kết quả khảo sát hiệu suất thủy phân cơ chất CMC của một số dòng vi khuẩn được tuyển chọn ................................................................................. 39 4.6. Kết quả khảo sát hiệu suất thủy phân cơ chất bã mía của một số dòng vi khuẩn được tuyển chọn ................................................................................. 41 4.7. Kết quả định danh một số dòng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp định danh sinh hóa ............................................................................................ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 47 PHỤ LỤC iv PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu phổ biến................. 4 Bảng 2: Môi trường đặc Delafield (2002) cải tiến (M1).............................................. 18 Bảng 3: Môi trường lỏng Delafield (2002) cải tiến (M2) ............................................ 19 Bảng 4: Bảng bố trí thí nghiệm 3 ................................................................................. 22 Bảng 5: Bảng bố trí thí nghiệm 4 ................................................................................. 23 Bảng 6: Kết quả khảo sát thành phần bã mía sau xử lý ............................................... 25 Bảng 7: Kết quả phân lập vi khuẩn hiếu khí từ dạ cỏ cừu ........................................... 27 Bảng 8: Kết quả phân lập vi khuẩn kỵ khí từ dạ cỏ cừu .............................................. 27 Bảng 9: Kết quả mô tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí.................... 28 Bảng 10: Kết quả mô tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn kỵ khí .................... 29 Bảng 11: Kết quả mô tả một số đặc điểm vi khuẩn hiếu khí ....................................... 30 Bảng 12: Kết quả mô tả một số đặc điểm vi khuẩn kỵ khí .......................................... 32 Bảng 13: Hiệu suất thủy phân các dòng vi khuẩn tuyển chọn định danh .................... 43 Bảng 14: Tóm tắt giai đoạn nhuộm Gram vi khuẩn ......................................... phụ lục 1 Bảng 15: Kết quả khảo sát thành phần ẩm độ và khoáng của bã mía nguyên liệu ....................................................................................... phụ lục 2 Bảng 16: Kết quả phân tích xơ bã mía.............................................................. phụ lục 2 Bảng 17: Kết quả đường kính thủy phân trên CMC của vi khuẩn hiếu khí ..... phụ lục 2 Bảng 18: Kết quả đường kính thủy phân trên CMC của vi khuẩn kỵ khí ........ phụ lục 2 Bảng 19: Kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía của vi khuẩn hiếu khí ............................................................................................. phụ lục 2 Bảng 20: Kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía của vi khuẩn kỵ khí.... phụ lục 2 Bảng 21: Kết quả đo độ nhớt của dịch nuôi vi khuẩn kỵ khí sau 5 ngày ......... phụ lục 2 Bảng 22: Kết quả đo độ nhớt của dịch nuôi vi khuẩn hiếu khí sau 5 ngày....... phụ lục 2 Bảng 23: Kết quả phần trăm CMC còn lại trong dịch nuôi vi khuẩn hiếu khí ............................................................................................ phụ lục 2 Bảng 24: Kết quả phần trăm CMC còn lại trong dịch nuôi vi khuẩn kỵ khí .... phụ lục 2 Bảng 25: Hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn kỵ khí ................................ phụ lục 2 v PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Bảng 26: Hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn hiếu khí.............................. phụ lục 2 Bảng 27: Số liệu khảo sát hiệu suất thủy phân bã mía các dòng vi khuẩn tuyển chọn ........................................................................................ phụ lục 2 Bảng 28: Kết quả phân tích thống kê đường kính vòng tròn thủy phân của vi khuẩn hiếu khí trên cơ chất CMC............................................. phụ lục 3 Bảng 29: Kết quả phân tích thống kê đường kính vòng tròn thủy phân của vi khuẩn kỵ khí trên cơ chất CMC .................................................................... phụ lục 3 Bảng 30: Kết quả phân tích thống kê đường kính vòng tròn thủy phân của vi khuẩn hiếu khí trên cơ chất bã mía ............................................................... phụ lục 3 Bảng 31: Kết quả phân tích thống kê đường kính vòng tròn thủy phân của vi khuẩn kỵ khí trên cơ chất bã mía .................................................... phụ lục 3 Bảng 32: Kết quả thống kê hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn hiếu khí .. phụ lục 3 Bảng 33: Kết quả thống kê hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn kỵ khí..... phụ lục 3 Bảng 34: Kết quả phân tích thống kê hiệu suất thủy phân bã mía của vi khuẩn hiếu khí sau 5 ngày.............................................................................. phụ lục 3 Bảng 35: Kết quả phân tích thống kê hiệu suất thủy phân bã mía của vi khuẩn kỵ khí sau 5 ngày................................................................................. phụ lục 3 vi PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1: Cấu trúc cellulose.............................................................................................. 3 Hình 2: Cấu trúc CMC ................................................................................................... 6 Hình 3: Cấu trúc nhóm enzyme cellulase ...................................................................... 7 Hình 4: Tác dụng của từng enzyme trong hệ enzyme cellulase ở vi sinh vật hiếu khí (A) và vi khuẩn kỵ khí (B) ................................................................. 8 Hình 5: Cấu trúc dạ dày cừu ........................................................................................ 11 Hình 6: Một số thiết bị sử dụng ................................................................................... 17 Hình 7: Bã mía thô và bột bã mía trước và sau xử lý .................................................. 26 Hình 8: Khuẩn lạc dòng vi khuẩn CD 22 và CD 28 .................................................... 28 Hình 9: Hình chụp nhuộm Gram một số dòng vi khuẩn.............................................. 31 Hình 10: Hoạt tính thủy phân CMC của nhóm vi khuẩn hiếu khí ............................... 34 Hình 11: Đường kính thủy phân trên cơ chất CMC của dòng CD 20 và CD 26 ......... 35 Hình 12: Hoạt tính thủy phân CMC của nhóm vi khuẩn kỵ khí .................................. 35 Hình 13: Đường kính thủy phân trên cơ chất CMC của dòng CD 23 và CD 37 ......... 36 Hình 14: Hoạt tính thủy phân bã mía của nhóm vi khuẩn hiếu khí ........................... 36 Hình 15: Hoạt tính thủy phân bã mía của nhóm vi khuẩn kỵ khí ................................ 37 Hình 16: Hoạt tính thủy phân bã mía của một số dòng vi khuẩn................................. 38 Hình 17: Hiệu suất thủy phân CMC của các dòng vi khuẩn hiếu khí tuyển chọn ....... 39 Hình 18: Hiệu suất thủy phân CMC của các dòng vi khuẩn kỵ khí tuyển chọn.......... 40 Hình 19:Hiệu suất thủy phân cơ chất bã mía của một số dòng vi khuẩn kỵ khí được tuyển chọn ............................................................................................. 41 Hình 20: Hiệu suất thủy phân cơ chất bã mía của một số dòng vi khuẩn hiếu khí được tuyển chọn ............................................................................................. 42 Hình 21: Kết quả định danh sinh hóa dòng vi khuẩn CD 22 ....................................... 44 Hình 22: Kết quả định danh sinh hóa dòng vi khuẩn CD 26 ....................................... 45 Hình 23: Phương pháp pha loãng mẫu.............................................................. phụ lục 1 Hình 24: Đường chuẩn phần trăm CMC theo độ nhớt của môi trường ............ phụ lục 2 vii PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
viii PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
CÁC TỪ VIẾT TẮT nm: nanomete CMC: carboxymethyl cellulose m: meter mm: milimete g: gram FAO: Food anh Agriculture Organization ml:mililite EM: Effective Microorganisms UV: Untra violet Đktp: đường kính thủy phân đvC: đơn vị cacbon CFU: colony forming unit VSV : vi sinh vật ix PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Tình hình ô nhiễm môi trường đang là vấn đề nóng trên các diễn đàn trong nước và thế giới. Trong các nguyên nhân dẫn đến ô nhiễm, thì nguyên nhân do các chất hữu cơ thực vật dễ xử lý và ít nguy hại nhất. Tuy nhiên, việc làm thế nào để xử lý nhanh chóng và hiệu quả các chất thải hữu cơ thực vật đồng thời có thể tận dụng sản phẩm sau xử lý phục vụ cho nền nông nghiệp sạch và năng lượng xanh là vấn đề quan trọng đối với những nước có nền sản xuất nông nghiệp như nước ta. Trong tế bào thực vật, cellulose là thành phần chiếm tỉ lệ cao nhất, ở các loại cây gỗ nói chung, hàm lượng cellulose khoảng 40-50% riêng ở cây bông, hàm lượng cellulose lên đến 90%. Hàng năm, có đến hàng tỉ tấn cellulose được tích lũy lại trong đất dưới dạng rác thải hữu cơ thực vật, hoặc do chính thực vật thải ra trong quá trình sinh trưởng phát triển. Nếu lượng cellulose này không được xử lý thì trong thời gian không lâu, toàn bộ nguồn cacbon trong không khí sẽ được chuyển hóa thành cellulose. Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học rất phức tạp, tốn kém và gây độc hại cho môi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất thải hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt là sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật (VSV) sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường. Mặt khác, việc ứng dụng enzyme cellulase để xử lý các sản phẩm thải thực vật, đồng thời tạo ra các sản phẩm phụ như thức ăn gia súc, cồn sinh học, biogas… đang là hướng phát triển tiềm năng của công nghệ sinh học. Số lượng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú như nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn… đặc biệt, khu hệ VSV cộng sinh với các loài động vật ăn cỏ, là đối tượng VSV thủy phân cellulose được chú ý nhất. Các nhà khoa học đã phân lập được trên 200 loài vi khuẩn có khả năng thủy phân cellulose từ dạ cỏ các loài động vật nhai lại (Theodorou và France, 1993). Nhằm phân lập và tuyển chọn những dòng vi khuẩn có hoạt tính cellulase cao , đề tài: “Khảo sát khả năng thủy phân bã mía và carboxymethyl cellulose của vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu” được thực hiện, góp phần cung cấp nguồn giống vi khuẩn phân hủy cellulose có hoạt tính cao để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học -1- Viện NC & PT Công nghệ sinh học PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT 1.2. Mục tiêu đề tài Phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có hoạt tính cellulase cao trên cơ chất CMC và bã mía. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học -2- Viện NC & PT Công nghệ sinh học PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.6. Tổng quan về cellulose 2.1.1. Cellulose Cellulose là một chất xơ không hòa tan và là một trong những thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, chúng được cấu tạo bởi nhiều gốc β-glucose, liên kết với nhau nhờ cầu nối β 1,4-glucan có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000. Hình 1: Cấu trúc cellulose (Nguồn: http://mpronovost.ep.profweb.qc.ca/BIONP1/bionp1_molecules_glucides.html Ngày 15/03/2012 ) Cellulose là glucan không phân nhánh, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose và các phân tử carbohydrate phức tạp khác. Các chuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm. Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hay còn gọi là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những khoảng trống lớn. Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose. Khối lượng phân tử cellulose thay đổi khác nhau phụ thuộc vào từng loại thực vật và tùy phương pháp xác định (khi xác định bằng phương pháp siêu li tâm, người ta nhận thấy rằng khối lượng phân tử của cellulose ở bông là 150.000-500.000 đvC còn ở gai là 1.840.000 đvC), (Nguyễn Lân Dũng, 2008). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học -3- Viện NC & PT Công nghệ sinh học PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình. Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất. Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt với nhau nên dễ bị tấn công. Bảng 1: Thành phần Lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu phổ biến Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%) Thân gỗ cứng 40-55 24-40 18-25 Thân gỗ mềm 45-50 25-35 25-35 Vỏ lạc 25-30 25-30 30-40 Lõi ngô 45 35 15 Giấy 85-99 0 0-15 Vỏ trấu 32.1 24 18 Vỏ trấu của lúa mì 30 50 15 Rác đã phân loại 60 20 20 Lá cây 15-20 80-85 0 Hạt bông 80-95 5-20 0 Giấy báo 40-55 25-40 18-30 Giấy thải từ bột giấy hóa học 60-70 10-20 5-10 Chất rắn nước thải ban đầu 8-15 - 24-29 Chất thải của lợn 6 28 - Phân bón gia súc 1,6-4,7 1,4-3,3 2,7-5,7 Cỏ ở bờ biển Bermuda 25 35,7 6,4 Cỏ mềm 45 31,4 12,0 Các loại cỏ (trị số trung bình 25-40 25-50 10-30 cho các loại) Bã thô 33,4 30,0 18,9 (Nguồn: Nguyễn Vũ Minh Hạnh, 2011) Có hai mô hình cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng tinh thể và vô định hình. - Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo thẳng và định hướng theo chiều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 Å và xếp xen kẽ với vùng vô định hình. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học -4- Viện NC & PT Công nghệ sinh học PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT - Trong mô hình chuỗi gập: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi. Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân. Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao. Trong vùng vô định hình, các liên kết β 1,4 - glycoside giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi 180o cho toàn mạch. Vùng vô định hình dễ bị tấn công bởi các tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β 1,4 - glycoside) sẽ làm giảm độ bền của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro. Cellulose có cấu trúc rất bền, không tan trong nước, chỉ bị trương phồng do hút nước, và khó bị thủy phân, chỉ bị phân hủy do đun nóng với kềm hay acid hay do các enzyme gọi chung là cellulase. Người và động vật không có enzyme phân hủy cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa được cellulose, vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trò điều hòa hoạt động của hệ thống tiêu hóa. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân hủy cellulose. Nấm đất cũng có thể phân hủy cellulose. Vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn. Trong xác thực vật (nhất là trong thành phần của thân và rễ) thì thành phần hữu cơ chiếm tỉ lệ cao nhất bao giờ cũng là cellulose. Hàm lượng cellulose trong xác thực vật thường thay đổi trong khoảng 50-80% (tính theo khối lượng khô), trong sợi bông, hàm lượng này thường vượt quá 90%. Có người đã tính rằng tổng lượng cellulose trên Trái Đất là vào khoảng 3500 tỉ tấn. Nếu không có quá trình phân hủy cellulose thì số lượng này sẽ tăng lên rất nhanh và chẳng bao lâu, tât cả CO2 trong không khí sẽ chuyển hóa hết thành cellulose, sự sống sẽ không tồn tại được nữa. (Nguyễn Lân Dũng, 2004) 2.1.2. Carboxymethyl cellulose (CMC) CMC còn được gọi là carboxymethyl cellulose, là một dẫn suất của cellulose, được tạo thành từ phản ứng với kiềm và acid chloroacetic có độ nhớt cao và tan trong nước. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học -5- Viện NC & PT Công nghệ sinh học PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Chế phẩm CMC khác nhau phụ thuộc vào mức độ thay thế gốc hydroxyl bằng gốc carboxy methyl trong chuỗi cellulose. Thông thường, mức độ thay thế ở khoảng 6-9.5 dẫn xuất trên 1 monomer. CMC có tác dụng ổn định hệ huyền phù, nên được sử dụng để bảo vệ hệ bùn trong khai thác mỏ và dầu khí, trong công nghiệp dùng CMC để hồ vải. (Hồ Sĩ Tráng, 2003). Hình 2: Cấu trúc CMC (Nguồn: http://www.lsbu.ac.uk/water/hycmc.html, ngày 15/03/2012) 2.1.3. Bã mía Mía, Saccharum officinarum, là loài thân thảo, cao 1-4m, đường kính có thể tới 40 – 60 mm. Sau khi ép tách đường, bã mía còn chứa khoảng 50% ẩm và 1 -2 % đường. Về thành phần hóa học, bã mía chứa 40 – 50% cellulose, 18 – 23 % lignin và 20 – 25% hemincellulose. (Hồ Sĩ Tráng, 2003) Các thống kê cho thấy hơn 300 triệu tấn bã mía và củ cải đường được thải ra mỗi năm, tập trung hầu hết ở các nhà máy đường. Các số liệu của FAO cho thấy khoảng 1.248 tấn mía được thu hoạch vào năm 1997, trong đó là 25% bã mía ép (312 triệu tấn). Năng lượng của 1 tấn bã mía ép (độ ẩm 50%) là 2,85 GJ/tấn. Đó là chưa kể các phần thừa (bã bỏ, phần ngọn và lá) và phần thải trong quá trình thu hoạch mía. Các phần này lại chiếm một tiềm năng năng lượng cao hơn cả (55%), thế nhưng hiện nay phần lớn vẫn chỉ bị đốt bỏ hoặc để phân rã ngoài đồng. Nói cách khác, tiềm năng lớn này hầu hết vẫn đang bị bỏ phí. Cho đến năm 1999, Châu Á vẫn dẫn đầu về sản lượng bã mía (131 triệu tấn), sau đó là đến Nam Mỹ (89 triệu tấn). Các nhà máy sản xuất đường đã có truyền thống tái sử dụng bã mía để đốt tạo hơi nước từ nhiều thế kỷ qua, Chuyên ngành Công nghệ Sinh học -6- Viện NC & PT Công nghệ sinh học PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT nhưng hiệu suất vẫn còn rất thấp. Cho đến gần đây, do sức ép kinh tế, các nhà máy đường đã phải tìm các giải pháp khác hoặc cải thiện hiệu suất tái tạo năng lượng, một số nhà máy thậm chí còn bán điện thừa, đặc biệt là tại Brazil, Ấn Độ, Thái Lan... (Đỗ Văn Chương và Nguyễn Thị Hồng Anh, 2007). 2.7. Hệ enzyme cellulase 2.7.1. Phân loại Hình 3: Cấu trúc nhóm enzyme cellulase (Nguồn: http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Cellulases&lang=1, ngày 15/03/2012) Liên kết chủ yếu trong cấu trúc của cellulose là β-(1à4) glucoside. Nói chung, để phá hủy hoàn toàn cấu trúc của polysaccharide này cần có các enzyme cellulase với những tác động đặc trưng riêng biệt. Cellulase là một phức hệ enzyme gồm: + Exocellulase (1,4 β-glucan cellobiohydrolase) (EC.3.2.1.91): cắt từ đầu không khử của chuỗi polymer cho sản phẩm là các gốc đường đôi cellobiose, không phân hủy cellulose kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của phân tử, giúp cho Chuyên ngành Công nghệ Sinh học -7- Viện NC & PT Công nghệ sinh học PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT enzyme endocellulase phân hủy chúng tốt hơn. Ngoài ra exocellulase còn có các tên khác như: cellobiohydrolase (CBH), exoglucanase, cellobiosidase, avicellase. + Endocellulase (1,4 β-D-glucan 4 glucanohydrolase) (EC.3.2.1.4): phân hủy liên kết β-1,4 glucoside trong vùng vô định hình của cellulose thành: cellodextrin, cellobiose, glucose. Tác động yếu lên vùng cellulose kết tinh. Các tên gọi khác như: endoglucanase, endo 1,4 β-glucanase, C-cellulase. + β-D glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21): phân hủy các gốc đường đôi cellobiose thành glucose. Không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy. Các tên gọi khác như: β-glucosidase hay cellobiase. (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Hình 4: Tác dụng của từng enzyme trong hệ enzyme cellulase ở VSV hiếu khí (A) và vi khuẩn kỵ khí (B) (Nguồn: Lee R. Lynd, et al. 2002) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học -8- Viện NC & PT Công nghệ sinh học PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com