intTypePromotion=1
ADSENSE

Thực hành phân tích vi sinh thực phẩm - Định lượng Coliforms và E.codi

Chia sẻ: Nguyen Nhi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:11

1.227
lượt xem
192
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24 – 48 giờ. Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường nhiều.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Thực hành phân tích vi sinh thực phẩm - Định lượng Coliforms và E.codi

  1. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM 2010 THỰC HÀNH PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ThS. Lê Thùy Linh 0 Lưu hành nội bộ
  2. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM NỘI DUNG Trang Bài 1: Định lượng Coliforms và E. coli 2 1.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản 2 1.2. Quy trình định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp MPN 3 1.3. Cách tiến hành thí nghiệm 4 1.4. Cách tính kết quả 10 Bài 2. Định lượng Staphylococcus aureus 10 2.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản 10 2.2. Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN 10 2.3. Cách tiến hành và cách tính kết quả 11 Bài 3. Định tính Salmonella 14 3.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản 14 3.2. Qui trình định tính Salmonella trong thực phẩm 14 Bài 4. Định lượng Bacillus cereus 20 4.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản 20 4.2. Quy trình định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 20 Bài 5. Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc 24 5.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản 24 5.2. Quy trình phân tích 26 Tài liệu tham khảo 1. Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm, NXB Giáo dục, 2006 2. http://www.microbelibrary.org 3. http://www.chromagar.com 4. http://www.rapidmicrobiology.com 5. http://www.marietta.edu Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 1 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
  3. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bài 1: Định lượng Coliforms và E. coli 1.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản Hình 1: phát hiện Coliforms và E. coli trong thực phẩm hay nước bằng 1.1.1 Định nghĩa môi trường CHROMagar ECC Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24 – 48 giờ. Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các loại vi sinh vật khác. Nhóm Coliforms gồm 4 giống là: E. coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter. Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi là IMViC. Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24h khi ủ ở 440C trong môi trường canh EC. Coliforms phân (Faecal Coliforms) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi ủ khoảng 24h ở 440C trong canh Trypton. E. coli là Coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC là ++-- (Indol +, Methyl Red +, Voges-Proskauer -, Citrate -) 1.1.2 Phương pháp Most Probable Number (MPN) Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm. Quy trình thực hiện như sau: Pha loãng mẫu phân tích ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp. Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp Kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Tra bảng Mac Crady Mật độ vi sinh vật MPN/100 ml hay MPN/1g mẫu Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 2 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
  4. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Chú ý: Đa số các bảng MPN cung cấp số liệu ở dạng số MPN trong 100ml dung dịch được sử dụng để phân tích ở các liều lượng là 10ml, 1ml, 0.1 ml. Trên thực tế phân tích, người ta thường dùng 1ml cho mẫu đã pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. Lượng mẫu với các độ pha loãng này tương đương với 1/100 lượng mẫu sử dụng theo bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml nêu trên. Vậy số liệu của bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml tương đương với MPN/ml mẫu chưa pha loãng khi 1ml của các dung dịch có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 được dùng để phân tích. Trường hợp mật độ vi sinh vật quá cao, cần phải sử dụng loạt nồng độ pha loãng tiếp theo cần phải nhân trị số tra bảng MPN nêu trên với hệ số pha loãng. Ví dụ: sử dụng 1ml cho mỗi độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 tức là chỉ sử dụng 1/10 lượng mẫu ở mỗi nồng độ so với trường hợp dùng 1ml mẫu ở các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. Do vậy, trị số tra bảng MPN cần nhân thêm hệ số pha loãng là 10. 1.2 Quy trình định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp MPN Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3… Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ Ghi nhận các ống LSB (+) (sinh hơi) ở mỗi nồng độ pha loãng Cấy vào ống canh BGBL, Cấy vào ống canh EC, ủ ủ ở 370C ± 10C, 48 giờ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng Số ống (+)(sinh hơi )ở mỗi độ pha loãng Cấy lên thạch EMB, ủ ở 370C, 24 giờ Coliforms Xem trang sau Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 3 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
  5. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Tiếp theo Chọn khuẩn lạc (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim xanh), cấy vào Trypton, MR-VP, SC Citrate, ủ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ Thử nghiệm IMViC Đếm số ống canh EC (+) và IMViC ++--, tra bảng MPN E. coli 1.3 Cách tiến hành thí nghiệm Mẫu phân tích: nước mía nguyên chất (dùng 10ml cho một tổ) 1.3.1 Pha môi trường và khử trùng dụng cụ Bước 1: pha môi trường Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích Ghi chú 500 ml nước Phân phối cho mỗi tổ 27ml NaCl : 42.5g SPW cất SPW (9ml/ống nghiệm) (Saline Pepton Pepton: 5g trước khi khử trùng. (buổi 1) Water) 1000 ml nước Phân phối 90ml LSB cho Tryptose: 20g LSB cất mỗi tổ (10ml/ống nghiệm) (Lauryl Sulphate Lactose: 5g trước khi khử trùng. (buổi 1) Broth) Sodium chloride: 5g pH 6.8 ± 0.2 KH2PO4: 2.75g K2HPO4: 2.75g Lauryl sulphate: 0.1g 1000 ml nước Phân phối 90ml BGBL cho Peptone: 10g BGBL Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 4 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
  6. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM cất mỗi tổ (10ml/ ống nghiệm có (Brilliant Green Lactose: 10g Lactose Mật bò: 20g chứa ống Durham) trước khi Bile pH 7.4 khử trùng. (buổi 1) Broth) Brilliant green: 0.0133g Trypticase or tryptose: 1000 ml nước Phân phối 90ml BGBL cho EC cất mỗi tổ (10ml/ ống nghiệm có (E.coli medium) 20g Muối mật No.3: 1.5g chứa ống Durham) trước khi pH 6.9 khử trùng. (buổi 1) Lactose: 5g KH2PO4: 1.5g K2HPO4: 4g NaCl: 5g Pancreatic digest of 1000 ml nước Phân phối 100ml EMB cho EMB cất. mỗi tổ (20ml/petri) (buổi 2) (Eosin Methylene gelatin: 10g Blue Agar) Lactose: 10g pH 7.1 ± 0.2 K2HPO4: 2g Eosin Y: 0.4g Methylene blue: 65mg Agar: 15g hoặc 1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 20ml, phân Tryptone Tryptone water cất phối 10ml/ống nghiệm. trypticase:10g (buổi 3) pH 7.2 ± 0.2 1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 30ml, phân Both Môi trường 1: MR-VP Buffered peptone-water cất. phối 10ml/ống nghiệm. (Glucose Kiểm tra lại môi trường cung Phosphate) powder: 7g pH 6.9 ± 0.2 cấp nào để pha môi trường. Glucose: 5g (buổi 3) K2HPO4: 5g Môi trường 2: Casein Pancreatic Digest: 3.5g Peptic digest of animal tissue:3.5g Dextrose: 5g Potassium phosphate: 5g Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 5 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
  7. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM pH 6.9 ± 0.2 Môi trường 3: Peptone: 5g Glucose: 5g Phosphate buffer: 5g pH 7.5 ± 0.2 1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 50ml, phân Sodium citrate: 2g SCA cất. Đun nóng phối 10ml/ống nghiệm. (Simmons Citrate NaCl: 5g nhẹ và thỉnh (buổi 3) Agar) K2HPO4: 1g thoảng lắc. NH4H2PO4: 1g Đun sôi 1-2 MgSO4: 0.2g blue: phút cho đến Bromothymol 0.08g khi hòa tan hết. pH 6.8 ± Agar: 15g 0.2 Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha. Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. 1.3.2 Cách tiến hành: Bước 3: pha loãng mẫu 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml ống 9ml mẫu 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Độ pha loãng Hình 2: quy trình pha loãng mẫu Pha loãng mẫu thành 3 nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 6 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
  8. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bước 4: Cấy mẫu vào canh LSB Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ. Hình 3: Sơ đồ cấy mẫu từ các độ pha loãng 10-1 10-2 10-3 Bước 5: Định lượng Coliform và E. coli Định lượng Coliform Định lượng E. coli Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa từ các ống LSB (+) sang môi trường canh canh BGBL và ủ ở 370C ± 10C, 48 giờ EC, ủ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) ứng với Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) ứng với mỗi độ pha loãng mỗi độ pha loãng Tính kết quả (xem 1.4) Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống (+) trên canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB. Ủ ở 370C, 24 giờ. Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1mm (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim xanh) (xem hình 4), cấy vào Trypton, MR-VP, SC Citrate, ủ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 7 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
  9. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Hình 4: E.coli nuôi trên môi trường thạch EMB cho khuẩn lạc màu kim xanh (theo Naowarat Cheeptham, Thompson Rivers University, Kamloops, BC, Canada) Bước 6: thử nghiệm IMViC Hình 5: Kết quả IMViC của Escherichia coli sau 24giờ ủ ở 37°C. (Anne Hanson, University of Maine, Orono) Ống A: dương tính thử nghiệm indole trên môi trường tryptone. Xuất hiện lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường sau khi nhỏ thuốc thử Kovács. Ống B: dương tính thử nghiệm methyl red xuất hiện màu đỏ của methyl red. Ống C: âm tính thử nghiệm Voges-Proskauer biểu hiện qua sự không thay đổi màu sau khi cho thuốc thử Barritt’s A và Barritt’s B. Ống D: âm tính thử nghiệm citrate biểu hiện qua sự thay đổi màu sắc và không có khuẩn lạc trong ống nghiệm. a. Thử nghiệm Indol (I): Nguyên tắc: Tryptophan là một acid amin có thể bị oxi hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol. Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa p- Dimethylaminbenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên một phức chất dạng quinone có màu đỏ. Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là nước tryptone. Sinh khối chủng thuần được cấy vào môi trường lỏng tryptone, ủ ở nhiệt độ 370C trong 24-48 giờ. Bổ sung 1ml ether hoặc xylene vào ống nghiệm, lắc đều để chiết Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 8 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
  10. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM tách indol lên lớp dung môi hữu cơ. Nhỏ 5 giọt thuốc thử vào ống dịch nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi sự tạo màu đỏ trong lớp dung môi hữu cơ. Đọc kết quả: (+) xuất hiện của lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường. (-) lớp màu vàng của thuốc thử. Đôi khi có sự xuất hiện của màu cam do skatol, là tiền chất của methyl hóa của indol, tạo ra. Hình 6: thử nghiệm Indol b. Thử nghiệm Methyl Red (MR): Nguyên tắc: chỉ thị đỏ methyl red giúp phân biệt nồng độ H+ hiện diện trong môi trường sau khi vi sinh vật lên men glucose. Chỉ thị này thay đổi màu như sau: pH6.0 màu vàng. Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường lỏng Glucose Phosphate (MR-VP Broth). Dùng que vòng cấy một lượng nhỏ khuẩn lạc trên môi trường MR-VP, ủ ở 370C trong khoảng 2-5 ngày. Thêm vào vài giọt thuốc thử đỏ methyl red (0.02% trong hỗn hợp cồn nước có tỷ lệ 3:2, bảo quản ở 40C) vào trong ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết quả ngay. Đọc kết quả: (+) môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung thuốc thử. (-) khi có màu vàng. Trường hợp màu cam, cần tiếp tục ủ ống môi trường có giống trong 4 ngày và thực hiện lại thử nghiệm. Hình 7: thử nghiệm MR c. Thử nghiệm Voges-Proskauer (VP) (xem mục 3.3, bài 3) d. Thử nghiệm Citrate (iC) Nguyên tắc: sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kềm hóa môi trường. Mặt khác mọi VSV có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất đều có khả năng dùng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự phân giải của muối ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi trường sẽ sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường. Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường. Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 9 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
  11. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường lỏng SCA. Dùng que vòng cấy ria một lượng nhỏ khuẩn lạc lên môi trường SCA rắn trong ống nghiệm thạch nghiêng, ủ ở 350C trong khoảng 24-48 giờ. Đọc kết quả: (+) khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường chuyển sang màu xanh dương. (-) khi không có khuẩn lạc và môi trường giữ nguyên màu xanh lục. 1.4 Cách tính kết quả Hình 8: thử nghiệm Citrate Từ số lượng các ống nghiệm có E. coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng MPN loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng. Bài 2. Định lượng Staphylococcus aureus 2.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, hình cầu, gram dương, có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease (+) có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl. Một số dòng có khả năng tăng trưởng làm Hình 9: S. aureus trên BPA tan máu trên môi trường thạch máu. S. aureus có thể nhiễm vào thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm. Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến. 2.2 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN Phương pháp này được dùng để định lượng S. aureus trong mẫu có mật độ S. aureus thấp nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao. Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 10 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD


intNumView=1227

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2