Thực tập Vi sinh vật học: Phần 1 - Đàm Sao Mai

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:106

Thêm vào BST

Báo xấu

30
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Cuốn sách Thực tập Vi sinh vật học cung cấp cho người đọc kiến thức thực hành cơ bản về vi sinh học thực phẩm một cách toàn diện thông qua việc trình bày các kĩ thuật kinh điển. Bên cạnh đó, sách còn trình bày một số kĩ thuật phân tích hiện đại dựa trên nguyên tắc sinh học phân tử như PCR hoặc sử dụng test thử nhanh bằng hệ thống API. Hệ thống bài thí nghiệm được bố trí hợp lí, kiến thức của bài trước làm nền cho bài sau. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung phần 1 dưới đây.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Thực tập Vi sinh vật học: Phần 1 - Đàm Sao Mai

L A IN IG R O
ĐÀM SAO MAI, TRỊNH NGỌC NAM, BÙI HỒNG QUÂN LÊ HỒNG THÍA, ĐÀO HỒNG HÀ O R IG IN A L NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH
3 Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm LỜI NHÀ XUẤT BẢN Là khoa học nghiên cứu về các đặc điểm sinh học của các vi sinh vật - sinh vật có kích thước hiển vi và siêu hiển vi, Vi sinh vật học có nhiệm vụ nghiên cứu các đặc điểm cơ bản về hình thái, cấu tạo, di truyền hoạt động sinh vật hóa học; nghiên cứu sự phân bố của vi sinh vật trong tự nhiên và mối quan hệ giữa chúng với môi trường và các sinh vật khác; nghiên cứu các biện pháp thích hợp để sử dụng hiệu quả nhất vi sinh vật có lợi cũng như các biện pháp tích cực nhằm ngăn ngừa các vi sinh vật có hại. Cuốn sách “Thực tập Vi sinh vật học” được nhóm tác giả: TS Đàm Sao Mai (chủ biên), Trịnh Ngọc Nam, Lê Hồng Thía, Đào Hồng Hà, Bùi Hồng Quân biên soạn khá công phu, là một nỗ lực rất đáng trân trọng trong việc giới thiệu các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập trung vào các thí nghiệm nghiên cứu, xác định các vi sinh vật dùng trong công nghiệp thực phẩm và các phương pháp kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm. Sách cung cấp cho người đọc kiến thức thực hành cơ bản về vi sinh học thực phẩm một cách toàn diện thông qua việc trình bày các kĩ thuật kinh điển. Bên cạnh đó, sách còn trình bày một số kĩ thuật phân tích hiện đại dựa trên nguyên tắc sinh học phân tử như PCR hoặc sử dụng test thử nhanh bằng hệ thống API. Hệ thống bài thí nghiệm được O bố trí hợp lí, kiến thức của bài trước làm nền cho bài sau. Trong mỗi bài đều có phần nhắc lại lí thuyết trọng tâm, giúp người đọc nắm được cơ sở lí thuyết của thí nghiệm. Trình tự thao tác được trình bày cặn kẽ, hợp lí và minh họa rõ ràng. Các bài thí nghiệm thực hiện qua nhiều công đoạn R đều có sơ đồ trình tự thí nghiệm, giúp người đọc hình dung rõ ràng tiến trình thí nghiệm. Ngoài ra, phần Phụ lục có chỉ tiêu vi sinh của một số sản phẩm thực phẩm theo Tiêu chuẩn Việt Nam giúp IG người đọc thông tin về giới hạn an toàn vi sinh trong thực phẩm. Sách đáp ứng được những đòi hỏi cơ bản của công tác hướng dẫn thực hành: cung cấp cơ sở lí thuyết cơ bản, dự trù nguyên liệu, hóa chất, chuẩn bị dụng cụ, hướng dẫn trình tự tiến hành và các thao tác chuyên môn đặc biệt của thí IN nghiệm, vì thí nghiệm vi sinh là thí nghiệm tinh tế, nhạy cảm, đòi hỏi sự cẩn trọng và độ chính xác cao. Trên cơ sở kế thừa, nâng cao, đổi mới nội dung kiến thức, cuốn sách này thể hiện kết quả A tinh thần làm việc khoa học nghiêm túc của các tác giả. Trong quá trình biên soạn, các tác giả đã tham khảo, chọn lọc nhiều tài liệu, tuân thủ nguyên tắc trình bày rõ ràng, lôgích. Vì vậy, cuốn sách L là một tài liệu khoa học, hệ thống và cơ bản, rất có ích cho giáo viên hướng dẫn thực hành cũng như sinh viên ngành công nghệ thực phẩm. Nhà xuất bản Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh trân trọng giới thiệu cuốn sách “Thực tập Vi sinh vật học” đến đông đảo bạn đọc. NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Thực tập Vi sinh vật học 4 LỜI MỞ ĐẦU Xung quanh chúng ta, ngoài các sinh vật lớn mà chúng ta có thể nhìn thấy được, còn có vô vàn vi sinh vật nhỏ bé, muốn nhìn thấy chúng phải sử dụng kính hiển vi, người ta gọi chúng là vi sinh vật. Vi sinh vật phân bố rộng rãi trong tự nhiên và ảnh hưởng rất lớn đến đời sống của con người và mọi sinh vật khác. Ngành khoa học nghiên cứu về hoạt động sống của các vi sinh vật được gọi là Vi sinh vật học. Vi sinh vật học phát triển rất nhanh, với nhiều lĩnh vực khác nhau: vi khuẩn học, nấm học, tảo học, virus học... hay y sinh vi sinh vật học, vi sinh vật học thú y, vi sinh công nghiệp, vi sinh nông nghiệp, vi sinh môi trường… Mỗi lĩnh vực có đối tượng riêng, cần đi sâu nghiên cứu; song ở mức độ nhất định, các chuyên ngành trên đều có những điểm cơ bản giống nhau. Quyển sách này sẽ giúp sinh viên hiểu rõ hơn về một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật; trong đó, tập trung chủ yếu về Vi sinh đại cương và Vi sinh trong công nghiệp thực phẩm. Tuy đã rất cố gắng trong quá trình biên soạn song không thể tránh khỏi nhiều khiếm O khuyết, chúng tôi rất mong nhận được sự góp ý của quý độc giả để nội dung sách ngày càng được nâng cao. R IG Các tác giả IN A L
5 Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm MỤC LỤC Trang Lời nhà xuất bản............................................................................................................................... 3 Lời mở đầu ........................................................................................................................................ 4 Những quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm vi sinh vật ......................................................... 7 Bài 1. Thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm và các phương pháp tiệt trùng vi sinh vật .................................................................................................................... 9 Bài 2. Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật ...................................................... 18 Bài 3. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật....................................................................................... 25 Bài 4. Phương pháp quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi quang học ......................................... 33 Bài 5. Phương pháp nhuộm màu vi sinh vật ................................................................................. 42 Bài 6. Phương pháp phân lập vi sinh vật....................................................................................... 53 Bài 7. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật............................................................................ 60 Bài 8. Khảo sát sự sinh trưởng của vi sinh vật – Đường cong sinh O trưởng của vi sinh vật ......................................................................................................... 64 Bài 9. Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự sinh R trưởng của vi sinh vật ......................................................................................................... 71 Bài 10. Khảo sát đặc tính sinh hóa của vi sinh vật .......................................................................... 75 IG Bài 11. Kiểm soát sự sinh trưởng của vi sinh vật............................................................................ 91 Bài 12. Xác định khả năng phân giải cellulose và hoạt tính enzyme cellulase của vi sinh vật ...................................................................................................... 95 IN Bài 13. Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm trực tiếp ................................................. 101 Bài 14. Định lượng tổng VK hiếu khí trong thực phẩm bằng phương pháp đếm khuẩn lạc .......................................................................................................... 107 A Bài 15. Định lượng Coliform bằng phương pháp MPN (Most probable number) ........................ 115 Bài 16. Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp dùng petrifilm ............................................... 121 L Bài 17. Ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất thực phẩm – Làm tương đậu................................... 126 Bài 18. Ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất thực phẩm – Làm rượu vang .................................. 129 Bài 19. Phương pháp phân tích định lượng Escherichia coli trong thực phẩm ............................ 132 Bài 20. Phương pháp phân tích Salmonella spp. trong thực phẩm................................................. 141 Bài 21. Phương pháp phân tích định lượng Bacillus cereus trong thực phẩm .............................. 149 Bài 22. Phương pháp phân tích định lượng Staphylococcus aureus trong thực phẩm ......................................................................................................................... 157 Bài 23. Phương pháp phân tích Vibrio cholerae trong thực phẩm ................................................ 163 Bài 24. Phương pháp phân tích Clostridium perfringens trong thực phẩm .................................. 175 Bài 25. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong thực phẩm bằng phương pháp PCR .......................................................................................................................... 180 Bài 26. Xác định nhanh vi sinh vật trong thực phẩm bằng hệ thống Multitest API 20E ............................................................................................................. 186
Thực tập Vi sinh vật học 6 Phụ lục Các chỉ tiêu vi sinh vật của sữa tươi tiệt trùng TCVN 7028:2002 ................................................. 192 Thường quy kỹ thuật định tính và bán định lượng độc tố vi nấm aflatoxin ................................... 194 Thường quy kỹ thuật định danh nấm mốc aspergillus flavus, aspergillus niger, aspergillus fumigatus trong thực phẩm ............................................................................... 201 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7042:2002 Bia hơi – quy định kỹ thuật Draught beer – Specification ........................................................................................................................ 206 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7041:2002 Đồ uống pha chế sẵn không cồn – quy định kỹ thuật Soft drinks – Specification ....................................................................................... 210 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7044:2002 Rượu mùi – quy định kỹ thuật Liqueur – Specification................................................................................................................... 214 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7043:2002 Rượu trắng – quy định kỹ thuật Distilled alcoholic beverages – specification ........................................................................ 218 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7045:2002 Rượu vang – quy định kỹ thuật Wine – Specification ....................................................................................................................... 221 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7108:2002 Sản phẩm sữa bột dành cho trẻ đến 12 tháng O tuổi – quy định kỹ thuật Dried milk for infants up-to 12 months age – Specification .................... 224 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5538:2002 (Soát xét lần 1) Sữa bột – quy định R kỹ thuật Milk powder – Specification ............................................................................................. 230 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7030:2002 Sữa chua – quy định kỹ thuật IG Yoghurt – Specification .................................................................................................................. 235 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5539:2002 (Soát xét lần 1) Sữa đặc có đường – quy định kỹ thuật Sweetened condensed milk – Specification ........................................................ 240 IN Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7029:2002 Sữa hoàn nguyên tiệt trùng – quy định kỹ thuật Sterilized reconstituted milk – Specification ............................................................ 244 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7028:2002 Sữa tươi tiệt trùng – quy định kỹ A thuật Sterilized fresh milk – Specification ...................................................................................... 248 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7049:2002 Thịt chế biến có xử lý nhiệt – quy L định kỹ thuật heat Treated processed meat – Specification ........................................................... 252 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7050:2002 Thịt chế biến không qua xử lý nhiệt - quy định kỹ thuật Non – heat treated processed meat – Specification .................................................. 257 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7048:2002 Thịt hộp - quy định kỹ thuật Canned meat Specification .................................................................................................... 262 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7046 : 2002 Thịt tươi – quy định kỹ thuật Fresh meat Specification ............................................................................................................... 266 Tài liệu tham thảo ......................................................................................................................... 272
Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 7 NHỮNG QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT Thao tác an toàn là yêu cầu cực kỳ quan trọng đối với thí nghiệm vi sinh vật. Vi sinh vật có kích thước nhỏ bé mà mắt thường không nhìn thấy được. Trong quá trình làm thí nghiệm, chúng ta thường thao tác với số lượng rất lớn và đậm đặc tế bào vi sinh vật. Bên cạnh những giống, loài vi sinh vật có ích là những giống, loài có khả năng gây bệnh và có hại đối với sức khỏe con người. Mặt khác, trong quá trình thí nghiệm chúng ta cũng phải sử dụng nhiều loại hóa chất, trong đó có những hóa chất có độc tính. Chính vì thế, người làm thí nghiệm trong phòng thí nghiệm vi sinh vật cần tuân thủ các quy tắc cơ bản sau đây. I. NHỮNG QUY ĐỊNH CHUNG - Những người không có nhiệm vụ không được vào phòng thí nghiệm. O - Khi vào phòng thí nghiệm phải mặc áo blouse (cài khuy kín), cột tóc gọn gàng. - Không nói chuyện ồn ào, giữ gìn trật tự. Không ăn uống, hút thuốc trong phòng R kiểm nghiệm. - Mang khẩu trang, găng tay khi thao tác với vi sinh vật và hóa chất. IG - Trên bàn thí nghiệm chỉ để vật dụng thí nghiệm, số ghi chép, giấy ghi chép. Tất cả các vật dụng cá nhân, áo khoác, túi xách, sách vở… phải để đúng nơi quy định. IN - Trước và sau khi kết thúc thí nghiệm, phải sát trùng mặt bàn bằng các hóa chất sát trùng cồn 70% hoặc dung dịch diệt khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%) đã chuẩn bị sẵn và lau khô bằng giấy vệ sinh. A - Cần ghi chú tên chủng, ngày tháng thí nghiệm, người làm thí nghiệm lên tất cả các hộp petri, ống nghiệm… L - Tuyệt đối không để canh trường hay vật phẩm có vi sinh vật dính lên quần áo, sách vở và dụng cụ cá nhân. Đồng thời cũng phải chú ý bảo vệ da và quần áo khỏi bị dính hóa chất và thuốc nhuộm. - Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn hoặc đèn bunsen. Tắt ngọn lửa khi chưa có nhu cầu sử dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác. Tuyệt đối không dùng đèn cồn để mồi lửa đèn cồn. - Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ống hút định lượng (pipette), tuyệt đối không hút bằng miệng. - Không tự ý sử dụng trang thiết bị, dụng cụ trong phòng thí nghiệm khi chưa được hướng dẫn cụ thể. Sử dụng theo hướng dẫn, hết sức thận trọng, tránh làm đổ vỡ và hư hỏng.
8 Thực tập Vi sinh vật học - Tất cả các vật liệu bị nhiễm bẩn, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần phải được khử trùng trước khi vứt bỏ hoặc sử dụng lại. Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần được ngâm vào dung dịch diệt khuẩn (nước javel) trước khi rửa và tái sử dụng. - Kết thúc thí nghiệm phải vệ sinh các thiết bị, dụng cụ đã sử dụng theo đúng quy trình và sắp xếp vào đúng nơi quy định. - Rửa tay sạch sẽ trước khi rời phòng thí nghiệm. - Tất cả các trường hợp tai nạn phải báo cáo cho cán bộ hướng dẫn thí nghiệm để kịp thời xử lý. II. MỘT SỐ LƯU Ý VỚI SINH VIÊN NHẰM ĐẠT KẾT QUẢ TỐT TRONG THỰC HÀNH VI SINH VẬT 1. Trước khi thực hành - Cần đọc trước nội dung toàn bài để hình dung được khối lượng công việc sẽ làm. - Hiểu rõ nguyên tắc, mục đích của các thí nghiệm. - Đọc cẩn thận cách tiến hành thí nghiệm. O 2. Trong giờ thực hành R - Ghi chú cẩn thận những căn dặn của giảng viên về các thao tác và quy trình thực hành. - Thực hiện thí nghiệm theo đúng hướng dẫn của giảng viên. IG - Trong quá trình thí nghiệm có những thao tác, công đoạn không rõ cần hỏi lại giảng viên hướng dẫn. IN - Ghi chép cẩn thận các chú ý quan trọng của thí nghiệm và kết quả của mỗi thí nghiệm. 3. Kết thúc thực hành A - Làm báo cáo thực hành theo các yêu cầu trong mục V của từng bài thí nghiệm và theo yêu cầu của giảng viên. L Tuyệt đối không dùng miệng để hút dung dịch vi sinh vật và hóa chất !!!
Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 9 Bài 1 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT I. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC o o 1. Tủ sấy (vacuum oven): điều chỉnh nhiệt độ từ 60 C – 200 C, dùng để sấy khô, khử trùng các loại dụng cụ chịu được sức nóng khô, chủ yếu là dụng cụ thủy tinh, kim loại. Tùy vào đối tượng cần khử khuẩn mà sấy ở chế độ nhiệt và thời gian khác nhau, thường o o sấy ở 160 C trong 2 giờ, hoặc 180 C trong 30 phút. O R IG IN Hình 1.1. Tủ sấy A o o 2.Tủ ấm (incubator or etuve): nhiệt độ từ 20 C – 60 C, có chế độ ổn định nhiệt độ, được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật tại nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát L triển của chúng. Tùy vào đối tượng nuôi cấy mà ủ ở nhiệt độ khác nhau để vi sinh vật có o o thể phát triển tốt. Ví dụ: coliform 30 C trong 24 – 48 giờ, E. coli thích hợp ở 44 C trong 24 – 48 giờ. 3. Tủ lạnh hay tủ mát (freezer): dùng bảo quản môi trường đã pha chế, giống vi khuẩn, các chế phẩm sinh học (vaccin, huyết thanh, đĩa giấy kháng sinh…), hóa chất, thuốc thử dễ phân hủy ở nhiệt độ thường. 4. Nồi hấp ướt (autoclave): Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước ở áp suất cao (hơi nước bão hòa ở áp suất cao), được sử dụng để hấp khử trùng môi trường, một số nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm. Tùy đối tượng mà sử dụng ở chế độ nhiệt độ và áp suất o o thích hợp, thường dùng ở 121 C/1 atm trong 15 phút; 127 C/1.5 atm trong 30 phút với môi o trường đất; hay 117 C/0.8 atm trong 15 phút với môi trường chứa nhiều đường, môi trường sữa…
10 Thực tập Vi sinh vật học Bảng 1.1. Tương quan giữa thể thích môi trường và thời gian hấp tiệt trùng ở 121oC Thể tích môi trường Thời gian hấp tiệt trùng nuôi cấy (ml) tối thiểu (phút) 25 20 50 25 100 28 250 31 500 35 1000 40 2000 48 4000 63 Bảng 1.2. Tương quan giữa áp suất hơi (chỉ số của áp kế nồi hấp) và nhiệt độ Chỉ số áp kế của nồi áp 0,0 0,2 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,5 2,0 suất (atm) o Nhiệt độ sôi nước ( C) 100 105 110 112 114 116 117 119 121 127 134 O o Nhiệt độ sôi nước ( F) 212 221 230 234 237 241 243 246 250 261 273 R IG IN A L Hình 1.2. Nồi hấp cao áp (Autoclave) 5. Cân phân tích điện tử (analytical balance): cân trọng lượng từ 100 µg – 200 g. -4 -2 Độ chính xác 10 g. Cân kỹ thuật (technical balance): độ chính xác 10 g. Dùng cân hóa chất, môi trường. Trong quá trình sử dụng, không đặt trọng lượng quá khoảng cân lên cân.
Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 11 A B Hình 1.3. Cân phân tích (A) và cân kỹ thuật (B) 6. Tủ cấy vô khuẩn có đèn cực tím (flux laminar): có không gian vô trùng được sử dụng để thao tác với vi sinh vật nhờ hệ thống đèn tử ngoại và bộ phận thổi khí vô trùng. O R IG Hình 1.4. Tủ cấy vô trùng IN 7. Máy ly tâm (centrifuge): dùng tách các chất ở các pha rắn - lỏng ra khỏi nhau A như tách sinh khối tế bào ra khỏi môi trường nuôi cấy, tách hồng cầu, enzyme… Khi sử dụng, các ống ly tâm cần đặt đối xứng và nhất thiết là phải có khối lượng bằng nhau. L Hình 1.5. Máy ly tâm
12 Thực tập Vi sinh vật học 8. Máy lắc (shaker): Thiết bị dùng để nuôi cấy, nhân giống vi sinh vật bằng cách lắc các bình nuôi cấy theo các chiều khác nhau (lắc vòng và lắc ngang) một cách đều đặn để tăng lượng oxy hòa tan trong môi trường. Hình 1.6. Máy lắc 9. Kính hiển vi (microscope): có vai trò rất quan trọng nghiên cứu vi sinh vật. Dùng nghiên cứu, quan sát tế bào vi sinh vật về đặc điểm hình thái, sinh lý nhờ vào khả năng phóng đại của kính (sẽ giới thiệu chi tiết ở bài sử dụng kính hiển vi). O R IG IN A Hình 1.7. Kính hiển vi quang học L 10. Máy đo pH (pH meter): đo pH dung dịch, môi trường nuôi cấy vi sinh vật A B Hình 1.8. Máy đo pH để bàn (A), máy đo pH cầm tay (B)
Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 13 11. Máy cất nước (single/ double water stills): dùng để cất nước. Hình 1.9. Máy cất nước 12. Bể ổn nhiệt (water bath): chứa nước và được cài đặt ở nhiệt độ nhất định để ổn định nhiệt độ cho những thí nghiệm cần sự ổn định về nhiệt độ. O R IG IN Hình 1.10. Bể ổn nhiệt A 13. Nồi lên men (fermenter/bioreactor): thiết bị lên men nuôi cấy vi sinh vật trong điều kiện tối ưu hóa và điều chỉnh được các thông số môi trường nuôi cấy. L Hình 1.11. Nồi lên men
14 Thực tập Vi sinh vật học 14. Các thiết bị khác như: máy đếm vi sinh vật, máy quang phổ, sấy đông khô… 15. Dụng cụ thí nghiệm Dụng cụ thủy tinh có nhiều loại với nhiều kích cỡ khác nhau như bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, lam kính, đũa thủy tinh, que trang, ống đong, cốc đong, bình định mức… Yêu cầu phải sạch, trong, trung tính. Trước khi dùng đựng môi trường phải được sấy khô, làm nút bông và khử trùng trong tủ sấy khô. - Phiến kính (lame): dùng làm tiêu bản quan sát hình thái, sinh lý tế bào vi sinh vật. - Lá kính (lamelle): dùng để đậy lên vết bôi trên tiêu bản cố định vi sinh vật trong quá trình nghiên cứu. - Hộp lồng (đĩa petri): dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy và phân lập của tế bào vi sinh vật. - Que gạt (que trải): là dụng cụ để phân lập vi sinh vật theo phương pháp trải đĩa. - Que cấy: gồm có ba loại. Que cấy đầu tròn: dùng để thao tác vi sinh trên đối tượng đơn bào như vi khuẩn, nấm men. Que cấy nhọn: dùng cấy sâu trên môi trường rắn. O Que cấy móc: dùng để lấy khuẩn ty hay một đoạn tơ nấm. R - Micro pipette: sử dụng khi cần hút một lượng chính xác môi trường sử dụng trong định lượng vi sinh vật. IG - Pipette Pasteur: dùng để lấy dung dịch môi trường nuôi cấy Các dụng cụ mới cần được ngâm nước hoặc dung dịch H2SO4 loãng trong 24 giờ. Sau đó mới rửa lại bằng nước hoặc xà phòng nhiều lần cho đến khi pH trung tính. IN Các dụng cụ đã qua sử dụng còn chứa môi trường và vi sinh vật, cần khử trùng rồi mới rửa sạch bằng xà phòng, phơi và sấy khô. A Các dụng cụ bị bám bẩn cần được ngâm thêm với dung dịch sulfocromic vài giờ, sau đó rửa lại bằng nước sạch. L Thành phần dung dịch sulfocromic K2CrO7 : 60 g H2SO4 : 66 ml Nước cất đến : 1000 ml Cách pha + Hòa tan 60 g K2CrO7 vào 700 ml nước cất, đặt bình vào chậu nước để tránh bị bỏng khi bổ sung axit. + Bổ sung từ từ 66 ml dung dịch axit H2SO4 vào dung dịch K2CrO7 trên đến khi tan hết.
Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 15 + Bổ sung nước cất vừa đủ 1000 ml. Bảo quản trong bình tối màu, tránh ánh sáng để dùng dần. - Dụng cụ sạch khi đưa lên ánh sáng không có vết mờ và vết bợn. - Các dụng cụ khác như: đèn cồn, giá ống nghiệm, que cấy, kẹp, kéo, bơm tiêm nhựa, đầu tuýp, bếp điện… II. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG VI SINH VẬT 1. Nguyên tắc Diệt trùng hay khử trùng là phương pháp nhằm ức chế hoặc loại bỏ, cuối cùng là giết chết các vi sinh vật không mong muốn. Người ta thường khử trùng bằng hai phương pháp chính. 2. Phương pháp a) Phương pháp lý học Nhiệt khô O - Đối với dụng cụ cấy kim loại, đôi khi cả thủy tinh, phương pháp thường dùng là đốt: đốt trực tiếp trên ngọn lửa hoặc nhúng cồn đốt. R o - Đối với dụng cụ thủy tinh có thể gói giấy và sấy ở 160 C trong 1-2 giờ hoặc IG 180 C trong 30 phút. Dụng cụ đưa vào sấy phải chịu được nhiệt độ cao và không buộc dây o nhựa hoặc thun. Nhiệt ẩm IN - Phương pháp luộc: cho vật khử trùng vào nước sôi, nhiệt sẽ thấm nhanh vào mẫu vật làm cho protein đông kết, dẫn đến giết chết vi sinh vật. Tuy nhiên, chỉ diệt tế bào sinh A dưỡng, bào tử vẫn còn. - Phương pháp Pasteur: chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh (ký sinh), không diệt bào tử và L vi khuẩn hoại sinh. Phương pháp này không diệt hoàn toàn mầm bệnh mà chỉ chọn một vài vi sinh vật đối kháng mạnh nhất. Vì vậy, phải biết nhiệt độ và thời gian diệt trùng cho từng loại vi sinh vật. Phương pháp này thường dùng nhiệt độ 70-75oC trong thời gian 10-15 phút. o - Phương pháp Tyndall: đun cách thủy nhiều lần ở nhiệt độ 70-80 C, mỗi lần 30-60 phút và liên tiếp trong ba ngày liền. - Phương pháp hơi nước bão hòa ở áp suất cao: dùng autoclave. Nhiệt độ và thời gian hấp tùy thuộc vào loại nguyên liệu cần hấp. Thường dùng nhất ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 15-30 phút. Diệt trùng bức xạ - Tia tử ngoại hay UV: chỉ sát trùng bề mặt, không xuyên sâu vào mẫu vật.
16 Thực tập Vi sinh vật học - Tia âm cực: dùng trong diệt trùng dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm. Vật khử trùng phải bao gói kín. Sóng ngắn khi tác động với cường độ và thời gian thích hợp có thể phá vỡ tế bào vi sinh vật, làm chết các tế bào sống. Diệt trùng bằng cách lọc - Dụng cụ lọc thường là những màng xốp bằng sứ, aminate, cellulose… có kích thước lỗ lọc từ 0,2-0,45μm, thường dùng để lọc những vật phẩm lỏng không khử trùng bằng nhiệt được. - Đối với khử trùng không khí thì thiết bị khử trùng là một máy lọc khí có trang bị màng lọc hay hấp phụ vi khuẩn. b) Phương pháp hóa học - Chất sát khuẩn ngoài da: xà phòng, cồn, iode, phẩm màu (phần lớn phẩm màu có tác dụng sát khuẩn như: xanh methylene). - Chất diệt khuẩn và tẩy uế: phenol, formol, hợp chất clor… O III. THỰC HÀNH CHUẨN Bị DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM R 1. Chuẩn bị ống nghiệm Dùng để chứa đựng dung dịch với dung tích nhỏ, nuôi cấy vi sinh vật trên môi IG trường lỏng hoặc môi trường thạch, thử các tính chất sinh hóa của vi sinh vật... Đối với các ống nghiệm không có sẵn nắp (nắp nhựa, nắp cao su, nắp inox…), sinh viên tiến hành làm nút đậy bằng bông không thấm nước và bao gói bên ngoài bằng giấy. IN Yêu cầu của nút đậy bằng bông và bao gói bên ngoài như sau. - Nút bông có độ chặt vừa phải đảm bảo độ kín và thuận tiện trong quá trình thao A tác mở hoặc đậy. Kích thước phần bên trong ống nghiệm của nút khoảng 1,5-2 cm, phần bên ngoài khoảng 0,5 cm. Đầu của nút bông nhẵn, không gấp nếp hoặc xù tơ bông. L - Bao giấy phải trùm kín được phần nút bông của ống nghiệm với độ chặt vừa phải. Mép giấy bên trong và ngoài phải được gấp chéo để thuận tiện cho quá trình tháo ra hoặc đậy lại. 2. Chuẩn bị đĩa petri Đĩa petri chủ yếu dùng để nuôi cấy, phân lập các chủng vi sinh vật hoặc làm các test chẩn đoán, kháng sinh đồ khoanh giấy, các thử nghiệm tính cạnh tranh giữa các chủng vi sinh... trên môi trường thạch dinh dưỡng, mà qua đó ta có thể quan sát được hình thái, tính chất khuẩn lạc của quần thể vi sinh vật. Trước khi sử dụng đĩa petri được rửa sạch, sấy khô sau đó bao gói và sấy hoặc hấp tiệt trùng.
Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 17 3. Chuẩn bị pipette Dùng để đong, hút dung dịch cần có độ chính xác cao. Có rất nhiều loại pipette thủy tinh khác nhau như pipette Pasteur, pipette có chia vạch thông thường... được thiết kế cho phù hợp với mục đích nghiên cứu. Hiện nay, trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu về vi sinh vật gây bệnh đều nghiêm cấm việc hút pipet bằng mồm, thay vì thế người ta dùng quả boa bằng cao su, quả bóp hút an toàn ba van, hoặc dùng pipette hút tự động (pipette aid) hoặc micropipette. Các pipette thủy tinh trước khi sử dụng, cần rửa sạch, nhét bông không thấm nước vào đuôi của pipette để tránh tạp nhiễm khi sử dụng. Pipette được bao gói bằng giấy hoặc đặt chung trong ống chứa pipette sau đó đem sấy hoặc hấp tiệt trùng. 4. Chuẩn bị bình tam giác Thường sử dụng để chuẩn độ, chứa đựng môi trường, dung dịch, nuôi cấy vi sinh vật, thực hiện các phản ứng... Bình tam giác, thường có thể tích từ 50 ml đến 10 lít tùy theo dung dịch chứa để chọn loại bình thích hợp. Trước khi sử dụng, bình tam giác cần được rửa sạch, sấy khô và bao gói. Nút đậy của bình có thể làm bằng bông không thấm nước. O Yêu cầu của nút đậy phải có độ chặt vừa phải, đầu của nút đậy phải tới phần cổ của bình đảm bảo độ kín và tránh tạp nhiễm tối đa. R IV. NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý - Không làm vụn bông không thấm khi làm nút đậy cho các dụng cụ như ống IG nghiệm, bình tam giác. - Khi nút bông gòn vào đuôi pipette, độ chặt phải vừa đủ, phải kiểm tra khả năng IN hút dung dịch của pipette sau khi nút xong. - Kích thước nút đậy của ống nghiệm, bình tam giác phải phù hợp, tiện dụng. A V. BÁO CÁO THỰC TẬP L - Trình bày yêu cầu của việc bao gói dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật. - Công dụng và cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh vật. - Trình bày phương pháp tiệt trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
18 Thực tập Vi sinh vật học Bài 2 PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT I. NGUYÊN TẮC Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào. Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa - khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi trường. Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng: có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết; có độ pH thích hợp; có độ nhớt nhất định; không chứa các yếu tố độc hại; hoàn toàn vô trùng đảm bảo sự phát triển ổn định của vi sinh vật. Phân loại môi trường dinh dưỡng: người ta dựa trên các cơ sở khác nhau để phân O loại môi trường. a) Phân loại theo nguồn gốc R - Môi trường tự nhiên: dịch nước chiết thịt, nước chiết khoai tây, máu động vật... IG - Môi trường nhân tạo: Czapeck, Hansen, EMB... - Môi trường bán tự nhiên: Potato glucose agar (PGA), giá đậu đường... IN b) Phân loại theo trạng thái vật lý - Môi trường lỏng: dạng lỏng, không có agar hay các chất làm giá thể khác trong thành phần môi trường. A - Môi trường rắn: mỗi 1000 ml môi trường có 15-20 g agar hay các chất làm giá L thể. - Môi trường bán lỏng (bán rắn): mỗi 1000 ml môi trường có 3-5 g agar hay các chất làm giá thể khác. c) Phân loại theo công dụng - Môi trường phân lập - Môi trường tăng sinh - Môi trường lưu giữ giống - Môi trường thử nghiệm sinh hóa Môi trường nuôi cấy vi sinh vật được pha chế theo nguyên tắc: - Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinh dưỡng của từng loại sinh vật.
Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 19 - Để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vật nên cần điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường. - Đảm bảo các điều kiện hóa lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật. II. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT 1. Dụng cụ Tên dụng cụ, thiết bị mỗi STT Đơn vị tính Số lượng nhóm (3 sinh viên) 1 Giá ống nghiệm Cái 1 2 Ống nghiệm Ф18 Cái 5 3 Bình tam giác Cái 1 4 Phễu thủy tinh Cái 1 5 Đũa khuấy thủy tinh Cái 1 6 Cốc 100 ml Cái 3 7 Cốc 500 ml Cái 1 O 8 Đĩa cân nhựa Cái 3 9 Bình tia Cái 1 R 10 Bếp điện Cái 1 Dụng cụ dùng chung IG 11 Máy đo pH Cái 1 12 Cân kỹ thuật Cái 1 13 Cân phân tích Cái 1 IN 14 Nồi hấp cao áp Cái 1 15 Tủ sấy Cái 1 A 2. Môi trường và hóa chất L a) Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Môi trường cao thịt - peptone - Cao thịt: 3 g - Peptone: 10 g - NaCl: 5 g - Agar: 20 g - Thêm nước cất cho đủ 1000 ml. Lắc đều, điều chỉnh pH 7,0 ± 0,2 Nấu sôi nhẹ để agar tan hoàn toàn, phân phối môi trường vào các dụng cụ để khử trùng ở 121oC trong 30 phút.
20 Thực tập Vi sinh vật học b) Môi trường nuôi cấy nấm men Môi trường Hansen - Glucose, maltose (hoặc đường kính): 50 g - Peptone: 10 g - K2HPO4: 3 g - MgSO4.7H2O: 2-5 g - Agar: 20 g - Thêm nước cất đủ: 1000 ml Lắc đều, điều chỉnh pH 6,0 ± 0,2 Nấu sôi nhẹ để agar tan hoàn toàn, phân phối môi trường vào các dụng cụ để khử trùng ở 121oC trong 30 phút. c) Môi trường nuôi cấy nấm mốc O Môi trường Czapek - Saccarose: 30 g R - NaNO3: 30 g IG - K2HPO4: 1 g - MgSO4: 0,5 g IN - FeSO4: 0,01 g - Thạch (agar): 20 g; - Thêm nước cất đủ: 1000 ml A pH 6,0 ± 0,2 khử trùng 1 atm /30 phút. L d) Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Môi trường Gauze 1 - Tinh bột tan: 20 g - K2HPO4: 0,5 g - MgSO4.7H2O: 0,5 g - KNO3 : 1,0 g - NaCl : 0,5 g - FeSO4 : 0,1 g - Agar : 20 g - Nước cất đủ: 1000 ml