tiểu luận: Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở lúa Việt Nam

Chia sẻ: Nguyễn Thị Bích Ngọc | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

128
lượt xem 30
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Năng suất lúa thấp do nguyên nhân mặn và những bất lợi của đất vẫn đang tồn tại ở các vùng ven biển Việt Nam. Hơn nữa thiếu khoáng chất và độc tố của muối trong đất ảnh hưởng lớn đến cây lúa, một cây trồng chủ đạo trong nên nông nghiệp nước ta (Hoàng Ngọc Giao, 2006; Nguyễn Tuấn Hinh và cs, 2006

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: tiểu luận: Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở lúa Việt Nam

Ti u lu n TÀI: Nghiên c u a d ng di truy n ngu n gen liên quan n tính ch u m n lúa Vi t Nam
Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở lúa Việt Nam Lê Thị Thu Trang Trường Đại học Khoa hoc Tự nhiên; Khoa Sinh học Chuyên ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70 Người hướng dẫn: TS. Lã Tuấn Nghĩa Năm bảo vệ: 2011 Apstract. Tổng quan về giống lúa chịu mặn: Sự hình thành và đặc tính của đất mặn; Giới thiệu chung về đặc điểm vùng lúa nhiễm mặn ở Việt Nam; Cơ sở di truyền tính chịu mặn ở lúa; Công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn; Đa dạng di truyền; Chỉ thị trong đánh giá đa dạng di truyền; Thành tựu trong nghiên cứu đa dạng di truyền lúa. Trình bày các phương pháp nghiên cứu: Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa; Tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá lúa; Nhận dạng di truyền các giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR; Phân tích số liệu. Trình bày kết quả và thảo luận: Kết quả đánh giá tính chịu mặn của các giống/dòng lúa; Kết quả tách chiết ADN tổng số; Kết quả phản ứng PCR và phân tích đa hình trên gel polyacrylamide; Quan hệ di truyền liên quan đến tính chịu mặn của các giống/dòng lúa. Keywords. Di truyền học; Gen; Tính chịu mặn; Lúa; Việt Nam I. MỞ ĐẦU Năng suất lúa thấp do nguyên nhân mặn và những bất lợi của đất vẫn đang tồn tại ở các vùng ven biển Việt Nam. Hơn nữa thiếu khoáng chất và độc tố của muối trong đất ảnh hưởng lớn đến cây lúa, một cây trồng chủ đạo trong nên nông nghiệp nước ta (Hoàng Ngọc Giao, 2006; Nguyễn Tuấn Hinh và cs, 2006). Bên cạnh đó, hiện tượng xâm thực của nước biển vào nước tưới và đất trồng lúa đã làm cho diện tích ngập mặn lên tới 200.000 ha (Nguyễn Ngọc Anh, 2005). Mặt khác do tập quán và nhu cầu mở rộng canh tác đổi mới ngành nghề nuôi trồng thuỷ sản vô tình làm tăng thêm diện tích ngập mặn cũng tăng thêm diện tích ngập mặn cũng như độ mặn tăng lên từ khoảng 0,3- 0,4% thậm chí có nơi cao hơn cả chục lần. Nông dân thường chờ mưa để trồng lúa. Tuy nhiên do lượng mưa thất thường, cây lúa vẫn có thể bị mặn gây hại ở giai đoạn mạ, hoặc ở giai đoạn trỗ đến chín. Từ trước đến nay, công tác chọn tạo giống 1
lúa ở nước ta tuy có nhiều thành quả, song các phương pháp chọn tạo chủ yếu là truyền thống thông qua lai tạo và đột biến thực nghiệm nên vẫn còn nhiều hạn chế và ảnh hưởng không nhỏ đến kết quả chọn tạo. Với sự phát triển của công nghệ sinh học, rất nhiều vấn đề còn tồn tại trước đây của công tác chọn giống truyền thống đã được giải quyết. Trong đó, ứng dụng chỉ thị phân tử như RAPD, SSR, RFLP, AFLP được nghiên cứu và phát triển đã trở thành công cụ mạnh mẽ để phân tích đa dạng di truyền và xác định được sự khác biệt về mặt di truyền của quần thể giống khởi đầu, từ đó xác định các cặp lai có khoảng cách di truyền phù hợp có thể cho ưu thế lai cao nhất. Việc tiếp cận ở mức độ phân tử cho phép đánh giá các giống bố mẹ một cách chính xác, không bị tác động bởi điều kiện ngoại cảnh, rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu quả công tác lai tạo Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở lúa Việt Nam” với mục tiêu chính là xây dựng cơ sở dữ liệu ADN và tính chịu mặn của các giống/dòng lúa nghiên cứu nhằm góp phần quan trọng cho việc khai thác nguồn gen chịu mặn và định hướng cho chọn tạo giống lúa chịu mặn ở Việt Nam. II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1. Vật liệu - Bộ giống lúa gồm 40 mẫu giống/dòng lúa thu thập từ ven biển phía Bắc, miền Trung Việt Nam đang được lưu giữ tại Ngân hàng gen cây trồng Quốc Gia và một số giống từ Viện nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) Bảng 1. Danh sách 40 giống/dòng lúa trong nghiên cứu TT Tên giống Nguồn gốc TT Tên giống Nguồn gốc 1 Ỏn Nam Định 21 Mành gié Quảng Bình 2 Nếp cúc Ninh Bình 22 IR28 IRRI 3 Hom râu 1 Thái Bình 23 Hom râu 2 Thái Bình 4 Bầu Hải Phòng Hải Phòng 24 CM6 Viện Di truyền NN 5 Nước mặn Thừa Thiên- Huế 25 Q5 Trung Quốc 6 Háu trắng Thừa Thiên- Huế 26 P4 Viện CLT-CTP 7 Lúa ven dạng 1 Quảng Bình 27 P6 Viện CLT-CTP 2
8 Tẻ chăm Quảng Bình 28 AC5 Viện CLT-CTP 9 Quảng Trắng Quảng Trị 29 Nghi hương - 10 Ven đỏ Quảng Trị 30 Tám dự - 11 Nước mặn dạng 1 Quảng Trị 31 Khang dân18 Trung Quốc 12 Chành trụi Thanh Hoá 32 Lúa su dạng 1 Quảng Bình 13 Lúa đỏ Thừa Thiên- Huế 33 Cườm dạng 1 Nam Định 14 Lúa chăm Nam Hà 34 Lúa chăm biển Ninh Bình 15 Pokkali IRRI 35 Ngoi tía Nam Định 16 Cườm dạng 2 Nam Định 36 Ré trắng Hải Phòng 17 Chiêm rong Nam Định 37 IR352 IRRI 18 Tám thơm Nam Định 38 Chiêm cũ Quảng Bình 19 Lúa ngoi Thanh Hoá 39 Tẻ tép Nam Định 20 Nếp quắn Hải Phòng 40 Nếp chẩn Nghệ An - Sử dụng 20 cặp mồi SSR để nhận dạng và phân tích đa dạng di truyền các mẫu giống/dòng lúa (bảng2) Bảng 2: Danh sách các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu Tm KTSP TT Locut Trình tự (oC) (bp) (f): ATATACTGTAGGTCCATCCA-5’ 1 RM5926 55 176 (r): AGATAGTATAGCGTAGCAGC-3’ (f): GTGTAAATCATGGGCACGTG-5’ 2 RM1233 55 161 (r): AGATTGGCTCCTGAAGAAGG-3’ (f): GGCTCGATCTAGAAAATCCG-5’ 3 RM527 55 233 (r): TTGCACAGGTTGCGATAGAG-3’ (f): CGAAAAGTGGGAAGCAAATG-5’ 4 RM5963 (r): GCGTACCCCTAGTGGCTGTA-3’ 55 196 (f): TGCCTCTTCCCTGGCTCCCCTG-5’ 5 RM140 55 261 (r): GGCATGCCGAATGAAATGCATG-3’ (f): TAGCTCCAACAGGATCGACC-5’ 6 RM493 55 211 (r): GTACGTAAACGCGGAAGGTG-3’ (f): AAAGCAGGTTTTCCTCCTCC-5’ 7 RM3412 55 211 (r): CCCATGTGCAATGTGTCTTC-3’ (f):TGACGAATTGACACACCGAGTACG-5’ 8 RM10745 (r): ACTTCACCGTCGGCAACATGG-3’ 55 188 (f): CAAATCCCGACTGCTCC-5’ 9 RM237 55 130 (r): TGGGAAGAGAGCACTACAGC-3’ 3
(f): CTCGTTTATTACCTACAGTACC-5’ 10 RM201 55 158 (r): CTACCTCCTTTCTAGACCGATA-3’ (f): CTGATGATAGAAACCTCTTCTC-5’ 11 RM214 55 112 (r): AAGAACAGCTGACTTCACAA-3’ (f): CCAGATTATTTCCTGAGGTC-5’ 12 RM231 55 182 (r): CACTTGCATAGTTCTGCATTG-3’ (f): CCCATGCGTTTAACTATTCT-5’ 13 RM206 55 147 (r): CGTTCCATCGATCCGTATGG-3’ (f): GAGTGAGCTTGGGCTGAAAC-5’ 14 RM223 55 165 (r): GAAGGCAAGTCTTGGCACTG-3’ (f): CAGATTGGAGATGAAGTCCTCC-5’ 15 RM202 55 189 (r): CCAGCAAGCATGTCAATGTA-3’ (f): GTAATCGATGCTGTGGGAAG-5’ 16 RM339 55 148 (r): GAGTCATGTGATAGCCGATATG-3’ (f): CTCTTCACTCACTCACCATGG-5’ 17 RM518 55 171 (r): ATCCATCTGGAGCAAGCAAC-3’ (f): CTACTTCTCCCCTTGTGTCG-5’ 18 RM261 55 125 (r): TGTACCATCGCCAAATCTCC-3’ (f):TCTGCAAGCCTTGTCTGATG-5’ 19 RM208 55 173 (r):TAAGTCGATCATTGTGTGGACC-3’ (f): AGAAGCTAGGGCTAACGAAC-5’ 20 RM235 55 124 (r):TCACCTGGTCAGCCTCTTTC-3’ 1.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 1.2.1. Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm. Hạt lúa nảy mầm được đặt vào trong những ô trên tấm xốp có đan lưới, đặt lọt khít vào bên trong chậu nhựa hình chữ nhật có chứa 10 lít nước. Mỗi tấm xốp gồm 20 ô, mỗi giống được gieo trên 1ô, mỗi ô 20 hạt. Sau 48 giờ, nước trong chậu được thay bằng dung dịch dinh dưỡng Yoshida có muối NaCl với nồng độ 0.3% và 0.8%. Dung dịch dinh dưỡng Yoshida được thay 2 ngày/lần và điều chỉnh pH hàng ngày ở độ pH= 5.0 bằng cách bổ sung thêm NaOH hoặc HCl. Đánh giá mức độ chịu mặn 7 ngày, 14 ngày và 21 ngày sau khi gieo hạt theo tiêu chuẩn đánh giá SES (Standar Evaluating Score) của IRRI, 1997 (bảng 1) để phân biệt từ mẫn cảm đến kháng, trên cơ sở quan sát bằng mắt với hai giống đối chứng là Pokkali (giống chuẩn kháng) và IR28 (giống chuẩn nhiễm). 1.2.2. Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa trong điều kiện nhà lƣới 4
Thiết kế các khay trồng lúa có kích thước 15 x 30 x 50cm. Đất không bị nhiễm mặn được phơi khô, băm nhuyễn vào khay dày khoảng 10cm (tương đương thể tích khoảng 0,015m3/khay). Hạt lúa nảy mầm được gieo thành hàng (10hạt/hàng, 5 hàng/giống) trong khay tưới nước ẩm cho hạt tiếp tục phát triển trong 3 ngày đầu. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại với 3 nghiệm thức: 0; 0.3%, 0.6 % muối NaCl (EC= 0; 6; 12dS/m). Đánh giá mức độ chống chịu mặn sau 10 ngày, 16 ngày và 22 ngày sau khi xử lý mặn theo tiêu chuẩn đánh giá SES của IRRI, 1997 (bảng 1) Bảng 1. Tiêu chuẩn đánh giá (SES) ở giai đoạn tăng trưởng và phát triển Điểm Quan sát Mức chống chịu 1 Tăng trưởng bình thường, không có vết cháy lá Chống chịu tốt 3 Tăng trưởng gần như bình thường, đầu lá hoặc vài lá Chống chịu có vết trắng, lá hơi cuộn lại 5 Tăng trưởng chậm lại, hầu hết lá bị cuộn, chỉ có vái Chống chịu trung lá còn có thể mọc dài ra, bình 7 Tăng trưởng bị ngưng hoàn toàn, hầu hết lá bị khô, Nhiễm mặn một vài chồi bị chết 9 Tất cả cây bị chết hoặc khô Rất nhiễm mặn 1.2.3. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá lúa Tách chiết ADN lúa bằng dung dịch đệm chứa CTAB dựa trên quy trình chuẩn của Saghai và Maroof (1994) 1.2.3. Nhận dạng di truyền các giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR 40 giống/dòng lúa được nhận dạng di truyền bằng 20 chỉ thị SSR. Phản ứng PCR được chuẩn bị bao gồm các thành phần: 2µl Buffer 10X; 1,2µl MgCl2 (25mM); 1µl dNTP(2,5mM); 0,1µl Taq DNA polymerase (5U); 1µl primer forward (20pmol/µl), 1 µl primer reverse (20pmol/µl)), 2µl ADN khuôn (20ng/µl) trong tổng thể tích phản ứng là 20µl. Chu kỳ nhân gen được thiết kế như sau: 94ºC trong 5 phút; (94ºC trong 1 phút, 56ºC trong 45 giây, 72ºC trong 1 phút) lặp lại 35 lần; 72ºC trong 7 phút; 4ºC trong 30 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamid 12%, trong môi 5
trường đệm TAE 1X, ở 70V trong 3 giờ 20 phút. Sau khi điện di, bản gel được nhuộm trong dung dịch Ethidium bromide và soi chụp ảnh bằng máy soi UV Transiluminator. 1.2.4. Phân tích số liệu Phân tích thống kê một số chỉ tiêu sinh trưởng khi tiến hành đánh giá mặn các mẫu giống/dòng lúa bằng phần mềm IRRISTAR 5.0 Dữ liệu kiểu gen được xử lý, phân tích bằng phần mềm NTSYS pc 2.11X (Applied Biosatistics); các chỉ số đánh giá đa dạng di truyền, tần số alen quần thể được xử lý bằng phần mềm POPGENEv1.32. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 2.1. Kết quả đánh giá tính chịu mặn của các giống/dòng lúa 2.1.1. Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm 2.1.1.1. Thời gian sống sót Kết quả ghi nhận thời gian sống sót của các giống/dòng lúa thanh lọc mặn trong môi trường EC=16dS/m cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Thời gian sống sót lâu nhất hơn giống đối chứng Pokkali (21ngày) có 2 giống lúa, đó là Chành trụi (26 ngày), Nếp cúc (25 ngày). Có 6 giống/dòng có thời gian sống sót tương đương với Pokkali (20-21 ngày) là Hom râu 1, Bầu Hải Phòng, Cườm dạng 2, Hom râu 2, CM6, Cườm dạng 1. Có 9 giống có thời gian sống sót gần bằng Pokkali (15- 19ngày) là Ỏn, Nước mặn, Quảng trắng, Lúa ngoi, Mành gié, Lúa su dạng 1. Lúa chăm biển, Ngoi tía, Chiêm cũ. Các giống còn lại có thời gian sống sót thấp, gồm 22 giống chiếm 55%. Giống chuẩn nhiễm IR28 sống sót được 8 ngày trong môi trường muối 16dS/m. Ghi nhận từ kết quả thực nghiệm chúng tôi thấy nồng độ muối càng cao thì thời gian sống sót của các giống/dòng lúa càng thấp và ngược lại. Ở môi trường EC= 0dS/m, 100% các giống/dòng lúa đều sống sót sau 35 ngày, nhưng trong môi trường dinh dưỡng có NaCl với EC=6dS/m, thời gian sống sót trung bình của các giống/dòng lúa là 29.6 ngày và ở môi trường dinh dưỡng có NaCl với EC=16dS/m, thời gian sống sót trung bình của các giống/dòng là 14.5 ngày. 2.1.1.2. Chiều cao thân 6
Kết quả phân tích phương sai cho thấy ở nồng độ muối khác nhau đều dẫn đến chiều cao thân khác nhau có ý nghĩa thống kê. Ở trong môi trường dinh dưỡng Yoshida có muối với nồng độ 0.3% (EC=6dS/m), kết quả ghi nhận cho thấy đa số các giống có chiều cao trong khoảng 22- 26cm. Chiều cao trung bình của các giống/dòng lúa là 24.41cm. Giống Cườm dạng 1 có chiều cao thân cao nhất (28.23cm) và giống có chiều cao thân thấp nhất là IR28 (19.40cm). Ở trong môi trường dinh dưỡng có muối với nồng độ 0.8% (EC= 16dS/m), đa số các giống/dòng lúa thí nghiệm có chiều cao trong khoảng 17-21cm. Chiều cao trung bình là 19.64cm. Các giống có chiều cao vượt trội, cao hơn hẳn giống đối chứng Pokkali (21.67cm) và có ý nghĩa khác biệt khi phân tích thống kê là Tẻ chăm, Chành trụi, Cườm dạng 2, Lúa ngoi, Hom râu 2, Cườm dạng 1, Lúa chăm biển, Ré trắng. Các dòng có chiều cao tương đương giống đối chứng Pokkali (không khác nhau về mặt thống kê) là Quảng trắng, Lúa đỏ, Nghi hương, Chiêm cũ. Có 4 giống/dòng (Lúa ven dạng 1, Nước mặn dạng 1, Ngoi tía, IR352) có chiều cao thân khá, cao hơn chiều cao thân trung bình. Như vậy, chiều cao cây và khả năng chịu mặn tỷ lệ nghịch với nhau. Nồng độ muối càng cao thì chiều cao cây càng giảm. 2.1.1.3. Chiều dài rễ Chiều dài rễ trung bình của 40 giống/dòng lúa trong môi trường dinh dưỡng có muối với nồng độ 0.8% (EC=16dS/m) là 8.37cm. Giống đối chứng Pokkali có chiều dài rễ là 9.77cm, có 6 giống/dòng có chiều dài tương đương với giống đối chứng (khác biệt không có ý nghĩa thống kê) là Nếp cúc, Nước mặn dạng 1, CM6, Q5, Cườm dạng 1, Ngoi tía, ngoài ra các giống Ỏn, Bầu Hải Phòng, Nước mặn, Lúa chăm biển, Hom râu 2, Tám dự, Lúa chăm biển, Ré trắng, Tẻ tép, Nếp chẩn có chiều dài rễ khá. Tuy nhiên, trong dung dịch Yoshida có muối với nồng độ thấp hơn (EC=6dS/m), các giống/dòng lúa có chiều dài rễ trung bình là 11.76cm. Trong đó, Hom râu 2 có chiều dài rễ dài nhất là 14.49cm và giống có chiều dài rễ thấp nhất là Quảng trắng (9.76cm), giống Pokkali có chiều dài rễ tương đối cao là 13.13cm. 2.1.1.4. Trọng lượng khô thân Khi phân tích phương sai kết quả ghi nhận trọng lượng khô thân của bộ giống nghiên cứu trong hai môi trường muối khác nhau cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống 7
kê. Trọng lượng khô thân trung bình của các giống/ dòng lúa đạt 116.22mg trong môi trường dinh dưỡng có muối với độ dẫn điện EC=6dS/m. Ghi nhận kết quả trọng lượng khô thân của 40 giống/dòng lúa thí nghiệm trong môi trường có độ dẫn điện EC=16dS/m cho thấy, trọng lượng trung bình chỉ đạt 93.63 mg. Giống chuẩn kháng Pokkali là giống có trọng lượng thân cao nhất (131.45mg), khác biệt rất có ý nghĩa với giống chuẩn nhiễm IR28 có trọng lượng khô thân là 59.34mg. Một số giống có trọng lượng khô thân tương đối cao, gần băng Pokkali là Chiêm rong, Chành trụi, Ven đỏ, Nếp cúc. 2.1.1.5. Trọng lượng khô rễ Kết quả ghi nhận trọng lượng khô rễ của các giống/dòng lúa thí nghiệm cho thấy sự khác biệt khi phân tích thống kê. Ở trong môi trường dinh dưỡng có muối với EC=16dS/m, các giống có trọng lượng khô rễ trung bình là 27.03 mg. Giống Pokkali (chuẩn kháng) có trọng lượng khô rễ cao (39.14mg), khác biệt rất có ý nghĩa với các giống/dòng lúa còn lại trong thí nghiệm, duy chỉ có giống Chành trụi có trọng lượng khô rễ cao hơn giống đối chứng là 40.33mg. Có 3 giống là Lúa su dạng 1, CM6, Lúa ven dạng 1 có trọng lượng khô rễ tương đối cao, gần bằng giống Pokkali. Giống chuẩn nhiễm IR28 có trọng lượng khô rễ là 25.75mg và là giống có trọng lượng khô rễ trung bình. Hai giống Nếp quấn, Ven đỏ có trọng lượng khô rễ thấp nhất là 20,06mg. Ghi nhận kết quả ở môi trường dinh dưỡng có NaCl 0.3 đa số các giống/dòng lúa có trọng lượng khô rễ từ 26-31mg và có trọng lượng khô rễ trung bình đạt 29.56 mg. 2.1.2.6. Đánh giá mức độ chống chịu mặn Kết quả ban đầu cho thấy, cây mạ trong môi trường dinh dưỡng có muối NaCl với nồng độ 6dS/m, sau 7 ngày xử lý mặn chỉ có 2 giống Khang dân và AC5 ảnh hưởng cấp độ 3, đến 14 ngày sau khi xử lý mặn cây mạ bị ảnh hưởng chủ yếu ở cấp 3-5; sau 21 ngày đa số các giống/dòng lúa bị ảnh hưởng chủ yếu ở cấp 5-7, 4 giống/dòng lúa bị chết (cấp 9) chiếm 10% là Khang dân, AC5, Q5, Ven đỏ. Ở trong môi trường trường dinh dưỡng có muối NaCl với độ dẫn điện EC=16dS/m, sau 7 ngày xử lý mặn giống chuẩn nhiễm IR28 có biểu hiện ở cấp 7, giống Pokkali có biểu hiện ở cấp 3, đa số các giống/dòng lúa khác bị nhiễm cấp 5-7. Vào 14 ngày sau xử lý mặn thì giống IR28 bị nhiễm cấp 9 (chết), giống Pokkali biểu hiện ở cấp 5 cùng với 13 giống/dòng lúa có biểu hiện tương đương Nước mặn, Lúa su 8
dạng 1, Lúa ven, Quảng trắng, Hom râu 1, Hom râu 2, Cườm dạng 1, Chiêm rong, Lúa chăm biển, Mành ré, Chiêm cũ, Bầu Hải Phòng, Ỏn. 9 giống/dòng lúa còn sống sau 21 ngày xử lý mặn là Ỏn, Bầu Hải Phòng, Lúa ven dạng 1, Pokkali, Mành gié, Hom râu 2, Lúa su dạng 1, Cườm dạng 1, Chiêm cũ nhưng ở mỗi giống chỉ còn lại vài cây bị nhiễm ở cấp 7(chiếm 22.5%), chỉ có Chành trụi, Cườm dạng 2, Nếp cúc là nhẹ hơn, cấp 5 (chiếm 7.5%). Hình 1: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ % mức chống chịu mặn của 40 giống/dòng lúa nghiên cứu trong dung dịch Yoshida có NaCl với EC=6dS/m và EC=16dS/m Mạ sau 21 ngày xử lý mặn (EC=6dS/m) Mạ sau 21 ngày xử lý mặn (EC=6dS/m) Mạ sau 17 ngày xử lý mặn (EC=0dS/m) Mạ sau 17 ngày xử lý mặn (EC=16dS/m) Hình 2: Thí nghiệm thanh lọc mặn các giống/dòng lúa nghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm 9
2.1.2. Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa trong điều kiện nhà lƣới 2.1.2.1. Tỷ lệ sống sót Ở điều kiện nhiễm mặn với nồng độ 0.3% (EC=6dS/m), giống IR28 chết vào thời điểm 21 ngày sau khi xử lý mặn. Đa phần các giống/dòng lúa có tỷ lệ sống sót trên 50%, trong đó có 6 giống có tỷ lệ sống sót > 70%, 25 giống có tỷ lệ sống sót từ 51- 70%, 5 giống có tỷ lệ sống sót nằm trong khoảng 31-50%, 4 giống/dòng lúa có tỷ lệ sống sót
giống/dòng bị ảnh hưởng ở cấp3, 11 giống/dòng lúa bị ảnh hưởng ở cấp 5, 11 giống/dòng lúa ở cấp 7 và 4 giống/dòng lúa ( IR28, P6, AC5, Khang dân 18) bị ảnh hưởng nặng nhất ở cấp 9. Khi xử lý mặn các giống/dòng lúa nghiên cứu ở nồng độ 0,6% (EC=12dS/m) thì sau 10 ngày ảnh hưởng mặn tới một số giống/dòng lúa, IR28 biểu hiện ở cấp 5, giống chuẩn kháng Pokkali biểu hiện ở cấp 3, đa số các giống/dòng lúa khác bị nhiễm cấp 5-7. Sau 16 ngày xử lý mặn giống IR28 bị chết, giống Pokkali biểu hiện ở cấp 3 (kháng mặn tốt) cùng với 3 giống có biểu hiện tương đương là Chành trụi, Cườm dạng 2, Nếp cúc. 23 giống/dòng lúa có biểu hiện cấp 5 là Ỏn, Hom râu1, Bầu Hải Phòng, Nước mặn, Háu trắng, Lúa ven dạng 1, Tẻ chăm, Quảng trắng, Nước mặn dạng1, Chiêm rong, Mành gié, Hom râu 2, CM6, P6, Nghi hương, Tám dự, Lúa su dạng 1, Cườm dạng 1, Lúa Chăm biển, Ngoi tía, Ré trắng, Chiêm cũ, Tẻ tép chiếm tỷ lệ 57.5%. Số giống/dòng lúa sống sau 22 ngày sau khi xử lý mặn là 38 giống/dòng lúa nhưng khả năng sinh trưởng đã bị giảm, ở mỗi giống/dòng chỉ còn vài cây bị nhiễm ở cấp 7. Giống Pokkali, Chành trụi, Cườm dạng 2, Nếp cúc vẫn ở mức kháng mặn trung bình (cấp5). Như vậy, sau khi giống chuẩn nhiễm IR28 bị chết, có 4 giống (chiếm 10%) có biểu hiện mức kháng mặn cao, 23 giống/dòng lúa (chiếm 57.5%) biểu hiện khả năng kháng mặn ở mức trung bình cấp 5, 11 giống/dòng lúa (chiếm 27.5%) tăng trưởng bị ngưng hoàn toàn, hầu hết lá bị khô, một vài chồi bị chết (cấp7). Hình 4: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ % mức chống chịu mặn của 40 giống/dòng lúa nghiên cứu trồng trong đất có NaCl với EC=6dS/m và EC=12dS/m 11
2.2. Kết quả tách chiết ADN tổng số Kết quả tách chiết ADN bằng phương pháp CTAB cải tiến thu được ADN nguyên vẹn, độ tinh sạch cao và có nồng độ khá lớn, từ 150- 300ng/µl, đảm bảo đủ điều kiện để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo (Hình 5) Hình 5: Kết quả tách chiết ADN tổng số lúa Số TT: 1đến 40: các giống/dòng lúa theo danh sách mẫu (phụ lục 1) 2.3. Kết quả phản ứng PCR và phân tích đa hình trên gel polyacrylamide Sản phẩm PCR-SSR được điện di trên gel polyacrylamide 8% để phân tích mối tương quan di truyền liên quan đến tính chịu mặn của bộ giống/dòng lúa nghiên cứu Tổng số thu được 800 mẫu phản ứng PCR (tổ hợp PCR). Hình 6: Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR- RM339 M: ADN 50bp ladder Số 1-40: thứ tự các mẫu giống/dòng lúa (phụ lục 1) Hình 7: Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR- RM261 M: ADN 50bp ladder Số 1-40: thứ tự các mẫu giống/dòng lúa (phụ lục 1) 12
Thống kê trên 20 locut SSR, sản phẩm PCR là các băng có kích thước nằm trong khoảng từ 110-300bp, kích thước phổ biến của các alen thu được trong bộ giống lúa nghiên cứu biến thiên trong khoảng 120- 250bp. Hình 8: Biến động kích thước của các alen tại locut SSR khảo sát. Thống kê kết quả nhân gen 40 giống/dòng lúa bằng 20 chỉ thị SSR được thể hiện ở hình 9. Tổng số alen được phát hiện tại 20 locut là 144. Số alen đa hình tại mỗi locut biến động từ 3 đến 11, đạt trung bình là 7,2 alen/locut. Số lượng alen nhiều nhất là 11 (RM235), đạt 10 alen (RM140, RM201, RM493, RM1233) và 9 alen 9(RM202). Locut cho ít đa hình nhất (3alen) tại RM5963. Bằng phần mềm POPGENE 3.1, tần số alen của mỗi locut được tính toán dựa trên số liệu nhận dạng di truyền của 40 giống/dòng lúa và là cơ sở để xác định các chỉ số đa dạng di truyền. Trong số 20 chỉ thị SSR, có 12 chỉ thị cho nhận dạng đặc biệt (unique allele). Các băng kích thước nằm trong khoảng 100-250bp. Tần số allen phổ biến nhất dao động từ 15.79 % đến 85%, trung bình là 40.07% (bảng 2). Hệ số đa dạng di truyền PIC (Polymorphism Information Content) được coi là thước đo tính đa hình của các alen trong từng locut SSR. Số liệu ở bảng 2 cho thấy các giống/dòng lúa nghiên cứu rất đa dạng về thành phần các alen ở các locut được nghiên cứu. Hệ số PIC thu được tại các locut SSR biến động từ 0,265 (locut RM5926) đến 0.889 (locut RM235) với giá trị trung bình là 0.713, cho thấy mức độ đa dạng gen tồn tại trong 40 mẫu lúa nghiên cứu ở mức khá cao. 13
Hình 9: Kết quả phản ứng PCR của 40 giống/dòng lúa với 20 cặp mồi SSR (ô đen- có alen được ghi nhận; ô trắng – không có alen được ghi nhận) 14
Bảng 2: Đa hình các locut SSR ở các giống lúa nghiên cứu TT Locut NST Số Kích thƣớc Tầ n số allen Số allen PIC allen sản phẩm phổ biế n đặc trƣng PCR (bp) nhấ t 1 RM201 9 10 135-168 28.205 4 0.828 2 RM202 11 9 140-210 30.000 0 0.835 3 RM206 11 7 125-150 30.769 0 0.785 4 RM237 1 7 110-140 48.718 0 0.709 5 RM493 1 10 200-275 34.211 3 0.821 6 RM10745 1 6 170-200 33.333 1 0.750 7 RM214 7 6 110-150 65.000 1 0.549 8 RM3412 1 7 180-240 20.000 1 0.828 9 RM231 3 8 120-200 23.077 0 0.855 10 RM339 8 5 140-190 43.243 1 0.706 11 RM518 4 7 135-180 34.286 0 0.805 12 RM261 4 8 120-140 32.500 1 0.810 13 RM140 1 10 250-300 27.500 4 0.828 14 RM527 6 6 220-280 22.500 0 0.810 15 RM1233 11 10 150-170 30.769 3 0.822 16 RM223 8 5 110-200 85.000 3 0.270 17 RM5963 6 3 160-200 66.667 0 0.492 18 RM5926 11 4 170-240 78.571 0 0.265 19 RM208 2 5 160-185 51.282 1 0.599 20 RM235 12 11 120-170 15.789 2 0.889 Total 144 25 Mean 7.2 40.071 1.3 0.713 Min 3 15.789 0 0.265 Max 11 85.000 4 0.889 15
2.4. Quan hệ di truyền liên quan đến tính chịu mặn của các giống/dòng lúa Quan hệ di truyền của 40giống/dòng lúa với 20 locut tương ứng với các mồi SSR được phân tích UPGMA bằng phần mềm NTSYS pc 2.11X. Sơ đồ hình cây giữa các giống nghiên cứu cho thấy hệ số tương đồng di truyền của cả nhóm biến động từ 0,68 đến 0,91 (theo phương pháp SM, NTSYS). Tại giá trị tương đồng 0,825; 40 giống/dòng lúa được chia thành 10 nhóm lớn với khả năng chịu mặn khác nhau: Nhóm I: Mức độ tương đồng di truyền thấp nhất là 0,836; gồm 3 giống/dòng lúa là Ỏn, Nếp cúc, Hom râu 1có khả năng chịu mặn tốt trong dung dịch Yoshida có NaCl với nồng độ 0.8% (EC= 16dS/m) và trong đất có NaCl với nồng độ 0.6% (EC=12dS/m). Nhóm II: Mức độ tương đồng di truyền thấp nhất là 0,826; gồm 5 giống/dòng lúa Bầu Hải Phòng, Háu trắng, Lúa đỏ, Nước mặn, Lúa chăm. Nhóm này đều là các giống/dòng lúa địa phương, trong đó có 3 giống/dòng lúa Lúa đỏ, Nước mặn, Lúa chăm có cùng nguồn gốc Thừa Thiên Huế. Đặc biệt có giống Bầu Hải Phòng có khả năng chịu mặn khá , 2 giống Háu trắng và Nước mặn có khả năng chịu mặn trung bình trên thực nghiệm. Nhóm III: Gồm 5 giống/dòng lúa là Lúa Ven dạng 1, Quảng trắng, Nước mặn dạng 1, Tẻ chăm, Ven đỏ đều có nguồn gốc từ ven biển miền Trung Việt Nam. Nhóm này có mức độ tương đồng thấp nhất là 0,852. Phần lớn các giống/dòng lúa trong nhóm này có khả năng chịu mặn khá cao. Nhóm IV: Có mức độ tương đồng di truyền thấp nhất là 0,842, chỉ gồm 2 giống/dòng lúa, trong đó, 1 giống có nguồn gốc từ Nam Định là Chiêm rong và 1 giống có nguồn gốc từ Thanh Hoá là Chành trụi có khả năng chịu mặn tốt trong điều kiện môi trường có muối với nồng độ 0,8%. Nhóm V: Có mức độ tương đồng thấp nhất là 0,825; gồm 6 giống/dòng lúa của Việt Nam (Cườm dạng 2, Tám thơm, CM6, Mành gié) và IRRI (Pokkali và IR28). Trong nhóm này, cùng với giống chuẩn kháng mặn Pokkali, giống/dòng lúa Cườm dạng 2 và CM6 có khả năng chịu mặn khá trong môi trường có muối với EC=16dS/m. 16
Nhóm VI: Mức độ tương đồng thấp nhất là 0,835; gồm 3 giống/dòng lúa Q5, Tám dự , Nghi hương. Nhóm này có 1 giống nhập nội có nguồn gốc từ Trung Quốc là Q5 có khả năng chịu mặn kém, 2 giống/dòng Tám dự và Nghi hương chịu mặn tốt trong môi trường có muối với nồng độ 12dS/m. Nhóm VII: Gồm 3 giống chịu mặn kém là P4, P6, AC5. Nhóm này có mức độ tương đồng di truyền thấp nhất là 0,862 và có nguồn gốc từ Việt Nam. Nhóm VIII: có mức tương đồng thấp nhất là 0,847; gồm 7 giống/dòng lúa của Việt Nam và IRRI là Lúa chăm biển, Ngoi tía, Ré trắng, IR352, Chiêm cũ, Tẻ tép, Nếp chẩn , trong đó có 2 giống/dòng lúa có khả năng chịu mặn ở mức trung bình có cùng nguồn gốc từ Nam Định là Ngoi tía và Tẻ tép Nhóm IX: có mức tương đồng di truyền thấp nhất là 0,829; gồm 3 giống/dòng lúa Lúa ngoi, Nếp quắn , Hom râu 2 đều là các giống địa phương của Việt Nam, trong đó có Hom râu 2 nguồn gốc từ Thái Bình có khả năng chịu mặn khá. Nhóm X: Gồm 3 giống/dòng lúa, trong đó có 1 giống nhập nội có nguồn gốc từ Trung Quốc là Khang dân; 2 giống địa phương của Việt Nam là Cườm dạng 1 và Lúa su dạng 1 có khả năng chịu mặn tốt theo thực nghiệm. Hình 10: Sơ đồ cây phân loại 40 giống/dòng lúa bằng phương pháp UPGMA 17
Trong công tác tạo giống lúa lai, người ta nhận thấy rằng các cặp bố mẹ càng xa nhau về phương diện di truyền thì càng cho ưu thế lai cao. Nếu khoảng cách di truyền giữa cặp giống bố mẹ quá lớn (tương đồng di truyền nhỏ hơn 0,4), con lai thường khó sống sót hoặc bất thụ. Nếu khoảng cách di truyền giữa cặp giống bố mẹ quá nhỏ (tương đồng di truyền lớn hơn 0,7) con lai thường có ưu thế lai rất thấp hoặc không cho ưu thế lai. Như vậy mức độ tương đồng di truyền từ 0,4 đến 0,7 làm chuẩn để chọn bố mẹ tạo các dòng lúa lai có khả năng cho ưu thế lai. Trên cơ sở phân tích di truyền dựa vào chỉ thị phân tử SSR, kết quả phân nhóm di truyền và hệ số tương đồng di truyền giữa các giống/dòng lúa nghiên cứu, chúng tôi đề xuất một số tổ hợp lai dự kiến có triển vọng như sau: Hom râu 1 và Pokkali, Chành trụi và P6, Pokkali và Q5, Cườm dạng 2 và Khang dân. IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Từ những kết quả đạt được của đề tài, chúng tôi đưa ra các kết luận sau: 1. Đã đánh giá được khả năng chịu mặn của 40 giống/dòng lúa nghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm và điều kiện nhà lưới, trong đó có 4 giống biểu hiện khả năng chịu mặn tốt là Pokkali, Nếp cúc, Cườm dạng 2 , Chành trụi. 2. Đã nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa liên quan đến tính chịu mặn bằng 20 chỉ thị SSR. Ghi nhận được tính đa alen rất cao của 20 locut SSR nghiên cứu (từ 3-11 alen/locut). Tần số alen phổ biến dao động từ 15,79% đến 85%, trung bình đạt 40,07%. Hệ số đa dạng di truyền PIC của các locut nghiên cứu khá cao với giá trị trung bình là 0,713. 3. Đánh giá đa dạng di truyền các giống/dòng lúa liên quan đến tính chịu mặn bằng chỉ thị SSR cho thấy mức độ đa dạng di truyền cao giữa các giống/dòng lúa; hệ số tương đồng di truyền ghi nhận được từ 0,68 đến 0,91. Tại giá trị tương đồng 0,825 đã phân 40 giống/dòng lúa thành 10 nhóm. 18
4. Trên cơ sở khoảng cách di truyền và khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa nghiên cứu, chúng tôi đề suất một số tổ hợp lai trong công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn có triển vọng cho ưu thế lai cao như sau: Hom râu 1 và Pokkali, Chành trụi và P6, Pokkali và Q5, Cườm dạng 2 và Khang dân18 Kiến nghị: Trên cơ sở các kết quả như trên chúng tôi có một số kiến nghị như sau: 1. Tiếp tục tiến hành xử lý mặn những giống/dòng lúa được xác định có khả năng chịu mặn tốt ở những vùng đất mặn để đánh giá khả năng chống chịu của các giống/dòng lúa chính xác hơn. 2. Cần có những nghiên cứu sâu hơn kiểm tra kiểu gen chống chịu mặn ở lúa. 3. Sử dụng số liệu mức độ tương đồng và khoảng cách di truyền hỗ trợ lựa chọn các giống/dòng lúa phù hợp cho công tác lai tạo giống lúa chịu mặn mới. References Tiếng Việt 1. Nguyễn Ngọc Anh (2005), “Chiến lược bảo vệ và sử dụng hợp lý dòng chảy kiệt đồng bằng sông Cửu Long”, Báo cáo hội thảo Khai thác và sử dụng hợp lý tài nguyên nước khu vực đồng bằng sông Cửu Long, Cần Thơ, ngày 21/4/2005. 2. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2001), “Định hướng chuyển dịch cơ cấu và phát triển sản xuất nông nghiệp vùng Đồng bằng sông Cửu Long thời kỳ 2001- 2005”, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn năm 2001. 3. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Duy Bảy, Phùng Bá Tạo, Đỗ Xuân Trường và Nguyễn Thị Lang (2000), “Chọn tạo giống lúa cho vùng bị nhiễm mặn ở đồng bằng sông Cửu Long”, OMon Rice 8:16-26. 4. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (1999), "Ứng dụng DNA marker trong đánh giá quỹ gen cây lúa", Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội, 9 – 10/12/1999, tr. 1216 – 1273. 19