Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

9
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án "Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens" là tuyển chọn và nâng cao được khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của vi khuẩn Bacillus sp. phân lập từ nguồn tương lên men truyền thống.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bùi Thị Thanh NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN TỪ VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ghi chú : Hà Nội - 2023
Công trình được hoàn thành tại: Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS Nguyễn Lan Hương 2. TS. Phạm Tuấn Anh Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Đại học Bách khoa Hà Nội họp tại Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi …….. giờ, ngày ….. tháng ….. năm ……… Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 1. Thư viện Tạ Quang Bửu - ĐHBK Hà Nội 2. Thư viện Quốc gia Việt Nam
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Các bệnh tim mạch (CVD) là một trong những nguyên nhân dẫn đến tử vong ở người. Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã xác định 17,9 triệu ca tử vong mỗi năm do CVD, ước tính chiếm 31% số ca tử vong trên toàn cầu. Các bệnh rối loạn tim mạch như nhồi máu cơ tim cấp tính, tắc mạch và đột quỵ chủ yếu là do sự tích tụ quá nhiều fibrin trong mạch máu tạo thành huyết khối. Các enzyme thủy phân fibrin được thu nhận từ các chủng vi sinh vật trở thành nguồn sản xuất các enzyme thủy phân fibrin dễ tiếp cận hơn, rẻ hơn và dần dần thu hút được sự chú ý trong điều trị các bệnh liên quan đến huyết khối, nó có thể làm tan được huyết khối có trong máu. Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin được phân lập chủ yếu từ các nguồn thực phẩm lên men trong đó có nguồn thực phẩm lên men từ đậu tương, các chủng vi khuẩn phân lập chủ yếu là B. subtilis, B. amyloliquefaciens và được cho là an toàn. Trước nhu cầu về sử dụng enzyme thủy phân fibrin ngày càng tăng trong các lĩnh vực y dược và thực phẩm bổ sung, việc mở rộng nghiên cứu tăng cường cải thiện hoạt độ của enzyme cũng như nâng cao sản lượng thông qua việc cải tiến chủng, tối ưu môi trường và lựa chọn kỹ thuật lên men phù hợp để tăng hiệu quả và năng suất góp phần giảm chi phí sản xuất là rất cần thiết. Ngoài việc lựa chọn phương pháp lên men phù hợp và tối ưu hóa thành phần môi trường lên men cho từng chủng cụ thể thì việc nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của các chủng khuẩn được coi là một trong những cách đem lại hiệu quả cao, nhất là ứng dụng trong sản xuất quy mô công nghiệp. Vì vậy, tác giả tiến hành “Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens” được phân lập từ sản phẩm tương của Việt Nam. 2. Mục tiêu của luận án Tuyển chọn và nâng cao được khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của vi khuẩn Bacillus sp. phân lập từ nguồn tương lên men truyền thống. 3. Nội dung của luận án - Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin cao. Định danh tên chủng bằng phương pháp giải trình tự gene. 1
- Nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng bằng phương pháp đột biến dùng tia UV kết hợp hóa chất EtBr và EMS. - Nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng bằng kỹ thuật lên men theo mẻ bổ sung cơ chất. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án - Về ý nghĩa khoa học: + Đã phân lập và tuyển chọn được chủng B. amyloliquefaciens HY6 từ tường Bần, Hưng Yên và cải biến thành chủng đột biến ES4 có khả năng sinh enzyme thủy phân fibrin. + Chứng minh được việc nâng cao khả năng sinh tổng enzyme thủy phân fibrin của chủng bằng cách tạo đột biến sử dụng kết hợp tia UV với hóa chất EtBr và EMS. + Đã nâng cao được khả năng sinh enzyme thủy phân fibrin bằng cách thiết lập được kỹ thuật lên men theo mẻ bổ sung cơ chất hai giai đoạn đối với chủng đột biến ES4. - Về ý nghĩa thực tiễn: + Bổ sung vào bộ sưu tập giống các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin cao. + Kết quả là cơ sở khoa học để nghiên cứu mở rộng quy mô sản xuất enzyme thủy phân fibrin nhằm tạo sản phẩm nhằm ứng dụng hỗ trợ phòng ngừa và điều trị bệnh liên quan đến huyết khối ở Việt Nam. 5. Những đóng góp mới của luận án - Là nghiên cứu đầu tiên có tính hệ thống về phân lập, tuyển chọn, tạo chủng vi khuẩn đột biến, xác định điều kiện lên men nhằm thu enzyme thủy phân fibrin từ chủng B. amyloliquefaciens HY6 có nguồn gốc từ tương Bần, Hừng Yên. - Đã tạo được chủng đột biến B. amyloliquefaciens ES4 sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin cao hơn so với chủng đã phân lập bằng kỹ thuật sử dụng kết hợp đột biến tia UV với hóa chất EMS và EtBr. - Đã nâng cao được khả năng sinh enzyme thủy phân bằng cách thiết lập kỹ thuật lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất hai giai đoạn trên thiết bị lên men 2 lít. 6. Bố cục của luận án Chương 1: Tổng quan tài liệu. Chương này trình bày kiến thức nền tảng về (1) Enzyme thủy phân fibrin bao gồm: tác dụng, cơ chế thủy phân fibrin của enzyme, nguồn thu và các ứng dụng của enzyme, tình 2
hình nghiên cứu trong và ngoài nước. (2) Chủng vi khuẩn Bacillus sp. sinh tổng hợp enzyme, nguồn thu nhận và các phương pháp nâng cao hoạt tính enzyme của chủng bằng đột biến, tối ưu môi trường, điều kiện nuôi cấy và kỹ thuật lên men thu nhận enzyme. (3) Sản phẩm enzyme thương mại. Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Chương này trình bày về đối tượng nghiên cứu, vật liệu, hóa chất, các phương pháp phân tích và các thí nghiệm cụ thể được thực hiện để giải quyết các nội dung đặt ra trong nghiên cứu của luận án. Chương 3: Kết quả và thảo luận. Chương này trình bày các kết quả đạt được từ các nội dung nghiên cứu qua đó biện luận, phân tích trên các cơ sở khoa học và so sánh với các nghiên cứu đã công bố (nếu có). Chương 4: Kết luận và kiến nghị. Chương này nêu các kết luận chính đạt được tương ứng với các nội dung nghiên cứu đặt ra đồng thời đề xuất kiến nghị một số nội dung tiếp tục làm để hoàn thiện và phát triển các kết quả đạt được. Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giớí thiệu về enzyme thủy phân fibrin Enzyme thủy phân fibrin hay còn gọi là enzyme tiêu sợi huyết, hầu hết các enzyme thủy phân fibrin thuộc họ protease subtilisin và được sinh tổng hợp bởi chủng vi khuẩn Bacillus sp., các chủng vi khuẩn Bacillus sp. được phân lập chủ yếu từ các nguồn thực phẩm lên men, trong đó có nguồn đậu tương lên men truyền thống (Hình 1.1). Hình 1.1. Nguồn phân lập vi khuẩn Hình 1.2. Cơ chế thủy phân fibrin sinh enzyme thủy phân fibrin của enzyme 1.1.1. Cơ chế tiêu sợi huyết của enzyme thủy phân fibrin Enzyme thủy phân fibrin hỗ trợ làm tan các sợi huyết trong cơ thể, giúp máu lưu thông tốt bằng cách phá vỡ các protein fibrin trong máu, 3
thúc đẩy và tăng cường lưu lượng máu khỏe mạnh. Bên cạnh đó, các enzyme thủy phân fibrin có khả năng cắt bỏ chất ức chế hoạt hóa plasminogen, kích hoạt pro-urokinase và chất kích hoạt plasminogen mô (t-PA), hỗ trợ hoạt động tiêu sợi huyết của plasmin (Hình 1.2), góp phần duy trì lưu lượng máu thích hợp, ngăn ngừa cục máu đông. 1.1.2. Ứng dụng của enzyme thủy phân fibrin Các enzyme thủy phân fibrin có tác dụng kích hoạt các chất hòa tan cục máu đông, được cho là an toàn và ngày càng được quan tâm, nghiên cứu ứng dụng làm thuốc tan huyết khối lâm sàng, hoặc sử dụng trong phòng ngừa các bệnh liên quan đến huyết khối và tim mạch ở dạng thực phẩm chức năng. 1.1.3. Nguồn thu nhận enzyme thủy phân fibrin Enzyme thủy phân fibrin thu nhận được từ nhiều nguồn vi khuẩn khác nhau, chủ yếu phân lập từ nguồn đậu nành lên men như: Doenjang, Cheonggukjang, Meju, Kimchi (Hàn Quốc); Tempeh (Indonesia); Chickpeas, Douchi (Trung Quốc); Bột Dosa (Ấn Độ); Natto (Nhật Bản); Kishk (Ai Cập); mắm tôm lên men (Châu Á); nem chua, nước tương lên men (Việt Nam). Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme thủy phân fibrin phân lập chiếm đa số là Bacillus sp. trong đó có B. amyloliquefaciens được xem là nguồn tiềm năng để sản xuất enzyme thủy phân fibrin ứng dụng trong cuộc sống. 1.2. Giớí thiệu về Bacillus sp. 1.2.1. Đặc điểm của Bacillus sp. Bacillus sp. là trực khuẩn hình que, hiếu khí, không gây bệnh, hình thành nội bào tử. Ở điều kiện sinh trưởng tối ưu Bacillus sp. có thời gian thế hệ khoảng 25 phút. 1.2.2. Nghiên cứu thu nhận các enzyme thủy phân từ nguồn vi khuẩn Bacillus sp. Các enzyme thủy phân fibrin được thu nhận từ nguồn vi khuẩn Bacillus sp. trong đó có B.amyloliquefaciens được nghiên cứu nhiều ở một số nước như Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn Độ. Đến nay các nhà khoa học vẫn đang nỗ lực tìm kiếm đa dạng chủng sản xuất enzyme cho hoạt độ cao từ các nguồn phân lập khác nhau, nhất là ở các nước khu vực Châu Á. Ở Việt Nam các enzyme thủy phân fibrin chưa thực sự được quan tâm, thu nhận từ các chủng vi khuẩn bản địa có trong các nguồn thực phẩm lên men truyền thống để hướng tới ứng dụng 4
1.3. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin bằng đột biến Để nâng cao khả năng thu nhận enzyme của chủng, mang lại hiệu quả kinh tế, có thể cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme của chủng bằng cách sử dụng tác nhân đột biến theo các phương pháp sinh học, lý học, hóa học hoặc áp dụng các kỹ thuật hoặc quy trình đặc biệt để phát hiện các đột biến hữu ích tạo chủng có khả năng siêu tổng hợp enzyme. 1.3.1. Phương pháp đột biến UV 1.3.1.1. Cơ chế gây đột biến UV Chiếu tia UV có thể dẫn đến sự hình thành các liên kết cộng hóa trị giữa các pyrimidine dimer, các liên kết này làm biến dạng cấu trúc DNA, ức chế quá trình sao chép và phiên mã DNA, gây đột biến. 1.3.1.2. Nghiên cứu đột biến UV nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của các chủng vi khuẩn Đã có nhiều nghiên cứu công bố đem lại hiệu quả đáng kể trong cải thiện nâng cao hoạt tính enzyme của các chủng dại bằng đột biến UV. Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme của các chủng vi khuẩn bằng phương pháp đột biến UV cho hoạt độ enzyme tăng từ 1,01 đến 2 lần so với chủng ban đầu. 1.3.2. Phương pháp đột biến hóa chất 1.3.2.1. Cơ chế gây đột biến hóa chất EMS và EtBr Tác nhân gây đột biến hóa học tạo thành các chất cộng với nucleotide và bắt cặp sai với các bazơ bổ sung trong khuôn mẫu, dẫn đến sự thay đổi của các bazơ trong quá trình sao chép gây nên đột biến. 1.3.2.2. Nghiên cứu đột biến hóa chất EMS và EtBr nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của các chủng vi khuẩn Phương pháp đột biến hóa chất như EMS, EtBr,.. là phương pháp đột biến có độ ổn định cao hơn so với đột biến UV, nhiều nghiên cứu đã công bố và đem lại hiệu quả đáng kể trong việc cải thiện nâng cao hoạt tính enzyme của các chủng dại, tăng từ 1,12 đến 2 lần. Ở Việt Nam, vẫn đề tìm kiếm thu nhận và cải thiện các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin bằng các phương pháp đơn giản như đột biến UV hoặc hóa chất vẫn chưa được quan tâm khai thác sử dụng để thu nhận nguồn enzyme tiềm năng này. 1.4. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin bằng tối ưu môi trường lên men 5
1.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin Trong lên men, nguồn dinh dưỡng C (glucose, sacarose, maltose, glycerol,..), N (cao nấm men, cao thịt, bột đậu, peptone, tryptone,…), các ion kim loại (Ca 2+, Mg2+, Fe2+, K+, Cu2+,…) và điều kiện lên men (nhiệt độ, pH môi trưởng) đã được nghiên cứu khảo sát lựa chọn cho chủng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin, các chủng khác nhau có điều kiện và sử dụng nguồn dinh dưỡng để sinh tổng hợp enzyme cho hiệu quả tốt hơn là khác nhau. 1.4.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin bằng tối ưu môi trường lên men Trong lên men thu nhận enzyme thủy phân fibrin, việc tối ưu các điều kiện và thành phần môi trường lên men để tăng khả năng sinh tổng enzyme thủy phân fibrin của các chủng vi khuẩn cũng đã được quan tâm nghiên cứu bởi nhiều tác giả cho kết quả tối ưu hoạt độ enzyme thủy phân fibrin đối với các chủng là khác nhau, nó có thể tăng từ 1,5 đến 6,3 lần so với hoạt độ enzyme ban đầu. 1.5. Kỹ thuật lên men sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin 1.5.1. Lên men theo mẻ Là phương pháp lên men mà trong suốt thời gian lên men không thêm dinh dưỡng và cũng không loại bỏ các sản phẩm cuối, hiệu quả thu nhận enzyme không cao. 1.5.2. Lên men theo mẻ bổ sung cơ chất Là hình thức trung gian giữa lên men theo mẻ và lên men liên tục, nâng cao được hiệu quả thu nhận enzyme, giảm được chi phí trong quá trình sản xuất. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng có thể tăng hoạt độ enzyme thủy phân fibrin từ 1,24 đến 7 lần khi chủng được lên men theo mẻ bổ sung cơ chất. 1.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng trong lên men Trong lên men, sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như: chủng giống, thành phần môi trường dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy (pH, nhiệt độ, cấp khí), thời gian nuôi cấy,... 1.6. Sản phẩm enzyme thủy phân fibrin thương mại Các chế phẩm enzyme thủy phân fibrin được ứng dụng phổ biến ở dạng thực phẩm chức năng đóng viên chủ yếu là của Nhật Bản, Mỹ, Canada, Việt Nam,… Các sản phẩm lưu hành trên thị trường có giá 6
thành dao động khác nhau, nó phụ thuộc vào nguồn gốc sản phẩm và hoạt độ enzyme có trong sản phẩm cao hay thấp. Ở Việt Nam các nghiên cứu thu nhận enzyme thủy phân fibrin trong nước chưa đáp ứng được nhu cầu thị trường, phần lớn phải nhập nguyên liệu enzyme thương mại từ các nước khác. Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Các chủng vi khuẩn Bacillus sp. phân lập từ sản phẩm tương ở: Hải Phòng, Hải Dương, Hưng Yên, Yên Bái, Phú Thọ, Bắc Ninh, Nghệ An và Hà Nội. 2.1.2. Hóa chất Các hóa chất dùng trong nghiên cứu có nguồn gốc từ các hãng như Himedia (Ấn Độ), Sigma (Mỹ), Merck (Đức),... 2.1.3. Thành phần môi trường Gồm môi trường LB; môi trường GY; môi trường GYP và môi trường tạo bào tử DSM. 2.1.4. Thiết bị Các trang thiết bị sử dụng ở các phòng thí nghiệm có xuất xứ từ nhiều nước như Nhật Bản, Đức, Trung Quốc và Việt Nam,… 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ thí nghiệm Mẫu tương Phân lập Bacillus sp. UV (5 lần) EtBr EMS EMS EtBr + EMS EtBr Dòng tế bào đột biến có hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao Kiểm tra độ ổn định hoạt độ enzyme của chủng Tối ưu môi trường và điều kiện lên men sinh tổng hợp enzyme 7 Lựa chọn kỹ thuật lên men thu nhận hoạt độ enzyme cao
2.2.2. Phương pháp phân tích 2.2.2.1. Xác định hoạt độ enzyme 2.2.2.2. Xác định đường khử bằng phương pháp DNS 2.2.2.3. Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Bradford 2.2.2.4. Đo độ nhớt dịch lên men 2.2.2.5. Nhuộm gram 2.2.2.6. Xác định hàm lượng sinh khối khô 2.2.2.7. Nhuộm bào tử 2.2.2.8. Định tính enzyme amylase 2.2.2.9. Định tính enzyme cellulose 2.2.2.10. Đặc điểm sinh hóa của chủng gốc và chủng đột biến 2.2.2.11. Tách DNA tổng số và giải trình tự bộ gene của vi khuẩn 2.2.2.12. Xử lý số liệu: Các số liệu công bố là giá trị trung bình với độ sai số được xử lý trên phần mềm Excel với sai số cho phép ≤ 5% và sử dụng phần mềm Design Expert. 2.2.3. Phương pháp thí nghiệm 2.2.3.1. Phân lập và sàng lọc chủng a. Phương pháp phân lập: 10g + 90ml nước muối 0,9% ở nhiệt 80oC/20 phút. Pha mẫu đến 10-5-10-6, trải trên đĩa môi trường LB agar, 37oC /24 h. b. Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme protease: khuẩn lạc cấy ria trên LB agar + 1% sữa gầy, ở 370C/24 h. Các chủng sau sàng lọc lên men trên môi trường GY ở 370C, lắc 150 vòng/phút, 24 h và đo hoạt độ enzyme. 2.2.3.2. Hoạt hóa chủng Chủng được nuôi trên môi trường LB ở 37oC trong 12-14 h trước khi sử dụng. 2.2.3.3. Thu nhận enzyme thủy phân fibrin ngoại bào Chủng hoạt hóa cấp vào 50 ml môi trường GY hoặc GYP (OD 0,2)/bình tam giác 250ml. Nuôi 37oC, lắc 150 vòng/phút/ 24 h, ly tâm tách sinh khối ở 10.000 vòng/phút, nhiệt độ 4oC/10 phút thu dịch đo hoạt độ enzyme. 2.2.3. 4. Đột biến chủng vi khuẩn a. Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào cho đột biến 8
Chủng nuôi trên môi trường LB ở 37oC/ 12 h. Sau đó, hút 10 ml dịch ly tâm 10.000 vòng/10 phút ở 4oC, tế bào rửa sạch, sinh khối tế bào được tạo huyền phù lại ở mật độ tế bào xấp xỉ 1×107 CFU/ml và sử dụng để đột biến. b. Đột biến bằng chiếu tia UV Dịch huyền phù tế bào được chuyển vào các đĩa peptri vô trùng trong tủ cấy và được đột biến bằng đèn UV (15 W, 254 nm), khoảng cách 20 cm (Hình 2.1), ở thời gian là 30, 60, 90, 120, 150 và 180 phút. Sàng lọc và xác định hoạt tính enzyme thủy phân fibrin của các chủng, lựa chọn chủng có hoạt tính enzyme cao cho đột biến tiếp lần 2, quá trình đột biến tương tự lần 1 và quá trình đột biến được dừng lại sau 3 lần đột biến liên tiếp hoạt độ enzyme thủy phân thu nhận được của chủng không tăng. Hình 2.1. Sơ đồ đột biến chủng bằng Hình 2.2. Sơ đồ đột biến chủng tia UV bằng hóa chất c. Đột biến chủng bằng hóa chất Dịch huyền phù tế bào được chuyển vào các ống fancol 15ml vô trùng, hóa chất EtBr hoặc EMS được thêm vào lần lượt hoặc đồng thời ở nồng độ là 50, 100, 150, 200 và 250 μg/ml ở thời gian là 30, 60, 90, 120 và 150 phút (Hình 2.2). Sàng lọc và lựa chọn các chủng cho hoạt tính enzyme thủy phân fibrin cao. 2.2.3.5. Kiểm tra độ ổn định của các chủng đột biến Chủng đột biến thu nhận được sẽ được đánh giá độ ổn định qua 10 lần cấy chuyển qua hoạt độ enzyme thủy phân fibrin. 2.2.3.6. Khảo sát khả năng tạo bào tử của chủng đột biến Chủng nuôi trên môi trường DSM trong 7 ngày được nhuộm bào tử, song song đó dịch được đun ở 80oC/20 phút, sau đó trải trên đĩa thạch LB + 1% sữa gầy, nuôi 37oC/24 h và đếm khuẩn lạc. 9
2.2.3.7. Tối ưu hóa điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng Bacillus sp. a. Nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho khả năng sinh enzyme Chủng vi khuẩn được khảo sát nguồn dinh dưỡng C (glucose, sucrose, maltose, glycerol), nguồn N (peptone, cao nấm men, bột đậu tương, cao thịt, tryptone) và ion kim loại (Ca2+, Mg2+, Mn2+, K+, Zn2+, Cu2+và Fe2+) thay đổi dựa trên thành phần môi trường GYP ban đầu, qua đó lựa chọn nguồn dinh dưỡng thích hợp cho chủng sinh tổng hợp enzyme fibrin. b. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện lên men thích hợp Chủng vi khuẩn được khảo sát lên men ở các điều kiện nhiệt độ và pH môi trường lên men với các nguồn dinh dưỡng thích hợp đã được lựa chọn ở trên, qua đó xác định được nhiệt độ, pH môi trường thích hợp cho chủng sinh tổng hợp enzyme fibrin. c. Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men Trên cơ sở nguồn dinh dưỡng và điều kiện khảo sát ở trên, sử dụng phầm mềm Design Expert để thiết kế thí nghiệm. Tổng cộng có 34 thí nghiệm với 3 lần lặp lại tại các điểm trung tâm được thực hiện theo thứ tự ngẫu nhiên. Hàm mục tiêu là hàm hoạt độ enzyme và hàm OD 600nm của chủng, sự ảnh hưởng của các yếu tố cũng như sự tương tác giữa các yếu tố đến hàm mục tiêu được xây dựng bởi hàm hồi qui bậc 2. 2.2.3.8. Nghiên cứu lựa chọn kỹ thuật lên men Lên men thực hiện trên thiết bị 2 lít (Sartorius A Plus), tốc độ sục khí duy trì 2 vvm, nhiệt độ và pH được kiểm soát bằng cách bơm tự động HCl 2N hoặc NaOH 2N; sự tạo bọt được kiểm soát bằng cách bơm tự động chất chống tạo bọt gốc silicon (antifoam). Chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường LB/14h, sau đó cấp vào dịch lên men ở OD ban đầu là 0,2. Mức oxy hòa tan (DO) được kiểm soát tự động ở mức ≥20% bằng cách thay đổi tốc độ khuấy (200-1.200 rpm). Việc bổ sung cơ chất được xác định dựa vào động học của quá trình lên men theo mẻ trước đó và được tính theo phương trình: F=[μ*Xₒ*Vₒ*exp(μ*t)]/Yx/s*(Sf-S0) (l/h) Trong đó: μ là tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật/h; X0 là giá trị OD tại thời điểm bắt đầu bổ sung; V0 là thể tích dịch lên men khi bắt đầu bổ sung cơ chất (lít); 10
t là khoảng thời gian bổ sung cơ chất (h); Sf là nồng độ cơ chất bổ sung (g/l); S0 là nồng độ cơ chất trong dịch lên men tại thời điểm bắt đầu bổ sung cơ chất (g/l); YX/S: hiệu suất sử dụng cơ chất của tế bào (g/g). a. Lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 1 giai đoạn Cơ chất sẽ được bổ sung trong quá trình lên men là thành phần dung dịch hỗn hợp có chứa glucose, YE và peptone với tỉ lệ tuân theo điều kiện tối ưu cho hàm đáp ứng là enzyme. Dựa vào các thông số động học lên men thẻo mẻ như tốc độ tăng trưởng của chủng/h và hiệu suất sử dụng cơ chất của tế bào, sau các khoảng thời gian nhất định 0,25 giờ, cơ chất được cài đặt bổ sung tự động. Chủng được lên men trên môi trường tối ưu cho enzyme, ở nhiệt độ, pH môi trường được khảo sát ở mục 2.2.3.7.b. Quá trình bổ sung cơ chất được thực hiện trước khi chủng phát triển chuyển sang pha cân bằng. b. Lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 2 giai đoạn Cơ chất bổ sung có thành phần tỉ lệ các chất thay đổi, tỉ lệ thành phần cơ chất bổ sung ở 2 giai đoạn khác nhau, giai đoạn đầu cơ chất bổ sung là thành phần tối ưu cho mật độ tế bào nhằm tăng sinh khối tế bào, giai đoạn 2 là giai đoạn bổ sung cơ chất là thành phần môi trường tối ưu cho enzyme. Các thông số lên men bổ sung cơ chất 2 giai đoạn như điều kiện lên men, thời gian bổ sung cơ chất và tốc độ cấp cơ chất bổ sung được duy trì như lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 1 giai đoạn. Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin cao 3.1.1. Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease Tổng số 28 mẫu tương phân lập được 68 khuẩn lạc, các khuẩn lạc được làm thuần trên môi trường LB agar + 1% sữa gầy để sàng lọc sơ bộ cho 48 chủng có khả năng sinh enzyme protease, có 23 chủng vi khuẩn có hoạt tính protease cao, các chủng có đặc điểm hình thái khuẩn lạc cơ bản là khác nhau, đa dạng về màu sắc, hình dạng. Trong đó, chủng HY6 cho đường kính vòng thủy phân sữa gầy to nhất là 12 ± 0 mm (Hình 3.1). 11
Hình 3.1. Kết quả đo đường kính vòng thủy phân sữa gầy của 48 chủng phân lập 3.1.2. Khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của các chủng 23 chủng có hoạt tính protease cao cho lên men trên môi trường GY/24 giờ, lắc 150 rpm/37oC, đo hoạt độ enzyme thủy phân fibrin. Kết quả 23 chủng đều có sinh tổng hợp enzyme phân hủy fibrin có hoạt độ từ 11,4 ± 2,2 FU/ml đến 49,2 ± 1,2 FU/ml. Chủng HY6 phân lập từ tương Bần, Hưng Yên cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao nhất đạt 49,2 ± 1,2 FU/ml và được chọn để tiếp tục nghiên cứu. Chủng HY6 được nhuộm Gram cho thấy tế bào của chủng HY6 bắt màu tím là vi khuẩn Gram dương, tế bào vi khuẩn hình que, có 2 đầu tròn, tồn tại đơn lẻ hoặc thành đám hình chuỗi ngắn (Hình 3.2). Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc và tế bào nhuộm Gram của chủng HY6 soi kính hiển vi trên vật kính dầu 100x 3.2. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng lựa chọn bằng phương pháp đột biến 3.2.1. Đột biến bằng tia UV Chủng HY6 được chiếu tia UV đột biến sau 5 lần liên tiếp thu nhận được chủng U5_90.5 cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao nhất đạt đạt 114 ± 8 FU/ml (Hình 3.3), tăng 2,3 lần so với chủng HY6. 3.2.2. Đột biến bằng hóa chất EtBr Chủng HY6 được đột biến bằng hóa chất EtBr thu nhận được chủng H12 cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao nhất đạt 180 ± 8 12
FU/ml (Hình 3.4), tăng 2,2 lần so với chủng HY6. Kết quả này so với phương pháp chiếu tia UV cho hoạt độ enzyme tăng xấp xỉ nhau. Hình 3.3. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng đột biến bằng tia UV Hình 3.4. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng đột biến bằng EtBr 3.2.3. Đột biến bằng UV kết hợp hóa chất 3.2.3.1. Đột biến chủng U5_90.5 bằng EtBr Chủng U5_90.5 trên môi trường GYP có hoạt lực enzyme cao nhất đạt 177,8 ± 9,8 FU/ml cho đột biến với hóa chất EtBr thu được 02 chủng cho hoạt độ enzyme cao E1 (452 ± 4 FU/ml) và E5 (440 ± 8 FU/ml) Hình 3.5. Kết quả, chủng đột biến cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin tăng 5,5 lần so với chủng gốc và tăng 2,5 lần so với chủng đột biến bằng UV và hóa chất trực tiếp. 3.2.3.2. Đột biến chủng U5_90.5 bằng EMS Chủng U5_90.5 cho đột biến với hóa chất EMS thu nhận được chủng S33 cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao nhất đạt 456 ± 8 FU/ml (Hình 3.6), hoạt độ enzyme thủy phân fibrin tăng so với chủng HY6 ban đầu là 5,6 lần. 3.2.3.3. Đột biến chủng E1 (đã đột biến UV và EtBr) bằng EMS Chủng E1 cho đột biến hóa chất EMS thu nhận được chủng E1.10 cho hoạt độ enzyme cao nhất đạt 320 ± 16 FU/ml (Hình 3.7), thấp hơn chủng 13
E1. Điều này cho thấy, quá trình sàng lọc và thu nhận các chủng đột biến không có lợi trong cải thiện hoạt độ enzyme thủy phân fibrin. Hình 3.5. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng đột biến bằng EtBr từ chủng U5_90.5 Hình 3.6. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng được đột biến bằng EMS từ chủng U5_90.5 Hình 3.7. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng được đột biến bằng EMS từ chủng E1 3.2.3.4. Đột biến chủng U5_90.5 bằng EtBr kết hợp với EMS 14
Chủng U5_90.5 cho đột biến kết hợp cùng lúc 2 hóa chất EtBr và EMS (tỉ lệ 1:1) thu được chủng ES4 cho hoạt độ enzyme cao nhất đạt 416 ± 8 FU/ml (Hình 3.8), tăng 5 lần so với chủng HY6. Hình 3.8. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng được đột biến bằng EtBr kết hợp EMS 3.2.4. Độ ổn định của các chủng đột biến Các chủng đột biến và chủng HY6 đã được kiểm tra tính ổn định sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin qua 10 lần cấy chuyển. Kết quả chủng ES4 cho độ ổn định nhất trong 5 chủng đột biến, hoạt độ enzym thủy phân fibrin 404 ± 4 FU/ml (Hình 3.9), tăng 5 lần so với chủng HY6. Hình 3.9. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng qua 10 lần cấy chuyển 3.2.5. Bước đầu tìm hiểu về hệ gen liên quan đến enzyme thủy phân fibrin của chủng HY6 ban đầu và chủng đột biến ES4 So sánh, phân tích genome của chủng HY6 và ES4 được thực hiện trên hệ thống RAST (trang https://rast.nmpdr.org/rast.cgi). Kết quả thu nhận được một số đặc điểm cơ bản về hệ gen của 2 chủng được thể hiện ở Bảng 3.1. Kích thước bộ gen của chủng ES4 tăng so với chủng HY6 là 1408 bp (Bảng 3.1). Tỷ lệ % GC của 2 chủng không đổi chiếm 45,78%. Dự đoán 15
chức năng của gen trên nền tảng RAST cho thấy mỗi chủng có 54 gen mã hóa rRNA. Bảng 3.1. Đặc điểm tổ hợp bộ gen của chủng HY6 và ES4 Chủng HY6 Chủng ES4 Số lượng contig 24 28 Kích thước hệ gen (bp) 3912654 3914062 Số lượng contig (với PEGs) 24 28 Tỷ lệ GC (%) 45,78 45,78 Số lượng các trình tự mã hóa protein 4351 4101 Số lượng hệ thống phân loại 329 329 Số lượng gen mã hóa RNAs 54 54 rRNAs 2 2 tRNAs 52 52 TmRNAs 1 1 Hình 3.10. Kết quả chạy RAST chủng HY6 Phân tích trình tự hệ gen (whole genome sequencing): Gen được chú giải trên hệ thống máy chủ RAST, số gen được dự đoán chức năng trong hệ thống (subsystem) của mỗi chủng đạt 28% (Hình 3.10 và Hình 3.11), với các gen trong subsystem nhỏ đều giống nhau. Chủng HY6 và ES4 được giải toàn bộ trình tự gen, kết quả 2 chủng được xác định là Bacillus amyloliquefaciens đã có trong ngân hàng gen của GenBank. Chủng HY6 và ES4 được xây dựng cây phân loài trên TYPE (STRAIN) GENOME SERVER (https://tygs.dsmz.de/user_requests/new) cho thấy, chủng HY6 và ES4 gần giống nhất với chủng Bacillus amyloliquefaciens DSM7. Các trình tự gen được cho là khác nhau sẽ được BLAST trên trang http://ncbi.nlm.nih.gov. qua đó thu nhận được số liệu các gen thay đổi và được tổng hợp ở Bảng 3.2. 16
Hình 3.11 Kết quả chạy RAST chủng ES4 Bảng 3.2. Các gen thay đổi giữa chủng HY6 gốc và chủng ES4 đột biến Sự thay đổi TT HY6 ES4 protein >CALMKEOM_00581 >LCCANNEE_00351 1 S->A Sporulation kinase A Sporulation kinase A >LCCANNEE_03339 >CALMKEOM_01099 Không thay đổi 2 Sporulation protein YunB Sporulation protein YunB >LCCANNEE_04149 I->V,S->N,Q- Sporulation protein YunB >K,S->N >CALMKEOM_02669 >LCCANNEE_02502 3 Không thay đổi Protein SprT-like protein Protein SprT-like protein >CALMKEOM_02828 >LCCANNEE_02661 4 Ferredoxin--NADP Ferredoxin--NADP G->S reductase 1 reductase 1 >CALMKEOM_02905 5 >LCCANNEE_02738 Không thay đổi Glutaminase 1 Glutaminase 1 >CALMKEOM_03627 6 Không thay đổi Protein UmuC >CALMKEOM_03629 >LCCANNEE_03733 7 Không thay đổi DNA polymerase IV DNA polymerase IV Đột biến 3 >CALMKEOM_04093 >LCCANNEE_02788 nucleotid: A  8 tRNA-Tyr(gta) tRNA-Tyr(gta) G, T  G, C T Từ Bảng 3.2 cho thấy, ở mục số 8 là gen mã hóa tRNA(tyr) (là RNA vận chuyển đặc hiệu cho tyrosine), trên gen có xuất hiện đột biến 3 điểm A -> T, T -> G, C -> T, 3 điểm đột biến này là rất nhỏ so với kích thước của hệ gen, do đó, khi tính toán tỉ lệ GC theo % thì tỉ lệ này gần như không thay đổi. Kết quả này cũng được thể hiện ở Bảng 17
3.1 (khi phân tích so sánh genome của 2 chủng HY6 và ES4 trên hệ thống RAST), tỉ lệ % GC giữa 2 chủng là không thay đổi (45,78 %). Ở mục số 1 và 2 là 2 gen có liên quan đến bào tử, gen spoA thay đổi có khả năng liên quan đến sự hình thành bào tử của chủng, ở mục số 4 là gen mã hóa cho enzyme trong chuỗi vận chuyển điện tử. Trên cơ sở phân tích sự thay đổi các gen, 2 chủng được nuôi trên môi trường DSM/7 ngày nuôi, kết quả chủng ES4 không tạo bào tử. Trên môi trường GYP/24 h, chủng ES4 (3 mPas) có độ nhớt giảm so với chủng HY6 (4 mPas), sinh khối tạo thành chủng ES4 so với HY6 không tăng, hàm lượng protein hòa tan của chủng ES4 tăng 1,2 lần so với HY6. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng ES4 tăng khoảng 5 lần so với HY6, 2 chủng đều có hoạt tính enzyme amylase và enzyme cellulose. Kiểm tra phản ứng sinh hoá 2 chủng HY6 và ES4 trên bộ kit Api-20E và 50CH cho thấy 2 chủng có các phản ứng sinh hóa cơ bản là giống nhau, chỉ khác nhau 01 phản ứng sinh hóa số 24 (Arbutin), chủng ES4 có khả năng sinh arbutin còn HY6 thì không. 3.3. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng ES4 bằng kỹ thuật lên men 3.3.1. Nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho khả năng sinh enzyme của chủng 3.3.1.1. Nguồn carbon Kết quả khảo sát nguồn dinh dưỡng C cho thấy, đối với chủng ES4 nguồn dinh dưỡng C là glucose cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng là cao nhất đạt 375 ± 5 FU/ml (Hình 3.12) và được chọn là nguồn C cho chủng phát triển sinh enzyme thủy phân fibrin. Hình 3.12. Ảnh hưởng của nguồn C Hình 3.13. Ảnh hưởng của nguồn N 3.3.1.2. Nguồn nitrogen Kết quả khảo sát cho thấy sự kết hợp 2 nguồn peptone và cao nấm men cho hoạt độ enzyme cao nhất đạt 385 ± 5 FU/ml (Hình 18