Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Dược học: Tiêu chuẩn hóa cao chiết từ cây Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm.F.) Nees)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

3
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Dược học "Tiêu chuẩn hóa cao chiết từ cây Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm.F.) Nees)" được nghiên cứu với mục tiêu: Chiết xuất, phân lập, tinh chế, xác định độ tinh khiết và cấu trúc một số hợp chất diterpen lacton từ lá Xuyên tâm liên; Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất diterpen lacton trong lá Xuyên tâm liên bằng HPLC và CE; Thử tác dụng in vitro của cao Xuyên tâm liên.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Dược học: Tiêu chuẩn hóa cao chiết từ cây Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm.F.) Nees)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --------------------------- LỮ THỊ KIM CHI TIÊU CHUẨN HÓA CAO CHIẾT TỪ CÂY XUYÊN TÂM LIÊN (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees) Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất Mã số: 62720410 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP. Hồ Chí Minh, năm 2023
Công trình được hoàn thành tại: Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. VĨNH ĐỊNH PGS. TS. PHAN THANH DŨNG Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp trường tại Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh. vào hồi giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam. - Thư viện Khoa học Tổng hợp TP. HCM. - Thư viện Đại học Y Dược TP. HCM.
1 1. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN a. Lý do và tính cần thiết của nghiên cứu Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees.) là dược liệu phổ biến tại Việt Nam, Trung Quốc, Ấn Độ,... cây được sử dụng nhiều trong y học dân gian với tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm nổi bật. Các nghiên cứu gần đây trên thế giới theo hướng tiếp cận của y học hiện đại còn cho thấy cao chiết từ Xuyên tâm liên có tác dụng bảo vệ gan, kháng ung thư, kháng sốt rét, kháng HIV,... và đặc biệt là kháng virus Sars-Covi 2. Với các giá trị nêu trên, nước ta đã có đề án phát triển các vùng trồng dược liệu này tại nhiều địa phương như Đồng Tháp, Đồng Nai, miền Trung,... Song song đó, các chế phẩm chứa Xuyên tâm liên đã được nghiên cứu và xuất hiện ngày càng nhiều trên thị trường, đặt ra vấn đề về kiểm soát chất lượng, tiêu chuẩn hóa dược liệu và cao chiết trong công tác kiểm nghiệm. Chuyên luận Xuyên tâm liên đã có mặt trong Dược điển Mỹ, Dược điển Anh, Dược điển Trung Quốc,... Dược điển Việt Nam V bản bổ sung cũng đã có chuyên luận này. Tuy nhiên, các chất đối chiếu cần thiết từ Xuyên tâm liên hiện không có sẵn hoặc giá thành cao. Đồng thời, chưa có nghiên cứu chặt chẽ về tác dụng sinh học của cao Xuyên tâm liên nhằm chứng minh hỗ trợ điều trị. Do đó, mục đích chính của nghiên cứu là nhằm phân lập các hợp chất diterpen lacton chính từ lá Xuyên tâm liên, khảo sát tác dụng sinh học in silico, in vitro các chất và các phân đoạn cao để từ đó thiết lập chất đối chiếu phù hợp phục vụ trong công tác kiểm nghiệm. Bên cạnh đó, đề tài cũng xây dựng quy trình định lượng đồng thời các diterpen lacton chính bằng hai phương pháp: sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản. Cuối cùng đưa ra dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho cao Xuyên tâm liên để giải quyết yêu cầu đặt ra về tiêu chuẩn hóa chất lượng cho nguyên liệu cao trên thị trường.
2 b. Mục tiêu nghiên cứu 1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế, xác định độ tinh khiết và cấu trúc một số hợp chất diterpen lacton từ lá Xuyên tâm liên. 2. Thử tác dụng in silico và in vitro trên nhóm một số hợp chất diterpen lacton trong lá Xuyên tâm liên. 3. Thiết lập chất đối chiếu andrographolid và 14-deoxy-11,12- didehydroandrographolid theo WHO và ASEAN. 4. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất diterpen lacton trong lá Xuyên tâm liên bằng HPLC và CE. 5. Thử tác dụng in vitro của cao Xuyên tâm liên. Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng đồng thời một số hợp chất diterpen lacton trong cao Xuyên tâm liên bằng phương pháp HPLC. Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cao Xuyên tâm liên. c. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ❖ Đối tượng nghiên cứu Dược liệu khô Xuyên tâm liên (toàn cây trên mặt đất), được thu hái tại 3 vùng trồng khác nhau là Đồng Tháp, Đồng Nai, Phú Yên. Dược liệu đã được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử và được kiểm tra chất lượng tại Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. HCM. ❖ Phương pháp nghiên cứu - Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp chiết nóng, phân lập các diterpen lacton bằng phương pháp kết tinh trong dung môi, sắc ký cột silica gel và sắc ký điều chế, xác định cấu trúc bằng biện giải phổ UV, IR, MS và NMR so sánh với các tài liệu đã công bố. - Sáu chất đã phân lập gồm: andrographolid (AP), 14-deoxy-11,12- didehydroandrographolid (DP), neoandrographolid (NAG), andro grapanin (AP1), 14-deoxyandrographisid (AP3), 14-deoxy-11,12- didehydroandrographisid (AP4). Trong đó, 4 chất chính là AP, DP,
3 NAG, AP1 được thử tác dụng hạ đường huyết, kháng ung thư, kháng HIV in silico bằng phương pháp docking. Tiếp theo, thử tác dụng in vitro chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH, kháng ung thư bằng phương pháp gây độc tế bào trên 3 dòng: ung thư vú, ung thư cơ vân, ung thư gan của 4 chất và các phân đoạn cao tương ứng. - Thiết lập hồ sơ 2 chất đối chiếu: AP và DP theo quy trình của WHO và ASEAN. - Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời 4 chất: AP, DP, NAG, AP1 bằng phương pháp HPLC và 3 chất: AP, DP, NAG bằng phương pháp CE theo ICH 2005. Các quy trình được ứng dụng để định lượng dược liệu tại 3 vùng trồng nói trên. - Khảo sát một số điều kiện điều chế cao Xuyên tâm liên. Thử tác dụng in vitro kháng ung thư của cao điều chế với chứng dương Doxorubicin. Xây dựng quy trình định lượng đồng thời 4 chất AP, DP, NAG, AP1 trong cao bằng phương pháp HPLC. Từ đó, đề xuất tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm cao Xuyên tâm liên. d. Những đóng góp mới của nghiên cứu về mặt lý luận và thực tiễn - Lần đầu cung cấp quy trình phân lập đồng thời 6 diterpen lacton (AP, DP, NAG, AP1, AP3, AP4) đạt độ tinh khiết cao và đầy đủ dữ liệu phổ nghiệm. - Lần đầu thử nghiệm và công bố tác dụng in silico của 4 chất AP, DP, NAG, AP1 trong hạ đường huyết, kháng ung thư, kháng HIV. Dựa trên kết quả đó, thử nghiệm tiếp hoạt tính in vitro cho tác dụng kháng ung thư. - Lần đầu xây dựng hồ sơ hoàn chỉnh cho 2 chất đối chiếu AP và DP phân lập từ Xuyên tâm liên theo tiêu chuẩn WHO và ASEAN. - Lần đầu xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời 4 chất: AP, DP, NAG, AP1 trong dược liệu và cao chiết Xuyên tâm
4 liên bằng hai phương pháp HPLC và CE chưa được công bố bởi tài liệu nào. - Lần đầu đưa ra dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho cao Xuyên tâm liên. e. Bố cục của luận án Luận án gồm 150 trang: Đặt vấn đề 2 trang, Tổng quan tài liệu 29 trang, Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 34 trang, Kết quả nghiên cứu 64 trang, bàn luận 13 trang, Kết luận 2 trang và Kiến nghị 1 trang. Luận án có 92 bảng, 31 hình và sơ đồ, 104 tài liệu tham khảo gồm 12 tài liệu tiếng việt, 87 tài liệu tiếng Anh và 5 trang web; 24 phần phụ lục gồm 159 trang thể hiện các kết quả thực nghiệm. 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan thực vật học cây Xuyên tâm liên Chi Andrographis thuộc họ Ô rô (Acanthaceae), phân bố nhiều ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, hiện nay đã được xác định 32 loài. Loài Xuyên tâm liên có tên khoa học là Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees., ngoài ra cây còn có một số tên gọi khác như: Công cộng, Nguyễn cộng, Khổ đảm thảo, Lãm hạch liên, Hùng bút. Cây phát triển được ở mọi loại đất, ưa khí hậu nóng ẩm, sinh trưởng mạnh vào mùa xuân và hạ. Lá được thu hái lúc cây bắt đầu ra nụ, toàn cây được thu hái lúc cây bắt đầu nở hoa. Dược điển Việt Nam V quy định bộ phận dùng của Xuyên tâm liên là toàn cây trên mặt đất phơi hay sấy khô. Thành phần chính quan trọng nhất là nhóm diterpen lacton khung ent-labdan, chiếm hàm lượng cao nhất trong cây, phân bố chủ yếu ở thân và lá. Một số thành phần chiếm hàm lượng nhỏ khác là: flavonoid, xanthon, acid quinic, polyphenol,... tập trung chủ yếu ở rễ. Các diterpen lacton quan trọng gồm: andrographolid (AP), 14-deoxy-11,12- didehydroandrographolid (DP), neoandrographolid (NAG), andro grapanin (AP1),... trong đó 2 marker quan trọng nhất là AP và DP, đã
5 được quy định ở mục định tính và định lượng trong một số Dược điển. Công năng chính của cây là thanh nhiệt giải độc, thanh nhiệt táo thấp, thanh tràng chỉ lỵ, thanh phế chỉ khái. Các nghiên cứu hiện đại chỉ ra nhiều tác dụng nổi bật khác: kháng sốt rét, kháng ung thư, kháng HIV, hạ đường huyết, chống oxy hóa, kháng Sars-Cov-2,... 2.2. Các phương pháp nghiên cứu về chiết xuất, phân lập, tinh chế hợp chất diterpen lacton trong cây Xuyên tâm liên Các nghiên cứu trong nước và quốc tế phân lập các hợp chất diterpen lacton từ cây Xuyên tâm liên chủ yếu bằng phương pháp sắc ký cột. Dung môi thường sử dụng để chiết cao toàn phần phần là methanol hoặc ethanol, trong đó methanol được sử dụng phổ biến trong đa số các nghiên cứu. Cột sắc ký thường là silica gel pha thuận, rửa giải với các dung môi tăng dần độ phân cực, từ đó thu được các phân đoạn và tinh chế thành các hợp chất tinh khiết. 2.3. Các phương pháp nghiên cứu về định lượng các hợp chất diterpen lacton trong cây Xuyên tâm liên Dược điển Việt Nam V định lượng diterpen lacton toàn phần trong dược liệu Xuyên tâm liên bằng phương pháp quang phổ UV-Vis, tạo màu tím đặc trưng bằng phản ứng của vòng lacton với thuốc thử Kedde, đo ở bước sóng 544 nm. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi xử lý mẫu khá phức tạp. Các nghiên cứu trong nước và trên thế giới tập trung chủ yếu ở phương pháp HPLC-PDA, chủ yếu áp dụng sắc ký pha đảo, định lượng đồng thời 2-4 diterpen lacton. Một số nghiên cứu ngoài nước áp dụng thêm phương pháp điện di mao quản bằng kỹ thuật mixen điện động, hoặc cá biệt có kỹ thuật phổ cộng hưởng từ proton định lượng. Tại Việt Nam hiện tại chưa công bố nghiên cứu nào áp dụng phương pháp điện di mao quản trong định lượng các diterpen lacton của cây Xuyên tâm liên.
6 2.4. Nghiên cứu in silico cho hướng tác dụng trên nhóm các hợp chất diterpen lacton trong cây Xuyên tâm liên Một số nghiên cứu tại Ấn Độ đã khảo sát hoạt tính in silico của andrographolid, hoạt chất chính của Xuyên tâm liên, đối với tác dụng kháng ung thư và kháng sốt rét. Các diterpen lacton khác chưa có ghi nhận công bố. Tại Việt Nam cũng chưa có công trình nghiên cứu in silico nào đối với các diterpen lacton của Xuyên tâm liên. 2.5. Nghiên cứu in vitro cho hướng tác dụng trên nhóm các hợp chất diterpen lacton trong cây Xuyên tâm liên Các nghiên cứu phần lớn tập trung vào cao toàn phần và các hợp chất chính như AP, DP, NAG, chủ yếu là tác động kháng ung thư trên các dòng tế bào như ung thư gan, ung thư lympho máu ngoại vi,.... Một nghiên cứu ở Việt Nam bởi Hứa Thị Như Cẩm và cộng sự (2010) khảo sát thêm tác dụng kháng virus herpes in vitro trên dòng tế bào Vero. Chưa ghi nhận có nghiên cứu in vitro đối với hợp chất AP1. 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng nghiên cứu 3.1.1. Nguyên vật liệu: Dược liệu khô Xuyên tâm liên, lấy toàn cây bỏ rễ, được thu hái tại 3 vùng trồng: Đồng Tháp (tháng 01/2015), Đồng Nai (tháng 02/2016), và Phú Yên (tháng 02/2017). 3.1.2. Hóa chất và dung môi: Dung môi gồm: hexan, dicloromethan, cloroform, ethyl acetat, methanol, acetonitril, ethanol 96 %, nước cất. Hóa chất gồm: vanillin, acid sulfuric, acid 3,5-dinitrobenzoic, diphospho pentoxid, than hoạt tính, natri tetraborat, natri dedocyl sulphat. Thuốc thử gồm: Kedde, MTT, trypan blue. 3.1.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu Cân phân tích, máy cô quay, máy HPLC, prep-HPLC, máy điện di mao quản, máy quang phổ UV-Vis, máy quang phổ IR, máy đo khối
7 phổ, máy đo phổ NMR, máy phân tích nhiệt vi sai, máy đọc ELISA, cột HPLC Gemini 3u C6-phenyl 110A (150 × 4,6 mm, 3 µm), cột prep- HPLC HiQ sil-10 KYATECH (21,2 × 250 mm, 10 µm). Nơi nghiên cứu: Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. HCM: Khoa Kiểm nghiệm Đông dược - dược liệu, Khoa Thiết lập chất chuẩn - chất đối chiếu, Khoa Vật lý đo lường, Khoa Dược lý, Khoa Vi sinh, đạt tiêu chuẩn GLP-WHO và ISO/IEC 17025. Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. HCM: Bộ môn Dược lý. Viện Pasteur TP. HCM. Viện Công nghệ Hóa học TP. HCM. 3.2. Phương pháp nghiên cứu Nội dung nghiên cứu của đề tài được tóm tắt như sau: Sơ đồ 0.1. Sơ đồ trình tự các nội dung nghiên cứu. 3.2.1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế, xác định độ tinh khiết và cấu trúc một số hợp chất diterpen lacton từ lá Xuyên tâm liên Chiết xuất: Lá Xuyên tâm liên chiết nóng với methanol ở 70 C,
8 cô thu hồi dung môi thu được cao đặc toàn phần. Phân lập: Cao methanol được pha loãng với cùng dung môi và tiến hành kết tinh lạnh để thu tủa thô andrographolid. Phần cao còn lại được lắc phân bố với n-hexan, cloroform, ethyl acetat thu được các phân đoạn. Các phân đoạn cao được phân lập tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thuận, dung môi khai triển theo thứ tự tăng dần độ phân cực: n-hexan → dicloromethan → cloroform → ethyl acetat → methanol tùy vào phân đoạn, kiểm tra và theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng. Tinh chế: Tinh chế bằng sắc ký cột hoặc sắc ký điều chế. Xác định lại độ tinh khiết bằng HPLC và DSC trước khi đo phổ. Xác định cấu trúc: Bằng phổ UV, IR, MS, NMR so sánh với các tài liệu đã công bố. 3.2.2. Thử tác dụng sinh học in silico và in vitro trên nhóm một số hợp chất diterpen lacton trong lá Xuyên tâm liên a. Thử tác dụng sinh học in silico Chọn 4 ligand là 4 diterpen lacton chính: AP, DP, NAG và AP1, kiểm tra các ligand đáp ứng luật 5 Lipinski. Chọn các protein mục tiêu cho 3 tác động: hạ đường huyết, kháng ung thư, kháng HIV. Tải cấu trúc 3D của ligand và protein từ ngân hàng dữ liệu và tiến hành redocking và docking để xác định mức độ tương tác và vị trí gắn kết. b. Thử tác dụng sinh học in vitro Chuẩn bị mẫu: 4 chất đánh dấu: AP, DP, NAG, AP1 và 5 phân đoạn cao H1→H5 tương ứng là cao toàn phần và cao có thành phần chính là các chất đánh dấu. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH: mẫu đối chứng dương là acid ascorbic, tiến hành phản ứng 30 phút, đo độ hấp thu ở 517 nm. Tính hoạt tính chống oxy hóa theo công thức: HTCO (%) = [(ODtrắng – ODthử)/ ODtrắng] × 100
9 Thông qua phương trình hồi quy, xác định IC50 của mẫu thử. Khảo sát hoạt tính độc tế bào: mẫu đối chứng dương là Paclitaxel 0,25 µM, thực nghiệm trên 3 dòng tế bào: ung thư vú (MDA), ung thư cơ vân (RDA), ung thư gan (HepG2). Đánh giá tỷ lệ tế bào sống bằng phương pháp MTT, đo mật độ quang ở 570 nm. Tính tỷ lệ ức chế tăng trưởng theo công thức: % ức chế = 100% – (OD mẫu thử/ODmẫu chứng âm)  100% Thông qua phương trình hồi quy, xác định IC50 của mẫu thử. 3.2.3. Thiết lập chất đối chiếu andrographolid và 14-deoxy-11,12- didehydro andrographolid theo WHO và ASEAN a. Xây dựng quy trình thiết lập chất đối chiếu Phương pháp HPLC, đầu dò PDA, bước sóng phát hiện 225 nm đối với andrographolid và 210 nm đối với 14-deoxy-11,12-didehydro andrographolid. - Mẫu chuẩn: CĐC USP/Phytolab trong methanol (200 µg/ml). - Mẫu thử: chất phân lập trong methanol (200 µg/ml). - Cột sắc ký: Gemini 3u C6 Phenyl 110A (150 × 4,6 mm, 3 µm). - Tốc độ dòng: 1 ml/phút, Thể tích tiêm: 20 µl, Nhiệt độ cột: 30 C. - Pha động: acetonitril − nước, chương trình gradient: Bảng 0.1. Chương trình dung môi theo thời gian. Thời gian Tỉ lệ dung môi (%) (phút) Acetonitril Nước 0–8 25 75 8 – 25 25 → 65 75 → 35 25 – 30 65 35 30 – 32 65 → 25 35 → 75 32 – 35 25 75 b. Thiết lập hồ sơ chất đối chiếu - Đánh giá đồng nhất lô: bằng phân tích ANOVA một yếu tố. - Đánh giá liên phòng thí nghiệm: tại 3 PTN độc lập (VKNT TP. HCM)
10 - Xác định giá trị ấn định và giá trị công bố: theo hướng dẫn của ISO 13528, tính toán độ không đảm bảo đo. 3.2.4. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất diterpen lacton đã phân lập trong lá Xuyên tâm liên bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản a. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Mục tiêu: định lượng đồng thời 4 marker: AP, DP, NAG, AP1. - Cột sắc ký: Gemini 3u C6 Phenyl 110 A (150 × 4,6 mm, 3 µm). - Đầu dò: PDA (bước sóng tùy theo các chất). - Tốc độ dòng: 1 ml/phút, Thể tích tiêm: 10 µl, Nhiệt độ cột: 30 C. - Pha động: acetonitril − nước, chương trình gradient. Bảng 0.2. Chương trình dung môi định lượng đồng thời 4 marker. Thời gian Tỉ lệ dung môi (%) (phút) Acetonitril Nước 0–8 25 75 8 – 20 25→65 75→35 20 – 22 65 35 22 – 25 65→25 35→75 25 – 30 25 75 Thẩm định quy trình phân tích theo ICH 2005 và áp dụng định lượng 3 mẫu dược liệu Xuyên tâm liên từ 3 nguồn thu hái khác nhau. a. Phương pháp điện di mao quản Mục tiêu: Định lượng đồng thời 3 marker: AP, DP, NAG. - Cột mao quản: silica nung chảy (Le.f. 40 cm, i.d. 50 µm). - Đầu dò: UV (bước sóng 210 nm). - Tiêm áp suất: 50 mbar  5 s. - Đệm dinatri tetraborat (khảo sát 30, 35, 40, 45, 50 mM). - SDS (khảo sát 8,5; 10, 15, 20 mM). - pH (khảo sát 9,0; 9,5; 10). - Methanol (khảo sát 2,5; 5, 7,5 %). - Nhiệt độ cột (khảo sát 25, 30, 35 C).
11 - Điện thế (khảo sát 20, 25 kV). - Chất chuẩn nội (khảo sát kirenol, ginkgolid A, quercetin, rutin). Thẩm định quy trình phân tích theo ICH 2005 và áp dụng định lượng 3 mẫu dược liệu Xuyên tâm liên từ 3 nguồn thu hái khác nhau. 3.2.5. Thử tác dụng sinh học in vitro của cao Xuyên tâm liên, xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất diterpen lacton trong cao Xuyên tâm liên bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cao Xuyên tâm liên a. Thử tác dụng sinh học in vitro của cao Xuyên tâm liên Khảo sát một số điều kiện điều chế cao: dung môi (cloroform, methanol, n-hexan, ether dầu hỏa, ethyl acetat, cồn 96 %, dicloromethan), bộ phận dùng (lá, thân, toàn cây), nồng độ dung môi (ethanol 50, 70, 96 %), thời gian chiết: (1, 2, 3, 7 ngày). Khảo sát hoạt tính độc tế bào: mẫu đối chứng dương là Doxorubicin 0,25 µM, thực nghiệm trên dòng tế bào ung thư vú MDA- MB-231. Đánh giá tỷ lệ tế bào sống bằng phương pháp MTT, đo mật độ quang ở 570 nm. Tính tỷ lệ ức chế tăng trưởng theo công thức: % ức chế = 100% – (OD mẫu thử/ODmẫu chứng âm)  100% Thông qua phương trình hồi quy, xác định IC50 của mẫu thử. b. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất diterpen lacton trong cao Xuyên tâm liên bằng HPLC Mục tiêu: định lượng đồng thời 4 marker: AP, DP, NAG, AP1. - Cột sắc ký: Gemini 3u C6 Phenyl 110 A (150 × 4,6 mm, 3 µm). - Đầu dò: PDA (bước sóng 210 nm). - Tốc độ dòng: 1 ml/phút, Thể tích tiêm: 10 µl, Nhiệt độ cột: 30 C. - Pha động: acetonitril − nước, chương trình gradient. Thẩm định quy trình phân tích theo ICH 2005.
12 Bảng 0.3. Chương trình dung môi định lượng đồng thời 4 marker. Thời gian Tỉ lệ dung môi (%) (phút) Acetonitril Nước 0–8 25 75 8 – 20 25 → 65 75 → 35 20 – 22 65 35 22 – 25 65 → 25 35 → 75 25 – 30 25 75 c. Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cao Xuyên tâm liên Các chỉ tiêu dự thảo: a) Tính chất: Cao đặc, thể chất sánh, màu xanh đen, vị đắng. b) Định tính: phải có phản ứng định tính của andrographolid, 14- deoxy-11,12-didehydroandrographolid. c) Độ ẩm: Không quá 20 %. d) Tro toàn phần: Không quá 4,0 %. e) Giới hạn kim loại nặng: Hàm lượng chì < 20 ppm. f) Giới hạn nhiễm khuẩn: Tổng số vi khuẩn hiếu khí Không quá 104 cfu/g Tổng số nấm men và nấm mốc Không quá 102 cfu/g Tổng số Enterobacteria Không quá 500 cfu/g E. coli Không được có/g Salmonella Không được có/10 g Staphylococcus aureus Không được có/g Pseudomonas aeruginosa Không được có/g g) Định lượng: Hàm lượng diterpen lacton không ít hơn 6,7 % tổng hàm lượng andrographolid (C20H30O5), neoandrographolid (C26H40O8), 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolid (C20H28O4) và androgra panin (C20H30O3) tính trên chế phẩm nguyên trạng. 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế, xác định độ tinh khiết và cấu trúc một số hợp chất diterpen lacton từ lá Xuyên tâm liên
13 4.1.1. Kiểm tra chất lượng dược liệu nghiên cứu Bảng 0.1. Kết quả kiểm tra chất lượng dược liệu nghiên cứu. Chỉ tiêu Mức chất lượng Kết quả Mô tả Theo DĐVN IV Đúng Vi phẫu Theo DĐVN IV Đúng Bột Theo DĐVN IV Đúng Định tính Sắc ký lớp mỏng Theo DĐTQ 2015 Đúng Độ ẩm Không quá 10 % Đạt (7,7 %) Tro không tan trong acid Không quá 2,0 % Đạt (0,9 %) Tỷ lệ lá Không ít hơn 30 % Đạt (40,1 %) Tạp chất Không quá 2 % Đạt (0,5 %) Chất chiết được trong dược liệu Chất chiết được trong ethanol 96 % Không ít hơn 8,0 % tính theo Đạt (18,4 %) dược liệu khô kiệt Định lượng Diterpen lacton toàn phần Không ít hơn 6,0 % tính theo Đạt (9,11 %) C20H30O5 trên dược liệu khô kiệt 4.1.2. Chiết xuất, phân lập, tinh chế một số diterpen lacton Kết quả phân lập 6 hợp chất diterpen lacton, gồm AP, DP, NAG, AP1, AP3, AP4, được ghi nhận như sơ đồ 3.1. Sơ đồ 0.1. Sơ đồ phân lập một số hợp chất diterpen lacton.
14 4.1.3. Xác định độ tinh khiết các chất phân lập Phương pháp SKLM: Tiến hành SKLM 6 chất phân lập được (AP, DP, NAG, AP1, AP3 và AP4), mỗi chất 3 hệ dung môi khác nhau. Sắc ký đồ SKLM cho thấy mỗi chất chỉ cho 1 vết có màu tím đặc trưng khi phun thuốc thử vanilin 1 % trong acid sulfuric đậm đặc Phương pháp HPLC-PDA: Trên SKĐ của các mẫu thử, các pic chính của mỗi chất đều có độ tinh khiết trên 95 %. Phương pháp DSC: kết quả như Bảng 3.10. Bảng 0.2. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập bằng DSC. Chất AP DP NAG AP1 AP3 AP4 Độ tinh khiết (%) 99,93 99,42 99,53 99,45 99,79 98,67 Điểm chảy (C) 235,56 208,28 168,72 98,85 200,47 172,07 4.1.4. Xác định cấu trúc các chất phân lập Thông qua kết quả biện giải phổ MS và NMR của các chất, kết hợp so sánh với các tài liệu đã công bố, đã xác định được AP là andrographolid, DP là 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolid, NAG là neoandrographolid, AP1 là andrograpanin, AP3 là 14- deoxyandrographisid và AP4 là 14-deoxy-11,12-didehydroandro graphisid. Kết quả biện giải phổ chi tiết ở Bảng 3.11-3.16. 4.2. Thử tác dụng sinh học in silico và in vitro trên nhóm một số hợp chất diterpen lacton trong lá Xuyên tâm liên 4.2.1. Thử tác dụng sinh học in silico a. Tác động hạ đường huyết Bảng 0.3. Năng lượng gắn kết của các ligand trên các protein liên quan đến tác động hạ đường huyết (kcal/mol). Ligand 3DDS 2QT9 2WLK Andrographolid −7,4 −7,6 −12,8 Neoandrographolid −8,2 −8,8 −12,9 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolid −7,2 −8,8 −13,5 Andrograpanin −6,8 −7,6 −13 Glycogen phosphorylase (3DDS) có điểm số redocking thấp nhất trong các protein được chọn khảo sát nên được chọn làm protein mục
15 tiêu cho tác động hạ đường huyết. Trên 3DDS, neoandrographolid có khả năng gắn kết tốt nhất trong bốn hoạt chất và là hoạt chất tiềm năng nhất ức chế glycogen phosphorylase giúp hạ đường huyết. Ngoài ra, đề tài cũng khảo sát thêm điểm số docking trên 2 protein nữa là DPP4 (2QT9) và KATP (2WLK). b. Tác động kháng ung thư Bảng 0.4. Năng lượng gắn kết của các ligand trên các protein liên quan đến tác động kháng ung thư (kcal/mol). Ligand 1M17 3OVV 3CS9 Andrographolid −8,8 −8,2 −7,4 Neoandrographolid −8,6 −9,7 −9,1 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolid −8,6 −9,0 −9,3 Andrograpanin −7,9 −8,7 −9,1 Tyrosin kinase Bcr-Abl (3CS9) có điểm số redocking tốt nhất trong các protein được chọn khảo sát. Trên 3CS9, khả năng gắn kết của 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolid là vượt trội nhất. Ngoài ra, đề tài cũng khảo sát thêm điểm số docking trên 2 protein nữa là EGFR (1M17) và PKA/cAMP (3CS9), thì DP cũng cho kết quả rất tốt. c. Tác động kháng HIV Bảng 0.5 và 0.6. Năng lượng gắn kết của các ligand trên các protein liên quan đến tác động kháng HIV (kcal/mol). Ligand 1HVR 1VRT Andrographolid −8 −7,7 Neoandrographolid −9,4 −9 14-Deoxy-11,12-didehydroandrographolid −7,9 −8,9 Andrograpanin −7,6 −9,3 HIV protease (1HVR) có điểm số redocking tốt hơn HIV reverse transcriptase (1VRT), tuy nhiên đề tài vẫn khảo sát song song hai protein mục tiêu này. Neoandrographolid có tiềm năng ức chế HIV protease tốt nhất, còn trên reverse transcriptase thì andrograpanin cho kết quả docking tốt nhất. 4.2.1. Thử tác dụng sinh học in vitro a. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro bằng phương pháp DPPH
16 Bảng 0.7. Nồng độ IC50 của mẫu H1, H5 và acid ascorbic. Mẫu thử Phương trình tuyến tính R2 IC50 H1 ŷ = 0,0007x + 0,1331 0,9910 524,14 µg/ml H5 ŷ = 0,0012x + 0,0365 0,9657 386,25 µg/ml Acid ascorbic ŷ = 8,5490x + 4,9320 0,9995 5,27 µg/ml Trong các cao khảo sát, kết quả cho thấy chỉ có cao H1, H5 có hoạt tính đáng kể (HTCO > 50%). Từ đó, tiến hành khảo sát tiếp HTCO của các cao này ở các nồng độ khác nhau, kết quả IC50 như Bảng 3.30. b. Khảo sát hoạt tính độc tế bào ung thư vú, ung thư cơ vân, ung thư gan Trên dòng tế bào ung thư vú MDA: Kết quả cho thấy tất cả các dịch chiết cao và chất chuẩn đều có tác dụng làm giảm tỷ lệ sống của tế bào MDA. Trong đó, XA1 ở nồng độ từ 10 µM trở lên đã có tác động cao hơn hẳn chế phẩm Paclitaxel ở nồng độ 0,25 µM. Ở nồng độ 100 µg/ml, các phân đoạn cao cũng cho tác dụng giảm tỷ lệ sống cao và giảm dần tương ứng với sự giảm nồng độ. Bảng 0.8. Nồng độ IC50 của các mẫu thử trên dòng MDA. Mẫu thử H1 H2 H3 H4 H5 PTHQ 1,0871e0,0725x 5,2795e0,0442x 1,1889e0,0701x 8,6328e0,0408x 5,7076e0,039x R2 0,8367 0,7988 0,9722 0,9878 0,9882 IC50 (µg/ml) 40,78 48,12 39,55 66,38 40,11 Mẫu thử XA1 XA2 XD XN PTHQ 1,9993e0,0275x 23,789e0,025x 12,1370e0,0303x 8,6942e0,0767x R2 0,8402 0,9867 0,9568 0,8104 IC50 (µM) 7,91 83,02 55,21 402,48 Trên dòng tế bào ung thư cơ vân RDA: Kết quả cho thấy tất cả các dịch chiết cao và chất chuẩn đều có tác dụng làm giảm tỷ lệ sống của tế bào RDA. Trong đó, XA1 ở nồng độ từ 25 µM trở lên có tác động cao hơn Paclitaxel nhưng không rõ rệt như ở tế bào MDA. Ở nồng độ 100 µg/ml, các phân đoạn cao cũng cho tác dụng giảm tỷ lệ sống tế bào MDA cao và giảm dần tương ứng với sự giảm nồng độ. Bảng 0.9. Nồng độ IC50 của các mẫu thử trên dòng RDA. Mẫu thử H1 H2 H3 H4 H5 PTHQ 8,1474e0,0306x 6,3703e0,0356x 3,0755e0,0503x 9,2768e0,0313x 3,5546e0,0419x R2 0,9956 0,9832 0,9991 0,9885 0,9979 IC50 (µg/ml) 37,62 37,77 38,02 44,36 28,88
17 Mẫu thử XA1 XA2 XD XN PTHQ 0,2462e0,0486x 10,779e0,0306x 0,714e0,0711x 9,7879e0,0570x R2 0,9851 0,9841 0,9822 0,9788 IC50 (µM) 2,80 49,77 24,97 169,2 Trên dòng tế bào ung thư gan HepG2: Kết quả cho thấy XA1 tiếp tục là chất có hoạt tính mạnh nhất trong các mẫu được khảo sát, tuy nhiên phân đoạn chứa XA1 là H1 lại không có hoạt tính ức chế mạnh như những dòng tế bào trước đó. Điều này có thể là do ngoài XA1 trong cao H1 còn có các thành phần khác có khả năng kìm hãm hoạt tính XA1 hoặc làm tăng sự phát triển của tế bào HepG2, cần phải có thêm các nghiên cứu để làm rõ vấn đề này. Bảng 0.10. Nồng độ IC50 của các mẫu thử trên dòng HepG2. Mẫu thử H1 H2 H3 H4 H5 PTHQ − 33,7385e0,0400x 4,2438e0,0370x − 28,0218e0,0221x R2 − 0,8812 0,9996 − 0,9454 IC50 − 249,30 26,98 − 84,60 (µg/ml) Mẫu thử XA1 XA2 XD XN PTHQ 2,3845e0,0406x 17,6675e0,0301x 3,1419e0,0502x 0,5204e0,1998x R2 0,9022 0,9111 0,8993 0,9590 IC50 (µM) 18,15 79,57 38,65 11348,52 Hoạt tính độc tế bào thường LLCPK1: Kết quả cho thấy tất cả các phân đoạn cao đều không gây độc tế bào bình thường, điều tương tự cũng xảy ra ở các chất chuẩn. Riêng XA1 ở nồng độ cao hơn 25 µM có xảy ra sự ức chế tế bào người phát triển. 4.3. Thiết lập chất đối chiếu andrographolid và 14-deoxy-11,12- didehydroandrographolid theo WHO và ASEAN Kết quả thiết lập chất đối chiếu được trình bày ở Bảng 3.38 – 3.41. Hai hợp chất diterpen lacton không thiết lập chất đối chiếu, gồm NAG và AP1, đã được xác định hàm lượng bằng phương pháp HPLC- PDA, dùng cho xây dựng quy trình định lượng đồng thời các diterpen lacton bằng HPLC và CE. Các quy trình đều được thẩm định và đạt các yêu cầu theo ICH 2005. Kết quả như sau: - NAG: 101,25 % tính theo NAG chuẩn (PhytoLab).
18 - AP1: 99,55 % tính theo phương pháp 100% diện tích pic. Bảng 0.11 - 0.12. Kết quả thiết lập chất đối chiếu AP và DP. 14-deoxy-11,12-didehydro Thông số Andrographolid andrographolid RSDTG lưu = 0,052 % RSDTG lưu = 0,022 % Tính phù hợp hệ thống RSDDT pic = 1,097 % RSDDT pic = 1,129 % Tính đặc hiệu Đạt, Rt = 10,46 phút Đạt, Rt = 19,22 phút Tính tuyến tính R2 = 0,9996 R2 = 0,9995 PT hồi quy ŷ = 42101x ŷ = 53725x Độ lặp lại RSD = 0,65 % (6 mẫu) RSD = 0,37 % (6 mẫu) Độ tái lặp RSD = 0,66 % (18 mẫu) RSD = 0,73 % (18 mẫu) Độ đúng 98,9 – 99,8 % 98,02 – 101,34 % Khoảng xác định 120,06 – 280,13 (µg/mL) 121,84 – 284,30 (µg/mL) Giá trị ấn định 98,03 % 96,51 % Độ không đảm bảo đo 0,216 0,141 4.4. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất diterpen lacton đã phân lập trong lá Xuyên tâm liên bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản 4.4.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Quy trình phân tích đạt các yêu cầu thẩm định theo ICH 2005. Bảng 0.13. Tóm tắt kết quả thẩm định quy trình phân tích bằng HPLC. Chỉ tiêu AP NAG DP AP1 Tính phù hợp hệ thống RSD%TG lưu 0,68 0,11 0,15 0,10 RSD%DT pic 0,40 0,59 0,23 1,10 Tính đặc hiệu Yêu cầu Đạt Đạt Đạt Đạt Tính tuyến tính R2 1 1 1 0,9999 PTHQ ŷ = 34629x ŷ = 27267x ŷ = 44273x + 12799 ŷ = 41087x Khoảng TT 25,19 − 403,02 8,37 − 133,86 11,41 − 182,59 0,57 − 9,18 Độ lặp lại RSD% 4,08 1,26 3,82 1,17 (6 mẫu) Độ chính xác trung gian RSD% 3,05 1,20 4,44 1,09 (12 mẫu) Độ đúng % Phục hồi 96,42 − 97,63 97,09 − 100,78 101,54 − 103,55 95,16 − 98,19 RSD% 0,53 1,17 1,30 1,05 Miền giá trị 157,85−395,91 46,09−112,60 84,07−174,48 3,51−8,03 (µg/mL)