Tóm tắt luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ở Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ở Việt Nam" là nghiên cứu loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) một cách hệ thống và đầy đủ về các mặt: Thực vật (vi phẫu, trình tự gen), thành phần hóa học và hoạt tính sinh học.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGŨ TRƯỜNG NHÂN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành : Hóa học các hợp chất thiên nhiên Mã số : 9 44 01 17 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2019
Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS. Nguyễn Mạnh Cường Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Đỗ Hữu Nghị Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: …. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 201…. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam.
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Việt Nam có diện tích khoảng 330000 km2, trải dài 1650 km qua 15 vĩ độ, có khí hậu nhiệt đới gió mùa, hai mùa nóng ẩm, độ ẩm tương đối lớn (trên 80%), lượng mưa hàng năm dồi dào (trung bình 1200-2800 mm). Với đặc thù môi trường thiên nhiên như thế đã tạo ra một hệ thực vật đa dạng phong phú về chủng loại, quanh năm xanh tốt, và có nhiều công dụng phục vụ cuộc sống con người như là lương thực, chế biến đồ dùng nội ngoại thất, làm cảnh, làm thuốc,… Theo số liệu thống kê, hệ thực vật bậc cao Việt Nam có trên 10.000 loài, trong đó có khoảng 3.200 loài cây được sử dụng trong y học dân tộc làm thuốc chữa bệnh. Trong hệ thực vật đó thì chi Trắc (Dalbergia) thuộc cây họ Đậu (Fabaceae) là một trong ba chi có số loài đa dạng và phong phú nhất. Theo tìm hiểu qua tri thức bản địa thì rất nhiều loài trong chi này như Trắc hoàng đàn Dalbergia assamica Bent, Trắc lá Dalbergia foliacea Wall. ex Benth, Cẩm lai một hạt Dalbergia candenatenis, Dalbergia rimosa, Dalbergia odorifera.., được sử dụng rộng rãi trong y học dân gian ở nhiều quốc gia để chữa nhiều bệnh như: đau đầu, chữa ung nhọt, ho suyễn, gãy xương, phong thấp, chảy máu cam, nhiễm trùng, bệnh giang mai, tiêu chảy, huyết áp, tim mạch, v/v. Trong đó, loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) bị khai thác quá mức, hiện có trong danh mục sách Đỏ Việt Nam (2007), phân hạng ở mức nguy cấp. Các nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy các loài chi Dalbergia chứa các lớp chất flavonoid (flavone, isoflavone, neoflavone, flavans, flavonol), hợp chất phenol và các terpen. Các cao chiết và hợp chất phân lập từ chi Dalbergia có các hoạt tính sinh học quí như làm giảm đau, kháng viêm, kháng androgen, chống dị ứng, ho suyễn, chống bệnh than, huyết áp, điều hòa miễn dịch, và có tác dụng liên quan đến tim mạch. Cho đến nay loài Sưa ở Việt Nam vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ và toàn diện về thực vật học, thành phần hóa học và tác dụng sinh học. Còn về mặt hóa học chỉ mới có một công trình nghiên cứu sơ bộ ở trong nước. 1
Từ những cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên đã định hướng cho chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ở Việt Nam’’. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án Nghiên cứu loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) một cách hệ thống và đầy đủ về các mặt: thực vật (vi phẫu, trình tự gen), thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án Để đạt được các mục tiêu nêu trên, luận án đã thực hiện các nội dung sau: - Nghiên cứu về thực vật (vi phẫu lá, thân, bột lõi thân và trình tự gen) của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain). - Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ lõi gỗ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain): điều chế cặn chiết và phân đoạn, phân lập các hợp chất từ cặn chiết bằng các phương pháp sắc ký, xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp hóa lý hiện đại. - Khảo sát một số hoạt tính sinh học: kháng khuẩn và ức chế enzyme - glucosidase của cao chiết tổng, cao chiết phân bố và một số hợp chất sạch phân lập từ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ở Việt Nam. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Phần tổng quan tài liệu là tập hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các vấn đề: 1.1. Tổng quan về họ đậu (Fabaceae) và chi trắc (Dalbergia) 1.1.1. Tổng quan về họ Đậu (Fabaceae) 1.1.1.1. Tổng quan về chi Trắc (Dalbergia) 1.1.1.2. Tổng quan về loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 1.2. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Trắc (Dalbergia) trên thế giới CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phần này mô tả chi tiết các quá trình xử lý mẫu nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu vi phẫu và trình tự gen, điều chế các phần chiết, phân tách sắc ký và phân lập các hợp chất, các phương pháp thử hoạt tính sinh học. 2
2.1. Đối tượng nghiên cứu Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) được thu hái tại thành phố Buôn Ma Thuột, tỉnh Đăk Lăk. Tên khoa học của loài cây trên được xác định bởi TS. Nguyễn Quốc Bình, Bảo Tàng thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu tiêu bản của cây được lưu trữ tại phòng tiêu bản thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật và tại phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, kí hiệu mẫu là C-561 và C-612. Mẫu Sưa (lá, vỏ, thân và lõi gỗ) sau khi thu hái về được rửa sạch, loại bỏ phần vỏ, chỉ lấy phần thân lõi có màu đỏ để phân lập chất, phơi khô. Sau đó mẫu được xay nhỏ và được ngâm chiết kiệt nhiều lần bằng MeOH ở nhiệt độ phòng. Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được chiết phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần như: n-hexan, chloroform hoặc dichloromethane, etyl acetate và nước. Lõi gỗ (3,7 kg) Ngâm MeOH (5 x 7,0L) Bã sau khi chiết Cao methanol (120 g, M) Đun nước (4 x 3,0L) Chiết phân bố n-hexane dichloromethane ethyl acetate nước W MH MD ME MW (4,2 g) (29,0 g) (45,1 g) (11,1 g) (12,0 g) Sơ đồ 2.1. Xử lý mẫu và chiết tách từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 2.2. Các phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Nghiên cứu vi phẫu: Thực hiện tại Bộ môn Thực vật- Trường Đại học Dược Hà Nội. 2.2.2. Nghiên cứu trình tự gen: Thực hiện tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2.3. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết 3
Các phương pháp đã được sử dụng như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát), sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường (Merck loại 40-63 m) hoặc pha đảo (ODS, YMC (30-50 μm)), sắc ký cột Dianion HP-20, Sephadex LH-20. Bên cạnh đó còn dùng phương pháp kết tinh để thu chất sạch. 2.2.4. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các chất là sự kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm: Phổ khối ion hóa bụi điện tử ESI-MS được ghi trên máy ghi Agilent 6310 Ion Trap, phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy Agilent 6510 Q-TOF LC/MS hoặc máy MicroQ-TOF III mass spectrometer (Bruker Daltonics, Germany). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-, 13C-và DEPT NMR) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz đo với TMS là chất chuẩn nội. Sử dụng các dung môi hòa tan được hoàn toàn mẫu thử chủ yếu là DMSO-d6, MeOD-d4, CDCl3. Trong luận án này chúng tôi sử dụng phổ CD (lưỡng sắc vòng - circular dichroism) để xác định cấu hình tuyệt đối của hợp chất mới. 2.2.5. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 2.2.5.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định trên một số chủng: Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Aspergillus niger, Fusarium oxyporum, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans. Thực hiện tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2.5.2. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase Thực hiện tại Khoa Dược, Trường Đại học Tam Kang, Đài Loan. Enzyme - glucosidase từ gạo, nấm men (Saccharomyces cerevisiae), vi khuẩn (B. stearothermophilus), chuột cùng với cơ chất p-nitrophenyl -D-glucopyranoside (pNPG) và acarbose mua tại hãng Sigma Aldrich, St. Louis City, MO, USA. 2.2.6. Thông số hóa lý và dữ kiện phổ các hợp chất phân lập Phần này trình bày chi tiết các dữ kiện phổ cũng như hằng số vật lý của 18 hợp chất phân lập từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinenis Prain). 4
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Chương này trình bày các kết quả nghiên cứu về vi phẫu, DNA, kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất, hoạt tính kháng khuẩn và ức chế enzyme -glucosidase. 3.1. Kết quả nghiên cứu về vi phẫu và trình tự gen của loài Sưa (Dalbergia tonkinenis Prain) Phần này mô tả chi tiết các kết quả về hình thái vi phẫu của lá, thân và bột lõi thân của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain). 3.1.1. Kết quả nghiên cứu vi phẫu Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu vi phẫu lá, thân và bột lõi thân của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) thu tại Tp. Buôn Ma thuột để hỗ trợ cho việc phân loại hình thái cũng như bổ sung cơ sở dữ liệu di truyền cho loài này. Một số kết quả được trình bày ở hình dưới đây: 1- Lông che chở; 2- Biểu bì trên; 3-Mô dày trên; 4; 7- Mô cứng; 5- Gỗ; 6- Libe; 8- Mô dày dưới; 9- Mô mềm; 10- Biểu bì dưới Hình 3.1. Vi phẫu lá Sưa 11- Biểu bì trên; 12- Hạ bì trên; 13- Mô giậu; 14- Mô khuyết; 15 – Biểu bì dưới. Hình 3.2. Phiến lá Sưa 5
3.1.2. Kết quả nghiên cứu về trình tự gen Trong nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành xác định trình tự 3 vùng gen lục lạp rbcL, rpoB và rpoC của 2 mẫu Sưa thu tại Tp. Buôn Ma Thuột (C-561-L) và thu tại Hà Nội (C-564-L) và so sánh khoảng cách di truyền của từng vùng gen đó với 5 loài Dalbergia khác đã công bố trình tự trên GenBank. Kết quả cho thấy (hình 3.3) ba vùng gen rbcL, rpoB và rpoC là thích hợp để sử dụng cho các nghiên cứu phân loại các loài thuộc chi Sưa (Dalbergia) với tỉ lệ phân biệt lần lượt là 99%, 98% và 97%. Trình tự 3 vùng gen lục lạp rbcL, rpoB và rpoC của loài Sưa (Dalbergia tonkinenis Prain) ở Việt Nam đã được đăng ký trên ngân hàng gen với số hiệu lần lượt là KY283103, KY287755 và KY287750. Hình 3.3. So sánh khả năng phân biệt giữa các loài Dalbergia của 3 vùng gen nghiên cứu 3.2. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain). Phần này mô tả chi tiết kết quả phân lập, phân tích phổ và xác định cấu trúc hóa học của lõi gỗ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain), trong đó có 02 hợp chất mới và còn lại là các hợp chất đã biết. Kết quả đã phân lập và xác định cấu trúc của 18 hợp chất từ lõi gỗ Sưa bao gồm: 08 hợp chất từ cao chiết dichloromethane, 07 hợp chất từ cao chiết ethyl acetate và 03 hợp chất từ cao nước. Cấu trúc 18 hợp chất phân lập được trình bày ở bảng 3.1. 6
Bảng 3.1. Bảng tổng hợp các hợp chất phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) . Pinocembrin Naringenin 3'-hydoxy-2,4,5-trimethoxydalbergiquinol Medicarpin Buteaspermanol Daltonkin A (2S)-8-carboxyethylpinocemprin (Chất mới) Dalbergin Daltonkin B (2S)-2,6-dicarboxyethylnaringenin (Chất mới) 7
Liquiritigenin 7,3',5'-trihydroxyflavanone Sativanone 3'-O-methylviolanone Vestitone Calycosin Formononetin 7,3',4'-trihydroxyaurone (Sulfuretin) Isoliquiritigenin 4',7-dihydroxy-3-methoxyflavone 3.2.1. Hợp chất mới daltonkin A Hợp chất daltonkin A được phân lập dưới dạng chất rắn vô định hình. Phổ khối phun bụi electron phân giải cao (HR-ESI-MS), cho pic ion giả phân tử ở m/z = 8
327,0868 [M – H]– (theo lý thuyết là 327,0863). Như vậy, công thức phân tử của hợp chất daltonkin A là C18H16O6. Phổ hồng ngoại (IR) của hợp chất daltonkin A xuất hiện các cực đại hấp thụ đặc trưng tại vị trí νmax tại 3354 và tại νmax 1701 cm-1, của các nhóm hydroxyl OH, nhóm carbonyl và kết C=C (benzene) ( νmax: 1701, 1637, 1610, 1452). Phổ tử ngoại UV cũng xuất hiện các đỉnh đặc trưng cho nối đôi liên hợp ở UV (MeOH) λmax nm (logε): 293 nm. Các tín hiệu trên phổ 1H-NMR và 13 C-NMR cho thấy, ngoài các tín hiệu đặc trưng cho 2 vòng thơm A và B còn xuất hiện thêm các tín hiệu của 1 carbon methylene tại δC 44,3 (C-3), 1 tín hiệu carbon nhóm oxymethine ở vị trí δC 80,5 (C-2) và tín hiệu 1 carbon của nhóm carbonyl tại δC 197,5 (C-4) của vòng C trong phổ 13C- NMR. Điều này cho phép kết luận hợp chất daltonkin A là một flavanone. Phổ 1H và 13 C-NMR của daltonkin A tương tự như hợp chất pinocembrin đã được phân lập từ loài Dalbergia odorifera, ngoại trừ sự thay thế một proton thơm H-8 trong hợp chất pinocembrin bởi một nhóm carboxyethyl (CH2CH2COOH) (H-9 [δH 2,86, t, 8,0 Hz]/C-9 [δC 18,7], H-10 [δH 2,49, t, 8,0 Hz]/C-10 [δC 34,1] và C-11 [δC 177,7]). Hình 3.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất daltonkin A 9
Hình 3.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất daltonkin A Hình 3.6. Phổ DEPT của hợp chất daltonkin A Mạch nhánh carboxyethyl được chứng minh thông qua các tương quan giữa proton methylene H-9 và H-10 trong phổ COSY, cũng như các tương quan giữa proton H-9 và H-10 với carbon C-11 của nhóm carbonyl trong phổ (HMBC). 10
Hình 3.7. Phổ COSY của hợp chất daltonkin A Hình 3.8. Phổ HMBC của hợp chất daltonkin A Thêm vào đó, các tương quan của proton H-9 với các carbon C-7, C-8 và C-8a trong phổ HMBC cho phép xác định nhóm carboxyethyl gắn vào vị trí C-8 của vòng A. Bảng 3.2. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất daltonkin A daltonkin A (*) Vị trí δH (ppm) (J , Hz) δC (ppm) 2 5,47, dd, 13,0; 3,0 80,5, d 2,80, dd, 17,0; 3,0, H-3eq 3 44,3, t 3,11, dd, 17,0; 13,0, H-3ax 4 197,5, s 4a 103,3, s 5 162,8, s 6 6,02, s 95,6, d 7 166,1, s 8 108,5, s 8a 162,8, s 9 2,86, t, 8,0 18,7, t 10 2,49, t, 8,0 34,1, t 11 177,7, s 9' 10' 11' 1' 140,5, s 2',6' 7,52, d, 7,5 127,3, d 4' 7,39, t, 7,5 129,6, d 3',5' 7,44, d, 7,5 129,7, d (*)1H-NMR (500 MHz, methanol-d4); 13C-NMR (125 MHz, methanol-d4) 11
Các nghiên cứu trước đây cho thấy các flavanone cấu hình 2S trên phổ CD (lưỡng sắc vòng - circular dichroism) thường có hiệu ứng Cotton dương trong vùng gần 330 nm (n–*) và hiệu ứng Cotton âm ở vùng 270–290 nm. Phổ CD (c 0,4, MeOH) của hợp chất daltonkin A (hình 3.9) cho thấy có hiệu ứng Cotton dương tại 330 + 2,10 (n–*) và hiệu ứng Cotton âm tại 288 – 10,43 (– * ). Như vậy, hợp chất flavanone daltonkin A có cấu hình 2S. Hình 3.9. Phổ CD của hợp chất daltonkin A Qua phân tích tổng hợp các dữ liệu phổ trên cho phép xác định hợp chất daltonkin A là (2S)-8-carboxyethylpinocembrin, đây là một hợp chất mới lần đầu tiên phân lập từ thiên nhiên. Hình 3.10. Cấu trúc hóa học của hợp chất daltonkin A Hình 3.11. Các tương tác HMBC (H→C) và COSY (H→H) của hợp chất daltonkin A 12
3.2.2. Xác định cấu trúc hợp chất mới daltonkin B Hợp chất daltonkin B được phân lập dưới dạng chất bột vô định hình màu trắng. Phổ hồng ngoại (IR) của hợp chất daltonkin B xuất hiện các cực đại hấp thụ đặc trưng cho nhóm hydroxyl OH (νmax 3369 cm-1) và nhóm carbonyl C=O (νmax 1751 cm-1) và liên kết C=C (benzene) (νmax, 1751, 1676, 1575 cm-1). Phổ tử ngoại UV tương tự hợp chất daltonkin A cũng xuất hiện các đỉnh đặc trưng cho nối đôi liên hợp ở UV (MeOH) λmax nm (logε): 297 nm. Phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) của hợp chất daltonkin B cho pic ion giả phân tử ở m/z = 415,1014 [M – H]– (tính toán là 415,1024). Công thức phân tử của hợp chất daltonkin B là C21H19O9. Hình 3.12. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất daltonkin B Tương tự như hợp chất daltonkin A, các tín hiệu carbon của hợp chất này đặc trưng cho một khung flavanone bao gồm: 1 tín hiệu của carbon methylene tại δC 44,0 (C-3), 1 tín hiệu carbon nhóm oxymethine ở vị trí δC 80,3 (C-2) và 1 tín hiệu carbon của nhóm carbonyl tại δC 197,5 (C-4) trong phổ 13C-NMR. Phổ 1H và 13 C-NMR của daltonkin B có các tín hiệu tương tự như của flavanone narigenin, được phân lập từ loài Dalbergia odorifera, ngoại trừ sự thay thế hai proton của vòng benzene (H-6 và H-8) trong hợp chất narigenin bởi tín hiệu của hai nhóm carboxyethyl (H-9 [δH 2,85, m]/C-9 [δC 18,8], H-10 [δH 2,55, m]/C-10 [δC 34,4], và C-11 [δC 179,1]) và (H-9' [δH 2,81, m]/C-9' [δC 19,4], H-10' [δH 2,51, 13
m]/C-10' [δC 34,8] và C-11' [δC 179,2]). Các số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất daltonkin B được trình bày trong (bảng 3.3). Hình 3.13. Phổ 1H-NMR của hợp chất daltonkin B Hình 3.14. Phổ 13C-NMR của hợp chất daltonkin B Các dữ kiện phổ 2 chiều HSQC, HMBC, COSY được sử dụng để xác định cấu trúc khung flavanone, 2 nhóm carboxyethyl và vị trí của gắn của chúng với vòng A của daltonkin B. Trên phổ COSY ta thấy rõ tương quan giữa các proton methylene H- 9/H-10 và H-9'/H-10'. Phổ HMBC khẳng định có hai nhóm carboxyethyl qua các tương tác giữa các proton methylene H-9 và H-10 với carbonyl carbon C-11 cũng như tương tác của proton H-9' và H-10' với carbon C-11'. Vị trí gắn kết của hai nhóm carboxyethyl được xác định qua tương tác giữa proton H-9' với các carbon C-5, C-6 và C-7, cũng như các tương tác của proton H-9 với C-7, C-8 và C-8a trên phổ 14
HMBC. Các tương tác đó cho phép kết luận hai nhóm carboxyethyl gắn vào vị trí C-6 và C-8 của vòng A. Hình 3.15. Phổ COSY của hợp chất daltonkin B Hình 3.16. Phổ HMBC của hợp chất daltonkin B Bảng 3.3. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất daltonkin B daltonkin B (*) Vị trí δH (ppm) (J , Hz) δC (ppm) 2 5,39, dd, 13,0, 3,0 80,3, d 2,79, dd, 17,0, 3,0, H-3eq 3 44,0, t 3,13, dd, 17,0, 13,0, H-3ax 4 198,6, s 4a 103,4, s 5 159,8, s 6 109,0, s 7 163,9, s 8 108,3, s 8a 161,1, s 9 2,85, m 18,8, t 10 2,55, m 34,4, t 11 179,1, s 9' 2,81, m 19,4, t 10' 2,51, m 34,8, t 11' 179,2, s 1' 131,4, s 2',6' 7,36, d, 8,5 128,8, d 4' 158,9, s 3',5' 6,85, d, 8,5 116,4, d (*) H-NMR (500 MHz, methanol-d4); 13C-NMR (125 MHz, methanol-d4) 1 15
Tương tự daltonkin A, hợp chất daltonkin B được xác định có cấu hình 2S. Như vậy, cấu trúc của hợp chất mới daltonkin B được xác định. Hợp chất dicarboxyethylflavanone mới này có tên gọi là (2S)-6,8- dicarboxyethylnaringenin, lần đầu được phân lập trong tự nhiên. Hình 3.17. Cấu trúc hóa học của hợp chất daltonkin B Hình 3.18. Các tương tác HMBC (H→C) và COSY (H→H) của hợp chất daltonkin B 3.2. Đánh giá tác dụng sinh học 3.2.1. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Các hợp chất pinocembrin, naringenin và 3'-hydroxy-2,4,5- trimethoxydalbergiquinol phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) được thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định trên một số chủng. Kết quả (bảng 3.4) cho thấy hợp chất pinocembrin biểu hiện hoạt tính ức chế mạnh đối với hai chủng nấm mốc và Fusarium oxyporum và Aspergillus niger với nồng độ ức chế tối thiểu MIC = 50 µg/mL. Loài nấm Fusarium oxyporum là loại gây bệnh thối cổ rễ. Một trong các bệnh gây hại nhiều đến mùa màng nước ta. Còn đối với các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans và vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus thì hợp chất pinocembrin cho thấy khả năng ức chế trung bình với giá trị MIC=100µg/mL. Hợp chất naringenin có tác dụng ức chế vửa phải đối với chủng vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus và chủng nấm mốc Aspergillus niger. Trong khi đó hợp chất 3'-hydroxy-2,4,5- 16
trimethoxydalbergiquinol không thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật trên các chủng thử nghiệm. Bảng 3.4. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất phân lập từ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Hoạt tính kháng khuẩn (MIC: µg/mL) Vi khuẩn Nấm mốc (sợi) Nấm men Hợp chất Bacillus Staphylococcus Aspergillus Fusarium Saccharomyces Candida subtillis aureus niger oxyporum cerevisiae albicans pinocembrin (-) 100 50 50 100 100 naringenin (-) 100 100 (-) (-) (-) 3'-hydroxy- (-) (-) (-) (-) (-) (-) 2,4,5- trimethoxydalbe rgiquinol (-): IC50 ≥ 200 µg/mL 3.2.2. Tác dụng ức chế enzyme -glucosidase  Cao chiết methanol của lõi gỗ, vỏ và lá của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) đã được đánh giá hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase, trong đó cao chiết methanol của lõi gỗ có tác dụng mạnh nhất với giá trị IC50 là 0,17 mg/mL, so với chất đối chứng dương là acabose (IC50 là 1,21 mg/mL). A IC50B Ức A B (mg/mL) 1.6 1.6 chế 100 1.25 1.25 100 1.4 1.4 (%) 80 1.2 1.2 EC50 (mg/mL) 80 EC50 (mg/mL) 1.0 1.0 aGI (%) 0.78 aGI (%) 60 60 0.78 0.8 0.8 0.57 0.57 40 40 0.6 Heartwood Lõi gỗ 0.6 Heartwood Vỏ bark Trunk 20 Lá Trunk bark 0.4 0.4 20 Leaves 0.17 Acarbose Leaves 0.17 Acarbose 0.2 Acarbose 0.2 0 0 0.0 0.0 0 1 2 3 4 5 Heartwood Bark Leaves Acarbose 0 1 2 3 4 5 Heartwood Bark Leaves Acarbose NồngConcentration độ (mg/mL) (mg/mL) Concentration (mg/mL) LõiPart gỗ used Vỏ Lá Part used Acarbose Hình 3.19. Khả năng ức chế α-glucosidase của các bộ phận loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)  Đánh giá tác dụng ức chế enzyme -glucosidase của các phân đoạn cao chiết methanol lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 17
Bảng 3.5. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của các cao phân đoạn từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Mẫu Ức chế enzyme α-glucosidase IC50 (mg/mL) ức chế (%)* HDT (cao methanol) 0,172±0,011 98±3,2 HDT-1 (cao phân đoạn hexane) 1,712±0,210 73±4,1 HDT-2 (cao phân đoạn 0,124±0,003 90±2,5 dichloromethane ) HDT-3 (cao phân đoạn ethyl 0,069±0,001 95±3,7 acetate ) HDT-4 (cao phân đoạn nước) 0,513±0,051 82±2,3 Acarbose (đối chứng dương) 1,357 62 (*): Khả năng ức chế của acarbose và các phân đoạn được xác định trong khoảng nồng độ 0,1-5 mg/mL. Từ bảng 3.5 cho thấy cao chiết ethyl acetate (HDT-3) có hoạt tính ức chế mạnh nhất tương ứng 95% và giá trị IC50 là 0,069 mg/mL. Dựa trên đánh giá sắc ký lớp mỏng. Chúng tôi chọn cao chiết phân đoạn này và cao chiết nước để phân lập các hợp chất theo định hướng tác dụng sinh học. Kết quả từ hai phân đoạn 3.1.2 và 4.3.3, 02 hợp chất sativanone và formononetin đã được phân lập. Tác dụng ức chế enzyme α- glucosidase của 2 hợp chất này so với acarbose được thể hiện trong hình 3.20. A B C 100 100 100 Ức 80 80 80 aGI (%) aGI (%) aGI (%) 60 60 chế 60 40 40 40 (%) 20 20 20 0 0 0 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 3.1.7 3.1.8 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 Các phân đoạn HDT-3 Sub-fractions of HDT-3 Components separated from HDT-3.1 Các phân đoạnEHDT-3.1 Các phân đoạn Sub-fractions of HDT-4 HDT-4 D 100 100 80 80 Ức aGI (%) aGI (%) 60 60 chế 40 40 Sativanone Formononetin (%) 20 20 Acarbose1 (purified HDT-3.1.2) Compound Compound 2 (purified HDT-4.3.3) Acarbose (positive control) 0 0 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.3.5 4.3.6 0 1 2 3 4 5 Components separated from HDT-4.3 Concentration (mg/mL) Các phân đoạn HDT-4.3 Nồng độ (mg/mL) Hình 3.20. Tác dụng ức chế α-glucosidase của các cao phân đoạn và hợp chất phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 18