Tóm tắt Luấn án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính sinh học các dẫn xuất mới của alkaloid dừa cạn

Chia sẻ: Lê Thị Hồng Nhung | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

37
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án: Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất vinca alkaloid mới mang các nhóm thế khác nhau trên các vị trí C-3’ và N-6’ thuộc vòng D của tiểu đơn vị velbanamine, đồng thời đánh giá hoạt tính sinh học của các dẫn xuất tổng hợp được. Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luấn án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính sinh học các dẫn xuất mới của alkaloid dừa cạn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- VÕ NGỌC BÌNH NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC DẪN XUẤT MỚI CỦA ALKALOID DỪA CẠN Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ Mã số: 9.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2018
Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS. Ngô Quốc Anh Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Đoàn Duy Tiên Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Cơ sở, họp tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 1. Ngo Quoc Anh, Vo Ngoc Binh, Nguyen Le Anh, Nguyen Van Tuyen. Synthesis and antitumor activity of new vinca-alkaloid mimicking sarcodictyin features. Tạp chí hóa học, 2014, 52(6A) 242-246. 2. Q. A. Ngo, L. A. Nguyen, N. B. Vo, T. H. Nguyen, F. Roussi and V. T. Nguyen. Synthesis and antiproliferativeactivity of new vinca alkaloids containing an α, β-unsaturated aromatic side chain, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2015, 25, 5597-5600. 3. Võ Ngọc Bình, Nguyễn Lê Anh, Nguyễn Thúy Hằng, Trần Thị Yến, Ngô Quốc Anh. Tổng hợp chọn lọc lập thể các dẫn xuất hidydrocyanoanhydrovinblastine. Tạp chí hóa học, 2016, 54(6e2), 180-183. 4. Võ Ngọc Bình, Nguyễn Lê Anh, Nguyễn Thúy Hằng, Trần Thị Yến, Ngô Quốc Anh. Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn xuất vinca – ancaloit mới từ 3’-cyanoanhydrovinblastine. Tạp chí hóa học, 2016, 54(6e2), 184-188. 5. N. B. Vo, L. A. Nguyen, T. L. Pham, D. T. Doan, T. B. Nguyen and Q. A. Ngo. Straightforward access to new vinca-alkaloids via selective reduction of a nitrile containing anhydrovinblastine derivative, Tetrahedron Letters, 2017, 58, 2503-2506. 6. Vo Ngoc Binh, Nguyen Le Anh, Nguyen Thuy Hang, Tran Thi Yen, Ngo Quoc Anh. Synthesis and antitumor activity of new vinca alkaloids from 3’-cyanoanhydrovinblastine, Viet Nam Journal of Chemistry, 2018 (Đã chấp nhận đăng).
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Ung thư là một nhóm các bệnh được đặc trưng bởi sự phát triển không kiểm soát và sự lan truyền của các tế bào bất thường. Tỷ lệ ung thư trên toàn thế giới ước tính khoảng 14 triệu trường hợp mới mỗi năm. Các nguồn lực to lớn đang được đầu tư trên khắp thế giới để phát triển các chiến lược phòng ngừa, chẩn đoán và điều trị ung thư. Các công ty dược phẩm và các tổ chức chính phủ, phi chính phủ đều tham gia tích cực vào việc phát hiện và phát triển các chất chống ung thư. Các vinca alkaloid được phân lập từ cây dừa cạn Madagascar, Catharantus roseus G. Don, chứa khoảng 130 terpenoid indole alkaloid. Giá trị lâm sàng của chúng đã được công nhận vào đầu những năm 1965. Vì vậy loại hợp chất này đã được sử dụng như các chất chống ung thư trong hơn 50 năm qua và là nhóm hợp chất dẫn đầu cho sự phát triển thuốc. Ngày nay, hai hợp chất tự nhiên, vinblastine (VLB) và vincristine (VCR) và hai dẫn chất bán tổng hợp, vindesine (VDS) và vinorelbine (VRLB), đã được phê duyệt để sử dụng tại Hoa Kỳ. Do tầm quan trọng dược phẩm và hàm lượng chiết xuất thấp của VLB, VCR và các alkaloid khác nên Catharanthus roseus trở thành một trong những cây thuốc được nghiên cứu nhiều nhất. Những nỗ lực nghiên cứu của các nhà khoa học nhằm tìm thêm các hợp chất khác có độc tính thấp hơn và khả năng điều trị cao hơn vẫn đang được tiếp tục. Xuất phát từ cơ sở các kết quả nghiên cứu và tính cấp thiết trong thực tiễn, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính sinh học các dẫn xuất mới của alkaloid dừa cạn”. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất vinca alkaloid mới mang các nhóm thế khác nhau trên các vị trí C-3’ và N-6’ thuộc vòng D của tiểu đơn vị velbanamine, đồng thời đánh giá hoạt tính sinh học của các dẫn xuất tổng hợp được. 3. Các phương pháp nghiên cứu Sử dụng các phương pháp tổng hợp hữu cơ hiện đại đã biết, có cải tiến và vận dụng thích hợp vào các trường hợp cụ thể. Sản phẩm phản ứng được làm sạch bằng phương pháp sắc ký cột. Cấu trúc của sản phẩm được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại như: IR, HR-MS, NMR. Hoạt tính sinh học được đánh giá theo phương pháp của Monks trên hai dòng tế bào ưng thư KB và HepG2. Phép thử độc tế bào ung thư bạch huyết cấp tính ở người HL-60, thử nghiệm apoptosis được thực hiện tại 1Viện Dược lý và Độc học, Đại học
Würzburg, Cộng Hòa Liên Bang Đức. Phương pháp mô hình mô phỏng docking phân tử được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Hóa học tính toán và Mô phỏng, Khoa Hóa học - Trường Đại học Quy Nhơn. 4. Những đóng góp mới của luận án  Tổng hợp được 23 hợp chất vinca alkaloid mới đi từ các alkaloid dừa cạn thiên nhiên như catharanthine, vindoline, vinblastine và vincristine bao gồm: – 12 dẫn xuất muối ammoni bậc IV của anhydrovinblastine, vinblastine, vincristine và 18(S)-3’,5'-dimethoxyanilinecleavamine 81a – 84c. – 11 dẫn xuất mới từ 3'-cyanoanhydrovinblastine bao gồm 5 dẫn xuất vinca alkaloid 92a – 92e thông qua việc khử chọn lọc 3’- cyanoanhydrovinblastine 88. 6 dẫn xuất vinca alkaloid 93a – 93f thông qua việc khử alkyl hóa aminomethyl 92c.  Lần đầu tiên quy kết đầy đủ độ chuyển dịch proton và carbon đối với hợp chất 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 và xác định cấu hình tuyệt đối tại vị trí C-3’ của hợp chất 88. Một phương pháp mới tổng hợp chất 88 cho hiệu suất cao hơn nhiều phương pháp tổng hợp cũ (74% so với 32%).  Cấu trúc của các chất mới đã được xác định bằng các dữ liệu phổ 1D- NMR, 2D-NMR, IR và HRMS. Đặc biệt, sử dụng các phổ 2D – NMR: COSY, HSQC, HMBC, NOESY đã xác định được cấu hình lập thể của 5 hợp chất mới 92a – 92e.  Tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên 2 dòng tế bào ung thư KB và Hep-G2 của 23 dẫn chất mới. Kết quả, bốn hợp chất 83a, 83b, 84a, 84b thể hiện tính độc tế bào có chọn lọc và mạnh đối với dòng tế bào KB với IC50 tương đương với vinblastine 1 và vincristine 2. Ba vinca alkaloid mới là các dẫn xuất 81a-c xuất phát từ anhydrovinblastine 12 có hoạt tính gây độc tế bào KB tốt hơn so với 12 và thậm chí tốt hơn so với Ellipcitine trong trường hợp 81b. Các hợp chất vinca alkaloid lược giản 82a-c bằng cách thay thế vindoline với 3,5-dimethoxyaniline (DMA) không làm mất đi hoạt tính mà còn cải thiện họat tính đáng kể so với hợp chất gốc 18(S)-3’,5'- dimethoxyanilinecleavamine 77.  Lựa chọn 8 hợp chất 81a – 81c, 82a-b, 92a-92c có độc tính tế bào mạnh để tiến hành docking trên tubulin. Kết quả cho thấy, 02 dẫn chất alkaloid dừa cạn mới 92b và 82a có hoạt tính gây độc tế bào mạnh nhất thì cho tương tác mạnh nhất với tubulin.  Lần đầu tiên tiến hành thử cơ chế sinh học 02 chất chlorochablastine 83b và chlorochacristine 84b trên các mô hình apoptosis, cell cycle, ức chế tăng sinh tế bào so với các alkaloid thương phẩm. Kết quả cho thấy hai chất được lựa chọn có hiệu lực tương tự như vinflunine là alkaloid dừa cạn bán tổng hợp thương phẩm thế hệ mới nhất hiện nay. 2
5. Bố cục của luận án Luận án có 138 trang bao gồm: Mở đầu: 2 trang Chương 1. Tổng quan: 27 trang Chương 2. Thực nghiệm: 38 trang Chương 3. Kết quả và thảo luận: 52 trang Kết luận: 1 trang Phần tài liệu tham khảo bao gồm 16 trang tài liệu được trích dẫn, các tài liệu cập nhật đến năm 2018. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Microtubule - Một đích tác dụng quan trọng của các thuốc điều trị ung thư 1.1.1. Định nghĩa 1.1.2. Động học của microtubule 1.1.3. Các nhóm thuốc chống ung thư theo cơ chế tác dụng lên microtubule 1.2. Vinca alkaloid 1.2.1. Giới thiệu về vinca alkaloid 1.2.2. Tổng hợp các vinca alkaloid 1.2.2.1. Bán tổng hợp 1.2.2.2. Tổng hợp toàn phần 1.2.2.3. Sinh tổng hợp và công nghệ sinh học 1.2.3. Mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính của vinca alkaloid 1.2.3.1. Những thay đổi trên phần khung vindoline 1.2.3.2. Những thay đổi trên phần khung velbanamine 1.2.4. Ứng dụng lâm sàng của vinca alkaloid 1.3. Định hướng và mục tiêu của luận án CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và thiết bị 2.1.1. Hóa chất và dung môi 2.1.2. Thiết bị nghiên cứu 2.1.2.1. Phổ hồng ngoại IR 2.1.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 2.1.2.3. Phổ khối lượng MS và HRMS 2.1.2.3. Năng suất quay cực riêng [α]D 2.2. Các phương pháp nghiên cứu 3
2.2.1. Các phương pháp tổng hợp hữu cơ 2.2.2. Phương pháp thử hoạt tính sinh học 2.2.3. Các phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc 2.3. Tổng hợp một số dẫn xuất vinca alkaloid mới chứa mạch nhánh ketone α,β-không no 2.3.1. Tổng hợp anhydrovinblastine 12 2.3.2. Tổng hợp 18(S)-3’,5'-dimethoxyanilinecleavamine 77 2.3.3. Tổng hợp một số dẫn xuất vinca alkaloid mới chứa mạch nhánh ketone α,β-không no 2.4. Tổng hợp một số dẫn xuất vinca alkaloid mới từ 3’- cyanoanhydrovinblastine 88 2.4.1. Tổng hợp 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 2.4.2. Tổng hợp các dẫn xuất alkaloid mới thông qua việc khử có chọn lọc dẫn xuất 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 2.4.2.2. Tổng hợp chất 3'R-cyano-(4’S,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 83a 2.4.2.2. Tổng hợp chất 3'R-cyano-(4’R,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92b 2.4.2.3. Tổng hợp chất (3'R-aminomethyl)-(4’S,5’-dihydro)- anhydrovinblastine 92c 2.4.2.4. Tổng hợp chất 3'S-cyano-4-deacetyl-anhydrovinblastine 92d và 3'S- cyano-4-deacetyl-3-hydroxymethyl-anhydrovinblastine 92e 2.4.3. Tổng hợp một số dẫn xuất alkaloid mới thông qua việc khử alkyl hóa của aminomethyl 92c 2.5. Thử nghiệm hoạt tính sinh học của các chất nghiên cứu Hoạt tính sinh học của các hợp chất được nghiên cứu theo phương pháp gây độc tế bào của Monks (1991) trên hai dòng tế bào ung thư biểu mô KB và ung thư gan HepG2 tại phòng thử hoạt tính Sinh học, Viện Hóa học và tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phép thử độc tế bào ung thư bạch huyết cấp tính ở người HL-60, thử nghiệm apoptosis được thực hiện tại Viện Dược lý và Độc học, Đại học Würzburg, Cộng Hòa Liên Bang Đức. Phương pháp mô hình mô phỏng phân tử docking được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Hóa học tính toán và Mô phỏng, Khoa Hóa học - Trường Đại học Quy Nhơn. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tổng hợp dẫn xuất vinca alkaloid mới chứa mạch nhánh ketone α,β- không no 4
Các hợp chất ketone α,β-không no là những hợp chất được tìm thấy nhiều trong thiên nhiên như alkaloid, terpene, sesquiterpen, triterpenoid, chalcone và flavone như daphnipaxianines trong cây Daphliphyllum paxianum, myrtenal từ loài Citrus reticulata, zerumbone của Zingiber zerumbet, licorisoflavane A, quercetin, kaemferol trong cây Morus alba L. hay isoliquirigenin từ cây Glycyrrhiza glabra, curcumin từ loài Curcuma longa L. Đặc biệt, sarcodictyin (71, 72) và eleutherobin 73 được phân lập từ một số loài san hô mềm,.. ngay cả chuỗi DNA của cơ thể sống cũng được tạo thành từ các hợp chất chứa nhóm ketone α,β-không no như thymine và uracil. Nhóm ketone α,β-không no có vai trò quan trọng cả về mặt hóa học và sinh học. Về mặt hóa học, các hợp chất ketone α,β-không no là chất trung gian chìa khóa để tổng hợp nhiều chất quan trọng như flavonoid, pyrazoline, diazepine, pyrimidine,…Về mặt sinh học, các hợp chất chứa nhóm ketone α,β-không no được xác định là có nhiều hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính kháng viêm, hoạt tính chống sốt rét, hoạt tính chống ký sinh trùng, hoạt tính chống huyết áp hay loại bỏ yếu tố NF-κB gây ra nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt là hoạt tính gây độc tế bào do nhóm này được xem như là các Michael acceptor đối với nhóm thiol của một số protein hay khả năng định hướng các tế bào ung thư chết theo chương trình. Chính vì vậy, các hợp chất chứa nhóm ketone α,β- không no luôn là đối tượng nghiên cứu hấp dẫn của các nhà khoa học, một số thuốc chứa nhóm này cũng đã được sử dụng hiệu quả trong điều trị bệnh như AZT, Edoxudine, Zalcitabine, Griseofulvin và nhiều các chất khác chứa nhóm này phân lập từ thiên nhiên được sử dụng trong hỗ trợ điều trị điều trị bệnh ung thư. Hình 3.3. Hợp chất lai giữa ketone α,β-không no và vinca alkaloid Do đó, chúng tôi đã nghiên cứu và tổng hợp một loạt các vinca alkaloid mới có chứa mạch nhánh là các hợp chất ketone α,β-không no liên kết với amin bậc ba trên phần velbanamine tạo thành các muối amoni bậc bốn và xác định hoạt tính 5
chống ung thư của chúng. Tổng hợp các hợp chất vinca alkaloid đơn giản bằng cách thay thế vindoline với 3,5-dimethoxyaniline (DMA) cũng đã được nghiên cứu. Sơ đồ 3.1. Quy trình chung tổng hợp các hợp chất 76a-c. Hóa chất và điều kiện: (a) ArCHO, MeOH, nhiệt độ phòng. (b) NBS, p-TsOH, CH3CN, nhiệt độ phòng Trước tiên, tổng hợp các alkylbromide 76a-c chứa hợp phần ketone α,β- không no bắt đầu bởi phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt của arylcarboxaldehyde và acetone trong methanol ở nhiệt độ phòng. Sau đó, sản phẩm ngưng tụ được bromo hóa chọn lọc ở vị trí α-methylketone của 75a-c áp dụng dụng quy trình của nhóm tác giả Lee Jong Chan, sử dụng NBS trong sự hiện diện của axit p- toluenesulfonic ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ, thu được sản phẩm 76a-c với hiệu suất 70-73%. Sơ đồ 3.2. Tổng hợp các vinca alkaloid chìa khóa 12 và 77. Hóa chất và điều kiện: (a) (i) Vindoline (V) hoặc 3,5-dimethoxyaniline (DMA), FeCl3, glycine- NaCl 0,1M, HCl 0,1 N, (ii) NaBH4, NH4OH Các hợp chất 12, 77 được tổng hợp theo phương pháp đã được mô tả trước đây bởi Vukovic với hiệu suất tốt (76-85%). Theo đó, chúng tôi thực hiện phản ứng ghép nối giữa catharanthine và vindoline (hoặc 3,5-dimethoxyaniline) với sự có mặt của ion sắt III trong môi trường nước có tính axit, sau đó khử hóa bằng NaBH4 thu được hợp chất 12 và 77 (Sơ đồ 3.2). Trong hóa học Hữu cơ, phản ứng Menshutkin là một cách dễ dàng và hiệu quả để chuyển một amin bậc ba thành muối ammonium bậc bốn thông qua alkylhalide. Bằng phản ứng Menshutkin, 12 muối amoni bậc bốn mới thu được sau khi khuấy một đương lượng alkylbromide 76a-c ở nhiệt độ phòng trong THF với các vinca alkaloid là anhydrovinblastine 12, 18(S)-3’,5'- 6
dimethoxyanilinecleavamine 77, vinblastine 1, vincristine 2 (Sơ đồ 3.4). Các sản phẩm cuối 81a-84c thu được với hiệu suất 63-72%. Sơ đồ 3.4. Tổng hợp các vinca alkaloid mới chứa mạch nhánh ketone α,β-không no Các hợp chất được miêu tả đầy đủ bằng cách sử dụng các phổ 1D, 2D NMR và phổ khối phân giải cao HR-EI-MS. Nhìn chung, khi so sánh với phổ của hợp chất ban đầu những thay đổi quan trọng trên phổ NMR của chúng được quan sát thấy xung quanh vị trí N-6’, đặc biệt đối với vị trí 5’, 7’, 19’ và 22’, sự cộng hưởng proton và carbon trên phần vidoline thay đổi không đáng kể. Các vinca alkaloid là phân tử có cấu trúc phức tạp nên việc gán phổ NMR của các vinca alkaloid phải được tiếp cận thận trọng. Việc phân tích cấu trúc của các hợp chất thu được được chúng tôi tiếp cận theo từng phần khung cấu trúc trong phân tử, trước hết là phần khung vindoline và sau đó là phần velbanamine chứa mạch nhánh ketone α,β-không no. 7
Hình 3.4. Cấu trúc hợp chất lai vinca alkaloid – ketone α,β-không no 81a-c Cấu trúc của các vinca alkaloid bisindole như anhydrovinblastine đã được chứng minh bởi Szantay, Kutney, Webb Andrews. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 81a-c được so sánh với hợp chất ban đầu anhydrovinblastine 12. Sự cộng hưởng proton trên phần vindoline thay đổi không đáng kể. Một số pic được xác định dễ dàng trên phổ 1H NMR với độ dịch chuyển hóa học và tương tác của chúng. Những pic này sau đó được sử dụng như là điểm khởi đầu thuận tiện cho việc gán các tín hiệu tiếp theo. Các tín hiệu cộng hưởng 1H, 13C NMR trên phần vindoline của hợp chất 81b được liệt kê trong Bảng 3.1. Hình 3.5. Cấu trúc và đánh số theo IUPAC trên phần vindoline Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR trên phần vindoline của hợp chất 81b và anhydrovinblastine 12 trong CDCl3 Vị trí Hợp chất 81b Anhydrovinblastine 12 δH, J (Hz) δC δH, J (Hz) δC 1 2 3,81(s, 1H) 83,06 3,72 (s, 1H) 83,2 3 79,85 79,7 4 5,43 (s, 1H) 76,53 5,45 (s, 1H) 76,4 5 42,65 42,7 6 5,36 (d, J = 15,7, 129,7 5,30 (d, J = 15,5, 1H) 130,0 1H) 7 5,89 (dd, J = 125,20 5,86 (dd, J = 10,2/ 124,6 10,1/ 4,4, 1H) 4,5, 1H) 8
8 2,08 (d, J = 7,5, 50,02 2,82 (d, J = 16,0, 1H) 50,3 1H) 3,37 (m, 1H) 3,33 (m, 1H) 9 10 2,72 (m, 1H) 50,3 2,47 (m, 1H) 50,3 3,33 (m, 1H) 3,23 (m, 1H) 11 2,06 (m, 1H) 45,44 1,84 (m, 1H) 44,6 2,22 (m, 1H) 2,15 (m, 1H) 12 53,4 53,3 13 124,08 122,8 14 6,55 (s, 1H) 122,4 6,55 (s, 1H) 123,5 15 118,4 121,1 16 157,91 158,0 17 6,14 (s, 1H) 94,22 5,45 (s, 1H) 94,2 18 153,6 152,7 19 2,83 (s, 1H) 65,00 2,66 (s, 1H) 65,4 20 1,38 (m, 1H) 30,85 1,35 (m, 1H) 30,9 1,78 (m, 1H) 1,79 (m, 1H) 21 0,87 (t, J = 7,4, 8,54 0,80 (t, J = 7,4, 3H) 8,4 3H) C16-OCH3 3,87 (s, 3H) 55,8 3,82 (s, 3H) 55,9 N-CH3 2,76 (s, 3H) 38,04 2,72 (s, 3H) 38,3 C3-COOCH3 171,1 170,9 C3-COOCH3 3,81(s, 3H) 52,21 3,80 (s, 3H) 52,2 C4-OCOCH3 171,6 171,6 C4-OCOCH3 2,13(s, 3H) 21,20 2,10 (s, 3H) 21,1 Trên phần vindoline, dựa trên sự so sánh với dữ liệu phổ anhydrovinblastine 12, dễ dàng định vị các tín hiệu proton của nhóm methyl N- CH3, C16-OCH3, H-21, C3-COOCH3 và C4-OCOCH3 ở 2,76 (s, 3H), 3,87 (s, 3H), 0,87 (t, J = 7,4 Hz , 3H), 3,81(s, 3H) và 2,13 (s, 3H). Tín hiệu doublet và double doublet của proton H-6 và H-7 ở 5,36 (d, J = 15,7 Hz, 1H) và 5,89 (dd, J = 10,1/ 4,4 Hz, 1H), trên phổ COSY cả proton H-6 và H-7 đều tương tác với hai proton H-8. Hai tín hiệu singlet cộng hưởng ở 6,55 (s, 1H) và 6,14 (s, 1H) được gán cho proton nhân thơm H-14 và H-17. Trên phổ COSY, hai tín hiệu cộng hưởng tại 1,78 (m, 1H, H-20b) và 1,38 (m, 1H, H-20a) tương tác với nhau và tương tác với proton H-21. Phổ HMBC xuất hiện các tương tác của proton ở 3,81 (s, 1H, H-2) với các nguyên tử carbon ở 38,1 (N-CH3), 45,5 (C-11), 53,5 (C-12), 76,5 (C-4) và 79,9 (C-3). Tín hiệu singlet ở 5,43 (s, 1H) được gán cho proton H-4 do proton này cạnh nhóm –OCOCH3 nên chuyển dịch về phía trường thấp. Trên phổ HMBC, proton H-4 tương tác với các nguyên tử carbon ở 30,9 (C-20), 42,7 (C-5), 129,7 (C-6) và 171,1 (C3-COOCH3). Tín hiệu singlet 9
cộng hưởng ở 2,83 (s, 1H) được gán cho proton H-19, trên phổ HMBC thì H-19 tương tác với các nguyên tử carbon 30,9 (C-20), 50,1 (C-10), 53,5 (C-12), 76,5 (C-4) và 83,1 (C-2). Trên phổ COSY, các proton H-10 tương tác với H-11. Hình 3.6. Cấu trúc và đánh số theo IUPAC trên phần velbanamine Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR trên phần velbanamine của hợp chất 81b và anhydrovinblastine 12 trong CDCl3 Vị trí Hợp chất 81b Anhydrovinblastine 12 δH, J (Hz) δC δH, J (Hz) δC 1’ 2,63 (m, 1H) 33,85 2,40 (m, 1H) 34,3 3,12 (m, 1H) 3,04 (m, 1H) 2’ 2,02 (m, 1H) 30,68 1,30 (m, 1H) 32,9 3’ 5,60 (s br, 1H) 121,8 5,45 (s, 1H) 123,5 4’ 132,87 140,0 5’ 4,45 (m, 1H) 64,35 3,28 (m, 1H) 52,1 4,56 (m, 1H) 3,52 (d, J = 16,0, 1H) 7’ 4,45 (m, 1H) 53,40 3,4 (m, 1H) 54,3 4,47 (m, 1H) 3,4 (m, 1H) 8’ 3,30 (m, 1H) 19,93 3,05 (m, 1H) 25,9 3,87 (m, 1H) 3,41 (m, 1H) 9’ 107,66 117,3 10’ 129,1 129,4 11’ 7,57 (d, J = 8,1, 1H) 117,44 7,51 (d, J = 7,7, 1H) 118,3 12’ 7,16 – 7,26 (m, 1H) 120,6 7,20 – 7,10 (m, 1H) 122,2 13’ 7,16 – 7,26 (m, 1H) 123,6 7,20 – 7,10 (m, 1H) 118,3 14’ 7,16 – 7,26 (m, 1H) 111,27 7,20 – 7,10 (m, 1H) 110,5 15’ 134,75 135,0 N-H 8,36 (s, 1H) 8,04 (s, 1H) 17’ 132,8 131,0 18’ 54,6 55,5 19’ 4,11 (m, 1H) 63,09 2,55 (br d, J = 14,0, 1H) 45,9 4,53 (m, 1H) 3,31 (m, 1H) 20’ 2,04 (m, 2H) 27,26 1,92 (dd, J = 14,5/7,5, 27,8 1H) 21’ 1,07 (t, J = 7,4, 3H) 11,50 0,98 (t, J = 7,5, 3H) 12,2 22’ 3,68 (s, 1H) 70,5 23’ 191,18 24’ 6,90 (d, J = 16,5, 1H) 123,90 25’ 8,25 (d, J = 16,5, 1H) 147,27 10
26’ 132,1 27’, 31’ 7,66 (d, J = 8,4, 2H) 130,6 28’, 30’ 7,40 (d, J = 8,5, 2H) 129,4 29’ 137,9 C18’-COOCH3 173,09 174,6 C18’-COOCH3 3,68 (s, 3H) 52,83 3,62 (s, 3H) 53,3 Trên phần velbanamine, tín hiệu N-H và H-3’ có thể được định vị dễ dàng ở 8,36 (s, 1H) và 5,60 (s br, 1H). Sử dụng H-3’ làm điểm bắt đầu, có thể xác định các proton H-1’, H-2’ và H-19’ dựa trên phổ COSY. Ba tín hiệu cộng hưởng proton methyl H-21’, C18’-COOCH3 ở 1,07 (t, J = 7,4 Hz, 3H) và 3,68 (m, 3H) không có sự thay đổi nhiều so với trong anhydrovinblastine 12. Trên phổ COSY, các proton methylene H-20’ cộng hưởng ở 2,02 ppm tương tác với proton H-21’ và tương tác allylic với proton H-3’ ở 5,60 ppm. Sự chuyển dịch hóa học của proton methylene H-20’ hoàn toàn phù hợp với tính chất allylic của nó. Hai tín hiệu cộng hưởng ở 4,45 và 4,56 ppm được gán cho proton H-5’ do hai proton này có tương tác yếu với hai proton H-20’. Các proton còn lại trên phần velbanamine là H-7’, H-8’ và proton thơm của nhân indole. Trên phổ COSY, hai proton H-7’ tương tác yếu với proton H-5’ và tương tác với hai proton H-8’. Độ chuyển dịch hóa học hai proton H-8’ ở 3,30 ppm và 3,87 ppm không khác nhiều so với trong anhydrovinblasstine 12, trong khi đó, độ chuyển dịch hóa học của hai proton H-7’ trong hợp chất 81b ở 4,45 và 4,56 ppm khác nhiều so với hai proton H-7’ trong anhydrovinblastine 12 ở 3,61 và 3,44 ppm, điều này có thể do ảnh hưởng của nhóm thế tại vị trí N-6’. Các proton thơm trên nhân indole từ H-11’ đến H-14’ có thể dễ dàng xác định dựa trên phổ COSY, HSQC và HMBC, bắt đầu từ H-11’ ở 7,57 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-11’) và ở 7,16 – 7,26 (m, 3H, H-12’, H-13’, H-14’). Như vậy, về cơ bản chúng tôi đã hoàn thành việc gán phổ proton trên hai phần khung vindoline và velbanamine. Dễ thấy, khi so sánh với hợp chất ban đầu các tín hiệu cộng hưởng proton và carbon-13 trên phần khung vindoline thay đổi không đáng kể, sự thay đổi quan trọng trên phổ NMR của 81b được quan sát thấy xung quanh vị trí N-6’, đặc biệt đối với vị trí 5’, 7’, 19’ và 22’ (xem Bảng 3.2). Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 81b, vùng trường thấp xuất hiện 4 tín hiệu cộng hưởng tại 7,66 (d, J = 8,4 Hz, 2H-H-27’, H-31’) và 7,40 (d, J = 8,5 Hz, 2H-H-28’, H-30’) đặc trưng cho nhân thơm đã được thế ở vị trí para. Hai tín hiệu doublet ở 8,25 ppm và 6,9 ppm có cùng hằng số tách J = 16,5 Hz đặc trưng cho proton olefin cạnh nhóm carbonyl H- 25’ và H-24’. Phổ khối phân giải cao HR-EI-MS của hợp chất 81b cho pic ion giả phân tử M+ có m/z 971,4366 (tính toán cho công thức M+ C56H64ClN4O9, 971,4356) xác nhận một nhóm thế alkylbromide 76b đã đính vào 11
anhydrovinblastine 12. Như vậy, nhóm thế alkylbromide 76b đã đính trên phần khung velbanamine của anhydrovinblastine 12. Cấu hình ở trung tâm bậc bốn N-6’ là yếu tố quyết định sự định hướng của các ketone α,β-không no, chính nó là cơ sở cho sự tương tác của hợp chất này với tubulin. Theo cấu trúc tia X của vinblastine, cặp electron không phân chia ở nguyên tử nitơ được định hướng sao cho cấu hình tuyệt đối của nhóm amino bậc ba là S. Do đó, cấu hình tuyệt đối ở N-6’ cho hợp chất 81b là cấu hình S. Bằng cách tiếp cận tương tự, dựa trên các dữ liệu phổ 1D, 2D NMR và phổ khối phân giải cao HR-EI-MS chúng tôi đã chứng minh được cấu trúc của các hợp chất còn lại 81a, 81c-d, 83a-84d. Tiếp theo là ví dụ về phân tích cấu trúc các hợp chất vinca alkaloid lược giản bằng cách thay thế vindoline với 3,5-dimethoxyanilin (DMA). Hình 3.10. Cấu trúc hợp chất 82b và cách đánh số theo IUPAC Phổ khối HR-EI-MS cho pic ion phân tử M+ có m/z 668,2866 ứng với công thức theo lý thuyết C39H43ClN3O5+ xác nhận một nhóm alkylbromide 76b gắn vào 18(S)-3’,5'-dimethoxyanilinecleavamine 77. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 82b xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hưởng của proton có mặt trên phân tử. Vùng trường thấp, 4 tín hiệu cộng hưởng tại 7,62 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-27’, H-31’) và 7,38 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-28’, H-30’) đặc trưng cho nhân thơm đã được thế ở vị trí para. Hai tín hiệu doublet ở 8,03 ppm và 6,88 ppm có cùng hằng số tách J = 16,2 Hz đặc trưng cho proton olefin H-25’ và H-24’. Tín hiệu proton nhân indole cộng hưởng tại 7,44 (m, 1H, H-11’), 7,25 (m, 2H, H- 13’, H-14’), 7,07 (t, J = 7,3 Hz, H-12’) và 8,40 (s, N-H). Trên nhân aniline, tín hiệu singlet cộng hưởng của 6 proton tương đương của 2 nhóm methoxi -OCH3 tại 3,76 ppm và hai tín hiệu proton H-2 và H-6 cộng hưởng tại 5,96 ppm và 6,00 ppm. Trên phổ 13C NMR và DEPT của hợp chất 82b, cho thấy rõ tín hiệu carbon của nhóm carbonyl ở 191,03 (C-23’) và 172,76 (C18’-COOCH3). Trên phổ 1H NMR và HSQC xác nhận tín hiệu proton không tương tác với carbon ở 5,29 (s, 2H) đó là tín hiệu proton –NH2 trên nhân aniline. 12
Bảng 3.3. So sánh phổ 1H NMR (CDCl3) của hợp chất 82b và 18(S)-3’,5'- dimethoxyanilinecleavamine 77 Vị trí Hợp chất 82b 18(S)-3’,5'-dimethoxyanilinecleavamine 77 5’ 4,45 (m, 1H) 3,30 (m, 1H) 6,11 (m, 1H) 3,40 (m, 1H) 7’ 4,26 (m, 1H) 3,00 (dd, J = 13,6Hz/ 4,6Hz, 1H) 4,40 (m, 1H) 3,15 (m, 1H) 19’ 4,18 (d, J = 15,9 Hz, 1H) 2,50 (d, J = 12,8Hz, 1H) 4,65 (d, J = 15,9 Hz, 1H) 3,54 (m, 1H) 22’ 3,64 (s, 2H) - 2 5,96 (s, 1H) 6 6,00 (s, 1H) 5,88 (s, 2H) 7,8 3,76 (s, 6H) 3,72 (s, 6H) NH2 5,29 (s, 2H) - Dữ liệu phổ của hợp chất 82b được so sánh với hợp chất ban đầu 18(S)- 3’,5'-dimethoxyanilinecleavamine 77 (xem Bảng 3.3). Dễ thấy, các tín hiệu cộng hưởng proton và carbon-13 trên phần khung velbanamine xung quanh vị trí N-6’ thay đổi so với hợp chất ban đầu, đặc biệt đối với vị trí 5’, 7’, 19’ và 22’. Từ những dữ liệu trên cho thấy nhóm thế ketone α,β-không no đã được gắn vào 18(S)-3’,5'-dimethoxyanilinecleavamine 77 tại vị trí N-6’ trên phần khung velbanamine. Cấu hình ở trung tâm bậc bốn N-6’ là yếu tố quyết định sự định hướng của các ketone α,β-không no, chính nó là cơ sở cho sự tương tác của hợp chất này với tubulin. Theo cấu trúc tia X của vinblastine [142], cặp electron không phân chia ở nguyên tử nitơ được định hướng sao cho cấu hình tuyệt đối của nhóm amino bậc ba là S. Do đó, cấu hình tuyệt đối ở N-6’ cho hợp chất 82b là cấu hình S. Tương tự như vậy, cấu trúc của hợp chất 82a, 82c cũng được chứng minh bằng các phương pháp phổ 1D, 2D NMR và phổ khối phân giải cao HR-EI-MS. Như vậy, chúng tôi đã tổng hợp được 12 muối amoni bậc bốn mới đi từ các vinca alkaloid là anhydrovinblastine 12, 18(S)-3’,5'-dimethoxyanilinecleavamine 77, vinblastine 1, vincristine 2 (Sơ đồ 3.4). Các sản phẩm thu được 81a-84c thu được với hiệu suất 62-72%. Ưu điểm của phương pháp này ở chỗ, phản ứng xảy ra dễ dàng, hiệu suất tốt. Sản phẩm tạo ra bền hơn so với chất ban đầu, do trung tâm phản ứng là nguyên tử nitơ trên amin bậc ba đã bị alkyl hóa. Đặc biệt, phản ứng xảy ra rất chọn lọc tại vị trí N-6’ trên phần khung velbanamine điều này được lý 13
giải do cấu tạo chữ T của cấu trúc vinca alkaloid che chắn vị trí N-9 trên phần vindoline và tính linh động của cặp electron trên amin bậc ba so với amin bậc một trên nhân aniline. 3.2. Tổng hợp các dẫn xuất vinca alkaloid mới từ 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 3.2.1. Tổng hợp các dẫn xuất vinca alkaloid mới thông qua việc khử chọn lọc 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 Hình 3.14. Hợp chất 85, 86 và 87 Langlois và Potier đã lần đầu tiên tổng hợp các dẫn xuất nitril vinca alkaloid (85, 86 và 87) thu được một hỗn hợp với hiệu suất thấp (
ghép nối giữa catharanthine và vindoline với sự có mặt của ion sắt III trong môi trường nước có tính axit, với tác nhân nitril là KCN trong NH4OH thu được hợp chất 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 (Sơ đồ 3.5). Sơ đồ 3.5. Tổng hợp 3’-cyanoanhydrovinblastine 88. Hóa chất và điều kiện: FeCl3.6H2O, glycine – NaCl 0,1M, HCl 0,1N, sau đó KCN/NH4OH Hợp chất 88 được khẳng định cấu trúc bằng các phổ IR, NMR và MS, cấu hình tuyệt đối được xác định dựa vào phổ NOESY. Trên phổ HR-ESI-MS của 88 cho pic ion giả phân tử [M+H]+ có m/z = 818,4124 ứng với hợp chất có công thức C47H55N5O8 với số khối chính xác [M+H]+ (m/z) theo lý thuyết là 818,4051. Trên phổ IR của hợp chất 88, xuất hiện vân phổ đặc trưng cho nhóm nitril ở 2230 cm-1 và một vân mạnh đặc trưng cho một enamin ở 1650 cm-1. Trên phổ 1H NMR, trong vùng trường thấp xuất hiện tín hiệu cộng hưởng proton singlet ở 5,92 ppm đặc trưng cho proton vinylic ở vị trí 5’, do proton này gần nguyên tử nitơ nên chuyển dịch về phía trường thấp, điều này để phân biệt với với proton H-3’ khi nhóm nitrile thế ở vị trí 5’. Như vậy, từ những phân tích ở trên, kết hợp với so sánh độ dịch chuyển hóa học và các hằng số tương tác của hợp chất này đã được Potier công bố trong tài liệu [90], hợp chất 88 được xác định là 3’-cyanoanhydrovinblastine. Vukovic và đồng nghiệp trước đây đã phát triển một phương pháp để ghép nối catharanthine 6 và vindoline 7 trong môi trường nước có tính axit. Họ đã chứng minh và xác định cấu hình C18’S bằng cơ chế phản ứng [78]. Bước đầu tiên, sắt xúc tác oxi hóa của amin bậc ba trên catharanthine tạo ra cation đặc biệt 14, tiếp theo là sự tấn công của vindoline theo cơ chế SN2 để tạo ra ion iminium 15, cuối cùng là sự cộng hợp của tác nhân cyano hóa. Việc bổ sung cyanide kim loại kiềm như KCN, trong trường hợp này chỉ dẫn đến phản ứng cộng 1,4. Việc chọn lọc của phản ứng cộng ion iminium không bão hòa α, β 15 thường do tính “cứng”, “mềm” của tác nhân nucleophil, với nucleophil mềm như CN- thích hợp cho cộng 1,4 [151-152]. Tiến hành phản ứng ở nhiệt độ cao dưới điều kiện bazơ 15
cũng thích hợp cho cộng 1,4. Đáng chú ý là hợp chất 88 tương đối bền, có thể kết tinh ở dạng tinh thể. Langlois và Potier đã không xác định cấu hình của carbon C-3’ mang nhóm nitril trong hợp chất 88. Mặc dù, cấu trúc lập thể C-3’ trong hợp chất 86 được công bố là R bằng phân tích tia X đơn tinh thể [82, 143]. Dữ liệu phổ X-ray của vinblastine, chỉ rõ cấu hình tuyệt đối ở C-2’ là R [142]. Trên phổ NOESY của hợp chất 88, xuất hiện tương tác của proton tại vị trí C-3’ với proton tại vị trí C-2’. Như vậy, cấu hình tuyệt đối tại vị trí C-3’ của hợp chất 88 là cấu hình S. Chúng tôi đã tổng hợp các nitril mới có chứa vinca alkaloid từ 3’- cyanoanhydrovinblastine 88, sử dụng các phản ứng khử khác nhau (Sơ đồ 3.8, Bảng 3.4) cho phép tổng hợp các dẫn xuất mới có hoạt tính sinh học thú vị. Sơ đồ 3.8. Các dẫn xuất vinca alkaloid mới 92a-e thông qua sự khử chọn lọc 88 Bảng 3.4. Phản ứng khử 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 ST Chất khử Xúc tác Dung môi Nhiệt độ Thời gian Tỉ lệ sản phẩm Hiệu suất ο T ( C) (giờ) 92a, 92b, 92c, 92d, 92e (%) a 1 HCOOH-NEt3 Pd/C THF 40 12 100:0:0:0:0 98(92a) 2b NaBH3CN Ni2B MeOH 40 12 10:90:0:0:0 72(92b) 3c NaBH4 CoCl2 EtOH 40 5 10:0:80:10:0 65(92c) 4c NaBH4 Ni2B EtOH 40 5 5:0:5:40:50 - c 5 NaBH4 Co2B EtOH 40 5 5:0:5:40:50 - c 6 NaBH4 NiCl2 EtOH 40 5 10:0:40:50:0 - 7d LiAlH4 - THF 0 οC-RT 3 0:0:0:50:50 37(92d/92e) a nitril (0,05 mmol), Pd/C (10 mol%), THF (0,2 mL) và HCOOH-NEt3 (0,2 mL, 18,5 : 1), 40 οC. b nitril (0,05 mmol), NaBH3CN (20 đương lượng), Ni2B (2 đương lượng) trong MeOH, 40 οC. c nitril (0,06 mmol), NaBH4 (20 đương lượng), xúc tác (2 đương lượng) trong EtOH, 40 οC. d nitril (0,06 mmol), LiAlH4 (3 đương lượng) trong THF ở 0 οC - RT. Ban đầu, hợp chất 88 được khử bằng khí H2 với xúc tác Pd/C, chúng tôi không quan sát được bất kỳ sự hình thành sản phẩm nào thu được. Tuy nhiên, 16
khi sử dụng Pd/C (10%) với HCOOH-NEt3 là nguồn cung cấp hydro ở điều kiện đã tối ưu trước đó [154], phản ứng hydro hóa đã khử chọn lọc nitril thơm thành các amin bậc một tương ứng và khác với trường hợp hydro hóa các dẫn xuất acrylonitril thường tạo ra một hỗn hợp các sản phẩm [154]. Trong trường hợp này, mặc dù không phát hiện sự hình thành sản phẩm amin, chúng tôi thu được một sản phẩm khử chọn lọc duy nhất ở vị trí C-4’ 92a với hiệu suất rất tốt (98%). Cấu trúc của hợp chất 92a được chứng minh bằng các phương pháp phổ IR, NMR và phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS. Cấu hình tuyệt đối tại vị trí C-4’ được xác minh trên phổ tương tác xa NOESY. Phổ IR của 92a cho thấy sự biến mất của vân hấp thụ ở 1650 cm-1 của enamin, trong khi giải hấp thụ của cyano ở 2229 cm-1 vẫn còn hiện diện. Phổ 1H NMR của hợp chất 92a cũng chỉ ra sự vắng mặt của proton H-5’ ở 5,92 ppm. Trên phổ HR-ESI-MS của hợp chất 92a cho pic ion giả phân tử có m/z = 820,42383 ứng với hợp chất có công thức C47H58N5O8 với số khối chính xác [M+H]+ (m/z) theo lý thuyết là 820,42854. Sự kết hợp các số liệu phổ HR-ESI-MS , 1H NMR, 13C NMR và 2D NMR cho thấy sự hydro hóa của liên kết đôi ở vị trí C-4’. Ngoài ra, sự tương tác NOESY giữa H-4’ và H-3’ xác nhận cấu hình tuyệt đối S của C-4’ trong 92a Tiếp theo chúng tôi nghiên cứu việc khử xúc tác bằng cách sử dụng các nguồn hydrid bao gồm NaBH4, NaBH3CN và LiAlH4 trong sự có mặt của cobalt (II) và nikel (II) halogenua hoặc các boride tương ứng để khử một cách có chọn lọc nitril, ester và nhóm chức olefin. Các nhóm chức này hầu như không tham gia phản ứng khử nếu không có mặt xúc tác. Đầu tiên, với tác nhân khử LiAlH4, không có dấu vết của sự khử nitril thay vào đó chúng tôi thu được đồng thời hai sản phẩm với tỉ lệ (50 : 50), bằng cách sử dụng phổ khối MS và sự biến mất của nhóm methoxycarbonyl CH3OCO- và nhóm acetate CH3COO- tại vị trí C-3, C-4 trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân chúng tôi xác định được sản phẩm 4-deacetyl 92d và sản phẩm deacetyl tại C-4 và khử este tại vị trí C-3 92e. Các dẫn xuất khử tương tự cũng từng thu được khi vincristine được xử lý với NaBH4. Trong trường hợp sử dụng hệ NaBH3CN/Ni2B, sự khử không dẫn đến sản phẩm methylamino mà là các sản phẩm hydro hóa liên kết đôi tại vị trí C4’-C5’ 92a và 92b (10:90). Trên phổ IR của hợp chất 92b chúng tôi vẫn quan sát thấy có vân đặc trưng của nhóm nitril ở 2228 cm-1. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 92b, xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hưởng từ của các proton trên khung cấu trúc của phân tử. Trong vùng trường thấp, dễ thấy tín hiệu cộng hưởng proton singlet ở 5,92 ppm đặc trưng cho tín hiệu proton vinylic tại vị trí 5' của hợp chất 88 đã bị mất. Sự kết hợp các số liệu phổ HR-ESI-MS , 1D NMR và 2D NMR 17