Tóm tắt Luận án tiến sĩ Kỹ thuật: Nghiên cứu thành phần loài sán lá song chủ (Digenea) ký sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) nuôi tại Khánh Hòa

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

70
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xác định được thành phần giống loài sán lá song chủ (Digenea) ký sinh trên cá chẽm (Lates calcarifer), đánh giá mối quan hệ di truyền của các KST này cùng mức độ nhiễm của KST ở cá chẽm nuôi và khả năng gây bệnh của các các loài sán song chủ đã phát hiện được. Từ đó đánh giá khả năng gây bệnh của các loài sán lá song chủ ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Kỹ thuật: Nghiên cứu thành phần loài sán lá song chủ (Digenea) ký sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) nuôi tại Khánh Hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ------------oo0oo----------- NGUYỄN NGUYỄN THÀNH NHƠN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI SÁN LÁ SONG CHỦ (DIGENEA) KÝ SINH Ở CÁ CHẼM (LATES CALCARIFER BLOCH, 1790) NUÔI TẠI KHÁNH HÕA Ngành đào tạo: Nuôi trồng thủy sản Mã số: 62620301 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Khánh Hòa – 2017
Công trình đƣợc hoàn thành tại Trƣờng Đại học Nha Trang Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Đỗ Thị Hòa 2. PGS.TS. Glenn Allan Bristow Phản biện 1: PGS.TS. Vũ Ngọc Öt Phản biện 2: TS. Nguyễn Thị Thanh Thủy Phản biện 3: TS. Nguyễn Hữu Thịnh Luận án đƣợc bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án cấp cơ sở họp tại Trƣờng Đại học Nha Trang vào hồi 14 giờ ngày 20 tháng 12 năm 2016. Có thể tìm hiểu luận án tại: Thƣ viện Quốc gia Thƣ viện Trƣờng Đại học Nha Trang
TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm nuôi bằng sự kết hợp giữa hai phương pháp: hình thái học và kỹ thuật sinh học phân tử. Kết quả đã phát hiện được 6 loài sán lá song chủ thuộc 5 giống, 5 họ ký sinh ở cá chẽm nuôi thương phẩm tại tỉnh Khánh Hòa, Việt Nam. Đặc biệt nghiên cứu này đã xác định được loài sán Pseudometadena celebesensis là ký sinh trùng đặc hữu trên vật chủ là cá chẽm; 2. Luận án đã đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các loài sán lá song chủ nội ký sinh trong cơ thể cá chẽm nuôi; 3. Lần đầu tiên tiến hành khảo sát vòng đời phát triển của 1 loài sán lá song chủ Pseudometadena celebesensis có giai đoạn trưởng thành ký sinh ở ruột của cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa. Ngƣời hƣớng dẫn Nghiên cứu sinh (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) PGS. TS. Đỗ Thị Hòa Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn, Võ Thế Dũng, Võ Thị Dung, Glenn Allan Bristow, Đỗ Thị Hòa (2010), Thành phần ký sinh trùng trên cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) nuôi ở Khánh Hòa. Tạp Chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Số 6/2010, trang 59-63.ISSN: 0866-7020. 2. Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn, Đỗ Thị Hòa, Glenn Allan Bristow, Phạm Thị Hạnh (2017), “Thành phần và mức độ nhiễm sán lá song chủ trên cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi tại Khánh Hòa”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 6/2017, tr. 90-94. 3. Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn, Đỗ Thị Hòa, Đặng Thúy Bình, Phạm Thị Hạnh, Trương Thị Oanh (2017), “Nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài của sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) nuôi tại Khánh Hòa”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản, Trường Đại học Nha Trang, 2/2017, tr. 63-70.
MỞ ĐẦU Cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) là đối tượng nuôi có giá trị kinh tế ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc châu Á và Thái Bình Dương. Từ năm 2005, nghề nuôi cá chẽm mới phát triển nhanh chóng ở một số tỉnh ven biển nước ta như Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa, Vũng Tàu. Hiện nay, cá chẽm được nuôi thương phẩm trong ao hoặc nuôi lồng trên biển. Tuy nhiên, trong những năm qua nghề nuôi cá chẽm thường xuyên gặp khó khăn do dịch bệnh. Ký sinh trùng (KST) là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm, gây tổn thất nhiều. Trong đó, sán lá song chủ ( Digenea) gây ra các bệnh trên cá là c á c KST có chu kỳ phát triển phức tạp, qua nhiều giai đoạn ấu trùng, đòi hỏi có từ 1-2 ký chủ trung gian trong vòng đời, giai đoạn trưởng thành ký sinh trùng này thường ký sinh trong các nội quan của cá như: máu, gan, mật, ruột, dạ dày…. , làm chậm sự tăng trưởng, ảnh hưởng đến chất lượng cũng như sản lượng cá nuôi. Hiện nay trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu định danh phân loại đến giống loài của tác nhân gây bệnh ở cá (gồm vi khuẩn và KST) bằng phương pháp truyền thống kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử, nhằm phân loại chính xác đến loài của các ký sinh trùng này và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài. Tuy nhiên, dùng kỹ thuật sinh học phân tử để phân loại đến giống loài của tác nhân gây bệnh như KST ở cá là lĩnh vực còn mới ở Việt Nam. Xuất phát từ thực tế như trên, tôi đã được cở sở đào tạo cho phép thực hiện đề tài nghiên cứu luận án “Nghiên cứu thành phần loài sán lá song chủ (Digenea) ký sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) nuôi tại Khánh Hòa”. 1
Mục tiêu: Xác định được thành phần giống loài sán lá song chủ (Digenea) ký sinh trên cá chẽm (Lates calcarifer), đánh giá mối quan hệ di truyền của các KST này cùng mức độ nhiễm của KST ở cá chẽm nuôi và khả năng gây bệnh của các các loài sán song chủ đã phát hiện được. Từ đó đánh giá khả năng gây bệnh của các loài sán lá song chủ ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa. Nội dung nghiên cứu: 1. Xác định thành phần sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa. 2. Phân loại và xác định mối quan hệ di truyền các loài sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa bằng kỹ thuật sinh học phân tử. 3. Xác định mức độ nhiễm sán lá song chủ trên cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa; 4. Khảo sát sự phát triển các giai đoạn ấu trùng của loài sán Pseudometadena celebesensis ký sinh ở cá chẽm. Ý nghĩa của luận án - Ý nghĩa khoa học: Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần giống loài, mức độ nhiễm và mối quan hệ di truyền của các loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi thương phẩm tại Khánh Hòa và làm cơ sở cho việc phát triển, mở rộng nghiên cứu trên các loài ký sinh trùng khác. - Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của đề tài này làm cơ sở để đưa ra biện pháp phòng bệnh do sán lá song chủ gây ra trong nghề nuôi cá chẽm. 2
Điểm mới của luận án: - Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần loài sán lá song chủ ở cá chẽm bằng phương pháp hình thái cấu tạo kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử, kết quả đã phát hiện được 6 loài sán lá song chủ thuộc 5 giống, 5 họ ký sinh ở cá chẽm nuôi thương phẩm. Ngoài ra đã xác định được loài sán Pseudometadena celebesensis là ký sinh trùng đặc hữu trên vật chủ là cá chẽm bằng kết hợp phân tích đồng tiến hóa và các công trình nghiên cứu loài sán này. - Luận án đã đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các loài sán lá song chủ nội ký sinh trong cơ thể cá chẽm nuôi. - Lần đầu tiên tiến hành khảo sát vòng đời phát triển của loài sán lá song chủ Pseudometadena celebesensis có giai đoạn trưởng thành ký sinh ở ruột của cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa. 3
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm (Lates calcarifer) Cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) thuộc phân họ cá chẽm (Latinae) của họ Centropomidae, thuộc bộ cá vược. Cá chẽm phân bố rộng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc tây Thái Bình Dương và Ấn Độ Dương. Cá chẽm là loài có kích thước lớn, khối lượng tối đa có thể đạt 60 kg. Cá tăng trưởng chậm ở giai đoạn đầu, khi đạt 20 – 30g tốc độ tăng trưởng nhanh hơn và chậm lại khi cá đạt khoảng 4 kg. Cá chẽm là loài chuyển đổi giới tính, lúc nhỏ là cá đực, lớn chuyển sang cái. 1.2. Tình hình nuôi cá chẽm (Lates calcarifer) thƣơng phẩm trên Thế giới và Việt Nam Cá chẽm được nuôi phổ biến ở nhiều nước thuộc khu vực Châu Á – Thái Bình Dương, đặc biệt ở các nước trong khu vực Đông Nam Á như Thái Lan, Phillipine, Đài Loan, Singapore, Malaysia. Theo FAO thì đến năm 2009, sản lượng cá chẽm của thế giới đạt 49.299 tấn với đạt giá trị gần 180 triệu USD, trong đó Thái Lan chiếm tới 36% tổng sản lượng, Đài Loan, Malaysia, Indonesia và Úc lần lượt giữ các vị trí tiếp theo. Nghề nuôi cá chẽm ở Việt Nam phát triển mạnh từ năm 2005 và được nuôi trong ao và nuôi lồng b , trong đó hình thức nuôi trong ao phổ biến hơn. Thức ăn sử dụng nuôi cá chẽm thương phẩm hiện này chủ yếu vẫn là cá tạp, do đó dễ gây ô nhiễm môi trường và là điều kiện để cá chẽm dễ bị nhiễm các loài giun sán có vòng đời phức tạp như sán lá song chủ (Digenea). 4
1.3. Nghiên cứu ký sinh trùng ở cá chẽm Lates calcarifer nuôi Luận án đã sơ lược tình hình nghiên cứu và thành KST ở cá chẽm trên thế giới từ châu Âu, châu Mỹ đến châu Á như nghiên cứu của Velasquez (1962, 1975); Leong & Wong (1986, 1987, 1990); Liang & Leong (1991); Marty et al., (2001); Anlan & Robir (2005)... Ở Việt Nam, những nghiên cứu về KST trên cá biển nói chung và cá chẽm nói riêng còn hạn chế. Một số nghiên cứu KST trên chẽm như Đỗ Thị Hòa và cs (2008); Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn và cs (2010, 2015); Võ Thế Dũng và cs (2012). Luận án cũng sơ lược tình hình nghiên cứu sán lá song chủ trên cá biển trên Thế giới và Việt Nam: Ở Châu Âu và Châu Mỹ Một số công trình tiêu biểu gồm Möller & Anders (1986), Gibson & Bray (1979); Paradiznik et al. (2007); Hollis & Manter (1957); Hisao (1962); Dyer et al. (1986); Nahhas & Carlson (1994); Bullard & Overstreet (2006); Braicovich et al. (2009). Ở Châu Đại Dƣơng Một số công trình nghiên cứu sán lá song chủ đã được công bố, trong đó nổi bật có nhiều công trình về sán lá song chủ nhất là 2 nhà khoa học Bray và Cribb, ví dụ như Cribb et al. (1992, 2002); Bray et al. (1979, 1990, 1991, 1993, 1994); Bray & Palm (2009). Ở Châu Á Tại khu vực châu Á, Yamaguti là nhà khoa học đã công bố nhiều công trình nghiên cứu về sán lá song chủ ký sinh ở các loài cá biển bao gồm cả các bài báo và sách, trong đó phải kể đến công trình như Yamaguti (1941, 1971). Một số nghiên cứu của các tác giả khác có thể kể đên là Valasquez (1962, 1975); Madhavi (1982); Salam et al. 5
(1990); Nahhas & Sey (2002); Nahhas & Calson (1994); Shih et al. (2004); Chai et al. (1984); Chai & Lee (2002); Chai et al. (2005). Việt Nam Nguyễn Thị Muội & Đỗ Thị Hòa (2004) đã công bố về kết quả nghiên cứu KST ký sinh trên một số loài cá có giá trị kinh tế khai thác được trên vùng biển Phú Khánh (nay là Khánh Hòa) trong thời gian từ 1978- 1980, trong đó phát hiện 29 loài sán lá song chủ. Arthur và Bùi Quang Tề (2006) đã phát hiện và công bố 453 loài KST trên cá nước ngọt, lợ và mặn, trong đó có 112 loài sán lá song chủ. Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn & cs (2010) đã phát hiện 4 loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi. Võ Thế Dũng và cs (2010, 2012) đã công bố 6 loài sán lá song chủ, 2 loại ấu trùng metacercaria trên các loài cá mú thuộc giống Epinephelus và 2 loài sán lá song chủ trên cá chẽm (Lates calcarifer). 1.4. Ứng dụng sinh học phân tử trong phân loại sán lá song chủ ký sinh Luận án đã giới thiệu về khái niệm hệ thống học phân tử và hệ thống học truyền thống, về các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu di truyền của gen nhân và gen ti thể, về ứng dụng các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu về sán lá song chủ ký sinh ở cá như: Nghiên cứu phát sinh loài của sán lá song chủ ở cá có thể kể đến nghiên cứu của Riutort et al. (1993); Blair et al. (1996); Ethes, (1984, 1985, 1986); Rohde et al. (1993,1994); Baverstock et al. (1991); Blair et al. (1993); Nelles et al. (1984); Brook et al. (1989); Gibson (1987); Pearson (1992); Blair et al. (1996); Carranza et al. (1997); Fernandez et al. (1998); Littlewood et al. (1999); Olson et al. (2003); Choudhury et al. (2007)... 6
Nghiên cứu về phân loại sán lá song chủ như Adlard et al. (1993); Miller & Cribb (2008); Miller et al. (2010); Hunter et al. (2010). Ngoài ra luận án cũng đã tổng quan những công trình nghiên cứu về vòng đời sán lá song chủ trên cá biển, ví dụ như Koei (1977, 1986, 1990, 1992); Blair et al. (1996); Cribb et al. (1998); Anderson (1999); Bartoli et al. (2000); Pina et al. (2009); Ana et al. (2012). CHƢƠNG II. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu: Sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi ở Khánh Hòa 2.1.2. Thời gian nghiên cứu: 2009-2014. Thời gian thực hiện luận án từ năm 2009 đến năm 2014. Tuy nhiên, tiến hành thu mẫu cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa để nghiên cứu thăm dò sán lá song chủ ký sinh được thực hiện từ năm 2007. 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu: Tỉnh Khánh Hòa. 2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu đã sử dụng 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu - Mẫu cá chẽm nuôi: thu cá ngẫu nhiên từ ngư dân tại các lồng/ao nuôi. Đã thu thập 875 cá chẽm nuôi ao và 205 cá chẽm nuôi lồng để kiểm tra sán từ năm 2010 đến 2013. Ngoài ra trước đó từ 2007-2009, 169 mẫu cá chẽm được thu để nghiên cứu thăm dò. - Thu mẫu ốc và cá tạp để khảo sát vòng đời sán lá song chủ: Thu 1255 mẫu ốc ở các ao nuôi cá chẽm thương phẩm bị nhiễm sán và 5 loài cá tạp gồm cá đối (Mugil sp.), cá hố (Trichiurus sp.), cá nục (Decapterus sp.), cá liệt (Leiognathus sp.) và cá giò hay cá kình (Siganus sp.) 7
2.2.2. Phƣơng pháp phát hiện, thu thập, bảo quản,cố định và làm tiêu bản sán lá song chủ Áp dụng phương pháp nghiên cứu KST của Dogiel (1929), được bổ sung bởi Bychowskaija & Paploskaja (1969), Hà Ký (1969). Thu thập sán lá song chủ: cạo nhớt da và lấy máu phết lên lam kính; lấy não ép lên lam kính; cắt rời các vây, mang cho vào hộp lồng đựng nước biển lọc sạch; mổ bụng, tách rời các nội quan cho vào các hộp lồng đựng nước muối sinh lý. Cố định, bảo quản và làm tiêu bản: theo hướng dẫn trong các tài liệu Berland (2005). 2.2.3. Phân loại sán lá song chủ bằng phƣơng pháp hình thái Phân loại sán lá song chủ theo khóa phân loại và các tài liệu: Sán trưởng thành Velasquez (1958, 1961, 1962, 1975); Yamaguti (1941, 1952, 1965, 1971); Võ Thế Dũng và cộng sự (2012). Phân loại ấu trùng sán lá song chủ được giới thiệu bởi Phan Thị Vân và Bùi Ngọc Thanh (2013) dựa trên các tài liệu phân loại của Pearson (1964), Yamaguti (1971), Hong et al. (2002), Bùi Quang Tề (2006, 2007), Sohn (2009); Pinto et al. (2012); Frandsen and Christensen (1984); Ginetsinskaya (1988); Murrell et al. (2005). Tiến hành xác định thành phần, mức độ nhiễm sán lá song chủ trên cá chẽm theo hình thức nuôi, theo thời gian nuôi và tính đặc hữu ký chủ của từng loài sán tìm thấy. 2.2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu di truyền sán lá song chủ trên cá chẽm Phương pháp nghiên cứu gồm các bước: chuẩn bị mẫu, tách chiết ADN, khuếch đại ADN bằng kỹ thuật PCR, chạy điện di trên gel 8
Argarose và giải trình tự ADN. Từ đó tiến hành phân loại và xác định mối quan hệ di truyền của các loài sán lá song chủ trên cá chẽm. Sử dụng các cặp mồi từ các nghiên cứu: mồi 18S rRNA của Littlewood et al. (1998); 28S rRNA của Olson et al. (2003); ITS1 rRNA của Bartoli et al. (2000). 2.2.5. Khảo sát vòng đời phát triển của 1 loài sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm Khảo sát ký chủ trung gian thứ nhất: kiểm tra ấu trùng cercaria ký sinh trong ốc thu từ ao nuôi cá chẽm. Khảo sát ký chủ trung gian thứ 2: kiểm tra ấu trùng metacercaria ở 5 loài cá tạp và bố trí thí nghiệm cho cá chẽm giống (7-10cm) ăn. Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức: cho ăn bằng cá đối, cá liệt, cá hố, cá nục, cá giò và thức ăn công nghiệp (Đối chứng). Cá chẽm giống được nuôi trong bể nhựa 200l, số lượng 50 con/bể. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sau 30 ngày thí nghiệm, kiểm tra cá chẽm. 2.3. Xử lý số liệu Nhập toàn bộ số liệu thu được vào phần mềm Excell, sau đó tùy thuộc mục đích sử dụng mà được xử lý trong các phần mềm khác nhau. - Xác định tỷ lệ cảm nhiễm và cường độ cảm nhiễm theo công thức; - Xử lý dữ liệu di truyền sán lá song chủ: các trình tự ADN sán lá song chủ được dóng hàng bằng phần mềm Bioedit, so sánh trình tự tương ứng trên Genbank được xử lý và kết nối bằng phần mềm MEGA 6.06 (Kumar et al., 2009), sau đó kiểm chứng bằng chương trình BLAST (ncbi.nlm.nih.gov/Blast). Xác định mức độ tương đồng và sự khác biệt di truyền của các loài sán. 9
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.2. Phát hiện, thu thập, cố định và phân loại thành phần giống loài sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa bằng phƣơng pháp truyền thống Nghiên cứu đã phát hiện được 6 loài sán thuộc 6 giống, 4 họ, 1 bộ. Bảng 3.2. Thành phần loài, mức độ nhiễm và vị trí ký sinh của sán lá song chủ (n=1.080) Vị trí ký Tỷ lệ nhiễm Cường độ nhiễm Loài sán sinh (%) (trùng/cá) Tranversotrema 1,88 ± 2,26 Da 15,19 patialanse (1 – 28) Erilepturus 4,84 ± 5,02 Dạ dày 50,83 hamati (1 – 37) Pseudometadena 16,57 ± 22,24 Ruột 40,65 celebesensis (1 – 186) Buccephalus 1,33 ± 0,59 Ruột 3,33 margaritae (1 – 3) Helicometra Ruột - - fasciata* Elytrophallus sp.* Ruột - - (Ghi chú: Trong ngoặc là giá trị lớn nhất và nhỏ nhất. Loài * phát hiện 1 con nên không tính mức độ nhiễm và so sánh). Bảng 3.1. Thành phần loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa Ngành Lớp Bộ Họ Giống Loài Opecoelidae Helicometra 1. H. fasciata Ozaki, 1925 Odhner, 1902 Rudolphi, 1819 Plathelminthes Plagiorchiida Bucephalidae Bucephalus 2. B. margaritae Scheider, 1873 Trematoda La Rue, 1957 Poche, 1907 Baer, 1826 Baer, 1827 Rudolphi,1808 Hemiuridae Erilepturus 3. E. hamati Luhe, 1901 Woolcock, 1952 Yamaguti, 1934 10
Elytrophallus 4. Elytrophallus Manter, 1940 sp. Cryptogonimidae Pseudometadena 5. P. celebesensis Ciurea, 1933 Yamaguti, 1952 Yamaguti, 1952 Transversotrematidae Transversotrema 6. T. patialense Yamaguti, 1954 Witengberg, 1944 Soparkar, 1924 Trong 6 loài sán được tìm thấy trong nghiên cứu này, loài có mức độ cảm nhiễm cao nhất là Erilepturus hamati với TLCN và CĐCN lần lượt là 50,83% và 4,84±5,02 trùng/cá; Tiếp theo là loài Pseudometadena celebesensis với mức độ cảm nhiễm lần lượt là 40,65% và 16,57±22,24 trùng/ cá. Loài Buccephalus margaritae có MĐN thấp nhất là 3,33 % và 1,33 ± 0,59 trùng/cá. Giữa hai hình thức nuôi cá chẽm, qua 3 năm nghiên cứu (2010- 2012), 3 loài có TLCN (%) khác nhau có ý nghĩa thống kê, chỉ có loài B. margaritae khác nhau không có ý nghĩa thống kê. Tuy nhiên, với CĐCN chỉ có một trường hợp khác nhau có ý nghĩa thống kê là E. hamati giữa hai hình thức nuôi cá chẽm. Hình thái cấu tạo: Tất cả sáu loài sán lá song chủ trong Bảng 3.2 đều được mô tả rõ ràng, k m theo các số liệu về kích thước cơ thể, kích thước của các bộ phận dùng để định loại và thảo luận. Mỗi loài sán đều có hình chụp và hình vẽ tổng thể và hình vẽ các bộ phận trong luận án. Tính đặc hữu vật chủ của sán lá song chủ (Host-specificity) + Tính đặc hữu của sán lá song chủ và cá chẽm được khảo sát thông qua quá trình đồng tiến hóa. Kết quả kiểm tra giá trị P-value cho thấy chỉ có loài Pseudometadena celebesensis và cá chẽm có xảy ra quá trình đồng tiến hóa (P ≤ 0.05). 11
Bảng 3.8. Kết quả Parafit của các loài sán lá song chủ trên cá chẽm. Giá trị P-value đƣợc tính toán sau khi phân tích 999 hoán vị ngẫu nhiên Vật chủ Ký sinh trùng P-value Lates calcarifer Transversotrema patialense 0.999 Lates calcarifer Bucephalus margaritae 0.976 Lates calcarifer Pseudometadena celebesensis 0.043* Lates calcarifer Helicometra fasciata 0.981 Lates calcarifer Ertlepturus hamati 0.998 Lates calcarifer Prosorhynchus pacificus 0.169 Dicentrarchus labrax Bucephalus margaritae 0.390 Stereolepis gigas Helicometra fasciata 0.426 Lateolabrax japonicus Ertlepturus hamati 0.341 Paralabrax nebulifer Prosorhynchus pacificus 0.185 Global test (Kiểm tra 0.008 tổng thể) * Giá trị ý nghĩa (P ≤ 0.05) + Kết hợp với việc tìm hiểu và tham khảo nhiều công trình đã công bố về sán lá song chủ ký sinh ở cá biển cho thấy đa số các loài thuộc sán lá song chủ đều có thể ký sinh trên 2 loài cá khác nhau như loài H. fasciata, T. patialense, E. hamati đều được tìm thấy trên các loài cá mú thuộc giống Epinephelus ở Việt Nam (Võ Thế Dũng, 2008, 2010). Trên thế giới, loài H. fasciata được tìm thấy ký sinh trên nhiều loài cá biển khác nhau (Aken et al., 2006). Loài T. patialence ký sinh ở dưới vảy cá cả cá nước ngọt và cá biển (Velasquez, 1961). Loài E. hamati ký sinh trên nhiều loài cá biển khác nhau như đề cập ở phần mô tả loài sán này. Loài B.margaritae được nhiều tác giả tìm 12
thấy trên nhiều loài cá biển khác nhau như Nahhas và Calson (1994) tìm thấy trên cá Caranx latus, Velasquez (1975) tìm thấy trên cá Carax sp. ở Philippine, Hisao (1962) phát hiện ở cá Centropomus pectinatus ở Mexico. Loài Elytrophallus mexicanus được Rivera (1995) tìm thấy trên cá mú Epinephelus labriformis ở vùng biển Mexico. Chỉ riêng loài P.celebesensis trong nghiên cứu này cũng được nhiều tác giả phát hiện ký sinh trong ruột cá chẽm ở những vùng biển khác nhau như Rukert et al. (2008) ở Celebes; Leong và Wong (1982, 1987, 1992) ở Malaysia, Singapore và Thái Lan; Supranee Chinabut (1994) ở Thái Lan; Trong ruột cá chẽm ở vùng biển Philippine, Velasquez (1962), Ruangpan (1982), Arthur et al. (1997) cũng công bố tìm thấy loài sán này. Cho đến nay chưa thấy công trình nào trên thế giới công bố bắt gặp loài P.celebensensis ký sinh ở loài cá biển khác. Do vậy, với kết quả nghiên cứu và tất cả những điều đã thảo luận ở trên, có thể kết luận rằng, cá chẽm (Lates calcarrifer) là vật chủ ưa thích của loài sán này, hoặc có thể xem như loài P. celebensensis ở giai đoạn trưởng thành là ký sinh trùng đặc hữu của cá chẽm. 3.3. Phân loại và xác định mối quan hệ các loài sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa bằng sinh học phân tử 3.3.1 Khuếch đại, giải trình tự ADN sán lá song chủ ở cá chẽm Sử dụng ADN tổng số đã tách chiết làm khuôn, Sản phẩm PCR thu được có kích thước là 1790 bp (18S), 1200 bp (28S) và 900 bp (ITS1) của rRNA. 13
Hình 3.8. Đoạn gen 18S và 28S Hình 3.9. Đoạn gen ITS1 3.3.2 So sánh sự khác biệt trình tự giữa các loài sán lá song chủ sinh trên cá chẽm + Giữa các loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm, sự khác biệt di truyền gen 18S rRNA nằm trong khoảng
hamati khác biệt với loài cùng họ là Lecithochirium caesionis là 16,4 %. Sự khác biệt giữa các giống thấp nhất là 16,2% (giữa Ertlepturus hamati và Lecithochirium spp.), cao nhất là 43,2% (giữa Lecithochirium và Transversotrema spp.). Riêng đối với gen ITS1 rRNA, sự khác biệt trình tự giữa các loài là rất lớn (62,1-65,8%). Đa số các trình tự chỉ có sự tương đồng ở phần gen 18S, còn lại đoạn gen ITS 1 đều thể hiện sự đa dạng rất lớn. 3.3.3. Xây dựng cây phát sinh loài sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa 3.3.3.1. Cây phát sinh loài dựa trên gen 18S rRNA Hình 3.10. Cây phát sinh loài dựa trên gen 18S rRNA của các loài sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm; Loài Ediplozoon nipponucun đƣợc sử dụng làm nhóm ngoại (outgroup). Bốn nhóm phụ được phát hiện bao gồm Nhóm 1 gồm loài P. celebesensis có quan hệ gần gũi với loài Caecincola parvulus GB, Siphodera vinaledwardsii (thuộc họ Cryptogonimidae) và E. hamati; 15
Nhóm 2 gồm loài Helicometra fasciata từ nghiên cứu này được sắp xếp cùng nhánh với loài H.boseli từ GenBank và nhóm này có quan hệ gần gũi với Peracreadium idoneum, 3 loài này đều thuộc họ Opecoelidae; Nhóm 3 gồm loài Lecithochirium caesionis thuộc giống Lecithochirium và loài Plerurus digitatus (thuộc họ Hemiuridae); Nhóm 4 bao gồm loài Transversotrema patialense thuộc giống Transversotrema và loài Transversotrema haasii từ GenBank. 3.3.3.2. Cây phát sinh loài dựa trên gen 28S rRNA Hình 3.11. Cây phát sinh loài dựa trên gen 28S rRNA của các loài sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm; Dendritobilharzia pulverulenta đƣợc sử dụng làm nhóm ngoại (outgroup). Ở cây phát sinh loài dựa trên gen 28S rRNA chia thành 2 nhánh chính. Nhánh 1 lại được chia thành 4 nhóm phụ: Nhóm 1.1 gồm loài Helicometra fasciata từ nghiên cứu hiện tại, thể hiện sự tương đồng 16