Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Ảnh hưởng của sử dụng kết hợp thuốc bảo vệ thực vật hoạt chất Chlopyrifos ethyl và Fenobucarb đến hoạt tính enzym Cholinesterase cá lóc (Channa striata)

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:26

Thêm vào BST

Báo xấu

13
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xác định nhạy cảm của enzyme cholinesterase ở não cá lóc (C. striata) với Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb khi phơi nhiễm riêng lẻ và phối trộn để cảnh báo nhiễm bẩn hai hoạt chất này trong môi trường nước. Nghiên cứu khả năng áp dụng đo ChE ở não cá lóc như phương pháp sinh học cảnh báo nhiễm bẩn thuốc BVTV chứa Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Ảnh hưởng của sử dụng kết hợp thuốc bảo vệ thực vật hoạt chất Chlopyrifos ethyl và Fenobucarb đến hoạt tính enzym Cholinesterase cá lóc (Channa striata)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ -oOo- TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Môi trƣờng Đất và Nƣớc Mã ngành: 9 44 03 03 ẢNH HƢỞNG CỦA SỬ DỤNG KẾT HỢP THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT HOẠT CHẤT CHLORPYRIFOS ETHYL VÀ FENOBUCARB ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYM CHOLINESTERASE Ở CÁ LÓC (CHANNA STRIATA) Cần Thơ, 2018 1
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Nguyễn Văn Toàn, Đào Trọng Ngữ, Nguyễn Văn Công, 2015. Response of cholinesterase to insecticide Chlorpyrifos ethyl in snakehead fish (channa striata) in rice field of Vietnamese Mekong Delta. Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Số đặc biệt Vol. 53, No, 3A, 2015. Trang 277 – 282. ISSN: 0866 – 708X 2. Nguyễn Văn Toàn, Đào Trọng Ngữ, Nguyễn Văn Bé, Phạm Văn Toàn, Trịnh Diệp Phương Danh và Nguyễn Văn Công, 2017. So sánh ảnh hưởng của việc sử dụng đơn lẻ và kết hợp hoạt chất Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl cho lúa đến cholinesterase ở cá lóc (channa striata) sống trên ruộng. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Số chuyên đề: Môi trường và biến đổi khí hậu (2017) (1): Trang 49 – 54. ISSN: 1859 – 2333. 3. Nguyễn Văn Toàn, Nguyễn Văn Công, 2017. Ảnh hưởng của hỗn hợp hoạt chất Fenobucarb và chlorpyrifos ethyl đến hoạt tính cholinesterase ở cá lóc (channa striata). Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông lâm Nghiệp - Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Số: 5/2017 Trang 66 – 71. ISSN: 1859-1523. 4. Nguyễn Văn Toàn, Nguyễn Văn Công, 2018. Hiện trạng sử dụng thuốc bảo vệ thực vật ở một số vùng canh tác lúa Đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí Tài nguyên và Môi trường, Số 5 (283) Kỳ 1 Tháng 3 năm 2018. Trang 26 – 30. ISSN: 1859 – 1477. 2
CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài Trong canh tác lúa ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) chứa hoạt chất Chlorpyrifos ethyl (nhóm Lân hữu cơ) và Fenobucarb (nhóm Carbamate) thường được sử dụng phổ biến (Nguyen Thanh Tam et al., 2015; Nguyễn Văn Toàn và Nguyễn Văn Công, 2018). Trong danh mục thuốc BVTV cho phép sử dụng năm 2016 có đến 159 tên thuốc thương mại có chứa Chlorpyrifos ethyl và 39 tên thương mại chứa hoạt chất Fenobucarb (TT 03/2016/TT-BNNPTNT). Các sản phẩm phối trộn sẵn hoạt chất Chlorpyrifos ethyl với Fenobucarb được sử dụng như: Visa 5GR, Rockfos 550EC, Babsac 600EC, 750EC, Fenfos 650EC, Super Kill Plus 550EC. Ngoài ra, hai đơn chất này cũng thường được phối trộn khi phun nhằm tiêu diệt cùng lúc rầy nâu và các loài sâu hại khác nhau (Phạm Văn Toàn, 2013). Dù phun riêng lẻ từng hoạt chất hay hỗn hợp thì sau cùng các hoạt chất này cùng tồn tại trong thành phần môi trường. Do đó, sinh vật trong thực tế thường chịu tác động của nhiều độc chất khác nhau. Sự phối trộn độc chất có thể làm (i) giảm (tác động đối kháng), (ii) tăng (tác động hợp lực) hay (iii) không ảnh hưởng đến độc tính so với trường hợp riêng lẻ (Trần Văn Hai, 2005). Cá lóc (Channa striata) sống ở nhiều loại hình thủy vực, trong đó có đồng ruộng (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993), nơi mà thuốc BVTV thường xuyên được sử dụng. Vào mùa mưa, cá thường tìm đến đồng ruộng để sinh sản (Amilhat and Lorenzen, 2005) nên chúng có nhiều nguy cơ phơi nhiễm thuốc BVTV. Do đó, cá lóc là một trong những loài thủy sinh vật chịu nhiều tác động bất lợi do phun thuốc BVTV cho lúa nên được để chọn lựa cho nghiên cứu. Enzyme Cholinesterase (ChE) có vai trò quan trọng trong điều tiết chức năng bình thường của quá trình truyền tín hiệu thần kinh qua các tế bào thần kinh ở động vật sống. ChE rất nhạy cảm với thuốc BVTV gốc Lân hữu cơ và Carbamate (Stenersen, 2004); khi ChE bị ức chế có thể ảnh hưởng đến hoạt động hô hấp, di chuyển, bắt mồi và gây chết sinh vật (Peakall, 1992). Hầu hết các loài thủy sinh vật chết khi ChE bị ức chế hơn 70% (Fulton and Key, 2001) và ngưỡng giới hạn sinh học cho phép ChE bị ức chế không quá 30% mức bình thường (Aprea et al., 2002). Đo hoạt tính ChE có thể giúp phát hiện sớm ảnh hưởng bất lợi của môi trường đến sinh vật (Peakall, 1992; Cong et al., 2006). Do vậy, ChE có thể sử dụng làm chỉ thị cảnh báo ô nhiễm và tác hại của ô nhiễm thuốc BVTV gốc Lân hữu cơ và Carbamate đến sinh vật. Kỹ thuật tái kích hoạt khi ChE bị ức chế bởi lân hữu cơ bằng pralidoxime (2-PAM) và phương pháp pha loãng rồi ủ mẫu ở nhiệt độ và thời gian thích hợp khi ChE bị ức chế bởi Carbamate đã được đề xuất áp dụng khi không có sinh vật đối chứng (Rotenberg, 1995). Trên thế giới, nhiều nghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài thực địa đã sử dụng ChE như chỉ dấu sinh học (Biomarker) cảnh báo nhiễm bẩn thuốc BVTV (Andresscu et al., 2006; Laetz et al., 2009;…). Những nghiên cứu bước đầu ở Việt Nam cho thấy có thể sử dụng ChE ở cá chép Cyprinus carpio, cá 3
mè vinh Puntius gonionotus (Đỗ Thị Thanh Hương, 1999; Nguyễn Trọng Hồng Phúc et al., 2010), cá lóc Channa striata (Cong et al., 2006, 2008), cá rô đồng Anabas testudineus (Ngô Tố Linh, 2008; Nguyễn Khắc Du, 2010; Nguyen Thanh Tam et al., 2015) để đánh dấu tác tác hại của nhiễm bẩn thuốc BVTV hoạt chất Diazinon, Acephate, Isoprocarb, Fenobucarb,… Tuy nhiên, sự tác động của hỗn hợp thuốc BVTV đến ChE vẫn chưa được tìm hiểu nhiều. Do đó Luận án “Ảnh hưởng của sử dụng kết hợp thuốc bảo vệ thực vật hoạt chất Chlopyrifos ethyl và Fenobucarb đến hoạt tính enzym Cholinesterase cá lóc (Channa striata)” đã được thực hiện. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Xác định nhạy cảm của enzyme cholinesterase ở não cá lóc (C. striata) với Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb khi phơi nhiễm riêng lẻ và phối trộn để cảnh báo nhiễm bẩn hai hoạt chất này trong môi trường nước. Nghiên cứu khả năng áp dụng đo ChE ở não cá lóc như phương pháp sinh học cảnh báo nhiễm bẩn thuốc BVTV chứa Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb. 1.3 Nội dung nghiên cứu Hiện trạng sử dụng thuốc BVTV ở một số vùng canh tác lúa ĐBSCL. Xác định ảnh hưởng riêng lẽ, hỗn hợp hoạt chất Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb đến hoạt tính enzyme Cholinesterase ở não cá Lóc ở điều kiện phòng thí nghiệm và trên đồng ruộng. Xác định kỹ thuật tái kích hoạt enzyme Cholinesterase như phương pháp sinh học để cảnh báo nhiễm bẩn thuốc BVTV Lân hữu cơ và Carbamate. 1.4 Phạm vi và đối tƣợng nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện với sự phối trộn 2 hoạt chất Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl tác động đến hoạt tính ChE ở não cá lóc ở các mức nồng độ dưới ngưỡng gây chết ở điều kiện phòng thí nghiệm trường Đại học Cần Thơ và ruộng lúa ở xã Tân Long, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang. 1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Nghiên cứu cho thấy việc hỗn hợp thuốc bảo vệ thực vật hoạt chất Fenobucarb với Chlorpyrifos ethyl dù không làm tăng hay giảm tính độc nhưng gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hoạt tính ChE ở cá lóc hơn trường hợp từng đơn chất. Qua đó cho thấy thói quen hỗn hợp thuốc khi sử dụng của người canh tác lúa góp phần đe dọa đến cá lóc nói riêng và động vật nói chung. Nghiên cứu khẳng định thêm đo ChE ở cá lóc có thể xem như phương pháp sinh học nhận ra ảnh hưởng của nhiễm bẩn thuốc BVTV lân hữu cơ và carbamate đến sinh vật. 1.6 Điểm mới của luận án Luận án cung cấp thông tin cập nhật về các loại thuốc BVTV được sử dụng phổ biến ở một số vùng chuyên canh lúa Đồng bằng sông Cửu Long. Luận án cũng cho thấy khi phối trộn hay hỗn hợp thuốc BVTV Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb làm ảnh hưởng đến ChE cá lóc nghiêm trọng hơn trường hợp đơn lẻ. Bổ sung phương pháp sinh học cảnh báo tác hại của sử dụng thuốc bảo vệ thực vật đến cá lóc (C. striata) nói riêng và sinh vật nói chung. 4
CHƢƠNG 2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 8 năm 2012 đến tháng 12 năm 2016. Trong đó, nội dung “Khảo sát tình hình sử dụng thuốc BVTV ở một số vùng canh tác lúa ở ĐBSCL” được thực hiện ở tỉnh Long An, Tiền Giang, Đồng Tháp và Hậu Giang trong thời gian từ 08/2012 đến tháng 02/2013. Các thí nghiệm về ảnh hưởng của thuốc BVTV Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb đến ChE ở cá lóc trong điều kiện phòng thí nghiệm được thực hiện tại Khoa Môi trường và Tài nguyên thiên nhiên – Trường Đại học Cần Thơ. Các thí nghiệm trên đồng ruộng được thực hiện ở Hậu Giang. 2.2 Sinh vật và thuốc BVTV sử dụng cho thí nghiệm Cá lóc (Ch. striata) có trọng lượng 2,5 – 3,0 g/con, được thuần dưỡng trong bể Composite 600 lít ở mật độ 250 - 300 con/bể từ 2 - 3 tuần trước khi bố trí thí nghiệm. Cá được cho ăn hằng ngày bằng thức ăn viên (Cargill mã số 7574, 400 đạm, kích thước viên 3 mm) với liều lượng 3 - 5% trọng lượng cá. Cá khỏe mạnh và đồng cỡ mới được chọn cho thí nghiệm. Thuốc BVTV có tên thương mại Bascide 50EC chứa 50% khối lượng Fenobucarb và Mondeo 60EC chứa 60% khối lượng Chlorpyrifos ethyl được sử dụng cho các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm và phun trên đồng ruộng. 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Nội dung 1: Khảo sát tình hình sử dụng thuốc BVTV ở một số vùng canh tác lúa ở ĐBSCL. Tình hình sử dụng thuốc BVTV tại một số vùng canh tác lúa ở ĐBSCL được tìm hiểu qua phỏng vấn trực tiếp người dân ở một số huyện thuộc tỉnh Long An, Đồng Tháp, Tiền Giang và Hậu Giang. Đây là các địa phương canh tác lúa trọng điểm ở ĐBSCL. Tổng số hộ được phỏng vấn là 939 hộ (Bảng 2.1). Phiếu phỏng vấn tập trung vào các nội dung như (i) chủng loại thuốc sử dụng, (ii) mục đích sử dụng, (iii) số lần sử dụng trong vụ, (iv) liều lượng sử dụng, (v) cách thức sử dụng…. Bảng 2.1:Số hộ được phỏng vấn tình hình sử dụng thuốc BVTV trong canh tác lúa Tỉnh Số hộ Tỷ lệ (%) Long An 300 31,9 Ðồng Tháp 242 25,8 Tiền Giang 247 26,3 Hậu Giang 150 16,0 2.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của phối trộn thuốc BVTV Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb đến ChE cá lóc điều kiện phòng thí nghiệm Mười hai (12) nghiệm thức có thuốc và 1 nghiệm thức đối chứng được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lập lại trong bể composite 100 lít chứa 30L nước máy (mẫu đối chứng) hoặc dung dịch thuốc (các nghiệm thức chứa thuốc). Trong 12 nghiệm thức có thuốc gồm 4 mức nồng độ 1%, 2%, 5% và 10% LC50- 5
96giờ của Fenobucarb (tương ứng 36, 72, 180 và 360 µg/L), Chlorpyrifos ethyl (tương ứng 0,27, 0,54, 1,36 và 2,70 µg/L) và hỗn hợp 2 hoạt chất này. Giá trị LC50 - 96 giờ của Fenobucarb là 3.630 µg/L (Võ Thị Yến Lam, 2011) và Chlorpyrifos ethyl là 27,1 µg/L (Nguyễn Anh Tuấn và ctv., 2015). Cá không được cho ăn suốt 96 giờ phơi nhiễm thuốc. Dung dịch gốc 30.000µg/L (Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl) được chuẩn bị từ Bascide 50EC (giả định chứa 50% khối lượng Fenobucarb như nhà sản xuất ghi trên nhãn) và Mondeo 60EC (giả định chứa 60% khối lượng Chlorpyrifos ethyl như nhà sản xuất ghi trên nhãn) và các dung dịch thí nghiệm được chuẩn bị theo công thức sau: Trong đó: V2: thể tích dung dịch gốc cần lấy; C1: là nồng độ dung dịch cần chuẩn bị; V1: thể tích dung dịch bố trí trong bể composite; C2: nồng độ dung dịch gốc. Mẫu nước được thu theo phương pháp tổ hợp ở thời điểm 1 và 96 giờ sau bố trí. Mỗi lần lập lại lấy 1 lít dung dịch mẫu, trộn 3 lít dung dịch mẫu vào thành 1 mẫu và thu 1 lít mẫu cho phân tích nồng độ từng hoạt chất. Mẫu được gửi đến Trung tâm Kỹ thuật Đo lường chất lượng 3 (QUATEST 3) – Tp. Hồ Chí Minh để phân tích theo phương pháp sắc ký. Cho cá tiếp xúc với thuốc trong 96 giờ, sau đó cho ra bể 600 lít (chứa 100 lít nước máy) để theo dõi phục hồi enzyme ChE. Trong giai đoạn theo dõi phục hồi, cá được thay nước máy mỗi ngày 1 lần (70% lượng nước) vào lúc 16:00 – 16:30 và cho ăn bằng thức ăn viên trong suốt thời gian phục hồi. Bảng 2.2: Tóm tắt thông tin bố trí và theo dõi thí nghiệm Thông tin Chlorpyrifos ethyl Fenobucarb Hỗn hợp Đối chứng 3 bể chung 1%LC50 – 96 giờ 3 bể 3 bể 3 bể 2%LC50 – 96 giờ 3 bể 3 bể 3 bể 5%LC50 – 96 giờ 3 bể 3 bể 3 bể 10%LC50 – 96 giờ 3 bể 3 bể 3 bể Số cá thả/bể 32 cá/bể 32 cá/bể 32 cá/bể Tần suất thu mẫu cá đo 0, 1, 12, 24, 36, 0, 1, 12, 24, 36, 0, 1, 12, 24, 36, ChE (giờ) 48, 60, 72, 96 48, 60, 72, 96 48, 60, 72, 96 Số cá thu mỗi lần 02 02 02 (cá/bể) Thu mẫu nước đo dư 1 và 96 giờ sau bố 1 và 96 giờ sau 1 và 96 giờ sau lượng thuốc BVTV trí bố trí bố trí Thời gian đo pH, DO, 6:00 – 6:30 6:00 – 6:30 6:00 – 6:30 nhiệt độ 14:00 – 14:30 14:00 – 14:30 14:00 – 14:30 Mẫu cá sau khi giai đoạn phơi nhiễm được thu ở các thời điểm trước khi cho thuốc, 1, 12, 24, 36, 48, 60, 72, và 96 giờ sau bố trí. Sau đó cho cá ra môi 6
trường nước máy và thu mẫu ở thời điểm 1, 3, 5 và 7 ngày để phân tích ChE với 2 cá cho mỗi bể. Các yếu tố môi trường pH, DO và nhiệt độ được đo hàng ngày vào lúc 6:00 – 6:30 và 14:00 – 14:30. 2.3.3 Nội dung 3: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của phối trộn thuốc BVTV Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb đến ChE ở cá lóc ngoài đồng ruộng Chín ruộng ở huyện Phụng Hiệp, Hậu Giang (diện tích từ 2.000 – 2.500 m2) và giữ được nước (9,0±0,4 – 11,3±0,5 cm) được chọn để tiến hành thí nghiệm trong vụ hè thu năm 2013. Lúa thí nghiệm được sạ trong khoảng 45 ngày tuổi ở mật độ 22 kg lúa/1.000m2 (Bảng 2.3). Mỗi ruộng đặt 3 lồng (0,5 x 0,6 x 0,9) m3 bằng lưới kẽm theo đường chéo của ruộng. Mỗi lồng thả 30 cá, chăm sóc 7 ngày cho quen với điều kiện trên ruộng rồi cung cấp thuốc Bascide 50EC và Mondeo 60EC để nông dân phun theo thói quen của họ. Các ruộng chỉ được phun một lần trong thời gian thí nghiệm ở liều cao nhất của chỉ dẫn (1,5L/ha đối với Bascide 50EC và 0,8L/ha đối với Mondeo 60EC). Bảng 2.3: Tóm tắt thông tin bố trí và theo dõi thí nghiệm trên ruộng Thông tin Bascide 50EC Mondeo 60EC Hỗn hợp Số ruộng 03 03 03 Số lồng/ruộng 03 03 03 Số cá thả/lồng 30 30 30 Tần suất thu mẫu Trước bố trí, 1 giờ Trước bố trí, 1 giờ Trước bố trí, 1 giờ nước đo thuốc và 1, 3 và 5 ngày và 1, 3 và 5 ngày và 1, 3 và 5 ngày BVTV sau khi phun sau khi phun sau khi phun Tần suất thu mẫu Trước phun, 1, 3, Trước phun, 1, 3, Trước phun, 1, 3, cá đo ChE 5, 7 và 14 ngày 5, 7 và 14 ngày 5, 7, 14 và 21 sau khi phun sau khi phun ngày sau khi phun Số cá thu ở mỗi 02 02 02 lần (cá/lồng) Mẫu nước được thu theo phương pháp tổ hợp (dùng cốc 500 mL thu 10 mẫu đơn cho vào xô rồi trộn đều lấy 1lít) và thu ở thời điểm trước khi thả cá, 1 giờ sau phun, 1, 3 và 5 ngày sau phun để phân tích nồng độ hoạt chất Fenobucarb, Chlorpyrifos ethyl. Mẫu được gửi đến Trung tâm Kỹ thuật Đo lường chất lượng 3 (QUATEST 3) – Tp. Hồ Chí Minh và được phân tích bằng phương pháp sắc ký. Khi thu mẫu cá, cá được đưa vào nước đá để làm chết nhanh, sau đó mổ lấy não rồi cho vào từng eppendorf, đưa vào Nitơ lỏng làm đông nhanh để hạn chế ảnh hưởng đến ChE trước khi chuyển về phòng thí nghiệm xử lý và phân tích ChE. Các yếu tố như: mực nước, nhiệt độ, oxy, pH được đo 01 ngày/lần vào lúc 7:00-8:00 tại nơi đặt lồng cá bằng máy đo nhanh. 2.4 Xử lý mẫu và phân tích ChE, tái kích hoạt 2.4.1 Xử lý mẫu và phân tích ChE Mẫu được xử lý dựa theo (Cong et al., 2006). Não cá sau khi thu mẫu có khối lượng trung bình từ 0,04 – 0,05 gram và được nghiền trong dung dịch đệm 7
0,1 M Phosphate buffer pH 7,4. Thể tích dung dịch đệm cho vào đảm bảo tất cả các não đều có nồng độ 25 mg não/mL dung dịch buffer pH 7,4 (#1,6 – 2,0 ml) và dung dịch nghiền này được sử dụng để đo ChE xác định tỷ lệ ức chế và thực hiện tái kích hoạt. Sau mỗi lần nghiền, rửa dụng cụ nghiền bằng nước cất - acetone - nước cất. Mẫu được trộn đều và lấy 1 mL dung dịch cho vào eppendorf rồi ly tâm ở 4oC, tốc độ 2.000 vòng/phút trong 20 phút bằng máy ly tâm Sigma (Đức). Phần trong phía trên sau khi ly tâm được lấy ra để đo ChE. 2.4.2 Phương pháp tái kích hoạt ChE do ức chế bởi Chlorpyrifos ethyl Lấy 0,5ml dung dịch mẫu não nghiền cho vào eppendorf, sau đó thêm vào 0,5ml dung dịch 2-PAM 0,6mM (nồng độ 2-PAM sau khi thêm vào là 0,3mM), trộn đều mẫu và đem ủ ở 37oC bằng bể ủ nhiệt (Memmert, Đức) trong 30 phút (Cong et al., 2008). Mẫu sau khi ủ đem ly tâm ở 4oC, tốc độ 2.000 vòng/phút trong 20 phút bằng máy ly tâm Sigma (Đức) rồi lấy phần trong phí trên đo ChE. 2.4.3 Phương pháp tái kích hoạt ChE do ức chế bởi Fenobucarb Lấy 0,1mL dung dịch mẫu não cho vào eppendorf, sau đó thêm vào 0,9ml dung dịch buffer pH 7,4, trộn đều mẫu và đem ủ ở 37oC bằng bể ủ nhiệt (Memmert, Đức) trong thời gian 3,5 giờ. Mẫu sau khi ủ đem ly tâm ở 4oC, tốc độ 2.000 vòng/phút trong 20 phút bằng máy ly tâm Sigma (Đức) và đo ChE 2.4.4 Phương pháp đo ChE Enzyme ChE được đo bằng máy so màu quang phổ U-2800 (Nhật) ở bước sóng 412nm trong 200 giây theo phương pháp Ellman et al., (1961). Mỗi mẫu đo được chuẩn bị bằng cách cho 2,65 mL 0,1M Phosphate bufer pH 7,4 vào cuvest nhựa, tiếp tục cho 0,1 mL dung dịch 3mM DTNB và 0,05 mL dung dịch 10mM Acetylthiocholine iodide. Sau đó, cho 0,2 mL dung dịch mẫu não đã ly tâm. Mẫu trắng cũng cho hoá chất tương tự như mẫu đo ChE nhưng lấy 0,2 mL dung dịch đệm 0,1M phosphate pH 7,4 thay cho dung dịch mẫu não. Kết quả được ghi nhận khi hệ số tương quan đạt từ 0,9 trở lên. 2.5 Tính hoạt tính ChE, tỷ lệ ức chế và xử lý kết quả 2.5.1 Xác định hoạt tính ChE Hoạt tính ChE được tính toán theo công thức sau: Trong đó: - HT (hoạt tính ChE): µmol/g/phút - A: Abs mẫu - Abs blank (Abs/phút) - Cv: thể tích cuvet hay tổng thể tích dung dịch đo (mL) = 3 mL - Hv: thể tích dung dịch đệm sử dụng để nghiền mẫu - E: hệ số=13,6 - L: là hệ số (bằng 1 khi dùng cuvest đáy bằng có cạnh 1 cm để đo mẫu) - Sv: thể tích mẫu sau ly tâm lấy đo (mL) = 0,2 mL - Ps: trọng lượng mẫu lấy nghiền (gam). 8
2.5.2 Xác định tỷ lệ ức chế Trong đó: - I (%) : tỷ lệ phần trăm bị ức chế - A: hoạt tính ChE đo ở từng mẫu (µM/g/phút) - Adc: trung bình hoạt tính ChE ở nghiệm thức đối chứng (µM/g/phút) 2.5.3 Xác định tỷ lệ tái kích hoạt ChE Trong đó: - TLTKH (%) : tỷ lệ cá tái kích hoạt - ChEu: ChE mẫu ủ với 2 – PAM hoặc pha loảng - ChEku: ChE mẫu nguyên thủy (không ủ với 2 – PAM hoặc pha loảng) 2.5.4 Xử lý kết quả Số liệu được phân tích phương sai (one-way ANOVA) và dùng kiểm định Duncan để so sánh giữa các nghiệm thức và Dunnet để so sánh với đối chứng. Sai khác cho là có ý nghĩa thống kê khi p
tên thương phẩm thuốc BVTV được sử dụng ở 3 huyện Vị Thủy, Phụng Hiệp và Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang. Kết quả nghiên cứu trong luận án này có sự đa dạng hơn về loại thuốc BVTV được sử dụng so với các nghiên cứu trước đây. Số lượng hoạt chất thuốc BVTV được phép sử dụng trong nông nghiệp tăng theo thời gian. Theo danh mục thuốc BVTV cho phép sử dụng năm 2007 thì có 675 hoạt chất được phép sử dụng nhưng năm 2012 là 1.418 hoạt chất. Mặt khác, trong luận án này cỡ mẫu được phỏng vấn lớn hơn và địa bàn phỏng vấn rộng hơn (4 tỉnh Long An, Tiền Giang, Đồng Tháp và Hậu Giang) nên sự đa dạng về các loại thuốc BVTV được sử dụng có nhiều hơn các nghiên cứu trước đây. Bảng 3.4: Chủng loại thuốc BVTV sử dụng ở các vùng nghiên cứu Tỉnh Long Tiền Đồng Hậu TB vùng Nhóm thuốc An Giang Tháp Giang nghiên cứu Hoạt chất Trừ côn trùng 18 20 20 16 20 Trừ bệnh 13 14 18 9 18 Trừ cỏ 7 7 8 9 9 Trừ ốc 5 2 5 2 5 Trừ chuột 6 5 6 6 6 Điều hòa sinh trưởng 7 6 6 7 7 Tổng 56 54 63 49 65 Tên thƣơng mại Trừ côn trùng 63 55 58 47 101 Trừ bệnh 26 28 31 31 54 Trừ cỏ 11 11 13 24 30 Trừ ốc 13 9 13 6 19 Trừ chuột 5 6 5 4 7 Điều hòa sinh trưởng 14 11 14 18 21 Tổng 132 120 134 130 232 Kết quả khảo sát cho thấy các hoạt chất như Chlorpyrifos ethyl, Pymetrozine, Fenobucarb, Emamectin, Chlorantramiliprole,…. được sử dụng với tỷ lệ lần lượt là 14,2%, 13,2%, 12,5%, 8,2% và 6,0%. Thuốc chứa hoạt chất Fenobucarb với các tên thương mại như Abasa, Bassa, Bassa tigi, Dybacide, Bascide, Hopkill, Vibasa và chứa hoạt chất Chlorpyrifos ethyl như B52 – USA, Mondeo 60EC, Dragon, Dragon nông,Wavotox được sử dụng phổ biến. Hai loại hoạt chất này thường cũng được phối trộn với nhau để phòng trừ rầy nâu và sâu cuốn lá, nhất là giai đoạn lúa từ 21 – 45 ngày tuổi. Hai hoạt chất Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb cũng được sử dụng khá phổ biến trong canh tác lúa (Pham Van Toan, 2011; Berg and Tam, 2012). Như vậy, nếu so với các nghiên cứu trước đây thì 2 hoạt chất Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl vẫn còn được sử dụng phổ biến trong canh tác lúa. 10
3.1.2 Tần suất và liều lượng thuốc BVTV sử dụng trong canh tác lúa 3.1.2. 1 Tần suất phun thuốc BVTV trong canh tác lúa Trung bình số lần phun thuốc BVTV ở tỉnh Tiền Giang là cao nhất (7,0±1,1 lần/vụ), kế đến là Hậu Giang 6,9±1,6 lần/vụ, Đồng Tháp 6,0±1,2 lần/vụ và thấp nhất là Long An với 5,3±0,9 lần/vụ. Qua đó cho thấy có sự khác nhau về số lần phun thuốc trong vụ giữa các địa phương. 8 Tröø saâu beän h Tröø coû Tröø oác 6 Taàn suaát phun (laàn/vuï) 4 2 0 Long An Tieàn Giang Ñoàng Thaùp Haäu Giang TB vuøng NC Hình 3.1: Tần suất phun các loại thuốc BVTV ở vùng nghiên cứu Berg (2001) cho thấy trung bình số lần phun thuốc ở Tiền Giang năm 1999 là 8,2 lần/vụ. Nghiên cứu của Pham Van Toan (2011) cho thấy ở 2 tỉnh Đồng Tháp và Cần Thơ, trung bình tần suất phun xịt thuốc BVTV là 8 lần/vụ. Như vậy, kết quả nghiên cứu trong luận án này cho thấy có giảm thấp hơn về tần suất phun so với các nghiên cứu gần đây. 3.1.2. 2 Liều lượng sử dụng và phối trộn thuốc BVTV Kết quả phỏng vấn cho thấy trung bình trong vùng nghiên cứu có 42,7% nông dân phun bằng chỉ dẫn và 53,7% phun cao hơn chỉ dẫn ghi trên nhãn thuốc, rất ít (3,6%) phun thấp hơn chỉ dẫn. Khi phân tích riêng theo từng tỉnh thì tỷ lệ phun thuốc bằng chỉ dẫn ở Long An, Tiền Giang, Đồng Tháp và Hậu Giang lần lượt là 50%, 16,9%, 38,5% và 76,7%. Trong khi đó tỷ lệ phun thuốc cao hơn chỉ dẫn ở các tỉnh theo thứ tự trên lần lượt là 49,3%, 72,3%, 61,1% và 20% (Bảng 3.2). Sử dụng thuốc BVTV liều cao hơn chỉ dẫn vừa làm hao phí thuốc vừa làm tăng nguy cơ gây độc cho sinh vật trong môi trường. Phun thuốc thấp hơn chỉ dẫn sẽ làm cho sâu bệnh không chết hết và tăng nguy cơ kháng thuốc. Qua nghiên cứu cho thấy tỷ lệ sử dụng liều cao hơn chỉ dẫn rất cao (20-72,3%) đặc biệt là tỉnh Tiền Giang Bảng 3.2: Liều lượng sử dụng thuốc BVTV ở các vùng nghiên cứu Long Tiền Đồng Hậu TB vùng Liều lƣợng phun An Giang Tháp giang nghiên cứu Ít hơn liều chỉ dẫn 0,7 10,7 0,4 3,3 3,6 Bằng liều chỉ dẫn 50,0 16,9 38,5 76,7 42,7 Cao hơn liều chỉ dẫn 49,3 72,3 61,1 20,0 53,7 11
Qua phỏng vấn cho thấy trung bình các vùng nghiên cứu có đến 88,6% số nông hộ phối trộn các loại thuốc với nhau trước khi phun xịt. Nếu xét theo từng tỉnh, tỷ lệ phối trộn ở các tỉnh Long An, Đồng Tháp, Tiền Giang và Hậu Giang lần lượt đạt 93,3%, 91,9%, 89,3% và 72,7%. Thuốc trừ sâu với các hoạt chất khác nhau thường được phối trộn trước khi phun. Việc phối trộn các loại thuốc BVTV với nhau có thể làm giảm, tăng hay không thay đổi độc tính của thuốc đối với địch hại (Trần Văn Hai, 2005). Nếu các loại thuốc có cơ chế tác động khác nhau thì khi phối trội có thể làm cho nhiều cơ quan, chức năng khác nhau của sinh vật bị ảnh hưởng cùng lúc và khi đó hậu quả sẽ nghiêm trọng hơn. Ngoài ra, nếu các chất khác nhau có hiệu lực gây độc ở các thời gian phơi nhiễm khác nhau thì sẽ làm cho sinh vật bị ảnh hưởng lâu dài vì vừa hết bị tác động của thuốc này lại bắt đầu bị tác động của thuốc khác (Zeliger, 2008). Trong vùng nghiên cứu tỷ lệ người dân phối trộn các loại thuốc BVTV trước khi phun cao trong nghiên cứu này là rất đáng được quan tâm. Tóm lại, kết quả nghiên cứu ở nội dung 1 nhận thấy các thuốc trừ sâu chứa hoạt chất Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb được sử dụng khá phổ biến. Hai hoạt chất này có độ độc cao, cùng cơ chế tác động là gây ức chế hoạt tính ChE ở sinh vật nên được chọn làm các nguồn gây độc trong các thí nghiệm ở nội dung 2 và 3. Nông dân thường phối trộn các thuốc BVTV với nhau (88,6%) nhằm giảm chi phí khi phun và thường phun ở liều lượng bằng (42,7%) hoặc cao hơn (53,7%) liều lượng hướng dẫn ghi trên nhãn thuốc. Đây là cơ sở để thực hiện nội dung 2 và 3 nhằm xem xét, đánh giá tác động riêng lẻ và phối trộn của 2 hoạt chất chất này đến ChE não cá lóc đồng điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài đồng ruộng. 3.2 Nội dung 2: Ảnh hƣởng của phối trộn thuốc BVTV Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb đến ChE cá lóc trong điều kiện phòng thí nghiệm 3.2.1 Nhiệt độ, DO, pH trong thí nghiệm Trong giai đoạn phơi nhiễm thuốc BVTV, nhiệt độ buổi sáng dao động từ 24,8±0,1 0C đến 26,5±0,1 0C và từ 26,9±0,3 0C đến 28,9±0,2 0C vào buổi chiều. Oxy hoà tan (DO) ít khác biệt giữa các nghiệm thức và DO buổi sáng dao động từ 4,0±0,2 - 4,7±0,1 mg/L, có xu hướng cao hơn DO buổi chiều dao động từ 3,7±0,1 - 4,4±0,2 mg/L. Giá trị pH trung bình tuy có sự khác biệt giữa các nghiệm thức và giữa hai buổi nhưng không quá 0,5 đơn vị, dao động từ 7,4±0,1 đến 7,5±0,1. Sau 96 giờ tiếp xúc với thuốc, cá được cho ra bể composite 600L chứa 100L nước máy (không có thuốc BVTV), có sục khí. Nhiệt độ dao động từ 28,0±0,2 oC - 28,9±0,2 oC vào buổi sáng và 28,2±0,2 oC - 29,6±0,2 oC vào buổi chiều. Hàm lượng DO trong các bể thí nghiệm khi cá ra nước máy cao hơn giai đoạn cá tiếp xúc thuốc BVTV trong 96 giờ do được sục khí, buổi sáng dao động từ 6,3±0,1 - 7,1±0,1 mg/L và buổi chiều dao động từ 6,4±0,2 - 7,1±0,1 mg/L. Giá trị pH buổi sáng dao động từ 6,9±0,1 - 7,2±0,1 và buổi chiều từ 7,0±0,1 - 7,2±0,1. 12
Nhìn chung nhiệt độ, DO và pH trong giai đoạn phơi nhiễm thuốc BVTV và phục hồi ChE trong nước máy đều nằm trong khoảng thích hợp cho sự phát triển của cá. Sự ổn định các yếu tố pH, DO và nhiệt độ giữa các nghiệm thức sẽ làm cho thí nghiệm mang tính đồng nhất cao về mặt môi trường nên tác động đồng đều đến sự ức chế ChE. 3.2.2 Nồng độ Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl trong bố trí thí nghiệm Kết quả phân tích đều không phát hiện (dưới ngưỡng phát hiện) Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl ở nghiệm thức đối chứng. Ở các nghiệm thức đơn chất, nồng độ sau khi chuẩn bị của Fenobucarb bằng 86,0 – 96,9% nồng độ lý thuyết (NĐLT) và Chlorpyrifos ethyl bằng 77,8 - 119,9% NĐLT. Ở các nghiệm thức hỗn hợp, nồng độ Fenobucarb thực tế đạt từ 96,4 - 109,9% NĐLT; nồng độ Chlorpyrifos ethyl bằng 82,4 - 96,3% NĐLT. Nồng độ Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl sau khi chuẩn bị dao động xung quanh giá trị nồng độ lý thuyết. Mặc dù không đúng như nồng độ lý thuyết nhưng vẫn phù hợp với thiết kế nồng độ tăng theo 1, 2, 5 và 10% LC50-96 giờ của từng loại thuốc đối với cá lóc. Bảng 3.3: Nồng độ Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl trong thí nghiệm Nồng độ thuốc BVTV (g/L) Nghiệm thức Nồng độ lý Nồng độ Nồng độ thuyết khi thực tế sau thực tế sau chuẩn bị khi chuẩn bị 96 giờ Fenobucarb 0,00 < DLF < DLF ÐC Chlorpyrifos ethyl 0,00 < DLChl < DLChl 1% Fenobucarb 36,00 31,20 5,40 2% Fenobucarb 72,00 68,40 11,00 5% Fenobucarb 180,00 175,00 49,90 10% Fenobucarb 360,00 351,60 69,90 1% Chlorpyrifos ethyl 0,27 0,21 < DLChl 2% Chlorpyrifos ethyl 0,54 0,47 0,06 5% Chlorpyrifos ethyl 1,36 1,63 0,14 10% Chlorpyrifos ethyl 2,70 2,48 0,29 Fenobucarb 36,00 39,90 5,30 1% Hỗn hợp Chlorpyrifos ethyl 0,27 0,26 0,04 Fenobucarb 72,00 76,70 10,00 2% Hỗn hợp Chlorpyrifos ethyl 0,54 0,48 0,08 Fenobucarb 180,00 191,60 59,20 5% Hỗn hợp Chlorpyrifos ethyl 1,36 1,12 0,13 Fenobucarb 360,00 350,11 52,40 10% Hỗn hợp Chlorpyrifos ethyl 2,70 2,29 0,46 DLF = 0,3 g/L, DLChl = 0,03 g/L Tại thời điểm 96 giờ sau bố trí, nồng độ Fenobucarb ở nghiệm thức đơn chất giảm từ 71,5 - 83,9% so với nồng độ thực sau khi bố trí. Nghiệm thức đơn Chlorpyrifos ethyl nồng độ hoạt chất này giảm từ 87,2% - 100%. Ở dạng hỗn hợp, tỷ lệ giảm nồng độ thuốc mạnh hơn, dao động từ 69,1% - 87,0% đối với Fenobucarb và từ 79,9-88,4% đối với Chlorpyrifos ethyl. 13
3.2.3 Ảnh hưởng của phối trộn hoạt chất Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb đến ChE ở cá lóc trong điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả phân tích phương sai cho thấy Fenobucarb, Chlorpyrifos ethyl, thời gian phơi nhiễm có ảnh hưởng đến hoạt tính ChE (p0,05) (Bảng 3.3). Bảng 3.3: Bảng phân tích phương sai xem xét tác động của Fenobucarb, Chlorpyrifos ethyl và thời gian phơi nhiễm tác động đến hoạt tính ChE Nguồn tác động SS df MS F P Fenobucarb 663,8 4 165,9 46,5 0,00 Chlorpyrifos ethyl 50,4 4 12,6 3,5 0,01 Thời gian phơi nhiễm 16,0 1 16,0 4,5 0,04 Fenobucarb*Chlorpyrifos ethyl 30,8 4 7,7 2,2 0,07 Fenobucarb*Thời gian phơi nhiễm 310,6 4 77,7 21,7 0,00 Chlorpyrifos ethyl*Thời gian phơi nhiễm 98,4 4 24,6 6,9 0,00 Fenobucarb * Chlorpyrifos ethyl * Thời gian phơi nhiễm 48,8 4 12,2 3,4 0,01 SS: Tổng bình phương, MS: Trung bình bình phương  Ở nồng độ 1% LC50 – 96 giờ Kết quả nghiên cứu cho thấy ở nghiệm thức Chlorpyrifos ethyl, tỷ lệ ức chế ChE ở tất cả các thời điểm đều khác biệt không có ý nghĩa so với đối chứng (p>0,05) (Hình 3.2A). 100 100 Tyû leä öùc cheá hoaït tính Cholinesterase (%) 2% Chlorpyrifos Ethyl Tyû leä öùc cheá hoaït tính Cholinesterase (%) 1% Chlorpyrifos Ethyl 1% Fenobucarb 2% Fenobucarb 80 80 2% HH (Chlor + Feno) 1% HH (Chlor + Feno) 60 60 40 40 * a * aa 20 *a 20 * a * a *ab a a a a a a a * a a * a a a a a b ab a ab a a a a b b a 0 a a 0 a ab b ab a a ab a a b b b a a a b c b b a -20 -20 0 1 12 24 36 48 60 72 96 0 1 12 24 36 48 60 72 96 Thôøi gian sau khi phôi nhieãm (giôø) Thôøi gian sau khi phôi nhieãm (giôø) (Hình 3.2A) (Hình 3.2B) Hình 3.2: Tỷ lệ ức chế hoạt tính ChE (% so với đối chứng) trong não cá lóc đồng (TB ± SE) sau khi phơi nhiễm với Fenobucarb, Chlorpyrifos ethyl và hỗn hợp theo thời gian ở mức nồng độ 1% LC50 - 96 giờ (Hình 3.2A), 2% LC50 - 96 giờ (Hình 3.2B). Trong cùng thời điểm phơi nhiễm, các số liệu có cùng chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05, Duncan test). Trong cùng đường số liệu có dấu * thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p
mẫu còn lại, tỷ lệ ức chế ChE đều thấp và khác biệt không có khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (p>0,05). Tương tự, ở nghiệm thức hỗn hợp thì tỷ lệ ức chế có sự khác biệt so với đối chứng (p
là 57,8%, 53,8%, 35,8%, 45,6%, 34,9% và khác biệt so với đối chứng (p0,05). Ở nghiệm thức đơn Chlorpyrifos ethyl, tỷ lệ ức chế ChE tăng dần và bắt đầu sai khác so với đối chứng (p
nhiễm (Williams et al., 2000). Nghiên cứu của Cong et al., (2006) đã cho thấy Fenobucarb gây ức chế ChE ở cá Lóc cao nhất ở 6 giờ sau khi phơi nhiễm. Trong nghiên cứu này, Fenobucarb gây ức chế ChE ở cá lóc cao trong khoảng 1 – 12 giờ sau phơi nhiễm. Chlorpyrifos ethyl là thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ, trong cấu tạo có gốc P=S (thiono); gốc này không gây ức chế trực tiếp ChE mà khi thâm nhập vào sinh vật sẽ bị chuyển hóa sinh học thành P=O (oxon) mới gây ức chế ChE (Stenerson, 2004). Quá trình chuyển hóa sinh học này diễn ra nhờ hệ thống enzyme cytochrome P450 (Keizer et al., 1991) nên thường hiệu ứng tác động chậm. Trong luận án này cho thấy tỷ lệ ức chế ChE ở nghiệm thức Chlorpyrifos ethyl tăng dần theo thời gian và đạt cao trong khoảng 48 - 60 giờ sau khi phơi nhiễm. Ở nghiệm thức hỗn hợp, hoạt tính ChE ở cá Lóc chịu tác động của cả Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl. Giai đoạn 1 -12 giờ, tỷ lệ ức chế ChE ở nghiệm thức hỗn hợp có xu hướng giống nghiệm thức Fenobucarb (p>0,05) ở tất cả 4 mức nồng độ. Qua đó có thể kết luận, sự ức chế ChE trong thời gian 1-12 giờ đầu phơi nhiễm chủ yếu do Fenobucarb gây nên. Sau đó, tỷ lệ ức chế có xu hướng giống nghiệm thức đơn Chlorpyrifos ethyl (p>0,05). Kết quả thể hiện rõ ở 2 mức nồng độ 5% và 10% LC50 – 96 giờ. Như vậy, nghiên cứu này đã cho thấy khi hỗn hợp hai hoạt chất Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb thì không làm tăng hay giảm giảm tỷ lệ ức chế ChE cá Lóc so với từng đơn chất nhưng thời gian ChE bị ức chế ở mức cao kéo dài hơn thay vì chỉ bị ảnh hưởng của Fenobucarb Chlorpyrifos ethyl. Qua đó cho thấy có thể hỗn hợp Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl lại với nhau mà không làm tăng hay giảm độc tính của từng hoạt chất. 3.2.4 Phục hồi ChE trong nước máy sau khi phơi nhiễm với Chlorpyrifos ethyl, Fenobucarb và hỗn hợp hai hoạt chất này Như đã trình bày và thảo luận mục 3.2.3, ở cả 2 mức nồng độ 1 và 2% LC50 – 96 giờ, tỷ lệ ức chế ở tất cả các trường hợp sau 96 giờ phơi nhiễm đều không khác biệt so với đối chứng và giữa các nghiệm thức với nhau (Hình 4.5A,B), nghĩa là ChE ở các nghiệm thức đã hoàn toàn phục hồi. Do đó theo dõi phục hồi ChE trong nước máy chỉ thực hiện ở nghiệm thức 5% và 10% LC50 – 96 giờ.  Ở nồng độ 5% LC50 – 96 giờ Trước khi ra môi trường nước máy, hoạt tính ChE ở các nghiệm thức Chlorpyrifos ethyl, Fenobucarb và hỗn hợp lần lượt đạt 88,8%, 101,2% và 86,5% so với đối chứng. Khi cho ra môi trường nước máy, ChE ở tất cả các nghiệm thức đều tăng và khác biệt không có ý nghĩa so với đối chứng (p>0,05) ở các thời điểm 1, 3, 5 và 7 ngày (Hình 3.4A). Như vậy, ở nồng độ 5% LC50 – 96 giờ, ChE đã phục hồi hoàn toàn và không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức so với đối chứng. 17
 Ở nồng độ 10% LC50 – 96 giờ Hoạt tính ChE ở các nghiệm thức Chlorpyrifos ethyl, Fenobucarb và hỗn hợp ở thời điểm 96 giờ sau khi phơi nhiễm lần lượt đạt 70,8%, 89,5% và 56,5% so với đối chứng và ở 2 nghiệm thức Chlorpyrifos ethyl và hỗn hợp khác biệt so với đối chứng (p
Trường hợp Chlorpyrifos ethyl có gốc P=S (thiono) không trực tiếp gây ức chế ChE mà cần thời gian để chuyển thành P=O (oxon) còn gọi là Chlorpyrifos-oxon và khi kết hợp với enzyme ChE sẽ tạo thành phức hợp Phosphorylated enzyme và Trychlorpyridinol. Phức hợp Phosphorylated enzyme thủy phân rất chậm để trở thành Diethylphosphate và enzyem ChE như ban đầu và một phần Phosphorylated enzyme tạo liên kết vĩnh viễn giữa Chlorpyrifos-oxon với enzyme ChE và trở nên bất hoạt, không thể phục hồi hay gọi là sự lão hóa (aging) (Timchalk, 2006). Quá trình này xảy ra khi một nhóm hữu cơ trong hợp chất lân hữu cơ gây ức chế bị mất đi và được thay thế bởi một nhóm Hydroxyl (-OH) và làm cho liên kết giữa chất ức chế và ChE bền chặt hơn và không thể bị thủy phân. Ở nghiệm thức hỗn hợp, hoạt tính ChE của cá phục hồi chậm và có diễn biến giống với sự phục hồi của nghiệm thức Chlorpyrifos elthyl khi cho ra môi trường nước máy. 3.3 Nội dung 3: Ảnh hƣởng của sử dụng phối trộn thuốc BVTV Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb cho lúa đến ChE ở cá Lóc 3.3.1 Nhiệt độ, pH, DO và mực nước trong thời gian thí nghiệm Nhiệt độ trung bình trên các ruộng phun thuốc chứa hoạt chất Fenobucarb dao động từ 26,0±0,3 0C đến 28,8±0,3 0C; phun Chlorpyrifos ethyl dao động từ 26,8±0,3 0C đến 29,3±0,7 0C và khi phun hỗn hợp dao động từ 27,0±0,6 0C đến 28,4±0,6 0C. Trung bình giá trị pH ở các ruộng phun thuốc Fenobucarb dao động từ 6,6±0,1 - 6,7±0,1, phun Chlorpyrifos ethyl dao động từ 6,6±0,1 - 6,8±0,1 và phun hỗn hợp thuốc dao động 6,5±0,1 - 6,8±0,1. Oxy hòa tan ở các ruộng phun thuốc Fenobucarb dao động từ 4,0±1,6 - 4,9±0,2 mg/L; phun Chlorpyrifos ethyl dao động từ 1,1±0,2 - 1,9±0,7 mg/L và hỗn hợp dao động từ 0,7±0,1 - 1,9±0,5 mg/L. Tóm lại, các yếu tố nhiệt độ, pH, DO ngoài đồng ruộng dao động nhiều hơn so với điều kiện phòng thí nghiệm nhưng vẫn thích hợp cho sự sống và phát triển của cá. 3.3.2 Nồng độ Fenobucarb, Chloryrifos Ethyl trong nước ruộng Trước khi phun thuốc, nồng độ Fenobucarb, Chlorpyrifos ethyl đều dưới ngưỡng phát hiện ở tất cả các ruộng. Sau khi phun 1 giờ, nồng độ Fenobucarb dao động từ 14 - 291g/L (trung bình 81,1g/L) ở ruộng phun đơn Bascide 50EC và từ 10,5 - 272g/L (trung bình 96,8g/L) ở ruộng phun hỗn hợp thuốc; trong khi đó nồng độ Chlorpyrifos ethyl dao động từ 1,3 - 7,1g/L (TB 4,7 g/L) ở ruộng phun đơn Mondeo 60EC và từ 0,2 - 25,2g/L (TB 9,1g/L) ở ruộng phun hỗn hợp thuốc. Một ngày sau phun, nồng độ thuốc giảm đáng kể; ở ruộng phun Bascide 50EC Fenobucarb đã dưới ngưỡng phát hiện (0,3g/L) nhưng ở ruộng phun đơn Chlorpyrifos ethyl và phun hỗn hợp vẫn còn phát hiện dư lượng thuốc. Những ngày sau đó, dư lượng tất cả các hoạt chất đều dưới ngưỡng phát hiện (Bảng 3.4). 19
Bảng 3.4: Nồng độ (g/L) thuốc trong nước trên các ruộng thí nghiệm Thời gian Sử dụng đơn chất Sử dụng kết hợp 2 hoạt chất Fenobucarb Chlorpyrifos ethyl Fenobucarb Chlorpyrifos ethyl Trước khi phun 1 giờ < DLF < DLChl < DLF < DLChl Sau khi phun 1 giờ 14-291 1,3-7,1 10,5-272 0,2-25,2 1 ngày < DLF 0,3-1,7 3,3-68,8 0,3-0,7 3 ngày < DLF < DLChl < DLF < DLChl 5 ngày < DLF < DLChl < DLF < DLChl DLF = 0,3 g/L, DLChl = 0,03 g/L Ở các ruộng thí nghiệm, thuốc được phun ở liều cao nhất trên nhãn và được đong bằng ly nhựa kèm theo chai; nước được đong vào bình phun bằng cách ước chừng nên không thật sự chính xác giữa các ruộng. Mật độ lúa không đồng đều, dao động từ 80-120 cây lúa/m2 cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ thuốc rơi xuống nước. Mặt đất ruộng không thật sự bằng phẳng dẫn đến độ sâu ngập khác nhau. Có thể các yếu tố trên là nguyên nhân góp phần gây biến động nồng độ hai hoạt chất trên ruộng ở 1 giờ sau khi phun. 3.3.3 Ảnh hưởng của sử dụng Bascide 50EC và Mondeo 60EC cho lúa đến ChE trong não cá lóc  Ở nghiệm thức chỉ phun Bascide 50EC, Trước khi phun thuốc Bascide 50EC, trung bình ChE của cá Lóc ở các ruộng thí nghiệm là 7,3±0,3µM/g/phút. Sau 1 ngày phun thuốc, trung bình tỷ lệ ChE bị ức chế so với trước phun là 24,2% (p0,05, Duncan Test). 20