Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Điều tra thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên, nghiên cứu nuôi trồng loài Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes)

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:29

Thêm vào BST

Báo xấu

45
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xác định được thành phần, tính đa dạng các loài nấm ĐTHT tại VQG Hoàng Liên và cơ sở khoa học trong việc nuôi trồng loài nấm ĐTHT bông tuyết (Isaria tenuipes).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Điều tra thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên, nghiên cứu nuôi trồng loài Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes)

1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Nhóm nấm Đông trùng hạ thảo (ĐTHT) được đánh giá cao về giá trị dược liệu nhờ có hợp chất cordycepin trong thể quả nấm. Đây là hợp chất có khả năng ức chế hoạt động của các tế bào ung thư. Nấm còn có tác dụng chống viêm và giàu khoáng... Như vậy giá trị của loài nấm ĐTHT là vô cùng quý giá. Tuy nhiên khu hệ nấm ở Vườn Quốc gia Hoàng Liên còn chưa có nhiều nghiên cứu. Những hiểu biết về đa dạng thành phần loài, đặc điểm sinh học và giá trị sử dụng còn đang rất hạn chế. Việc nhân nuôi nguồn dược liệu quý, mở ra một hướng đi mới trong việc phát triển kinh tế, tạo sản phẩm du lịch đặc trưng mang thương hiệu ĐTHT Sapa. Do vậy, đề tài: “Điều tra thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên, nghiên cứu nuôi trồng loài Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes) đặt ra là rất cần thiết, có ý nghĩa cả về lý luận và thực tiễn. 2. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Xác định được thành phần, tính đa dạng các loài nấm ĐTHT tại VQG Hoàng Liên và cơ sở khoa học trong việc nuôi trồng loài nấm ĐTHT bông tuyết (Isaria tenuipes). Mục tiêu cụ thể: Xac đinh đ ́ ̣ ược thành phần loài nấm ĐTHT tại VQG Hoàng Liên. Xac đinh đ ́ ̣ ược tính đa dạng và đặc điểm sinh học của các loài nấm ĐTHT thu được tại VQG Hoàng Liên. Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng loài nấm ĐTHT bông tuyết trên giá thể nhân tạo. 3. Đối tương, phạm vi nghiên cứu
2 Giới hạn đối tượng nghiên cứu Nhóm nấm Đông trùng hạ thảo tại VQG Hoàng Liên. Nấm Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes). Giới hạn địa điểm nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu được giới hạn trong phạm vi VQG Hoàng Liên, tỉnh Lào Cai. Phân lập và nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo tại phòng thí nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam. 4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và đóng góp mới của luận án 4.1. Ý nghĩa khoa học: Đóng góp các dữ liệu khoa học về thành phần loài, tính đa dạng và đặc điểm sinh học của nấm ĐTHT; góp phần xây dựng luận cứ khoa học cho việc nuôi trồng thành công thể quả đệm loài nấm ĐTHT bông tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn: (1) Kết quả nghiên cứu của luận án xác định được thành phần loài nấm ĐTHT tại VQG Hoàng Liên, tỉnh Lào Cai. (2) Xác định được cơ sở khoa học và xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng thành công loài nấm ĐTHT bông tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo. 4.3. Những đóng góp mới của luận án (1) Lần đầu tiên xác định được danh mục gồm với 15 loài Đông trùng hạ thảo thuộc 3 chi gồm: Cordyceps, Isaria (Cordycipitaceae) và Ophiocordyceps (Ophiocordycipitaceae) và ba loài nấm ký sinh côn trùng ở giai đoạn vô tính thuộc 2 chi: Metarhizium (Clavicipitaceae) and Beauveria (Cordycipitaceae). Quá trình phân lập đã phát hiện hai mẫu nấm mới cho khoa học là Beauveria sp. và Isaria sp. Mô tả chi tiết đặc
3 điểm hình dạng, sinh thái và các chỉ số đa dạng sinh học của các loài nấm thu thập được. (2) Nghiên cứu nuôi trồng thành công thể quả đệm I. tenuipes trên giá thể nhân tạo: giá thể rắn, giá thể lỏng và trên nhộng tằm. Nhiễm nấm vào sâu non nhộng tằm ở tuổi 5 (trước khi hóa nhộng) cho kết quả tốt nhất. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1. 1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 1.1.1. Nghiên cứu về phân loại, thành phần loài. Năm 1843, Berkeley xuất bản kết quả nghiên cứu về một loài nấm ĐTHT và đặt tên nấm là Sphaeria sinensis. Đến năm 1878, tên này được đổi là Cordyceps sinensis bởi Pier Andrea Saccardo. Năm 2007, khi sử dụng phương pháp sinh học phân tử để phân loại đã tạo ra tên gọi cho một họ mới là Ophiocordycipitaceae và việc chuyển một số loài Cordyceps sang chi Ophiocodyceps (Sung et al., 2007). Nhóm nấm ĐTHT được xác định khoảng 700 loài. Các loài trên được xếp trong 162 đơn vị phân loại, gồm các chi chủ yếu là: Cordyceps, Elaphocordyceps, Metacordyceps và Ophiocordyceps thuộc 2 họ Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae (Sung et al., 2007). Chi Isaria bao gồm các loài phân bố khá rộng và thường gặp. Đến năm 2007, nghiên cứu của Sung đã xếp Isaria thuộc ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Cordycipitaceae. 1.1.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học Chất Trichothecene mycotoxin tách chiết từ quả thể của Isaria japonica có tác dụng trong chữa trị đối với người người bị bệnh bạch cầu. Sakakura et al., 2005 [54] đã phát hiện hợp chất mới chống oxy hóa pseudodipeptide và tiền chất của nó được chiết xuất từ I. japonica.
4 Các hoạt chất sinh học có trong Isaria đã được nghiên cứu ứng dụng ở nhiều nước trên thế giới. (Sano et al., 1995) đã phát hiện trong các chất trao đổi tách chiết từ Isaria sinclairii có cơ chế ức chế miễn dịch để tổng hợp bất đối xứng ISPI (Myriocin, Thermozymocidin). Theo kết quả nghiên cứu của (Kikuchi et al., 2004) cho thấy nấm I. tenuipes chứa Paecilomycine A, B và C là các hoạt chất có hoạt tính sinh học cao 1.1.3. Nghiên cứu về giá trị dược liệu Nấm Đông trùng hạ thảo được dùng để điều trị thành công các chứng rối loạn lipit máu, viêm phế quản, hen phế quản, viêm thận, suy thận, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp và thiểu năng sinh dục... Nấm Cordyceps có thể nâng cao sức luyện tập, khả năng chịu đựng và làm giảm mệt mỏi ở những người trong độ tuổi 40 70. Nấm I. tenuipes có giá trị cao về mặt dược liệu. Các hoạt chất Ergosterol peroxide và Acetoxyscirpenediol tách chiết từ nấm I. tenuipes có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư ở người như tế bào khối u dạ dày, tế bào ung thư gan. Hợp chất 4acetyl12,13epoxyl9 trichothecene3,15diol của nấm I. tenuipes đang được dùng để điều trị bệnh ung thư, đặc biệt là bệnh máu trắng ở các nước trên thế giới (Paea et al., 2003). 1.1.4. Nghiên cứu về nuôi cấy sinh khối hệ sợi và nuôi trồng thể quả đệm trên giá thể nhân tạo Thái Lan đã nghiên cứu phân lập và sự sinh trưởng của hệ sợi và hình thành bào tử chồi của nấm Cordyceps unilateralis ký sinh kiến. Khả năng nhân sinh khối của I. tenuipes trên các môi trường khác nhau đã được quan tâm nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới. Khi nhân
5 sinh khối các điều kiện nuôi như nguồn dinh dưỡng cacbon, khoáng, nitơ và độ pH ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển của nấm. Theo Ji và cộng sự, 2011, dạng bào tử vô tính Isaria tenuipes đã được nuôi cấy trên môi trường có chứa nhộng tằm, kết quả cho thấy tỷ lệ sống cao nhất đạt 97,6% trên các giống tằm được thử nghiệm. 1.2. Nghiên cứu về nấm ĐTHT ở Việt Nam 1.2.1. Nghiên cứu về thành phần loài Đến nay ở Việt Nam đã có 38 công trình nghiên cứu, hiện đã công bố có 85 loài, 18 chi thuộc 3 họ của bộ Hypocreales; trong đó họ Clavicipitaceae có 35 loài, họ Cordycipitaceae có 20 loài, và họ Ophiocordycipitaceae có 30 loài. Có 55 dạng loài chưa định danh đến loài. 1.2.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học và giá trị dược liệu Phạm Quang Thu (2011) đã xác định các chủng nấm C. militaris đều sản sinh ra hợp chất cordycepin trong dịch nuôi cấy. Theo Lê Thị Thu Hiền (2015) ĐTHT có tác dụng chống ung thư và việc sử dụng kết hợp với một số phương pháp khác như hóa trị, xạ trị có tác dụng ngăn chặn di căn của tế bào ung thư. 1.4.3. Nghiên cứu về nuôi trồng Phạm Quang Thu (2011) đã nghiên cứu và xây dựng thành công quy trình nuôi trồng nấm ĐTHT C. militaris trên giá thể. Điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng hệ sợi của nấm C. militaris là môi trường P55, pH = 6,5%, nhiệt độ 200C, ẩm độ 80%, (Nguyễn Thị Mi et al., 2015). Nguyễn Mậu Tuấn và cộng sự, 2013 đã nghiên cứu sản xuất nấm ĐTHT tằm dâu, P. tenuipes trên giá thể nhộng tằm, Bombyx mori L. Nhận xét chung:
6 Các nghiên cứu về thành phần loài, thành phần hóa học, giá trị dược liệu và nuôi trồng được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới và đạt được kết quả tốt. Ở Việt Nam đến nay đã có 38 công trình nghiên cứu, hiện đã công bố có 85 loài, 18 chi thuộc 3 họ của bộ Hypocreales. Các nghiên cứu trong nước cũng đã hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi cấy thành công một số loài nấm ĐTHT có dược tính quý và ứng dụng thành công một số loài nấm ký sinh côn trùng trong phòng trừ sinh học. Tuy nhiên chưa có một công trình nghiên cứu chi tiết, đầy đủ và mang tính hệ thống về ĐTHT tại VQG Hoàng Liên và về nuôi trồng ĐTHT bông tuyết (I. tenuipes) trên giá thể nhân tạo.
7 Chương 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu 2.1.1. Nghiên cứu thành phần loài nấm ĐTHT tại VQG Hoàng Liên Điều tra, thu mẫu, xác định mẫu nấm ĐTHT. Mô tả, giám định các loài ĐTHT thu được ở khu vực nghiên cứu Lập danh lục các loài nấm ĐTHT thu được 2.1.2. Xác định các chỉ số đa dạng các loài nấm Đông trùng hạ thảo Các chỉ số đa dạng bao gồm: Đa dạng về thành phần loài, tần suất xuất hiện, đa dạng về phân bố, đa dạng về ký chủ, đa dạng về giá trị dược liệu 2.1.3. NC nuôi trồng nấm ĐTHT bông tuyết trên giá thể nhân tạo (1) Nghiên cứu môi trường thích hợp tạo giống gốc (2) Nghiên cứu nuôi trồng thể quả đệm trên giá thể lỏng Nghiên cứu môi trường dịch thể tối ưu cho nuôi trồng thể quả đệm Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sinh trưởng và phát triển của nấm Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng và phát triển của nấm. (3) Nghiên cứu nuôi trồng thể quả đệm trên giá thể rắn Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình nhân giống dịch thể Nghiên cứu khả năng hình thành thể quả đệm trên giá thể rắn (4) Nghiên cứu nuôi trồng thể quả đệm trên giá thể nhộng tằm 2.1.4. XD HDKT nuôi trồng nấm ĐTHT bông tuyết trên giá thể nhân tạo 2.2. Vật liệu nghiên cứu
8 Các loài nấm ĐTHT tại VQG Hoàng Liên Nấm ĐTHT bông tuyết (Isaria tenuipes) 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp điều tra thu mẫu và giám định mẫu thu được Điều tra thành phần theo phương pháp của Phạm Quang Thu (2011). Định danh bằng khóa phân loại của Sung (2007), Kobayasi (1982), Sung (2000). Đồng thời sử dụng phương pháp sinh học phân tử. 2.3.2. Phương pháp xác định các chỉ số đa dạng + Đa dạng về thành phần loài, tần suất xuất hiện: Các loài nấm thu được trong khu vực điều tra được phân tích đánh giá theo % số loài thuộc các chi nấm. Tần suất xuất hiện của loài được chia làm 3 cấp: rất phổ biến > 30%, khá phổ biến 10% ≤ 30% và ít phổ biến
9 + Đa dạng về ký chủ: Căn cứ vào đặc điểm hình thái của các loài côn trùng bị nấm ký sinh, đối chiếu với các chuyên khảo về các loài côn trùng. Xác định côn trùng bị ký sinh đến bộ, trong trường hợp mẫu còn nguyên vẹn có thể xác định đến giống hoặc đến loài. + Đa dạng về giá trị dược liệu: Giá trị sử dụng và giá trị dược liệu của nấm trên cơ sở tổng quan tài liệu của các tác giả Mao (2000). 2.3.3. Phương pháp nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm ĐTHT bông tuyết trên giá thể nhân tạo 2.3.3.1. Phương pháp nghiên cứu môi trường thích hợp tạo giống gốc Bốn loại môi trường được dùng để thử nghiệm sản xuất giống: CT1: Môi trường dinh dưỡng có chứa agar: PDA, CT2: 40 g Glucoze, 10 g pepton, 0,5 g MgSO4.7H2O, 0,5 g K2HPO4, 0,5 g KH2PO4, 10 g Yeast extract và bổ sung nước đủ 1 lít dung dịch, CT3: Nhộng tằm nguyên con, CT4: 150 g gạo lứt ngâm + 10% bột nhộng tằm khô + 80 100 ml H2O 2.3.3.2. Phương pháp nghiên cứu nuôi trồng thể quả đệm trên giá thể lỏng a. Phương pháp nghiên cứu môi trường dịch thể tối ưu cho nuôi trồng thể quả đệm. Thí nghiệm được thực hiện trên 3 môi trường dịch thể: CT1 40 g glucose + 10 g peptone + 0,5 g KH2PO4 + 0,5 g K2HPO4.3H2O, + 0,5 g MgSO4.7H2O + 10 g yeast extract + H2O đủ 1 lít dung dịch CT2 30 g glucose + 3 g peptone + 0,5 g KH 2PO4 + 0,5 g (NH4)2SO4, + 0,5 g MgSO4.7H2O + 1 g yeast extract + 0,5 mg B1 + H2O đủ 1 lít dung dịch CT3 30 g glucose + 3 g peptone + 0,5 g KH2PO4 + 0,5 g K2HPO4.3H2O, + 0,5 g MgSO4.7H2O + 3 g yeast extract + 5 g bột nhộng tằm + H2O đủ 1 lít dung dịch b. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sinh trưởng và phát triển của nấm, thí nghiệm với 3 CT: 15oC, 20oC, 25oC.
10 c. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng và phát triển của nấm. Các thang pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. 2.3.3.3. Phương pháp nghiên cứu nuôi trồng qua th ̉ ể đệm trên gia thê ́ ̉ rắn a. PP nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình nhân giống Chọn môi trường thích hợp nhất cho sinh trưởng của hệ sợi theo kết quả của mục 2.3.4.2 (a) Thí nghiệm thực hiện với 6 công thức lắc như sau: 100, 120, 150, 170, 190 và 210 vòng/phút. b. PP nghiên cứu khả năng hình thành thể quả đệm trên giá thể rắn Thí nghiệm được chuẩn bị với 8 công thức sau: CT 1 Cơm + 1% bột nhộng tằm CT 2 Cơm + 2% bột nhộng tằm CT 3 Cơm + 3% bột nhộng tằm CT 4 Bột ngô + 1% bột nhộng tằm CT 5 Bột ngô + 2% bột nhộng tằm CT 6 Bột ngô + 3% bột nhộng tằm CT 7 20g gạo lứt+ 25ml môi trường lỏng (40 g glucose + 10 g peptone + 0,5 g KH2PO4 + 0,5 g K2HPO4.3H2O, + 0,5 g MgSO4.7H2O + 10 g yeast extract + H2O đủ 1 lít dung dịch) CT 8 20 g Bột ngô + 25 ml môi trường lỏng (40 g glucose + 10 g peptone + 0,5 g KH2PO4 + 0,5 g K2HPO4.3H2O, + 0,5 g MgSO4.7H2O + 10 g yeast extract + H2O đủ 1 lít dung dịch) 2.3.3.4. PP nghiên cứu nuôi trồng quả thê đ ̉ ệm trên gia thê nh ́ ̉ ộng tằm Thí nghiệm được thực hiện với 3 công thức: CT1: Nhiễm nấm từ giai đoạn nhộng tằm bằng cách tiêm dịch giống CT2: Nhiễm nấm từ giai đoạn nhộng tằm bằng cách phun dịch giống
11 CT3: Nhiễm nấm từ giai đoạn sâu non tuổi 5 2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu Xử lý số liệu bằng phần mềm Excel, GenStat 12.1. 2.4. Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm ĐTHT với các giải pháp liên hoàn gồm sử dụng giống gốc chất lượng cao, kỹ thuật nhân giống gốc, kỹ thuật nhân nuôi thể quả đệm trên các loại môi trường tối ưu. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thành phần loài nấm ĐTHT tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên 3.1.1. Kết quả điều tra thành phần loài nấm ĐTHT tại VQG Hoàng Liên Dựa vào đặc điểm hình thái, đặc điểm của bào tử vô tính, hữu tính, đặc điểm của hệ sợi, giám định mẫu được dựa trên các khóa phân loại, chuyên khảo thu được kết quả bảng 3.1 và 3.2 Bảng 3.1: Thành phần loài nhóm nấm Đông trùng hạ thảo ở VQG Hoàng Liên Lào Cai TT Tên loài nấm Ký chủ 1 Cordycipitaceae 1.1 Cordyceps Cordyceps cardinalis G.H. Sung & Spatafora, Sâu non bộ Cánh vảy 1 2004. 2 Cordycep militaris (L.) Link, 1833. Nhộng bộ Cánh vảy Cordyceps pseudomilitaris HywelJones & Sâu non bộ Cánh vảy 3 Sivichai, 1994. Cordyceps takaomontana Yakush. & Kumaz., Nhộng bộ Cánh vảy 4 1941. 1.2 Isaria 5 Isaria cateniannulatus (Z.Q. Liang) Samson & Nhộng bộ Cánh vảy
12 TT Tên loài nấm Ký chủ HywelJones, 2005. 6 Isaria tenuipes Peck., Nhộng bộ Cánh vảy 7 Isaria sp., Nhộng bộ Cánh vảy 1.3 Ophiocordycipitaceae 1.3. Ophiocordyceps 1 Ophiocordyceps annullata (Kobayasi & Sâu non bộ Cánh 8 Shimizu) cứng Spatafora, Kepler & Quandt, 2015. Ophiocordyceps crinalis (Ellis ex Lloyd) G.H. Sâu non bộ Cánh vảy 9 Sung, J.M. Sung, HywelJones & Spatafora, 2007. Ophiocordyceps formicarum (Kobayasi) G.H. Trưởng thành bộ 10 Sung, J.M. Sung, HywelJones & Spatafora, Cánh màng 2007. Ophiocordyceps formosana (Kobayasi & Sâu non bộ Cánh vảy 11 Shimizu) Wang, Tsai, Tzean & Shen, 2015. Ophiocordyceps myrmecophila (Cesati) G.H. Trưởng thành bộ 12 Sung, J.M. Sung, HywelJones & Spatafora, Cánh màng 2007. Ophiocordyceps nutans (Pat.) G.H. Sung, J.M. Trưởng thành bộ 13 Sung, HywelJones & Spatafora, 2007. Cánh nửa cứng Ophiocordyceps oxycephala (Penz. & Sacc.) Trưởng thành bộ 14 G.H. Sung, J.M. Sung, HywelJones & Cánh màng Spatafora, 1897. Ophiocordyceps sphecocephala (Klotzsch ex Trưởng thành bộ 15 Berk.) G.H. Sung, J.M. Sung, HywelJones & Cánh màng Spatafora, 2007. Bảng 3.2: Thành phần loài nhóm nấm ký sinh côn trùng ở VQG Hoàng Liên Lào Cai TT Tên loài nấm Ký chủ 1 Clavicipitaceae 1.1 Metarhizium Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin, Trưởng thành bộ Bọ 1 1883. que 2 Cordycipitaceae 1.2 Beauveria 2 Beauveria bassiana (Bals.Criv.) Vuill., 1912. Sâu non, trưởng thành
13 TT Tên loài nấm Ký chủ bộ Cánh vảy, bộ Cánh cứng 3 Beauveria sp., Nhộng bộ Cánh vảy Kết quả giám định trên cho thấy thành phần loài nấm ĐTHT ở VQG Hoàng Liên là rất phong phú với với 15 loài Đông trùng hạ thảo thuộc 3 chi gồm: Cordyceps, Isaria (Cordycipitaceae) và Ophiocordyceps (Ophiocordycipitaceae) và ba loài nấm ký sinh côn trùng ở giai đoạn vô tính thuộc 2 chi: Metarhizium (Clavicipitaceae) and Beauveria (Cordycipitaceae). Quá trình phân lập đã phát hiện hai mẫu nấm mới cho khoa học là Beauveria sp. và Isaria sp. Sau khi đã giải trình tự gene bằng cặp mồi ITS1 và ITS4. Ký chủ của nấm ĐTHT tại VQG Hoàng Liên Kết quả điều tra ký thu được các mẫu nấm gồm 18 loài ĐTHT ký sinh trên 5 bộ côn trùng khác nhau đó là bộ Bọ que (Phasmatodea), bộ Cánh vảy (Lepidoptera), bộ Cánh cứng (Coleoptera), bộ Cánh nửa cứng (Hemiptera) và bộ Cánh màng (Hymenoptera). 3.1.2. Đặc điểm hình thái và giải phẫu nấm ĐTHT 1. Loài Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin, 1883. Sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn ngang, đường kính 3 4 µm. Sợi nấm phát triển trên bề mặt côn trùng có màu từ trắng đến hồng, cuống sinh bào tử ngắn mọc tỏa tròn trên đám sợi nấm dày đặc. Bào tử trần hình que có kích thước 3,5 x 6,4 x 7,2 µm, màu từ lục xám đến ôliu lục, bào tử xếp thành chuỗi khá chặt chẽ và nhìn bằng mắt thường có thể thấy bào tử được tạo ra trên bề mặt cơ thể côn trùng một lớp phấn khá rõ màu xanh lục.
14 2. Loài nấm Beauveria bassiana (Bals.Criv.) Vuill., 1912. Nấm có cơ quan sinh trưởng dạng sợi, phân nhánh, có vách ngăn ngang. Cấu tạo tế bào sợi nấm gồm vách ngăn tế bào, màng tế bào chất và nhân. Sợi nấm có màu trắng mịn và tập hợp nhiều sợi nấm sinh trưởng tạo thành khuẩn lạc. Khuẩn lạc nấm có màu trắng, hình tròn, bề mặt lồi. 3. Loài nấm Beauveria sp. nov. Sợi nấm Beauveria sp. nov. có màu trắng, sợi ngắn mọc bao phủ toàn bộ cơ thể côn trùng và trên đó có đính các hạt bột màu trắng. Bào tử vô tính có hình trứng nối với nhau thành chuỗi, bào tử non không màu, khi già chuyển màu vàng, kích thước không đồng nhất từ 2,03,5 x 1,02. Từ kết quả giải trình tự gen cho thấy loài Beauveria sp. nov. có quan hệ gần với các loài Beauveria amorpha, Beauveria vermiconia và Beauveria caledonica. Tuy nhiên, Beauveria sp. nov. nằm ở một nhánh phân loại chị em riêng biệt so với ba loài trên với giá trị lặp lại (bootstrap value) đạt 70%, thể hiện đây là một loài mới thuộc chi Beauveria. 4. Loài nấm Cordyceps cardinalis G.H. Sung & Spatafora, 2004. Các mẫu nấm thu được có màu cam đỏ đến đỏ, thường có từ 1 26 thể quả đệm (stromata) trên mỗi ký chủ. Thể quả đệm thường dài 1 5 cm và rộng 0,5 1,5 mm. Thể quả đệm thường mọc trên cơ thể sâu non. Phía đầu phình ra, kích thước 29 x 14 mm. Thể quả hình trùy và bán bầu dục. Các nang bào tử túi có một mũ riêng biệt. Bào tử túi có các vách ngăn không đều nhưng không bị rời ra thành các bào tử riêng rẽ. 5. Loài nấm Cordyceps militaris (L.) Link, 1833. Mẫu nấm thu được đều có màu vàng da cam. Thể quả đệm dài 2 8 cm, hình chùy, phần chân và cuống nhỏ mọc lên từ thân hoặc đầu của nhộng; phần đầu (phần sinh sản) phình to, chiều rộng đến 0,5cm. Màu
15 sắc của phần cuống nấm và phần sinh sản khác nhau. Phần cuống nấm nhẵn có màu da cam nhạt, phần sinh sản có màu da cam đậm và có nhiều mụn nhỏ. Thể quả dạng chai (perithecia) được gắn rất lỏng lẻo trên bề mặt hoặc cắm sâu một phần vào mô của nấm ở phần sinh sản. Túi bào tử (asci) có kích thước 300500 x 35 m; phần mũ gắn trên túi thể quả có kích thước 3,5 5,0 m. Bào tử túi (ascospores) dài dạng sợi chỉ và đứt thành các đoạn bào tử hình trứng dài, có kích thước 2,04,1 x 1,01,5 m. 6. Loài nấm C. pseudomilitaris HywelJones & Sivichai, 1994. Thể quả đệm mọc đơn lẻ hay phân nhánh từ đầu và mình của sâu non bộ Cánh vảy, chiều dài 15 30 mm, đường kính 0,9 3 mm, chất thịt màu cam, phía đầu chứa các cơ quan sinh bào tử hình trụ hay hình chùy, kích thước chiều dài 2 8 mm, chiều rộng 1,2 4,0 mm. 7. Loài Cordyceps takaomontana Yakush. & Kumaz, 1941. Mẫu nấm thu được ký sinh trên nhộng, nằm hoàn toàn dưới đất. Chúng được phát hiện thấy cả giai đoạn hữu tính với tên gọi là Cordyceps takaomontana và giai đoạn vô tính được xác định là Isaria tenuipes (Paecilomyces tenuipes) trên cùng ký chủ. Giai đoạn hữu tính tồn tại dưới dạng cây nấm màu vàng nhạt, mọc đơn lẻ hoặc mọc cụm, hình chày có kích thước dài 1,04,5 x 0,10,2 cm, chia làm 2 phần rõ ràng gồm cuống nấm hình trụ và đỉnh nấm. 8. Isaria cateniannulatus (Liang) Samson & HywelJones, 2005. Thể quả đệm có màu trắng và chia làm 2 phần, phần cuống dài khoảng 1/2 chiều dài cuống, phía trên phình to, là đỉnh sinh sản của nấm, phồng căng chứa bào tử nấm vô tính dạng hạt, màu trắng, khô và dễ phát tán khi có tác động. Nhìn tổng thể nấm bông trắng, chiều dài cây nấm khoảng 1,5 3,0 cm, số lượng nấm trên nhộng thường nhiều
16 và mọc cụm. Bào tử có nhiều hình dạng khác nhau hình hạt gạo hoặc hình bầu dục, kích thước bào tử chiều dài 1,8 3,5 µm chiều rộng 0,5 1,5 µm. 9. Loài nấm Isaria tenuipes Peck. Isaria tenuipes (Paecilomyces tenuipes) là giai đoạn vô tính còn Cordyceps takaomontana là giai đoạn hữu tính trên cùng ký chủ. Thể quả đệm có màu trắng sữa và chia làm 2 phần, phần cuống dài bằng 3/4 chiều dài nấm có màu vàng chanh, phần trên là đỉnh sinh sản của nấm hay còn gọi là phần tế bào sinh bào tử, phân thành nhiều nhánh dạng san hô phồng căng chứa bào tử nấm vô tính dạng hạt bụi màu trắng, khô và dễ phát tán khi va chạm. Quan sát tổng thể thấy cây nấm bông trắng, chiều dài cây nấm khoảng 0,5 4,0 cm, số lượng nấm trên nhộng thường nhiều và mọc cụm. Bào tử có nhiều hình dạng khác nhau hình hạt gạo hoặc hình hạt đậu, kích thước bào tử chiều dài 2,0 3,3 µm chiều rộng 0,5 1,2 µm. 10. Loài nấm Isaria sp.nov. Thể đệm có màu trắng vàng và chia làm 2 phần, phần cuống dài bằng 3/4 4/5 chiều dài nấm có màu vàng đậm, phần trên là đỉnh sinh sản của nấm hay còn gọi là phần tế bào sinh bào tử, phân thành nhiều nhánh dạng san hô chứa bào tử vô tính dạng hạt bụi màu vàng nhạt, khô và dễ phát tán khi va chạm. Bào tử có nhiều hình dạng khác nhau hình hạt gạo hoặc hình hạt đậu, kích thước bào tử chiều dài 1,8 3,2 µm chiều rộng 0,5 1,3 µm. Nấm được tìm thấy dưới lớp lá rụng của rừng tự nhiên, phía dưới của các cây bụi. 11. Loài nấm Ophiocordyceps annulata (Kobayasi & Shimizu) Spatafora, 2015. Thể quả đệm mọc trên đầu hoặc thân sâu non, có màu vàng đến vàng đậm. Một nửa phần dưới của thể quả đệm hình trụ, có màu hơi
17 đậm hơn, 1/2 phía trên thể quả đệm có màu vàng và phình to. Chúng mọc thành cụm trên ký chủ, chiều dài của thể quả đệm từ 2 5 cm, phần đỉnh của thể quả đệm nhỏ dần lên phía ngọn. 12. Loài nấm Ophiocordyceps crinalis (Ellis ex Lloyd) G.H. Sung, J.M. Sung, HywelJones & Spatafora, 2007. Thể quả đệm mọc trên thân sâu non của sâu róm dài và mảnh. Một nửa phần dưới của nấm có màu trắng nâu, 1/2 phía trên nấm có màu trắng sữa, nấm mọc thành cụm trên ký chủ và thân nấm phân thành nhiều nhánh. Chiều dài của nấm từ 5 7 cm, nấm nhỏ dần lên phía ngọn. Có nhiều thể quả đệm (stromata) trên ký chủ, trên mỗi thể quả đệm chứa nhiều thể quả (Perithecium). Bào tử túi dài thành chuỗi có vách ngăn giống như các đoạn bào tử nối với nhau nhưng không bị tách rời thành từng đoạn bào tử. Bào tử được đựng trong túi bào tử. 13. Loài nấm Ophiocordyceps formicarum (Kobayasi) G.H. Sung, J.M. Sung, HywelJones & Spatafora, 2007. Thể quả đệm mọc ra từ hầu hết các bộ phận của ký chủ: phần cổ, bụng và đuôi của ký chủ. Nấm có màu trắng vàng, nhỏ dài và mảnh được chia thành 2 phần, phần cuống trơn hình trụ dài 3/4 1/2 chiều dài nấm, phần trên là phần đỉnh nấm chứa các cơ quan sinh bào tử trên đó được bao bọc quanh bởi các gai nhú lên khỏi bề mặt đó là thể bó, phía trong gai chứa đựng rất nhiều túi bào tử, chiều dài của nấm 0,7 1 cm. Trên một ký chủ có thể mọc 8 11 cây nấm. Bào tử nấm dài mảnh bện vào nhau, dễ bị đứt thành các đoạn bào tử, đoạn bào tử hình thuôn dài, nhọn 2 đầu ở giữa phình to. 14. Loài nấm Ophiocordyceps formosana (Kobayasi & Shimizu) Wang, Tsai, Tzean & Shen, 2015 Thể quả đệm hay thể sinh bào tử túi (Ascostromata) mọc từ đầu hoặc thân ký chủ côn trùng bị nhiễm nấm, cuống thể quả dài, hình trụ,
18 kích thước 1030 x 0,52 mm, có màu cam và phủ lớp lông ngắn nhưng không có vỏ màng. Các đầu thể quả hình thuôn, kích thước 46 x 14 mm và phần lớn là các mô biểu bì chất thịt giả. Cơ quan sinh bào tử nằm bên trong thể quả đệm hình trứng và có màu cam nâu, kích thước 360480 x 240320 ? với cổ ngắn, với miệng cổ (ostioles) rộng 60 ?. Vách cơ quan sinh bào dày 20 ?, phía dưới dày 40 ?. Túi bào từ hình trụ dài, kích thước 6,57,9 x 160240 ?, chứa 8 bào tử túi không màu, khi thành thục bào tử bị đứt đoạn thành 1020 đoạn bào tử bằng đầu, hình trụ, kích thước 2,63,0 x 6,57,3 ?. 15. Loài nấm Ophiocordyceps myrmecophila (Ces.) G.H. Sung, J.M. Sung, HywelJones & Spatafora, 2007. Loài nấm này có thể quả đệm đơn độc hoặc mọc thành cụm, chúng mọc lên từ thể ký sinh, phần đỉnh phình ra, màu vàng nhạt, thường dài 0,5 1,5 cm, có hình trái xoan, dày 0,1 0,25 cm. Cuống đàn hồi, dài 0,05 cm. Nang quả hình oval, chìm sâu trong mô, kích thước 600 x 250 μm. Nang có kích thước 300 x 6 μm. 16. Loài nấm Ophiocordyceps nutans (Pat.) G.H. Sung, J.M. Sung, HywelJones & Spatafora, 2007. Thể quả đệm mảnh nhỏ hình chùy được mọc từ phần đầu và phần cuối của bụng bọ xít trưởng thành. Cuống của nấm màu nâu hơi đen, phần hình chùy và phần trên của nấm, chiếm ¼ chiều dài của cả cây nấm có màu đỏ da cam đặc trưng. Số lượng nấm nấm trên một con bọ xít có từ 1 đến 5, chiều dài từ 90 140 mm, chiều ngang 2 2,5 mm. Trên phần sinh sản màu đỏ da cam chứa thể quả đệm dạng chai, chìm sâu, vách không màu, mọc xiên, cổ cong, miệng thể quả đệm vẫn nhìn thấy trên thể hình chùy. Kích thước của thể quả đệm 550810 x 130210 m. Túi bào tử hình trụ, kích thước chiều dài 760 780 m, đường kính 7 8 m. Mỗi túi bào tử chứa 8 bào tử.
19 17. Loài nấm Ophiocordyceps oxycephala Penz. & Sacc., 1897. Thể quả đệm mảnh, dài, nhọn ở phía đầu, toàn bộ thể quả đệm được bao phủ bởi lớp lông mịn. Nấm ký sinh trên Ong đất thuộc bộ cánh màng (Hymenoptera). Trên mỗi ký chủ có thể có 2 4 nấm, chiều dài 2 4 cm, đường kính 2 2,5 mm. Túi bào tử hình trụ, mỗi túi bào tử chứa 8 bào tử, mỗi bào tử là chuỗi rất nhiều đoạn bào tử dễ gãy đính với nhau, đoạn bào tử hình que, hai đầu nhọn và phình to ở giữa. Kích thước đoạn bào tử dài 10 15 m, rộng 1,5 2,5 m. 18. Loài nấm Ophiocordyceps sphaecocephala: Thể quả đệm mọc đơn độc, dài 3 9 cm, màu vàng nhạt, cuống dai, dày 0,05 1 cm. Đỉnh hình chùy, kích thước 39 x 12 mm, nơi sẽ hình thành các nang quả. Nang quả nằm sâu trong mô hình chai, kích thước 800 x 300 m. Nang hình que, kích thước 500x8 m. Bào tử phân đoạn, có thích thước 610 x 1,5 m. Trong nuôi cấy thuần khiết, hệ sợi nấm hình thành thể quả đệm hoàn chỉnh trên môi trường PDA. 3.2. Đa dạng sinh học và phân bố các loài ĐTHT tại VQG Hoàng Liên 3.2.1. Đa dạng về thành phần loài, tần suất xuất hiện Kết quả thống kê cho thấy loài Beauveria bassiana (Bals.Criv.) Vuill và Isaria tenuipes Peck có tần xuất suất hiện khá phổ biến, lần lượt là 13,77% và 21,74%. Các loài còn lại ở mức ít phổ biến, chiếm chủ yếu từ 2,9 5% tổng số loài thu được. 3.2.2. Đa dạng về phân bố 3.2.2.1. Phân bô theo sinh c ́ ảnh ́ ược trên tất cả các trạng thái rừng là: Metarhizium 3 loai thu hai đ ̀ anisopliae, Beauveria bassiana, Isaria tenuipes, con ̀ 5 loai la: ̀ ̀ Cordyceps cardinalis, Isaria sp. nov., Ophiocordyceps crinalis, Ophiocordyceps
20 sphecocephala được tìm thấy ở rừng nguyên sinh, rừng thứ sinh và trảng cây bụi á nhiệt đới trên núi. Riêng loài mới chưa được mô tả trong khu hệ nấm VQG Hoàng Liên Beauveria sp. nov. và các loài Cordyceps formosana, Cordyceps pseudomilitaris, Ophiocordyceps annullata, ̉ ược tim thây Ophiocordyceps nutans chi đ ̀ ́ ở rưng nguyên sinh. ̀ 3.2.2.2. Phân bô ĐTHT theo đ ́ ộ cao Độ cao thích hợp nhất cho nâm ĐTHT phát tri ́ ển là độ cao từ 1.500 2.000 m và 2000 2.500 m, vơi ́ số mẫu thu được lần lượt là 65 mẫu (47,1%) và 53 mâũ (38,41%). ̣ ̀ 3.2.2.3. Phân bô theo đô tan che ́ Đa số mẫu thu được dưới độ tàn che lớn hơn 0,5 với 92/138 mẫu, chiếm 66,67%; trong khi đó ở độ tàn che từ 0,3 0,5 thu được 37/138 mẫu, chiếm 26,81%; và ở độ tàn che nhỏ hơn 0,3 chỉ tìm được 9/138 mẫu, chiếm 6,52%. 3.2.2.4. Phân bô theo ́ thời gian Số lượng mẫu thu được tập trung tại tháng 6 và tháng 8, nhiều nhất vào tháng 8 với 73 mẫu, chiếm 52,9%, tháng 8 cũng là tháng xuất hiện hầu hết số loài thu được trừ loài Ophiocordyceps myrmecophila chỉ tìm thấy ở tháng 6. Số lượng mẫu thu được ở tháng 4 và tháng 10 là rất thấp, với 03 mẫu (2,17%). 3.2.3. Đa dạng về ký chủ Bảng 3.9. Thanh phân côn trung ky chu ̀ ̀ ̀ ́ ̉ cua các loài nâm ĐTHT ̉ ́ TT Bộ côn trùng ký chủ Sô loài ́ Tỷ lệ (%) 1 bộ Bọ que (Phasmatodea) 1 5,56 2 bộ Cánh vảy (Lepidoptera) 11 61,11 3 bộ Cánh cứng (Coleoptera) 1 5,56 4 bộ Cánh nửa cứng 1 5,56