Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đặc tính sinh học của vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên một số loài cá biển nuôi lồng tại Việt Nam và tạo chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

35
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích cơ bản của luận án này là xác định được một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn P. damselae phân lập từ cá biển Việt Nam. Tạo được chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh Photobacteriosis ở cá biển nuôi lồng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đặc tính sinh học của vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên một số loài cá biển nuôi lồng tại Việt Nam và tạo chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --------------- LÊ MINH HẢI NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN Photobacterium damselae GÂY BỆNH TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ BIỂN NUÔI LỒNG TẠI VIỆT NAM VÀ TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC PHỤC VỤ SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG BỆNH TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội, năm 2018
Công trình được hoàn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Phạm Thị Tâm 2. PGS.TS. Tô Long Thành Phản biện 1. 2. 3. Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ họp tại Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam Có thể tìm kiếm luận án tại thư việdn: 1. Thư Viện Quốc Gia Việt Nam 2. Thư viện của Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Việt Nam có tiềm năng lớn về nuôi trồng thủy sản trên biển, diện tích có khả năng sử dụng phát triển nuôi cá biển bao gồm các vùng vịnh kín, bãi triều ven biển và một phần ở các hải đảo, vùng biển hở. Biển Việt Nam có nhiều loài cá phân bố tự nhiên có thể đưa vào nuôi biển như nhóm cá mú, cá hồng, cá cam, cá tráp, cá giò, cá vược... Trong chương trình nuôi, đến năm 2020 Việt Nam dự kiến đạt sản lượng 200.000 tấn cá biển nuôi trong đó 50.000 tấn là nuôi theo quy mô lớn [16]. Hiện tại, mô hình nuôi cá lồng bè có giá trị kinh tế cao trên biển đang được áp dụng phổ biến ở nhiều vùng ven biển nước ta. Tuy nhiên, việc phát triển mô hình nuôi nhanh về số lượng cũng như về mức độ thâm canh ngày càng cao, tình hình dịch bệnh gây chết cá hàng loạt cũng đã được ghi nhận ngày càng nhiều với tỉ lệ hao hụt cao. Vi khuẩn ưa mặn Photobacterium damselae gây bệnh Photobacteriosis hay Pasteurellosis còn được gọi là xuất huyết nhiễm trùng, hoặc bệnh đốm trắng ở thận trên cá biển [5]. Vi khuẩn P. damselae có thể tấn công và gây bệnh trên cá biển nuôi ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá từ giai đoạn ấu trùng, cá giống đến cá nuôi thương phẩm. Khi bị bệnh cá có thể biểu hiện ở dạng mãn tính và cấp tính, biểu hiện bệnh Photobacteriosis như: gây loét trên da, xuất hiện các nốt kem trắng hoặc u hạt tubercules màu trắng ở một số cơ quan nội tạng, gây hoại tử trong nội tạng, hoại tử tập trung ở thận và lá lách, gây nhiễm trùng và hoại tử rộng rải [146], [41]. Cá bệnh có thể chết sau 5-10 ngày với tỷ lệ chết cao từ 80-100% gây thiệt hại kinh tế ở các nước như: Nhât, Mỹ, Pháp, Tây Ban Nha, Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ,... Ở Việt Nam, theo báo của các tác giả Đỗ Thị Hòa và cs năm 2008, cho thấy các loài cá biển nuôi tại Khánh Hòa, Kiên Giang và các tỉnh phí Bắc đều bị bệnh do vi khuẩn P. damselae và gây thiệt hại lớn cho người nuôi. Hiện nay, người nuôi cá biển sử dụng vắc xin để phòng bệnh còn rất ít do các nghiên cứu và sản xuất còn hạn chế, trên thị trường khan hiếm vắc xin thương mại. Vắc xin phòng bệnh do vi khuẩn P.damselae chủ yếu là ở dạng vô hoạt, sử dụng bằng cách tiêm cho cá, giá thành cao, khó sử dụng cho cá giống kích thước bé. Người nuôi cá biển, chủ yếu sử dụng kháng sinh để trị bệnh do vi khuẩn P. damselae dẫn đến sự kháng thuốc, tồn dư kháng sinh trong sản phẩm. Nhằm giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh, thì nghiên cứu tạo vắc xin phòng bệnh là rất cần thiết. Hiện tại, có nhiều phương pháp để tạo vắc xin, trong đó phương pháp tạo vắc xin nhược độc từ chủng vi khuẩn nhược độc bằng kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm là phương pháp phổ biến và rất hữu hiệu khắc phục được các hạn chế của vắc xin vô hoạt. Xuất phát từ lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc tính sinh học của vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên một số loài cá biển nuôi lồng tại Việt Nam và tạo chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh” làm cơ sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc xin phòng bệnh Photobacteriosis ở cá biển trên quy mô công nghiệp. 2. Mục tiêu đề tài luận án - Xác định được một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn P. damselae phân lập từ cá biển Việt Nam. 1
- Tạo được chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh Photobacteriosis ở cá biển nuôi lồng. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng: Vi khuẩn P. damselae, một số loài cá biển nuôi lồng (cá mú, cá hồng mỹ, cá bớp (cá giò). - Phạm vi nghiên cứu: Các vùng ven biển miền Bắc Việt Nam. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học: - Các kết quả nghiên cứu trong luận án đã xác định được các đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn P. damselae gây bệnh Photobacteriosis ở cá là cơ sở khoa học trong nghiên cứu dịch tễ và xây dựng các giải pháp phòng trị bệnh. - Kết quả tạo vi khuẩn P. damselae giảm độc lực bằng kỹ thuật gây đột biến là cơ sở cho các nghiên cứu tạo các dòng vi khuẩn đột biến phục vụ cho định hướng sản xuất vắc xin nhược độc phòng bệnh cho cá đạt hiệu quả cao. Ý nghĩa thực tiễn: Đề tài đã tạo được chủng vi khuẩn P. damselae giảm độc lực, an toàn, có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ làm nguyên liệu để sản xuất vắc xin phòng bệnh Photobacteriosis cho cá góp phần tăng sản lượng cá nuôi và phát triển bền vững nghề nuôi cá biển ở nước ta. 5. Đóng góp mới của đề tài luận án - Ở Việt Nam đây là công trình nghiên cứu đầu tiên, toàn diện về vi khuẩn P.damselae gây bệnh trên cá biển nuôi lồng, đã phân lập và xác định được 07 chủng vi khuẩn, xác định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn gây bệnh. - Luận án là công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn P.damselae giảm độc lực làm nguyên liệu sản xuất vắc xin phòng bệnh Photobacteriosis ở cá biển. Thành công của nghiên cứu sẽ góp phần giải quyết vấn đề một cách đáng kể việc sử dụng kháng sinh dẫn đến hiện tượng nhờn thuốc và giảm sự tồn dư kháng sinh trong sản phẩm, nâng giá trị sản phẩm cá biển, tăng năng xuất cá biển nuôi lồng. Cấu trúc của luận án: Luận án chính gồm 111 trang với 16 bảng số liệu và 27 hình. Luận án gồm 5 phần: Mở đầu (3 trang); Tổng quan tài liệu (38 trang); Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu (12 trang); Kết quả và thảo luận (56 trang); Kết luận và kiến nghị (1 trang). Luận án tham khảo 183 tài liệu trong đó 22 tài liệu tiếng Việt và 161 tài liệu tiếng Anh. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trong chương này luận án trình bày về tình hình nuôi cá biển trên thế giới và ở Việt Nam; một số bệnh thường gặp trên cá biển nuôi, vi khuẩn P. damselae và bệnh do vi khuẩn P. damselae gây ra trên cá biển: phân loại, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hoá, đặc điểm nuôi cấy, khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn P. damselae, đặc điểm dịch tễ, gen độc tố và các yếu tố gây bệnh, dấu hiệu bệnh lý, các phương pháp phát hiện P. damselae, phòng và điều trị bệnh; Tổng quan về tạo chủng vi khuẩn nhược độc, các phương pháp làm giảm độc vi khuẩn: phương pháp vật lý, 2
phương pháp vi sinh vật học , đột biến bằng kháng sinh rifampicin, giảm độc bằng kỹ thuật gen; Đáp ứng miễn dịch của cá và vắc-xin phòng bệnh: đáp ứng miễn dịch của cá,vắc xin phòng bệnh cho cá (tình hình nghiên cứu trên thế giới, tình hình nghiên cứu trong nước). Vi khuẩn P. damselae có thể tấn công và gây bệnh trên cá biển nuôi ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá từ giai đoạn ấu trùng, cá giống đến cá nuôi thương phẩm. Hiện nay, người nuôi cá biển chủ yếu sử dụng kháng sinh để trị bệnh, nhằm giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh, do đó việc nghiên cứu tạo vắc xin rất cần thiết. Trong các phương pháp tạo vắc xin, phương pháp tạo chủng vi khuẩn nhược độc bằng kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm tạo ra vắc xin nhược độc là phương pháp phổ biến và rất hữu hiệu. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn P. damselae gây bệnh xuất huyết nhiễm trùng trên cá biển nuôi lồng tại vùng biển Việt Nam 2.2. Vật liệu nghiên cứu - Động vật thí nghiệm: Cá mú, cá bớp, cá chẽm, cá hồng nghi mắc bệnh xuất huyết nhiễm trùng thu tại một số khu vực nuôi cá lồng ở vùng biển Việt Nam. Cá gây nhiễm: cá mú đã được kiểm tra sạch đối với các loại bệnh, có khối lượng 60 - 80g, màu sắc tươi sáng, đầy đủ các bộ phận và bơi lội bình thường. - Hóa chất: Các cặp mồi nhân gen 16S RNA, ureC, , hlyA của các chủng vi khuẩn P.damselae; Bộ Kit dùng tách chiết DNA, thang DNA chuẩn; Cột Nikel chelating Resin (Invitrogen); Hóa chất dùng cho nuôi cấy vi khuẩn; Hóa chất tách chiết DNA; Hóa chất cho phản ứng PCR; Hóa chất thực hiện phản ứng ELISA; Hóa chất điện di. Các cặp mồi nhân gen 16s RNA, ureC, , hlyA của các chủng vi khuẩn P.damselae. - Môi trường và dung dịch nuôi cấy vi khuẩn: BHI, TCBS, KIA, peptone kiềm, Marine Agar... Môi trường dùng để pha loãng vi khuẩn: Peptone đệm, nước muối sinh lý. Môi trường dùng cho phản ứng sinh hóa: KIA, Indol, môi trường Muller Hinton, LB lỏng, BHI... 2.3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập một số chủng vi khuẩn P.damselae từ các mẫu cá nước mặn như cá mú, cá chẽm, cá hồng và cá bớp tại một số vùng biển ở miền Bắc Việt Nam - Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập được. - Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn P. damselae đột biến giảm độc lực 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp thu mẫu cá bệnh Phương pháp thu thập, lấy mẫu áp dụng theo TCVN 5276:1990 (Quyết định số 2920 ngày 30/12/2008 của Bộ trưởng Bộ KHCN về việc công bố tiêu chuẩn Quốc gia). 2.4.2. Phương pháp mổ cá để lấy nội tạng (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2008; Bùi Quang Tề, 1998) 2.4.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae (Wang et al. 2007). 2.4.4. Phương pháp giữ giống các chủng vi khuẩn tuyển chọn (Đỗ Thị Hòa và cs, 2008; Nguyễn Lân Dũng và cs, 2012) 3
2.4.5. Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn tuyển chọn (Bakopoulos et al., 1995) 2.4.6. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng nhân lên và sinh độc tố gây dung huyết của vi khuẩn (Phạm Công Hoạt, 2012) 2.4.6.1. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nhiệt độ 2.4.6.2. Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH 2.4.6.3. Phương pháp xác định ảnh hưởng của độ mặn 2.4.7. Phương pháp nghiên cứu đặc tính gây bệnh xuất huyết nhiễm trùng trên cá biển của vi khuẩn P. damselae (Phạm Công Hoạt, 2012) 2.4.8. Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm và xác định LD50 (Reed và Muench, 1938) 2.4.9. Phương pháp tách chiết DNA (Lawson et al., 1989) 2.4.10. Phương pháp Multiplex PCR phát hiện phân biệt P. damselae subsp. Damselae và P. damselae subsp. piscicida (Osorio et al., 2000) 2.4.11. Phương pháp PCR phát hiện gen và hlyA 2.4.12. Phương pháp điện di trên agarose (Sambrook và Russell, 2001) 2.4.13. Phương pháp tạo chủng nhược độc bằng kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm 2.4.13.1. Phương pháp gây giảm độc lực bằng tia cực tím (Preecha et al., 2010). 2.4.13.2. Phương pháp gây giảm độc lực vi khuẩn bằng kháng sinh rifampicin (Gliniewicz et al., 2015). 2.4.14. Đánh giá khả năng gây dung huyết của các dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực (Vaca et al., 2009) 2.4.15. Phương pháp mô bệnh học (Mitchell et al., 2004) 2.4.16. Giải trình tự DNA, xử lý và phân tích số liệu trình tự các gen - Giải trình tự DNA Sau khi PCR nhân các gen quan tâm trình tự các gen được gửi đến địa chỉ Jalan SP 2/7, Taman Serdang Perdana, Seksyen 2, Seri Kembangan 43300, Selangor, Malaysia để giải trình tự. - Xử lý và phân tích số liệu trình tự các gen Sử dụng công cụ Clustal omega của phần mềm trực tuyến EMBL-EBI để đánh giá: Sự sai khác di truyền gen , hlyA của các dòng P.damseale giảm độc lực và chủng gốc và sự sai khác trong trình tự protein suy diễn từ gen của dòng giảm độc lực. 2.4.17. Phương pháp xác định khả năng tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ ở cá của dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực 2.4.18. Phương pháp ELISA xác định kháng thể đặc hiệu (Yoshihito, 2002). Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn P. damselae 3.1.1. Đặc điểm mẫu cá bệnh Trong thời gian từ cuối tháng 2 đến tháng 6 năm 2015 tại một số trang trại nuôi cá biển ở các tỉnh miền Bắc (Hải Phòng;Nam Định; Quảng Ninh), 20 mẫu cá biển (cá mú 7 mẫu, cá bớp 9, cá vược 2 mẫu, cá hồng 3 mẫu) có dấu hiệu bệnh Photobacteriosis (được gọi là xuất huyết nhiễm trùng, hoặc bệnh đốm trắng ở thận trên 4
cá biển) như: cá bơi gần mặt nước hoặc bơi sát lưới, chết rải rác, loét trên da, da tối màu, mang hoại tử, bụng chướng có dấu hiệu bị bệnh (hình 3.1) a b c Hình 3.1. (a), (b) Mẫu cá mú nghi mắc bệnh Photobacteriosis, thu tại Hải Phòng (c) Mẫu cá mú không bị bệnh Trong 20 cá bệnh thu được với biểu hiện bệnh lý bên ngoài khác nhau, tiến hành giải phẫu cá, chúng tôi thu được 60 mẫu từ các cơ quan gan, thận, lách, tim, não với các dấu hiệu bị tụ huyết trùng, xuất hiện các nốt kem trắng hoặc u hạt màu trắng ở các cơ quan nội tạng, hoại tử trong nội tạng . Hình 3.2. Hình ảnh cơ quan nội tạng cá bị bệnh Photobacteriosis (1) Gan sưng to và có các đốm nhỏ trên bề mặt (2) Niêm mạc dạ dày bị viêm nhiễm (3) Lách sưng và có đốm trắng (4) Thận sưng và có các đốm trắng 5
3.1.2. Kết quả phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên cá biển nuôi lồng Bảng 3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn P. damsalae từ các mẫu cá biển nghi mắc Photobacteriosis (xuất huyết nhiễm trùng) Các phản ứng sinh hóa Nguồn Khả Tên Đặc điểm TT gốc phân năng chủng vi khuẩn Catalase Indole KIA lập dung huyết 1 T1.7 Cá mú Trực + - Tùy tiện, lên men β (Thận) khuẩn, glucose, sinh khí lưỡng cực, gram (-) 2 T1.8 Cá bớp Trực + - Tùy tiện, lên men β (Gan) khuẩn, glucose, sinh khí lưỡng cực, gram (-) 3 T4.2 Cá hồng Trực + + Không thực hiện (Thận) khuẩn, gram (-) 4 T4.3 Cá mú Trực khuẩn + - Tùy tiện, lên men β (Thận) gram (-) glucose, sinh khí 5 T4.4 Cá bớp Trực khuẩn + - Tùy tiện, lên men β (Thận) gram (-) glucose, sinh khí 6 B5.22 Cá mú Trực + - Tùy tiện, lên men β ( Gan) khuẩn, glucose, sinh khí lưỡng cực, gram (-) 7 B10.25 Cá vược Trực khuẩn + - Tùy tiện, lên men α (Lách) gram (-) glucose, sinh khí Từ 20 mẫu bệnh phẩm ban đầu, chúng tôi phân lập được 07 chủng vi khuẩn P. damsalae với các đặc điểm hình thái: khuẩn lạc màu trắng đục, vàng sậm hoặc nâu đỏ, tròn đều, trơn, bóng với kích thước 1- 2 mm (hình 3.3.a), tế bào dạng trực khuẩn, lượng cực, gram âm (hình 3.3.b). 6
a b c d T1.7 Hình 3.3. Hình thái vi khuẩn P. damselae (a): Hình thái khuẩn lạc trên môi trường Marine agar; (b): Hình thái vi khuẩn P. damselae nhuộm gram soi dưới kính hiển vi quang học (100X); (c), (d): Hình thái khuẩn lạc khi ria trên môi trường TCBS sau 24 giờ nuôi cấy Các chủng này đều phát triển tốt, tạo khuẩn lạc màu xanh trên môi trường TCBS ở điều kiện 28ºC trong 24 – 32 giờ (hình 3.3c). Đặc điểm này tương tự với báo cáo của Love et al. (1981) và Thyssen et al., (2000) trên TCBS, khuẩn lạc vi khuẩn P. damselae có màu xanh, tròn, lồi, bóng [111], [166]. Từ kết quả trên cho thấy vi khuẩn P. damselae phân lập được trên các đối tượng: cá mú, cá hồng, cá vược, cá bớp tại miền BắcViệt Nam 3.1.3. Xác định phân loài P. damselase gây bệnh trên cá biển nuôi lồng bằng phương pháp sinh học phân tử Kết quả thực hiện phản ứng multi- PCR khuếch đại 2 gen 16S rRNA và ureC cho thấy: có 05 chủng chỉ phát hiện thấy 1 đoạn gen có kích thước khoảng 267bp, 02 chủng phát hiện thấy 02 đoạn gen có kích thước khoảng 267bp và 448bp (Hình 3.5). So sánh với kết quả nghiên cứu của Osorio et al. (2000) [130] và các công bố của tác giả này năm 1999 [129], Magarinos et al. (1996) [114] cho thấy 05 chủng T1.7, B5.22, T4.4, B10.25 và T4.2 thuộc phân loài P. damselae subsp. Piscicida, 02 chủng T1.8 và T4.3 thuộc phân loài P. damselae subsp. Damselae. 7
. Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm multi-PCR khuếch đại các gen ureC và 16S rRNA của vi khuẩn P. damselase (M: thang chuẩn 100 bp, 1: T1.7, 2: B5.22, 3: T4.4, 4: B10.25, 5: T4.2, 6: T1.8, 7: T4.3) 3.1.4 Nghiên cứu độc lực của các chủng P. damselae phân lập Độc lực của vi khuẩn được xác định bằng liều gây chết 50% (LD50). Cá thí nghiệm được gây nhiễm với 07 chủng vi khuẩn phân lập có mật độ là 102-1012 CFU/ml. Tỷ lệ chết của cá được gây nhiễm với các chủng vi khuẩn có sự khác nhau rõ rệt, xét tỷ lệ gây chết của từng chủng chúng tôi nhận thấy tỉ lệ chết tỉ lệ thuận với mật độ vi khuẩn tiêm. Áp dụng công thức của Reed-Muynch, liều LD50 của chủng T1.7 được xác định như sau: LD50 = 10(a + x) Trong đó: 10a là độ pha loãng canh khuẩn tại đó số lượng cá sống và chết sau thí nghiệm là 50%, tương ứng là: 103; x = (Pa- 50)/(Pa- Pu), do đó x= (74,75-50)/ (74,75-45)= 0,83 Như vậy: LD50 của chủng T1.7= 10(3 + 0,83) = 103,83 Tương tự như vậy, liều gây LD50 của các chủng T4.3, T1.8, B5.22, T4.2, T4.4, B10.25 tương ứng là 104,34, 104,76, 106,52, 106,61, 107,17, 109,28. Kết quả này cho thấy, ba chủng T1.7, T4.3, T1.8 có độc lực cao hơn các chủng còn lại, trong số đó, hai chủng T1.8 và T4.3 thuộc phân loài P. damselae subsp. Damselae có độc lực cao nhất, chủng T1.7 thuộc loài P. damselae subsp. Piscicida có độc lực tương đương với chủng T1.8. Các chủng còn lại thuộc phân loài P. damselae subsp. Piscicida có độc lực thấp hơn đáng kể so với 03 chủng nói trên. Labella et al. (2010), nghiên cứu khả năng gây bệnh của P. damselae subsp. Damselae đã xác định được rằng: chủng có LD50 là 1x105 CFU là chủng có độc lực mạnh, có khả năng gây chết cá chẽm đỏ sau 2 đến 4 giờ gây nhiễm trong khi các chủng không độc có LD 50 > 108 CFU không gây chết cá sau khi gây nhiễm [98]. Như vậy, hai chủng P. damselae subsp. Damselae T1.8 và T4.3 có LD50 bằng 104,76 và 104,34 phân lập được là các chủng có độc lực cao. 8
3.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn P. damselae phân lập được Kết quả xác định ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và gây dung huyết của vi khuẩn P. damselae. Trong thí nghiệm này, chúng tôi lựa chọn hai chủng đại diện cho 02 phân loài của P. damselae bao gồm: P. damselae subsp. piscida T1.7 và P. damselae subsp. damselae T4.3 để nghiên cứu xác định ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và gây dung huyết của vi khuẩn 3.2.1. Ảnh hưởng nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và gây dung huyết của vi khuẩn P. damselae. Kết quả theo dõi nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn thể hiện trong hình 3.6 và 3.7 và bảng 3.4. Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn P. damselae T1.7 Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn P. damselae T4.3 Sự ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh sản của mẫu P. damselae T4.3 khá giống với mẫu P. damselae T1.7. Điều này có thể được giải thích do sự giống nhau về đặc tính sinh học của các chủng trong cùng một loài. 9
Kết quả kiểm định LSD cho thấy ở các mức nhiệt độ, thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng sinh trưởng của P. damselae, sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p
Hình 3.8. Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh trưởng của P. damselae Chủng P. damselae T1.7 sinh trưởng tốt nhất ở khoảng pH từ 8,0 – 8,5 trong khi chủng P. damselae T4.3 thích nghi với pH thấp hơn ở khoảng 7,5 – 8,0. Kết quả kiểm định LSD cho thấy ở các độ pH thí nghiệm sinh trưởng của P. damselae, có sự sai khác ý nghĩa thống kê với p
Kết quả trong hình 3.9 cho thấy: độ mặn thích hợp nhất cho các chủng vi khuẩn P. damselae thí nghiệm sinh trưởng là từ 1 – 2,5%, độ mặn càng cao thì khả năng sinh trưởng của vi khuẩn giảm dần và thấp nhất ở nồng độ 6%. Kết quả kiểm định LSD cho thấy sinh trưởng của P. damselae ở các nồng muối thí nghiệm có sự sai khác ý nghĩa thống kê với p
Từ kết quả bảng 3.7, chúng tôi lựa chọn 112 dòng tế bào thu được sau đời xử lý UV thứ 3, với biểu hiện biến đổi hình thái khuẩn lạc để kiểm tra mức độ giảm độc lực. Bảng 3.8. Kết quả tạo chủng vi khuẩn P. damselae nhược độc bằng tác nhân kháng sinh Rifampicin Nồng độ Số khuẩn Chủng kháng lạc sống TT Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn sinh sót (µg/ml) (CFU/đĩa) T 4.3 1 (chủng 0 300 Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,5-2mm gốc) 2 T 4.3K1 5 107 Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,5-2mm 3 T 4.3K2 10 98 Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,5-2mm 4 T 4.3K3 25 77 Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,5-2mm 5 T 4.3K4 50 53 Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,5-2mm T 4.3K5 100 33 Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,4- 6 1,8mm 7 T 4.3K6 150 25 Trắng,tròn, bóng D = 1,2-1,8mm 8 T 4.3K7 200 17 Trắng, tròn, bóng D = 1,2-1,8mm 9 T 4.3K8 250 8 Trắng, tròn, bóng D = 1,2-1,5mm Từ kết quả trong bảng 3.8, chúng tôi lựa chọn 50 dòng tế bào thu được sau đời xử lý rifampicin thứ 6, với biểu hiện biến đổi hình thái khuẩn lạc để kiểm tra mức độ giảm độc lực. 3.3.2. Kết quả đánh giá mức độ giảm độc lực của các dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến 3.3.2.1. Đánh giá mức độ giảm khả năng gây dung huyết của các dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến Độc tố dung huyết (haemolysis) là một trong những yếu tố gây bệnh chủ yếu của vi khuẩn P. damselae đối với vật chủ. Kết quả thu được ở bảng 3.9 và hình 3.12. 13
Bảng 3.9. Kết quả khả năng dung huyết của các dòng P. damsela đột biến Số lượng Số lượng các dòng gây dung huyết ở các ở các độ pha Dòng vi các dòng loãng độc tố khuẩn không gây dung huyết ½ ¼ 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 Vi khuẩn xử 2 lý UV (T4.3U5, 110 110 110 110 110 110 92 87 72 (n= 112) T4.3U6) 4 Vi khuẩn xử (T4.3K6, lý rifampicin T4.3K7, 46 46 46 46 46 41 38 35 31 (n=50) T4.3K8.1, T4.3K8.2) Kết quả thu được cho thấy, có 06 dòng vi khuẩn không gây dung huyết trên thạch máu cừu, trong đó 4 dòng vi khuẩn T4.3K6, T4.3K7, T4.3K8.1, T4.3K8.2 được tạo ra bởi phương pháp gây đột biến bằng rifampicin, 02 dòng vi khuẩn T4.3U5, T4.3U6 được tạo ra bởi phương pháp gây đột biến bằng tia UV, 146 dòng vi khuẩn còn lại có biểu hiện thay đổi hình thái khuẩn lạc đều gây dung huyết trên thạch máu cừu ở mức độ cao. Hầu hết các dòng này đều gây dung huyết ở nồng độ pha loãng độc tố là 1/64. Ở các độ pha loãng 1/132, 1/256, 1/512, số lượng các dòng gây dung huyết giảm, lần lượt là 92, 87, 72 dòng xử lý UV và 38, 35, 31 dòng xử lý rifampicin (bảng 3.9). Kết quả này chứng tỏ các tác nhân gây đột biến có ảnh hưởng và làm giảm độc lực của độc tố dung huyết ở một số dòng vi khuẩn được tạo ra, tuy nhiên mức độ không nhiều. Trong đó 6 dòng vi khuẩn không còn độc tố dung huyết được sử dụng để đánh giá khả năng gây bệnh trên cá mú để chứng minh mức độ giảm độc lực của chúng. 3.3.2.2. Đánh giá mức độ giảm độc lực của các dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến Vi khuẩn không gây dung huyết hồng cầu cừu bao gồm (6 dòng): T4.3K6, T4.3K7, T4.3K8.1, T4.3K8.2, T4.3U5, T4.3U6 được sử dụng để đánh giá mức độ giảm độc lực so với dòng tự nhiên T4.3. Nhìn chung, 6 dòng đột biến (T4.3K6, T4.3K7, T4.3K8.1, T4.3K8.2, T4.3U5, T4.3U6) đều giảm độc lực đáng kể so với chủng giống gốc. LD cá gây nhiễm với chủng tự nhiên T4.3 có biểu hiện chết nhanh trong vòng 3-7 ngày, với các đặc điểm đặc trưng của bệnh xuất huyết nhiễm trùng do vi khuẩn P. damselae gây ra như: cá giảm ăn, hoạt động bơi bị rối loạn. Cơ thể có màu đen đặc biệt ở vùng lưng và trên các vết thương tổn da, vây có thể sưng lên và bị lở loét. Mang nhợt nhạt, mắt cá lồi đục, lớp cơ dưới da có nhiều sắc tố melanin màu đen và thể hiện dấu hiệu hoại tử, có hiện tượng lở loét của lớp biểu bì. Lá lách, gan, thận bị hoại tử, vết hoại tử này lan nhanh, hoá lỏng và lá lách sẽ có màu đỏ anh đào, rồi mất dần hình dạng ban đầu của nó, gan chuyển từ màu xám nâu thành màu vàng. Các cơ quan bên trong khoang bụng xuất huyết, tim cá bị bệnh xuất hiện các vết nâu đen. So sánh độc lực của 06 dòng đột biến chúng tôi nhận thấy: dòng T4.3K7 có LD50= 107,49, 05 dòng T4.3K6, T4.3K8.1, T4.3K8.2, T4.3U5, T4.3U6 có LD50 lần 14
lượt là 109,02, 1010, 1011,03, 1010,07, 1011,02. Theo Esteve et al. (1993), vi khuẩn được xem như không có độc lực khi có giá trị LD50 ≥ 108 CFU/ml [57]. Kết quả trên chứng tỏ 05 dòng T4.3K6, T4.3K8.1, T4.3K8.2, T4.3U5, T4.3U6 không còn độc lực. Trong nghiên cứu này, hai dòng T4.3K8.2, T4.3U6 có giá trị LD50 = 1011,03 và 1011,02 được chúng tôi lựa chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo xác định đặc điểm sinh hóa, đặc điểm đột biến, mức độ an toàn và khả năng kích thích miễn dịch đặc hiệu ở cá. 3.3.3. Kết quả đánh giá mức độ an toàn của vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến giảm độc lực trên cá mú 3.3.3.1. Biểu hiện của cá thí nghiệm Bảng 3.11. Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng của cá thí nghiệm Lô đối Biểu hiện T4.3 T4.3K8.2 T4.3U6 chứng Tỷ lệ chết (%) 100 8 4 2 Xuất huyết thân, miệng, mang, vây (%) 100 2 0 0 Hoại tử, lở loét trên thân (%) 100 0 0 0 Mắt đục (%) 100 16 0 0 Phản xạ bắt mồi chậm (%) 100 12 0 0 Thay đổi sắc tố da (%) 100 12 0 0 Thay đổi tập tính bơi lội (%) 100 8 4 2 Với cùng liều gây nhiễm là 100 LD50, các dòng đột biến T4.3K8.2 và T4.3U6 gây chết cá với tỷ lệ tương ứng là: 8% và 4%, cá chết sau gây nhiễm 20-25 ngày và không có các biểu hiện như mô tả của Hawke, (1996) [81]. Hình 3.13. Biểu hiện bệnh tích bên ngoài của cá mú gây nhiễm chủng P. damselae T4.3 (liều tiêm 100 LD50, sau 7 ngày) 3.3.3.2. Biểu hiện bệnh tích đại thể Các tổn thương đại thể ở các lô cá được gây nhiễm bởi chủng P. damselae tự nhiên T4.3 chủ yếu tập trung ở lách, gan, thận và tim, 100% cá thí nghiệm có các biểu hiện bệnh tích. Các cơ quan này có biểu hiện sưng to bất thường (gấp 4- 15
10 lần so với đối chứng) và xuất hiện các hạt màu trắng (hình 3.14), tỷ lệ cá có biểu hiện bệnh tích ở gan chiếm 94%, lách chiếm 96%, thận chiếm 96%, tim chiếm 30% tương ứng (Bảng 3.12) Bảng 3.12. Biểu hiện bệnh tích do P. damselae trên cá thí nghiệm Chủng vi Số cá có bệnh Tỷ lệ cá có bệnh Cơ quan Tần suất xuất khuẩn thí tích điển hình tích điển hình có bệnh hiện bệnh tích nghiệm (n) (%) tích (%) Gan 94,00 Lách 96,00 T4.3 50 100 Thận 96,00 Tim 30,00 Gan 4,00 Lách 4,00 T4.3K8.2 2 4,00 Thận 4,00 Tim 2,00 Gan 0 Lách 0 T4.3U6 0 0 Thận 0 Tim 0 Gan 0 Lách 0 Đối chứng 0 0 Thận 0 Tim 0 Từ kết quả trong bảng 3.12 và 3.14 cho thấy: các trường hợp cá chết sau khi gây nhiễm dòng T4.3U6 có thể là do tác động cơ học trong quá trình tiêm chứ không liên quan đến độc lực của vi khuẩn. Hình 3.14. Biểu hiện bệnh tích ở các cơ quan bên trong cơ thể của cá gây nhiễm 16
(A: Thận sưng to bất thường, xuất huyết, có các u hạt màu trắng; B, C: Gan sưng bất thường, có các điểm hoại tử; 1 và 2: Gan cá gây nhiễm chủng P. damselae tự nhiên; 3: Gan cá đối chứng) 3.3.3.3. Biểu hiện bệnh tích vi thể Bảng 3.13. Tần suất xuất hiện các tổn thương vi thể trong các tổ chức của cá thí nghiệm (Đơn vị tính: %) Chủng vi khuẩn thí nghiệm Gan Lách Thận Tim T4.3 100,00 100,00 100,00 32,00 T4.3K8.2 24,00 22,00 18,00 12,00 T4.3U6 2,00 2,00 2,00 - Đối chứng - - - - Hình 3.15. Biểu hiện bệnh tích ở các cơ quan bên trong cơ thể của cá gây nhiễm (A: Tổn thương hoại tử trong tổ chức gan cá gây nhiễm chủng T4.3; B) Tổn thương hoại tử ở mô thận cá gây nhiễm chủng; T1.7 C) Sự tăng sinh của các đại thực bào trong mô lách ở cá gây nhiễm chủng T4.3U6) Đối với các lô cá gây nhiễm với hai dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực T4.3K8.2 và T4.3U6, tỷ lệ cá có bệnh tích giảm rõ rệt. Với các kết quả thu được có thể thấy, dòng vi khuẩn T4.3U6 an toàn đối với cá thí nghiệm, có thể sử dụng để phát triển sản xuất vắc xin nhược độc phòng bệnh Photobacteriosis (xuất huyết nhiễm trùng) ở cá. 3.3.3.4. Đặc điểm sinh hóa của các dòng vi khuẩn sau khi gây nhiễm Dựa trên các kết quả thu được, chúng tôi đã xác định các chủng phân lập lại có đặc tính sinh hóa hoàn toàn giống với chủng vi khuẩn sử dụng để gây nhiễm và thuộc loài P. damselae subsp. Damselae (Bakopoulos et al., 1995) [35]. 3.3.4. Kết quả phân tích kiểm tra đột biến của các chủng vi khuẩn Photobacterium damselae nhược độc Kết quả PCR khuếch đại các gen độc tố và hlyA được thể hiện trong hình 3.16 và 3.17. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR cho thấy, đã khuếch đại thành công 2 gen này, với kích thước là 540bp và 1480bp, tương ứng với kích thước lý thuyết của các 17
gen và hlyA. Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen hlyA của chủng giống gốc và các dòng gây giảm độc lực (1: T4.3, 2: T4.3K8.2, 3: T4.3U6, M: 200 bp DNA ladder) Hình 3.17. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen của chủng giống gốc và các dòng gây giảm độc lực (1: T4.3, 2: T4.3K8.2, 3: T4.3U6, M: 100 bp DNA ladder) 3.3.4.1. Kết quả phân tích sai khác di truyền của các gene độc tố của các dòng vi khuẩn P.damselae giảm độc lực 3.3.4.1.1. Gen hlyA * So sánh trình tự đoạn gen hlyA của các chủng gốc so với các trình tự tương đồng trên Genbank Kết quả trong hình 3.18 và bảng 3.15 cho thấy gen hlyA của chủng T4.3 và trình tự hlyA từ Genbank với kích thước gen giống nhau là 1484bp, mức độ tương đồng của hai trình tự này là 99%. Kết quả này có thể khẳng định đã khuếch đại thành công gen hlyA. 18