Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tính kháng và cơ chế kháng thuốc của cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) đối với hoạt chất quinclorac ở Đồng bằng Sông Cửu Long

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

39
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích cơ bản của luận án này là đánh giá đa dạng hình thái và đa dạng di truyền của quẩn thể cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) ở Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). Đánh giá tính kháng của cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) với bispyribac, penoxsulam và quinclorac trên ruộng lúa ở ĐBSCL.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tính kháng và cơ chế kháng thuốc của cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) đối với hoạt chất quinclorac ở Đồng bằng Sông Cửu Long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã ngành: 9620112 LÊ DUY NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG VÀ CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC CỦA CỎ LỒNG VỰC NƯỚC (Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.) ĐỐI VỚI HOẠT CHẤT QUINCLORAC TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Cần Thơ, 2018
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Minh Chơn Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: Hội trường …….; Khoa………………..……. ……………………; Trường Đại học Cần Thơ. Vào lúc ….. giờ ….. ngày ….. tháng ….. năm ….. Phản biện 1: ……………………………………………… Phản biện 2: ……………………………………………… Phản biện 3: : ……………………………………………… Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. Thư viện Quốc gia Việt Nam.
CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ 1. Duy Le, C. M. Nguyen, R. K. Mann, C. N. Yerkes and B. V. N. Kumar. 2017. Genetic diversity and herbicide resistance of 15 Echinochloa crus-galli populations to quinclorac in Mekong Delta of Vietnam and Arkansas of United States. Journal of Plant Biotechnology, 44: 472-477. 2. Duy Le, C. M. Nguyen, R. K. Mann, B. V. N. Kumar and M. Morell. 2018. Efficacy of Rinskor (florpyrauxifen-benzyl ester) on Herbicide Resistant Barnyardgrass (Echinochloa crus-galli) in Rice Fields of Mekong Delta, Vietnam. Journal of Crop Science and Biotechnology, 21: 75-81. 3. Duy Le, C. M. Nguyen, B. V. N. Kumar and R. K. Mann. 2018. Weed management practices to control herbicide- resistant Echinochloa crus galli in rice in Mekong Delta, Vietnam. Research On Crops , 19: 20-27.
Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cỏ lồng vực (Echinochloa crus-galli) được xem là một trong những loài cỏ dại quan trọng nhất trên ruộng lúa, do là cây C4 nên cỏ lồng vực có khả năng phát triển lấn át cây lúa trên ruộng. Ngoài ra cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) và cỏ lồng vực cạn (Echinochloa colona) còn có khả năng “bắt chước” hình thái của cây lúa ở giai đoạn đầu. Do đó, việc phân biệt và nhổ cỏ bằng tay ở giai đoạn này trở nên khó khăn hơn. Sử dụng thuốc cỏ là một biện pháp giúp kiểm soát cỏ lồng vực một cách hiệu quả, tuy nhiên, cỏ lồng vực kháng thuốc đã trở thành vấn đề nghiêm trọng trên ruộng lúa. Cỏ lồng vực có khả năng kháng với nhiều hoạt chất trừ cỏ trên thị trường. Trong điều kiện hiện nay việc nghiên cứu sâu hơn về tính kháng thuốc của cỏ lồng vực là cần thiết. Do đó, luận văn “Nghiên cứu tính kháng và cơ chế kháng thuốc của cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) đối với hoạt chất quinclorac ở Đồng bằng Sông Cửu Long” đã được thực hiện. 1.2 Mục tiêu của luận văn (1) Đánh giá đa dạng hình thái và đa dạng di truyền của quẩn thể cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) ở Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). (2) Đánh giá tính kháng của cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) với bispyribac, penoxsulam và quinclorac trên ruộng lúa ở ĐBSCL. (3) Giải thích cơ chế kháng quinclorac ở mức sinh hóa và mức độ di truyền phân tử của cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli). 1.3 Các nghiên cứu của luận văn (1) Khảo sát tập quán canh tác lúa và quản lý cỏ dại ở ruộng lúa tại ĐBSCL. (2) Đánh giá sự đa dạng của quần thể cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) ĐBSCL. (3) Đánh giá mức độ kháng bispyribac-sodium, penoxsulam và quinclorac của các mẫu cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) bằng phương pháp thử bằng dãy nồng độ của thuốc. 1
(4) Đánh giá hiệu quả của, hoạt chất trừ cỏ mới chuyên dùng cho cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) kháng thuốc để kiểm soát quần thể cỏ lồng vực kháng thuốc. (5) Dùng phân tích RAPD để đánh giá đa dạng gene của quần thể cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli), sự tương quan giữa các quần thể cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) kháng quinclorac và khoảng cách gene giữa các quần thể cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) ở ĐBSCL. (6) Đo lường hoạt tính của enzyme β-cyanoalanine synthase (CAS) trong mô lá cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) để tìm ra cơ chế kháng quinclorac ở mức sinh hóa của cỏ lồng vực nước. 1.4 Thời gian và địa điểm Luận văn được tiến hành từ 2014 đến 2018. Thí nghiệm 1; 2 và 3 được tiến hành tại khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Đại học Cần Thơ; Nghiên cứu 4; 5 và 6 được tiến hành tại Trung tâm nghiên cứu của Dow AgroSciences tại Indianapolis, Indiana, Hoa Kỳ. 1.5 Tính mới của nghiên cứu Các nghiên cứu trong luận văn đã xác nhận sự tồn tại của các quần thể cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) kháng thuốc cỏ ở ĐBSCL. Nghiên cứu này còn đánh giá sự tương quan giữa tập quán quản lý cỏ của nông dân và tính kháng thuốc của cỏ, và từ đó đưa ra được giải pháp thực tiễn để quản lý cỏ hiệu quả. Cơ chế kháng quinclorac của cỏ lồng vực được xác định và phân tích sâu ở mức enzyme và di truyền phân tử, thông qua đo lường mức hoạt động của enzyme giải độc quinclorac và mức độ biểu hiện gene trên cỏ lồng vực. Kết quả này cung cấp thông tin quan trọng và đặt nền móng cho những nghiên cứu sâu hơn và sự kháng thuốc ở cỏ lồng vực. 1.6 Bố cục luận văn Luận văn bao gồm 102 trang (21 bảng, 38 hình và 202 tài liệu tham khảo). Trong đó, phần Giới thiệu: 3 trang, Tổng quan tài liệu: 33 trang; Phương tiện và Phương pháp: 18 trang; Kết quả và Thảo luận: 43 trang; Kết luận và đề nghị: 2 trang; Tài liệu tham khảo: 18 trang; Phụ lục: 42 trang, bao gồm số liệu và hình ảnh. 2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chi Echinochloa gồm hơn 250 loài và hầu hết đều là cỏ dại. Cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) là cây C4 đơn tử diệp, bắt nguồn từ châu Âu và đã được phát hiện khắp thế giới. Hình thái của Echinochloa spp. có mức đa dạng cao, trong nhiều trường hợp thường nhằm lẫn các loài với nhau. Ruộng lúa ở châu Á có 3 loại cỏ lồng vực chủ yếu, Echinochloa crus-galli, Echinocloa colona, và Echinochloa glabrescens, các loài này đều được tìm thấy ở Việt Nam. Thuốc cỏ bispyribac và penoxsulam là hai hoạt chất trừ cỏ nhóm ức chế enzyme ALS phổ biến trên ruộng lúa, hai hoạt chất này được sử dụng phổ biến để quản lý lồng vực ở Việt Nam. Quinclorac là thuốc cỏ nhóm auxin tổng hợp, các thương phẩm chứa quinclorac được sử dụng rộng để kiểm soát cỏ lồng vực trên ruộng lúa. Rinskor là hoạt chất mới thuộc nhóm auxin tổng hợp, hoạt chất này chưa được sử dụng để trừ cỏ ở Việt Nam từ thời điểm bắt đầu luận văn này vào năm 2014. Hạt cỏ từ 78 quần thể cỏ lồng vực được thu thập từ ruộng lúa ở 7 tỉnh ĐBSCL. Cây con được trồng từ các hạt thu thập được và sau đó được xử lý bằng thuốc bispyribac, penoxsulam, quinclorac và rinskor để xác định liều gây chết 90% quần thể (LD90) và mức độ kháng thuốc của quần thể. Các nghiên cứu tiếp theo được thực hiện nhằm tìm hiểu về độ đa dạng di truyền và cơ chế kháng thuốc quinclorac của cỏ, 15 quần thể được chọn để phân tích khoảng cách di truyền bằng phương pháp RAPD. Hoạt động của CAS cũng được phân tích để xác định hàm lượng enzyme trong mô lá của 5 quần thể cỏ khác nhau dưới tác động của quinclorac. Ngoài ra mức thể hiện của mRNA của gene quy định enzyme cyanoalanide synthase của 5 quần thể cỏ đã được phân tích bằng phương pháp so sánh 2−ΔCt. Hoạt động của enzyme và mức thể hiện của mRNA tương ứng trong 5 quần thể đã được đối chiếu để tìm sự liên quan giữa hai yếu tố này trong mô cỏ sau khi xử lý thuốc. Kết quả của nghiên cứu này cung cấp thêm kiến thức về cơ chế kháng quinclorac của cỏ lồng vực. 3
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Thí nghiệm 1. Khảo sát hoạt động canh tác lúa và kiểm soát cỏ dại ở ĐBSCL, Việt Nam. Mục tiêu của nghiên cứu: Điều tra tập quán của nông dân về quản lý cỏ dại trên ruộng lúa ở ĐBCSL. Hạt của cỏ lồng vực được thu từ 90 ruộng lúa. Sau khi kiểm tra tỉ lệ nảy mầm trong nhà kính, 78 mẫu được chọn làm thí nghiệm. Trong công đoạn thu hạt cỏ từ ruộng lúa, đồng thời phỏng tập quán canh tác của nông dân, 9 câu hỏi sau được dùng trong khảo sát: - Số vụ lúa canh tác trong năm - Diện tích ruộng lúa (ha) - Số lần phun thuốc cỏ mỗi vụ - Điều kiện quản lý nước tưới - Hiểu biết về các loại cỏ dại quan trọng trên ruộng lúa - Những loại thuốc trừ cỏ quan trọng cho cỏ lồng vực. - Chi phí quản lý cỏ dại cho 1 ha/vụ - Chi phí phun thuốc cho 1 ha/vụ - Chi phí nhổ cỏ 1 ha/vụ Bộ câu hỏi trên được thiết kể để lấy được những thông tin quan trọng về điều kiện tại ruộng lúa, tập quán quản lý cỏ của nông dân, bộ câu hỏi trên được hỏi sau khi thu mẫu hạt cỏ trên từng ruộng. Phân tích thống kê Sau khi kiểm tra chéo, những thông tin không đủ tin cậy hoặc không rõ ràng được loại bỏ khỏi bộ số liệu. Bộ số liệu sau cùng được phân tích với trả lời từ 71 nông dân. Dữ liệu được phân tích với giá trị trung bình được so sánh bằng kiểm định Tukey-Kramer test ở mức α=0,05. Phân tích Phương sai một chiều (Oneway ANOVA) với t-test ở mức P
3.2 Thí nghiệm 2. Phân loại quần thể cỏ Echinochloa spp. bằng đặc điểm hình thái Mục tiêu nghiên cứu Phân loại các quần thể Echinochloa spp. bằng các đặc điểm phân loại đã được công bố trước đó. Mục tiêu của nghiên cứu này là xây dựng cơ sở dữ liệu về sự đa dạng của các quần thể Echinochloa spp. ở ĐBSCL trước khi tiến hành nghiên cứu về cơ chế kháng thuốc của cỏ lồng vực (Echinochloa crus-galli). Từng loài trong các mẫu cỏ lồng vực thu được được xác định dựa vào khóa phân loại được đề xuất bởi Pignatty và Carretero – khóa phân loại được kiểm chứng lại với các đánh giá dựa trên phân tích di truyền bởi Tabacchi et al. (2006). Các đặc điểm hình thái sau được ghi nhận: (1) Chiều cao cây: đo từ gốc cây đến lá trên cùng lúc 56 ngày sau nảy mầm; (2) Trọng lượng khô: sinh khối khô (phần trên mặt đất) lúc 56 ngày sau khi gieo được đo bằng cách phơi cây trong vòng 7 ngày đến khi trọng lượng không thay đổi; (3) Màu sắc đốt thân gốc: quan sát màu sắc của đốt thân gốc của cây con là xanh lá hay màu đỏ. (4) Số đốt thân: số đốt được đếm lúc 56 ngày sau nảy mầm; (5) Thời gian trổ bông: thời gian từ lúc nảy mầm đến lúc hoa đầu tiên nở hoàn toàn. (6) Chu kỳ sinh trưởng: thời gian từ lúc nảy mầm đến khi hạt chín; (7) Hình thái bông: chụp hình bông và hạt, sau đó sử dụng tài liệu tham khảo để xác định tên loài; (8) Định danh dựa trên hình thái và khóa phân loại nhằm giảm thiểu khả năng sai sót trong khi lựa chọn mẫu cho các phân tích enzyme và di truyền phân tử về sau. Các thông tin thu được ban đầu sẽ được sàng lọc để chọn ra quần thể để xác định đa dạng di truyền, hoạt động enzyme và mức thể hiện gene dưới tác động của quinclorac. Phân tích thống kê Trung bình được so sánh bằng kiểm định Tukey-Kramer test ở mức α=0,05. Phương sai một chiều (one way ANOVA) với t-test ở mức P
3.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá mức độ kháng thuốc của các quần thể Echinochloa spp. với 3 hoạt chất bispyribac-sodium, penoxsulam và quinclorac Mục tiêu của nghiên cứu Sử dụng phương pháp thử thuốc theo dãy nồng độ để xác định các quần thể mẫn cảm và quần thể kháng của cỏ lồng vực ở ĐBSCLvà đánh giá mức kháng của các quần thể với 3 hoạt chất bispyribac, penoxsulam và quinclorac. Đánh giá mức kháng thuốc Ở giai đoạn 3-4 lá, cây cỏ lồng vực được phun lên lá bằng các loại hoạt chất bispyribac (10% SC), penoxsulam (2.5% OD) và quinclorac (25% SC) ở 6 liều 0,25X, 0,5X, 1,0X, 2,0X, 4,0X và 8,0X, với X là liều được khuyến cáo, liều khuyến cáo của bispyribac là 25 g/ha, penoxsulam là 12,5 g/ha, và quinclorac là 250 g/ha. Bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), 4 lặp lại. Một chậu 1 lặp lại và 10 cây 1 chậu. Thuốc cỏ được phun trong buồng phun thuốc (Máy phun chuyên dụng SB-8, Devries Manufacturing), áp lực phun chỉnh về mức 300 L/ha với áp lực 140 kPa. 14 ngày sau phun, tỉ lệ chết được ghi nhận bằng cách đếm cây còn sống và cây chết hoàn toàn. Các kết quả ghi nhận được dùng để tính toán giá trị LD90 của từng quần thể bằng mô hình hồi quy không tuyến tính sử dụng bốn thông số điều chỉnh (four parameters) của phần mềm GraphPad Prism 7.02 (San Diego, CA) software. Tính kháng đơn hoặc kháng đa hoạt chất được tính toán dựa vào đáp ứng của từng quần thể với từng hoạt chất. Phương pháp tính toán được trình bày chi tiết ở phần xử lý số liệu. Phân tích thống kê Tỉ lệ chết theo liều thuốc cỏ được dùng để tính theo hàm sau: 𝑎−𝑏 𝑦=𝑎+ (𝑙𝑜𝑔 𝐿𝐷90−𝑥)∗𝑒 1 + 10 Y: tỉ lệ chết; X: liều quinclorac; LD90: liều dự kiến giết 90% cá thể trong quần thể; a: ngưỡng dưới; b: ngưỡng trên; e: độ dốc của đồ thị Tính kháng của cỏ lồng vực được phân hạng theo phần trăm cá thể bị chết ở liều khuyến cáo. Bảng phân hạng R được dùng dựa theo nghiên cứu của Moss et al. (2007). Trong đó, quần thể mẫn cảm (S) 6
có tỉ lệ chết khoảng 81-100%; R? (có thể đã kháng thuốc) cho mức kiểm soát 72-80%; RR có tỉ lệ chết khoảng 36-71% và RRR có tỉ lệ chết khoảng 0-35%. Sự tương quan giữa các nhân tố thí nghiệm được phân tích bằng phương pháp hồi quy và tương quan Pearson. Phân tích hồi quy và đường hồi quy được xử lý bằng phần mềm JPM Pro 13 (SAS). 3.4 Thí nghiệm 4: Đánh giá hiệu quả của hoạt chất rinskor cho quần thể cỏ lồng vực kháng thuốc. Mục tiêu nghiên cứu Sau khi sàng lọc tính kháng với các hoạt chất bispyribac, penoxsulam và quinclorac, 78 quần thể cỏ lồng vực được xử lý thuốc bằng cách phun lên lá với rinskor 2.5% với liều 0,25X, 0,5X, 1,0X, 2,0X, 4,0X và 8,0X. Liều 1,0X là 25 g/ha. Phần trăm (%) cỏ chết được ghi nhận lúc 14 ngày sau xử lý thuốc. Kết quả của thí nghiệm này được dùng để đưa ra khuyến nghị về giải pháp kiểm soát cỏ lồng vực hiệu quả ở ĐBSCL Phân tích thống kê Phương pháp tính giá trị LD90 và mức kháng thuốc giống với phương pháp được dùng ở thí nghiệm 3. 3.5 Thí nghiệm 5: So sánh hoạt tính của enzyme β-cyanoalanine (CAS) ở quần thể cỏ lồng vực nước mẫn cảm và quần thể cỏ lồng vực kháng quinclorac để nghiên cứu cơ chế kháng ở mức sinh hóa Mục tiêu của nghiên cứu Xác định mức độ kháng của các quần thể cỏ lồng vực nước bằng mức biểu hiện của β-cyanoalanine trong mô lá của cây sống sót trong thí nghiệm thử dãy nồng độ với quinclorac. Chọn quần thể để phân tích và phương pháp xử lý thuốc Chọn 5 quần thể cỏ lồng vực nước thể hiện tính ổn định cao nhất với các kiểm tra tính kháng và mẫn cảm quinclorac cho phân tích enzyme. Ở giai đoạn 3-4 lá, các cây được chọn được xử lý bằng cách phun quinclorac lên lá với liều 125 g/ha (1/2 liều khuyến cáo để đảm bảo xử lý thuốc không giết cây mẫn cảm trong quá trình thí nghiệm). Thuốc cỏ được phun trong buồng phun thuốc (Máy phun chuyên dụng SB-8, Devries Manufacturing), áp lực phun chỉnh về mức 300 L/ha với áp lực 140 kPa. Mẫu lúa giống IR50404 ở giai đoạn 7
3-4 lá và 2 quần thể cỏ lồng vực được xác định là kháng và mẫn cảm quinclorac được thu từ Arkansas Hoa Kỳ cũng được đưa vào thí nghiệm để phân tích hoạt tính enzyme. Xác định hoạt tính enzyme CAS trong mô lá Hoạt tính của enzyme CAS trong mô lá cỏ lồng vực nước được phân tích bằng phương pháp của Chon et al. (2008): - 1 gram lá tươi từ 4 cây trong mỗi quần thể được thu lúc 1 giờ và 3 ngày sau khi phun thuốc - Mẫu lá được ngâm và đông lạnh nhanh bằng nitơ lỏng sau đó được nghiền với TissueLyzer II (Qigen), mô lá được trộn đều ở mức 30 vòng lắc trong 1 giây trong vòng 1 phút. Quá trình trộn này được tiến hành 2 lần và đảo chiều 2 lần để đảm bảo mẫu trộn đồng đều. - Ly tâm 10,000 g trong 10 phút ở 4oC. - Thêm 2,5 mL dung dịch 100 M Tris buffer (pH=8,5) vào từng vi ống chứa 1 g mẫu mô lá đã được trộn đều. - Phần dịch trích được dùng để phân tích enzyme. - 100 mM dung dịch Tris buffer (pH=8,5) được dùng để chuẩn bị 2 dung dịch 25 mM NaCN và 5mM L-cysteine. - Dịch trích được để trong 10 phút ở nhiệt độ 30oC, sau đó trộn với 0,5 ml dịch trích enzyme, 2 ml NaCN, 2 ml L-cysteine và được ủ 30oC trong 60 phút. - Sau khi ủ, 1 ml dung dịch được chuyển vào ống ly tâm chứa sẵn 0,1 ml dung dịch 0,03 M FeCl3 trong dung dịch 1,2 N HCl và 0,1 ml dung dịch 0,02 M N,N-dimethyl-p-phenylenediamine sulfate trong dung dịch 7,2 N HCl. - Mẫu được trữ trong tối trong vòng 20 phút và ly tâm ở 1020 g trong 5 phút để protein lắng tụ dưới đáy ống. - Quá trình khử methylene blue bằng hydrogen sulfide được dùng để xác định hoạt tính của CAS trong mô lá. - Hoạt tính của enzyme được xác định bằng chỉ số hấp thu methylene blue ở bước sóng 650 nm và Na2S được dùng làm thang chuẩn. 8
- Hoạt tính của enzyme được thể hiện bằng đơn vị nmol H2S/g lá tươi/phút. Mỗi mẫu được thực hiện với 4 lặp lại. Phân tích thống kê Phân tích enzyme được bố trí hoàn toàn ngẫu nghiên, mỗi mẫu gồm 4 lặp lại. Dữ liệu của 4 lặp lại được phân tích bằng Tukey-Kramer Test ở mức α=0,05. Phân tích dữ liệu bằng JPM Pro 13 (SAS). 3.6 Thí nghiệm 6: Xác định đa dạng di truyền giữa quần thể cỏ lồng vực kháng thuốc và quần thể cỏ mẫn cảm ở ĐBSCL. Mục tiêu nghiên cứu Phương pháp RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) được dùng để đánh giá đa dạng di truyền giữa các quần thể để cung cấp thông tin giá trị về mức phổ biến và sự phân bố của quần thể cỏ kháng quinclorac ở ĐBSCL. Vật liệu nghiên cứu Từ kết quả của nghiên cứu hình thái, hạt của 15 quần thể cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) được chọn lại. Quá trình chọn lọc dựa vào từng nhóm loài cỏ và tính kháng quinclorac. 4 quần thể của mỗi nhóm cỏ được chọn và chỉ chọn quần thể có tính ổn định cao trong các đợt thử về tính kháng và tính mẫn cảm với quinclorac. Cỏ được trồng trong nhà kính, thu mẫu lá từ cây mẫu đại diện quần thể vào giai đoạn 3-4 lá thật. Phân tách DNA từ mô lá DNA từ nhân tế bào được trích từ mô lá theo quy trình DNAzol Reagent (CAS No. 593-84-0, Invitrogen, Thermo Scientific Corp., Waltham, MA) như sau: - Mô lá tươi (1 g) từ cây đại diện của mỗi quần thể được nghiền nhuyễn trong dung dịch ni tơ lỏng để chuẩn bị trích DNA. - Mỗi mẫu được nghiền bằng cối và chày sứ, 100g mẫu trộn đều được chuyển vào ống ly tâm có chứa sẵn DNAzol (1,5 mL) và RNAse (150 µL). - Hỗn hợp được trộn và lắc đều trong 5 phút ở 25oC. - Chloroform (900 µL) được thêm vào và trộn đều trong 5 phút ở 25oC. - Hỗn hợp được ly tâm 12000 g trong 10 phút. Phần dịch lỏng được chuyển sang ống mới. 9
- Phần dung dịch được trộn với 100% ethanol (700 µL) để kết tủa DNA. - Ống được lật ngược 6-8 lần ở nhiệt độ phòng (25oC) trong 5 phút và ly tâm lại ở mức 5000 g trong 5 phút để lắng DNA. - DNA kết tủa được rửa sạch bằng dung dịch với tỉ lệ 1:0,75 (v/v) DNAzol và 100% ethanol (900 µL) bằng cách lắc nhẹ trong 10 giây. - Dung dịch rửa DNAzol được loại bỏ và thay bằng 75% ethanol (700 µL, pha bằng nước không chứa nuclease). - Hỗn hợp được ly tâm ở mức 5000 g trong 4 phút. - Ethanol sau đó được loại bỏ và tủa DNA được để khô tự nhiên trong 1-2 phút. - Mẫu DNA sau đó được hòa tan bằng 50 µL TE buffer, pH 8,0. - Nổng độ DNA và độ tinh khiết sau đó được kiểm tra bằng cách đo quang phổ qua máy NanoDrop (Thermo Scientific Corp, USA). Phương pháp phân tích đa dạng di truyền RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 40 đoạn mồi oligonucleotide 10 bp (được tổng hợp bởi công ty Integrated DNA Technology, Inc., Coralville, IA) được dùng để phân tích RAPD. Tất cả đoạn mồi được dùng cho 15 quần thể Echinochloa spp. và đánh giá tính lặp lại, độ phân giải và tính đa hình. Dung dịch PCR Master mix gồm 2,7 µL H20, 1 µL PCR buffer (Invitrogen Cat. No. 18067-017), 80 µL MgCl2, 5 µM primer, 0,25 µL template DNA, 0,05 µL Taq polymerase (0,5 units), và 1 µL dNTP. PCR được thực hiện bằng máy LightCycler 480 II (Roche Molecular Diagnostics, Indianapolis, IN) bằng các bước sau: - Ủ ở 94oC trong 2 phút - 45 chu kỳ ở nhiệt độ 94oC trong 45 s (ramp rate 4,8oC/s) - 38oC trong 5 phút (ramp rate of 2,5oC/s) - 72oC trong 2 phút (ramp rate 4,7oC/s), và 72oC trong 7 phút - Sản phẩm PCR được phân tích bằng máy LabChip GXII (PerkinElmer, Waltham, MA) 10
Phân tích thống kê Khoảng cách di truyền và cây phả hệ của 15 quần thể E. crus- galli dựa trên kết quả điện di của PCR và 6 bộ mồi. Mỗi mẫu điện di, có băng là 1, không có là 0. Ma trận tương đồng (similarity matrix) được tính toán bằng Simple Matching Coefficient (SMC) (Sneath & Sokal 1973). Khoảng cách gene được tính toán bằng công thức 1- SMC. Dùng chương trình NT-SYS 2.1 để vẽ cây phả hệ bằng phương pháp UPGMA (Unweighted Pair Group Method Average). 3.7 Thí nghiệm 7: Đo lường mức thể hiện của mRNA của gene CAS trong quần thể cỏ lồng vực kháng và mẫn cảm quinclorac. Mục tiêu của nghiên cứu Đo lường mức độ biểu hiện của mRNA từ CAS gene trong quần thể cỏ lồng vực đã được sàng lọc và cây lúa để hiểu về cơ chế kháng bằng CAS enzyme của quần thể kháng và mẫn cảm. Quy trình phân tích RT-qPCR Hai bộ mồi và mẫu dò để phóng đại từng gene được thiết kế dựa vào trình tự đã biết của enzyme β-cyanoalanine synthase (LOC100682425) từ lúa mì (Triticum aestivum) và β-Actin synthase (HQ395760.1) của Echinochloa crus-galli trong bộ cơ sở dữ liệu của Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Quốc Gia Hoa Kỳ (National Center for Biotechnology Information, U.S). Tất cả mẫu dò được thiết kế bằng FAM fluorophore và phản ứng singleplex. 10 µL dung dịch phản ứng gồm 1,8 µL PCR grade H20, 5,0 µL Roche Probes Master Mix (11636103001) (Roche), 0,4 µM Forward Primer 0,4 µM Reverse Primer, 0,2 µM Probe và 2,0 µL dung dịch 1:2 diluted cDNA. Khay Roche 384 giếng được dùng cho phản ứng qPCR bằng máy Roche Light Cycler 480II. Quy trình PCR được tiến hành như Bảng 3.2. Bảng 3.2 Chuỗi phản ứng PCR Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ Hoạt hóa enzyme 95oC 10 phút 1 Tách chuỗi DNA 95oC 10 giây Nối chuỗi DNA 60oC 35 giây 40 Kéo dài 72oC 1 giây Hạ nhiệt 45oC 1 giây 1 11
Cơ chế kháng quinclorac chính của cỏ lồng vực nước là kháng bằng cách phân giải thuốc thông qua cơ chế sinh hóa, không phải kháng thông qua đột biến của vị trí thuốc gắn vào. Hiện nay, thông tin về trình tự gen của cỏ lồng vực nước vẫn còn hạn chế. Do đó, việc giải trình tự của gene quy định vị trí thuốc gắn vào trong các quần thể kháng quinclorac và mẫn cảm quinclorac sẽ không đủ để giải thích cơ chế kháng thuốc. Phương pháp so sánh 2−ΔCt được sử dụng để tính toán mức thể hiện của CAS gene (Livak và Schmittgen, 2001), gene β-Actin được sử dụng làm gene tham chiếu. Để đảm bảo không bị nhiễm DNA, phương pháp no-RT (NRT) đã được sử dụng cho từng mẫu. Phân tích thống kê Bốn lặp lại được sử dụng cho mỗi mẫu mRNA. Phần mềm LC480 (LightRoch) được sử dụng để quản lý số liệu của quá trình thể hiện gene và vẽ đồ thị cần thiết trong các phân tích. Phần mềm JMP Pro 13 (SAS software) được sử dụng để thực hiện phân tích Student’s t-test để so sánh nhóm đối chứng và nhóm được xử lý quinclorac trong từng mẫu. β-Actin được sử dụng làm gene so sánh để phân tích những tác động nếu có của quinclorac lên quá trình thể hiện của gene CAS giá trị Ct của β-Actin được chuyển đổi thành dạng giá trị tuyến tính bằng cách sử dụng công thức 2-Ct (Livak và Schmittgen, 2001) và giá trị này được so sánh với nhóm đối chứng và nhóm được xử lý quinclorac bằng phép kiểm định Student’s t-test (P
Bảng 4.1: Tập quán canh tác lúa và quản lý cỏ dại tại ĐBSCL Tỉnh Mùa Diện tích Số lần phun Quản lý vụ/năm (ha) thuốc cỏ/vụ nước* An Giang 2,3c 1,6bc 2,2ab 2,5 Cần Thơ 2,5bc 0,9c 2,2ab 1,9 Hậu Giang 2,7abc 1,1c 2,5ab 2,2 Kiên Giang 3,0a 2,3ab 2,5ab 2,2 Long An 3,0a 2,9a 2,7a 2,1 Tiền Giang 3,0a 1,3c 2,0b 2,8 Vĩnh Long 3,0a 0,7c 2,1ab 2,2 Trung bình 2,7 1,5 2,3 2,2 F * * * ns CV(%) 14,5 46,4 25,4 29,7 *1=thuận lơi, mặt bằng ruộng tốt và chủ động được quản lý nước trên ruộng, 2=trung bình, mặt bằng ruộng tốt và chủ động được nước, nhưng đất không giữ nước tốt, 3=khó khăn, mặt bằng ruộng không bằng phẳng, khó quản lý nước trên ruộng; Các giá trị trung bình mang các chữ cái bắt đầu giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức P
Chi phí trung bình để quản lý cỏ dại tại ĐBSCL khoảng 2.740.000 VND mỗi vụ (Bảng 4.5). Chi phí bao gồm 990.000 VND cho thuốc cỏ và 1.750.000 VND cho nhổ cỏ bằng tay mỗi vụ, tương ứng với 654.000 VND và 1.330.000 VND trên mỗi hecta. Bảng 4.5 Chi phí quản lý cỏ dại trên ruộng lúa tại ĐBSCL Chi Chi phí Chi phí Chi phí Chi phí Chi phí Địa phí thuốc trên thuốc nhổ cỏ nhổ cỏ phương quản cỏ mỗi hecta cỏ/ha tay/vụ tay/ha lý cỏ vụ AG 2,75ab 1,79ab 1,05abc 0,59ab 1,7 1,20ab CT 2,05b 2,27ab 0,66bc 0,73ab 1,38 1,53ab HG 1,93b 1,8b 0,89abc 0,82a 1,03 0,98b KG 2,99ab 1,34b 1,34ab 0,59ab 1,65 0,75b LA 4,11a 1,41b 1,39a 0,48b 2,72 0,93b TG 3,36ab 2,94a 1,06abc 0,715ab 2,29 2,23a VL 1,83b 2,35ab 0,51c 0,64ab 1,34 1,71ab Avg 2,74 1,99 0,99 0,65 1,75 1,33 F * * * * ns * CV(%) 16,5 11,3 17,8 5,4 9,6 9,2 AG: An Giang, CT: Cần Thơ, HG: Hậu Giang, KG: Kiên Giang, LA: Long An, TG:Tiền Giang, VL: Vĩnh Long Đơn vị trong bảng tương ứng với 1.000.000 VND; Các giá trị trung bình mang các chữ cái bắt đầu giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức P
Bảng 4.6 Đặc điểm hình thái của cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) được thu thập tại ĐBSCL Màu PH SDW PE GD ND N gốc (cm) (g) (ngày) (ngày) (số) Nhóm 1 41 Đỏ 107,4b 14,2b 49,2b 80,9b 6,3 Nhóm 2 25 Xanh 134,6a 20,9a 53,1a 93,4a 6,7 Nhóm 3 12 Xanh 113,6b 16,4b 47,3b 87,6ab 6,7 F - * * * * ns CV (%) - 9,8 14,9 11,6 8,1 7,5 PH (Chiều cao cây); SDW (Trọng lượng khô của thân), PE (thời điểm trổ bông), GD (thời gian sinh trưởng), ND (số lóng trên thân); Các giá trị trung bình mang các chữ cái bắt đầu giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức P
4.3.2 Tương quan giữa kích thước ruộng và tập quán nhổ cỏ tay Kết quả nghiên cứu cho thấy kích thước ruộng có ảnh hưởng đến tập quán nhổ cỏ tay trên ruộng lúa tại ĐBSCL (phương sai một chiều t-test, P1,5 ha, 67,7% trong số đó không thực hiện nhổ cỏ tay sau khi phun thuốc cỏ, chi phí cao cho việc nhổ cỏ tay trên diện tích lớn là nguyên nhân chính cho sự khác biệt này. Diện tích ruộng (ha) Không Có Nhổ cỏ tay Hình 4.7 Tương quan giữa kích thước ruộng và nhổ cỏ tay 4.3.3 Ảnh hưởng của nhổ cỏ tay lên mức độ kháng thuốc của cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) tại ĐBSCL Những ruộng không có nhổ cỏ tay có cỏ kháng thuốc ở mức cao hơn so với những ruộng có nhổ cỏ tay(Hình 4.8). Mức độ kháng thuốc trung bình ở 15 ruộng không có nhổ tay là 4,8 so với mức 3,1 của những ruộng có nhổ cỏ tay sau khi phun thuốc. 16
Mức độ kháng thuốc Không Có Nhổ cỏ tay Hình 4.8 Ảnh hưởng của nhổ cỏ tay lên mức độ kháng thuốc cỏ của cỏ trên ruộng 4.4 Thí nghiệm 4. Hiệu lực trừ cỏ lồng vực của thuốc rinskor tại ĐBSCL 4.4.1 Hiệu lực của thuốc rinskor trên 3 nhóm cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) thu thập tại ĐBSCL Bảng 4.13 Giá trị LD90 trung bình của quần thể cỏ lồng vực đối với bispyribac, penoxsulam, quinclorac và rinskor LD90 (g/ha) Bispyribac Penoxsulam Quinclorac Rinskor An Giang 23,3b 11,9 495ab 19,3 Cần Thơ 34,0ab 16,5 844a 15,6 Hậu Giang 36,4a 16,7 545ab 17,9 Kiên Giang 40,3a 14,7 384ab 17,8 Long An 35,9a 16,1 593ab 18,8 Tiền Giang 27,2b 13,0 341b 16,4 Vĩnh Long 34,4ab 16,1 439ab 15,1 Trung bình 33,1 15,1 520,2 17,1 F * ns * ns CV(%) 34,9 38,8 93,2 43,4 Các giá trị trung bình mang các chữ cái bắt đầu giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức P