Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa hình hệ gen các dòng tôm sú (Penaeus monodon) Việt Nam nhằm phục vụ công tác chọn giống tôm

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:31

Thêm vào BST

Báo xấu

43
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của đề tài là đánh giá đa hình hệ gen các quần đàn tôm sú thu từ các vùng biển Việt Nam; Sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNPs) có tiềm năng liên kết với tính trạng tăng trưởng bằng cách áp dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (phương pháp GBS) trên hai nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa hình hệ gen các dòng tôm sú (Penaeus monodon) Việt Nam nhằm phục vụ công tác chọn giống tôm

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH THANH NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH HỆ GEN CÁC DÒNG TÔM SÚ (Penaeus monodon) VIỆT NAM NHẰM PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG TÔM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9 42 01 21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC
Hà Nội 2019
Luận án được hoàn thành tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. ĐINH DUY KHÁNG Viện Công nghệ sinh học 2. PGS.TS. NGUYỄN HỮU NINH Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản III Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án Phiên chính thức họp tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. Vào hồi …giờ …, ngày … tháng … năm 2019 Có thể tìm đọc Luận án tại: Thư viện Quốc Gia Việt Nam Trang web của Bộ Giáo dục và đào tạo (http:luanvan.moet.gov.vn) Viện Công nghệ sinh học.
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của Đề tài Tôm sú Penaeus monodon Fabricius (1798) là loài thủy sản nuôi kinh tế quan trọng ở nhiều quốc gia trên thế giới. Ở Việt Nam, tôm sú là một trong những đối tượng nuôi chủ lực cho xuất khẩu thủy sản. Nền tảng cho chiến lược phát triển bền vững ngành công nghiệp nuôi tôm sú là chú trọng phát triển nguồn tôm bản địa với các chương trình nhân giống khoa học để nâng cao tỷ lệ sống và sự tăng trưởng. Để đạt được mục tiêu này, nghiên cứu cấu trúc và chức năng của hệ gen tôm sú là vấn đề khoa học cơ bản có định hướng ứng dụng hết sức quan trọng. Hiện nay, các nghiên cứu về di truyền phân tử trên đối tượng tôm sú vẫn còn ít ỏi và chưa tương xứng với vai trò của một đối tượng nuôi kinh tế quan trọng. Thông tin về các locus tính trạng định lượng (QTLs) liên quan đến tính trạng tăng trưởng hầu như rất hiếm. Vì vậy, việc nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định mối tương quan giữa các SNP (đa hình nucleotide đơn) loại biến dị phổ biến nhất trong hệ gen với tính trạng tăng trưởng ở tôm sú để tạo cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu về chọn giống dựa trên chỉ thị phân tử (CTPT) là hướng nghiên cứu quan trọng đối với ngành công nghiệp nuôi tôm sú. Trong khuôn khổ Đề tài “Lập bản đồ bộ gen tôm sú (Penaeus monodon)” thuộc Nhiệm vụ đánh giá di truyền nguồn gen cấp Nhà nước, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu đa hình hệ gen các dòng tôm sú (Penaeus monodon) Việt Nam nhằm phục vụ công tác chọn giống tôm”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá đa hình hệ gen các quần đàn tôm sú thu từ các vùng biển Việt Nam; Sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNPs) có tiềm năng liên kết với tính trạng tăng trưởng bằng cách áp dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (phương pháp GBS) trên hai nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm. 3. Đối tượng nghiên cứu Tôm sú Penaeus monodon Fabricius (1798). 4. Các nội dung nghiên cứu (1) Đánh giá đa hình hệ gen ba quần đàn tôm sú thu từ các vùng biển khác nhau của Việt Nam bằng kỹ thuật AFLP; (2) Lai hỗn hợp 4 dòng tôm sú bố mẹ khác nhau về nguồn gốc địa lý để tạo vật liệu nghiên cứu thế hệ Go và G1; (3) Áp dụng kỹ thuật xác định kiểu gen bằng phương pháp giải trình tự (GBS) để phân tích hệ gen tôm sú thuộc hai nhóm tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm thế hệ Go và G1 nhằm sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) liên quan đến tính trạng tăng trưởng; (4) Sàng lọc chỉ thị SNP G>A ở tôm sú tăng trưởng nhanh bằng kỹ thuật PCR đặc hiệu alen cạnh tranh (KASP) để đánh giá tiềm năng ứng dụng của SNP này đối với việc đánh giá nhanh chóng và chính xác các cá thể tôm nhằm hỗ trợ trong công tác chọn giống tôm sú. 5. Những đóng góp mới của Luận án về mặt khoa học và thực tiễn
2 (1) Luận án là nghiên cứu đầu tiên đưa ra đánh giá về đa dạng di truyền của ba quần đàn tôm sú tự nhiên từ các vùng biển Việt Nam bằng kỹ thuật AFLP. (2) Sàng lọc được bộ chỉ thị SNP ở nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh làm cơ sở cho việc tìm kiếm chỉ thị SNP liên kết với tính trạng tăng trưởng nhanh ở tôm sú. Hai chỉ thị SNP được xác định trong nghiên cứu của luận án là phát hiện đầu tiên về chỉ thị SNP nằm trong exon của gen MHC ở họ giáp xác. Những kết quả này cung cấp dẫn liệu khoa học hữu ích cho việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống tôm sú. 6. Bố cục của Luận án Luận án gồm tổng cộng 194 trang cả bìa, trong đó: Mở đầu 4 trang; Chương 1 Tổng quan tài liệu 34 trang; Chương 2 Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu 22 trang; Chương 3 Kết quả nghiên cứu 38 trang; Chương 4 Bàn luận kết quả 25 trang; Kết luận và Kiến nghị 2 trang; Danh mục các công trình công bố 2 trang; Tóm tắt kết quả nghiên cứu bằng tiếng Anh 7 trang; Tài liệu tham khảo 28 trang; Phụ lục 17 trang; Trong Luận án có 24 bảng và 23 hình. Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát về tôm sú Penaeus monodon và tình hình nuôi tôm sú trên thế giới Tôm sú Penaeus monodon thuộc họ Penaeidae, bộ Decapoda, lớp Malacostraca, ngành phụ Crustatacea, ngành Arthropoda. Với những tiến bộ về kỹ thuật nuôi và công nghệ chế biến thức ăn thủy sản thì ngành công nghiệp nuôi tôm sú đã nhanh chóng lan rộng khắp Châu Á, Châu Mỹ trong những thập niên cuối thế kỷ 20. Tuy nhiên trong những năm sau đó, dịch bệnh gia tăng trong các quần đàn tôm tự nhiên khiến chất lượng giống liên tục sụt giảm đã dẫn đến sự thay thế dần tôm sú bởi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) sạch bệnh có nguồn gốc Nam Mỹ. Việc các nước Châu Á dần từ bỏ đối tượng bản địa quan trọng này chủ yếu là do chưa gia hoá và kiểm soát được dịch bệnh nên không đảm bảo chất lượng tốt của con giống. Việt Nam nằm trong nhóm gồm các quốc gia sản xuất tôm sú hàng hoá lớn nhất thế giới. Khác với các nước Châu Á láng giềng (chủ yếu nuôi tôm thẻ chân trắng), Việt Nam hiện là một trong số ít các nước vẫn đang sản xuất tôm sú cỡ to, chất lượng cao và chiếm phần lớn sản lượng tôm nuôi. Tuy nhiên nghề nuôi tôm sú ở Việt Nam hiện nay cơ bản vẫn dựa vào nguồn tôm giống đánh bắt từ tự nhiên và các thành tựu gia hóa dựa trên phương pháp chọn giống truyền thống. Do đó, nghề nuôi tôm sú vẫn đối mặt với không ít thách thức, trong đó có vấn đề về chủ động nguồn tôm giống đảm bảo chất lượng. Nhìn chung, xu thế ở các quốc gia trên thế giới trong sản xuất tôm giống là từng bước gia hóa đàn tôm, tiến hành các giải pháp công nghệ để khép kín vòng đời, chọn giống tôm sạch bệnh, tạo ra các dòng mới chất lượng cao và tăng trưởng tốt. Những nỗ lực trong vấn đề gia hoá (tạo tôm bố mẹ) và nâng cao chất lượng di truyền (nghiên cứu đa dạng di truyền, tìm kiếm các CTPT liên kết với các tính trạng tăng trưởng nhanh, chống chịu bệnh tốt, sức sinh sản cao…) được coi là những vấn đề then chốt. 1.2. Kỹ thuật phân tích chỉ thị DNA và ứng dụng trong nghiên cứu đa hình hệ gen và trong chọn giống tôm sú Các CTPT được sử dụng rộng rãi như những công cụ chọn lọc đắc lực đối với các tính trạng quan tâm trong các chương trình chọn giống ở nhiều loài vật nuôi, cây trồng và các loài
3 thủy sản. Việc ứng dụng các CTPT giúp cho các nhà chọn giống nhận diện chính xác các gen quan tâm nhằm rút ngắn thời gian chọn giống. Hiệu quả cải tiến giống sẽ gia tăng gấp nhiều lần so với các phương pháp chọn giống cổ điển nhờ thực hiện việc chọn lọc không cần trực tiếp trên tính trạng mong muốn mà thông qua CTPT liên kết với tính trạng đó. Các CTPT là công cụ hữu hiệu để đánh giá sự đa dạng di truyền, xây dựng bản đồ di truyền và ứng dụng trong nghiên cứu cải tạo, chọn giống tôm chất lượng tốt, sạch bệnh như: RAPD (Garcia & Benzie, 1995), RFLP (Benzie et al., 1993, Klinbunga et al., 1999), xác định các chỉ thị RAPD ở quần đàn tôm sú kháng bệnh đốm trắng (Dutta et al., 2013), phát triển chỉ thị microsatellite trong chọn tôm sú bố mẹ (Jerry et al., 2006), kỹ thuật microsatellite nghiên cứu đa hình di truyền trên đối tượng tôm sú (Saeid et al., 2011, Nguyễn Thị Thảo et al., 2004; Rumisha et al., 2017; Staelens et al., 2018…), sử dụng kỹ thuật AFLP để lập bản đồ di truyền trên đối tượng tôm Trung Quốc (Zhaoxia et al., 2006, You et al., 2010), đa hình SNP tại thụ thể vitellogenin (PmVtgr) gắn liền với các kiểu hình liên quan đến sinh sản (chỉ số gonadosomatic và trọng lượng buồng trứng) của tôm sú P. monodon đã được phát hiện (Klinbunga et al., 2015), biểu hiện của protein gắn kết Xbox 1 (PmXbp1) trong quá trình phát triển buồng trứng ở tôm sú bố mẹ P. monodon hoang dã và sự liên kết giữa SNP với các tham số liên quan đến tăng trưởng đã được phát hiện (Prasertlux et al., 2015)… Kỹ thuật AFLP được sử dụng để phân tích đa hình DNA bằng cách nhận biết đồng thời nhiều phân đoạn DNA sau khi cắt bởi enzyme và khuếch đại chọn lọc. Đây là công cụ hiệu quả để nhận biết các locus đa hình mà không cần biết trước thông tin về trình tự DNA của chúng (Richard et al., 1998). Phương pháp này có thể ước lượng nhanh sự đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể với nhau (Watson và Barker, 2004). AFLP được sử dụng cho nhiều mục đích như: nghiên cứu biến dị di truyền (Mueller và Wolfenbarger, 1999); đánh giá đa dạng di truyền các quần đàn ở các đối tượng khác nhau như cá trê (Liu et al., 1998), cá thơm (Seki et al., 1999), cá chép (Wang et al., 2000); lập bản đồ di truyền (Zhaoxia et al., 2006, You et al., 2010; Staelens et al., 2018); xác định quan hệ giữa các giống ( Jacobs et al., 2008); xây dựng các nhóm liên kết chéo; các nghiên cứu về đa dạng di truyền và phát sinh loài phân tử ( Wang et al., 2004)… SNP là một trong những CTPT hiệu quả được ứng dụng trong chọn giống. Các vị trí SNP trong hệ gen là nơi mà ở đó chuỗi DNA được phân biệt bởi một base duy nhất khi hai hoặc nhiều cá thể được so sánh. Sự khác nhau về nucleotide này có thể dẫn đến thay đổi tính trạng và được sử dụng để đánh giá đa dạng trong tiến hóa. SNP có số lượng lớn, ổn định , thích hợp cho việc tự động hóa trong phân tích và chỉ ra được các đa hình có thể không phát hiện được bởi các phương pháp khác (Vaseeharan et al., 2013; Liu and Cordes, 2004). SNP có thể xuất hiện ở các vùng mã hóa và không mã hóa trong hệ gen của sinh vật, tác động trực tiếp đến tính trạng quan tâm, rất hiệu quả trong việc xác định tương quan giữa SNP và tính trạng (Beuzen et al., 2000). SNP đã được sử dụng để sàng lọc các gen tiềm năng liên quan đến tính trạng tăng trưởng của một số đối tượng thuỷ sản: cá hồi Salvelinus alpinus (Tao và Boulding, 2003), cá chẽm (Xu et al., 2006), tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei và tôm sú P. monodon (Glenn et al., 2005)... 1.3. Kỹ thuật GBS và ứng dụng trong chọn giống
4 GBS (Genotyping By Sequencing: Kỹ thuật xác định kiểu gen bằng phương pháp giải trình tự) là một ứng dụng mới của kỹ thuật NGS (Next Generation Sequencing: công nghệ giải trình tự thế hệ mới) để phát hiện SNP. Những cải tiến không ngừng của các hóa chất giải trình tự và các công cụ phần mềm cho phép các kỹ thuật NGS cung cấp những thông lượng lớn về dữ liệu giải trình tự trong mỗi lần thực hiện, nhờ đó giảm giá thành, khiến cho GBS trở thành giải pháp thay thế có tính cạnh tranh so với các phương pháp phân tích gen khác. NGS cho phép tạo ra các bản đồ SNP mật độ cao được dự đoán sẽ là hướng ứng dụng rộng rãi trong nhiều chương trình chọn giống. Các nhà chọn giống có thể giải trình tự các bộ gen lớn và xây dựng các bản đồ liên kết mật độ cao từ các quần thể chọn giống. Các ứng dụng trong tương lai của GBS đối với việc cải thiện giống cây trồng, vật nuôi có thể cho phép các nhà chọn giống kiểm soát được các chương trình MAS (chọn giống dựa trên CTPT) hay GS (chọn lọc hệ gen) trên phôi mầm hay loài mới mà không cần phát triển các công cụ phân tử trước đó. Khi việc phân tích gen dựa trên việc giải trình tự có thể thực hiện được đối với toàn bộ các lĩnh vực nghiên cứu về hệ gen thì GBS sẽ trở thành nhân tố chính trong di truyền và chọn giống (He et al., 2014). 1.4. Phương pháp PCR đặc hiệu alen cạnh tranh (KASP) KASP là một dạng biến đổi của kỹ thuật PCR để phân tích hệ gen dựa trên sự kéo dài chuỗi oligo đặc hiệu alen và sự chuyển năng lượng cộng hưởng huỳnh quang để tạo ra tín hiệu (Kumpatla et al., 2012; He et al., 2014). Công nghệ này có nhiều ứng dụng trong phân tích kiểm soát chất lượng hệ gen, lập bản đồ QTL, chọn giống dựa trên CTPT (MAS)... Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu * Các mẫu tôm sú sử dụng cho nghiên cứu đa hình AFLP do Viện Nghiên cứu NTTS I cung cấp. Mẫu được thu từ 3 quần đàn tự nhiên khác nhau: Quần đàn Bắc Trung Bộ (kí hiệu: BTB) thu mẫu tại vùng biển tỉnh Nghệ An, Quần đàn Nam Trung Bộ (NTB) thu mẫu tại vùng biển tỉnh Khánh Hòa và Quần đàn Nam Bộ (NB) thu mẫu tại vùng biển tỉnh Bạc Liêu. M ỗi quần đàn thu trên 50 mẫu. * Các mẫu tôm sú sử dụng cho nghiên cứu sàng lọc SNP do Viện Nghiên cứu NTTS II cung cấp: Vật liệu gốc bao gồm 4 dòng tôm sú bố mẹ có nguồn gốc địa lý khác nhau, trong đó 3 dòng có nguồn gốc tự nhiên là tôm sú Ấn Độ Dương (kí hiệu: A) Nhập từ Thái Lan (vùng biển Amanda) và từ Myanmar, tôm sú Thái Bình Dương (T) Nhập từ Singapore, tôm tự nhiên của Việt Nam (thu thập từ Cà Mau, Đà Nẵng, Phú Yên) gọi chung là tôm nội địa (N) và dòng tôm Gia hóa (G) được cung cấp bởi Công ty Moana Ninh Thuận Đây là dòng tôm được thương mại hóa dùng làm tôm bố mẹ sản xuất tôm giống phục vụ cho nuôi thương phẩm. Tôm sú thế hệ Go và G1 được tạo ra từ các đàn tôm bố mẹ này bằng cách lai hỗn hợp giữa bốn dòng tôm bố mẹ. Từ các cá thể trong đàn con của các gia đình tôm sú thế hệ G o và G1, chọn ra các cá thể (bao gồm cả tôm cái ♀ và tôm đực ♂) thuộc hai nhóm khác nhau theo tiêu chí mức độ tăng trưởng: tăng trưởng nhanh (F) và tăng trưởng chậm (S) để sử dụng cho nghiên cứu sàng lọc SNP. 40 mẫu tôm sú cái lớn nhanh thế hệ G1 được chọn để thực hiện kỹ thuật KASP.
5 * Các hóa chất và kit tinh sạch được sử dụng của các hãng: Sigma Aldrich, Qiagen, Invitrogen, Life Technologies, Fermentas, Promega; Các hóa chất thông dụng khác trong phòng thí nghiệm đạt độ tinh khiết cần thiết cho các nghiên cứu. * Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu thuộc Phòng Vi sinh vật học phân tử và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2. Các phương pháp nghiên cứu chính 2.2.1. Thu mẫu tôm sú Thu mẫu tôm sú tự nhiên phục vụ nghiên cứu đa hình hệ gen: các mẫu tôm sú được thu gom bằng cách đặt hàng cho người dân đánh bắt bằng lưới ở ngoài biển xa bờ. Thu mẫu tôm sú tự nhiên làm tôm giống bố mẹ, sàng lọc mầm bệnh và chăm sóc tôm bố mẹ: Các quy trình thu mẫu tôm sú bố mẹ, sàng lọc mầm bệnh và chăm sóc tôm bố mẹ được thực hiện tại Trung tâm Quốc gia Giống hải sản Nam Bộ Viện NCNTTS II. 2.2.2. Thiết lập các gia đình tôm sú tạo thế hệ Go, G1 Các phương pháp: lai hỗn hợp giữa các dòng tôm sú bố mẹ, ghép phối, sinh sản nhân tạo, ương nuôi, đánh dấu huỳnh quang và truy xuất nguồn gốc tôm sú… được thực hiện theo quy trình sản xuất giống đã được nghiên cứu và thực hiện thành công nhiều năm tại Trung tâm Quốc gia Giống hải sản Nam Bộ, thuộc Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II. 2.2.3. Tách chiết, tinh sạch, xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số từ mô cơ tôm sú DNA tổng số từ mô cơ tôm sú được tách chiết theo quy trình của Eurobiobank (2004). DNA tổng số được tinh sạch bằng Kit PureLinkTM Genomic DNA (Life Technologies). Nồng độ và độ tinh sạch của DN A được xác định bằng máy quang phổ NanoDrop® Spectrophotometer ở bước sóng λ = 260 nm và λ = 280 nm (Thermo Fisher Scientific NanoDrop Products, www.nanodrop.com). 2.2.4. Kỹ thuật AFLP đánh giá đa hình hệ gen Kỹ thuật AFLP được thực hiện theo quy trình của hãng Applied BioSystems. Phân tích kết quả AFLP trên máy xác định trình tự tự động ABI3100 ( Invitrogen) sử dụng điện di mao quản và phần mềm phân tích đoạn GeneMapper® Software Version 4.1 AFLP® System Analysis (Invitrogen) để đánh giá tính đa hình di truyền hệ gen tôm sú; Xây dựng cây phát sinh chủng loại giữa các quần đàn tôm sú Việt Nam bằng phần mềm MEGA (Kumar et al., 2001). 2.2.5. Kỹ thuật GBS phân tích hệ gen tôm sú, sàng lọc SNP liên kết với tính trạng tăng trưởng Xây dựng thư viện GBS và giải trình tự DNA: Kỹ thuật GBS được thực hiện theo các bước như mô tả trong công bố của Elshire et al. (2011). Enzyme cắt hạn chế được sử dụng là ApeKI (New England Biolabs). DNA tổng số sau khi được cắt và gắn với adaptor được tinh sạch bằng QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Các đoạn DNA tinh sạch từ các mẫu được trộn lại với nhau với tỷ lệ tương đương. Khoảng 100 ng sản phẩm DNA trộn từ các mẫu được sử dụng làm khuôn để tạo thư viện cho NGS với cặp mồi primer1 và primer2 bắt cặp bổ sung với barcode adaptor và common adaptor:
6 Primer1:(5’3’)AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT Primer2:(5’3’) CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT Sản phẩm PCR có kích thước 300500 bp được thu nhận bằng phương pháp cắt gel và tinh sạch bằng QIAquick PCR Purification Kit. Kích thước và độ sạch của thư viện DNA sau đó được đánh giá trên Bioanalyzer 2100 (Agilent Technology). Thư viện DNA được làm giàu và xác định trình tự cả hai chiều (pairend) trên hệ thống Illumina NextSeq®500, sử dụng NextSeq 500/550 High Output v2 kit (300 cycles). Xử lý dữ liệu GBS, lắp ráp hệ gen tham chiếu tạm thời và xác định SNP: Dữ liệu GBS được xử lý và phân tích để phát hiện SNP dựa theo phương pháp GBSSNP CROP (GBS SNPCalling Reference Optional Pipeline) được mô tả bởi Melo et al. (2016). Dữ liệu thô được chuyển thành định dạng fastq bằng công cụ BCL2FASTQ 2.1. Chất lượng trình tự được đánh giá bằng FastQC. Trình tự adaptor được loại bỏ bằng phần mềm Trimmomatic software v.0.3.6 (Bolger et al., 2014). Trình tự của từng mẫu được tách ra trên cơ sở nhận biết trình tự barcode sử dụng công cụ Inhouse script do nhóm nghiên cứu tự phát triển. Do hệ gen tôm sú chưa được công bố trình tự tham chiếu nên chúng tôi đã sử dụng các mẫu lắp ráp de novo để tạo trình tự tham chiếu tạm thời theo phương pháp được mô tả bởi Melo et al. (2016), sử dụng các công cụ PEAR v.0.96 và USEARCH v.8.0.162 (Zhang et al., 2014; Edgar, 2010). Trình tự của các mẫu tôm sú được so sánh với trình tự tham chiếu bằng BWAMEM v.0.7 (Li et al., 2009a). Dữ liệu SNP được truy xuất bằng công cụ SAMtools v.1.2 (Li et al., 2009b). SNP được xác định khi gióng hàng các contig và sự sai khác nucleotide được phát hiện trên ít nhất bốn trình tự. Chỉ các SNP hai allen đáp ứng mức độ l ặp lại như trên mới được xác định là SNP (Melo et al., 2016; Nguyễn Minh Thành et al., 2015; Kumar, 2014). Chú giải các đoạn trình tự và xác định gen liên quan: Công cụ BlastX (Evalue
7 cá thể tôm sú tăng trưởng nhanh thuộc thế hệ G1 bằng kỹ thuật KASP. Các mồi xuôi và mồi ngược được thiết kế đặc hiệu với trình tự DNA chứa SNP này. Nồng độ DNA mỗi mẫu sử dụng là 50ng. Thí nghiệm bố trí 2 ống đối chứng âm để so sánh (ở ống đối chứng âm, DNA template được thay thế bằng nước). Trình tự mồi xuôi allele kiểu dại (gắm HEXtail): 5’GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCAGAGCTCCTTCGGCC3’ Trình tự mồi xuôi allele kiểu đột biến (gắn FAMtail): 5′GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGCACGCATCTTGGTCTTCTCC3’ Trình tự mồi ngược: 5’CGCACGCATCTTGGTCTTCTCC3’ Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Đa hình AFLP ở các quần đàn tôm sú Việt Nam Kết quả phân tích AFLP sử dụng cặp mồi chọn lọc MseICTT/EcoRIACC JOE cho thấy với các mẫu tôm sú thu thập từ 3 quần đàn tự nhiên của Việt Nam, có 309 alen được phát hiện. Số lượng alen ở các quần đàn là khác nhau và không có sự trùng nhau về vị trí xuất hiện của các alen: Quần đàn BTB có số lượng alen dao động từ 32 đến 76, Quần đàn NTB là 29 đến 64 và Quần đàn NB là 38 đến 77. Trong phạm vi mỗi quần đàn, quân đan NTB co 4 alen trung nhau gi ̀ ̀ ́ ̀ ưa cac ca thê cung quân ̃ ́ ́ ̉ ̀ ̀ ̀ ở quân đan NB có 8 alen trùng nhau, đ đan, ̀ ̀ ặc biệt không phat hiên th ́ ̣ ấy bất kỳ alen trùng nhau nào giưa cac ca thê trong quân đan BTB cho th ̃ ́ ́ ̉ ̀ ̀ ấy tính đa dạng di truyền rất cao giữa các cá thể ngay trong quần đàn này. Không phát hiện thấy alen nào chung cho cả 3 quân đan. ̀ ̀ Quan hệ phát sinh chủng loại giữa các quần đàn tôm sú Việt Nam: Cây phát sinh chủng loại giữa các cá thể thuộc ba quần đàn tôm sú BTB, NTB và NB cho thấy mối liên hệ họ hàng giữa các cá thể. Về cơ bản cây được chia làm 3 nhánh, mỗi nhánh tương ứng với các cá thể thuộc cùng một vùng (một quần đàn) được xếp vào cùng một nhánh. Tuy nhiên, có một vài cá thể của một trong 3 quần đàn này được xếp về nhánh của quần đàn khác (BTB7 và BTB16 thuộc cùng nhánh của quần đàn Nam Trung Bộ, NTB2 và NTB3 thuộc cùng nhánh của quần đàn Bắc Trung Bộ. Kết quả này có thể được lý giải do quá trình di cư của tôm sú đến vùng biển khác theo các dòng hải lưu để tìm kiếm nguồn thức ăn và môi trường mới thích hợp với giai đoạn sinh trưởng của chúng. B A Hình 3.1. Cây phát sinh chủng loại các quần đàn tôm sú thu từ ba vùng biển Việt Nam: A Nhánh Bắc Trung Bộ (BTB), B Nhánh Nam Trung Bộ (NTB), C Nhánh Nam Bộ (NB) (Vòng tròn màu đỏ biểu thị các cá thể tôm sú của một trong ba quần đàn này xuất hiện trên nhánh của quần C
8 3.2. Sản xuất tôm sú thế hệ Go, G1 3.2.1. Sàng lọc nguồn tôm bố mẹ đầu vào Từ các cá thể tôm bố mẹ thuộc 4 dòng tôm sú có nguồn gốc địa lý khác nhau (vật liệu gốc), tổng cộng có 460 tôm cái và 376 tôm đực được sử dụng làm vật liệu đầu vào để tiến hành sàng lọc. Kết quả (Bảng 3.1) cho thấy số tôm được giữ lại sau sàng lọc bệnh nghiêm ngặt tương đối thấp: chỉ có 48,0% tôm cái và 54,5% tôm đực được giữ lại. Trong đó, tỷ lệ giữ lại thấp nhất là tôm dòng Nội địa, chỉ đạt 21,6% đối với tôm cái và 39,8% đối với tôm đực. Các dòng tôm tự nhiên nhập ngoại có tỷ lệ sạch bệnh và được giữ lại sau sàng lọc khá hơn như ở tôm cái dòng Ấn Độ Dương là 51,3% và ở tôm cái dòng Thái Bình Dương là 80,2%. Tỷ lệ tôm đầu vào sạch bệnh và được giữ lại cao nhất là tôm Gia hóa: 100% đối với cả tôm đực và tôm cái. Về khối lượng thân trung bình, nhìn chung các dòng tôm có nguồn gốc nhập ngoại có khối lượng lớn hơn so với tôm Việt Nam: nhóm tôm Nội địa và nhóm tôm Gia hóa có khối lượng trung bình lần lượt là 165,7g và 160,8g, thấp hơn so với nhóm tôm Ấn Độ Dương (222,2g) và nhóm tôm Thái Bình Dương (220,0g). Bảng 3.1. Kết quả sàng lọc tôm sú bố mẹ đầu vào Số lượng thu Số tôm sạch Khối lượng % sạch bệnh Dòng tôm thập bệnh (g/con) Cái Đực Cái Đực Cái Đực TB ± SD Ấn Độ Dương (A) 76 71 39 34 51,3 47,9 222,2 ± 25,4 Thái Bình Dương (T) 86 58 69 36 80,2 62,1 220,0 ± 23,1 Nội địa (N) 236 186 51 74 21,6 39,8 165,7 ± 19 Gia hóa (G) 62 61 62 61 100 100 160,8 ± 10,4 Tổng 460 376 221 205 48,0 54,5 3.2.2. Thiết lập các gia đình tôm sú thế hệ Go, G1 Từ 16 phép lai tổ hợp toàn phần 4 dòng tôm sú khác nhau đã tạo ra được các gia đình thế hệ Go. Kết quả có 69 gia đình Go được thả nuôi thành công. Số lượng gia đình Go được ương nuôi thành công đến kích cỡ đánh dấu, thả nuôi chung của từng phép lai được trình bày ở Bảng 3.2. Bảng 3.2. Số lượng gia đình tôm sú thế hệ Go thả nuôi thành công từ 16 phép lai Phép lai Tôm đực Tôm Dòng tôm A G N T Tổng cộng cái A 6 5 5 5 21 G 2 2 2 3 9 N 4 6 6 5 21
9 T 4 4 4 6 18 Tổng cộng 16 17 17 19 69 Kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy: có sự khác nhau khá rõ về tỷ lệ thả nuôi thành công giữa các gia đình Go khác nhau về nguồn gốc tôm bố và tôm mẹ, đặc biệt là khác nhau về nguồn gốc tôm mẹ, cụ thể: Các phép lai giữa tôm mẹ nguồn gốc Nội địa với 4 dòng tôm bố khác nhau đều cho tỷ lệ thả nuôi thành công của các gia đình ở mức cao (tổng cộng là 21 gia đình) ; Tôm mẹ nguồn gốc A cũng cho tỷ lệ các gia đình thả nuôi thành công khá cao (21 gia đình); Tôm mẹ nguồn gốc T cho tỷ lệ các gia đình thả nuôi thành công thấp hơn (18 gia đình); Trong khi đó, các phép lai có tôm mẹ nguồn gốc G cho tỷ lệ các gia đình thả nuôi thành công thấp nhất (chỉ có 9 gia đình). Kết quả trên đây cho thấy: tôm mẹ thuộc các dòng khác nhau sau khi được cấy tinh nhân tạo và thả nuôi để chuẩn bị cho sinh sản tạo thế hệ Go đã có sự khác nhau rõ rệt về khả năng sống. Xét về ảnh hưởng của nguồn gốc tôm bố đối với tỷ lệ thả nuôi thành công của các gia đình thế hệ Go thì không thấy sự khác biệt lớn: Số lượng các gia đình khác nhau về nguồn gốc tôm bố (A, G, N, T) lần lượt là 16, 17, 17 và 19 gia đình. Tỷ lệ góp vật liệu di truyền theo dòng của 4 dòng tôm sú ở thế hệ Go và số lượng cá thể tôm đực và tôm cái (tôm bố mẹ) của từng dòng tham gia sinh sản để tạo thế hệ G o được trình bày ở Bảng 3.3. Tổng số có 108 cá thể tôm bố mẹ (bao gồm 55 tôm cái và 53 tôm đực) được chọn từ 4 dòng tôm (vật liệu ban đầu) để tạo thế hệ Go. Bảng 3.3. Tỷ lệ góp vật liệu di truyền theo dòng ở thế hệ Go Dòng tôm A G N T Giới tính Cái Đực Cái Đực Cái Đực Cái Đực Số lượng 19 10 6 16 17 14 13 13 (con) Tỷ lệ (%)* (34,5) (18,9) (10,9) (30,2) (30,9) (26,4) (23,7) (24,5) Tổng 29 (26,9%) 22 (20,4%) 31 (28,7%) 26 (24,1%) (Ghi chú * : Các con số tỷ lệ % trong ngoặc được tính theo tôm cái riêng và tôm đực riêng, tổng là 100% đối với mỗi nhóm tôm đực cái). Kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy: + Trong 69 gia đình được nuôi thành công, có sự cân bằng tương đối về tỷ lệ tôm bố mẹ tham gia tạo vật liệu cho thế hệ G o, cụ thể: Dòng tôm sú A chiếm tỷ lệ 26,9% với tổng số 29/108 cá thể, trong đó có 19 cá thể tôm đực và 10 cá thể tôm cái; Dòng tôm sú G chiếm tỷ lệ 20,4% với tổng số 22/108 cá thể, trong đó có 6 cá thể tôm đực và 16 cá thể tôm cái; Dòng tôm sú N chiếm tỷ lệ 28,7% với tổng số 31/108 cá thể, trong đó có 17 cá thể tôm đực và 14 cá thể tôm cái; Dòng tôm sú T chiếm tỷ lệ 24,1% với tổng số 26/108 cá thể, trong đó có 13 cá thể tôm đực và 13 cá thể tôm cái. Như vậy, tỷ lệ góp vật liệu di truyền của dòng tôm Nội địa (N) là cao nhất (28,7%) và thấp nhất là nhóm tôm Gia hóa (20,4%).
10 + Xét trong cùng một dòng: có sự chênh lệch lớn về tỷ lệ góp vật liệu di truyền giữa tôm cái (tôm mẹ) và tôm đực (tôm bố) trong cùng một dòng tôm ở nhóm tôm Ấn Độ Dương (19 tôm cái, 10 tôm đực) và nhóm tôm Gia hóa (6 tôm cái, 16 tôm đực); Ở hai nhóm còn lại là Nội địa và Thái Bình Dương, tỷ lệ tôm đực và tôm cái tham gia sinh sản tạo thế hệ G o là tương đương nhau (lần lượt là 17 tôm cái và 14 tôm đực ở dòng N; 13 tôm cái và 13 tôm đực ở dòng T). Sự chênh lệch cũng thể hiện rõ ở tỷ lệ đóng góp tôm mẹ (nhóm Ấn Độ Dương là 34,5% so với nhóm Gia hóa là 10,9%) và tôm bố (nhóm Ấn Độ Dương là 18,9% so với nhóm Gia hóa là 30,2%) giữa bốn nhóm vật liệu ban đầu. Tôm bố mẹ Go được ghép cặp để sản xuất các gia đình G1 cùng cha mẹ (fullsibs family) và các cặp gia đình cùng cha khác mẹ (halfsibs group). Tổng cộng có 246 cá thể tôm thế hệ G o (bao gồm 112 tôm cái và 134 tôm đực) thuộc 69 gia đình Go được sử dụng làm tôm bố mẹ để sản xuất thế hệ G1. Kết quả đã tạo được 76 gia đình thế hệ G 1. Số lượng các nhóm gia đình và số lượng cá thể tương ứng được trình bày ở Bảng 3.4. Bảng 3.4. Số lượng các nhóm gia đình tôm sú thế hệ G1 Kiểu gia Tôm Tôm Số Tôm bố Số lượng Số Tổn đình bố mẹ lượng x tôm nhóm gia lượng g tôm con mẹ đình cùng gia đình cha khác cùng mẹ cha mẹ Cùng cha 15 50 5.155 1 x 2 6 12 50 khác mẹ 1 x 3 3 9 1 x 4 3 12 1 x 5 2 10 1 x 7 1 7 Cùng cha mẹ 26 26 2.257 26 Tổng 7.412 76 Kết quả ở Bảng 3.4 cho thấy: Trong tổng số 76 gia đình của thế hệ G 1 có 15 nhóm gia đình cùng cha khác mẹ (bao gồm 50 gia đình, chiếm tỷ lệ 65,8%) và 26 gia đình cùng cha mẹ (không có nhóm cùng cha khác mẹ tương ứng), chiếm tỷ lệ 34,2%. Tổng số cá thể tôm sú thế hệ G1 thu được là 7.412, trong đó có 5.155 cá thể (chiếm tỷ lệ 69,5%) thuộc nhóm gia đình cùng cha khác mẹ và 2.257 cá thể (chiếm tỷ lệ 30,5%) thuộc nhóm gia đình cùng cha mẹ. Tôm sú thế hệ Go, G1 ở các giai đoạn khác nhau (từ ấu trùng đến giai đoạn thành thục) được ương nuôi trong điều kiện kiểm soát nghiêm ngặt về các thông số môi trường sống. Tất cả mẫu của các gia đình lai đều được sàng lọc mầm bệnh và đều cho kết quả âm tính với mầm bệnh virus. Các quần đàn tôm lai thế hệ Go và thế hệ G1 sẽ là nguồn vật liệu được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm sàng lọc các chỉ thị phân tử (SNP) liên kết với tính trạng tăng trưởng.
11 3.3. Sàng lọc đa hình nucleotide đơn (SNP) liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tôm sú 3.3.1. Giải trình tự, kết nối các đoạn trình tự và thiết lập hệ gen tham chiếu tạm thời Số lượng contig Giải trình tự hệ gen tôm sú thuộc hai nhóm tôm tăng trưởng nhanh và tôm tăng trưởng chậm trên hệ thống Illumina NextSeq®500 thu được 145.836.644 đoạn trình tự thô (raw read); trong số đó có 120.438.739 (83%) đoạn trình tự mang barcode và điểm cắt của ApeKI. Sau khi tinh sạch thu được 102.505.713 (70,2%) đoạn trình tự có chất lượng tốt để sử dụng Phân bố độ dài contig cho việc kết nối contig và thiết lập hệ gen tham chiếu tạm thời, với dung Hình 3.2. Phân bố độ dài các contig sau tinh sạch lượng dữ liệu ~100 GB. Từ Các contig có kích thước 70 150 bp chiếm số lượng 102.505.713 đoạn trình tự sau khi kết nhiều nhất (211.389), ít nhất là các contig có kích thước >450 bp, loại bỏ các contig kích thước ngắn
C Số lượng SNP ở cả hai nhóm (501). 12 3.3.3. Chú giải gen chức năng từ dữ liệu giải trình tự tôm sú Từ dữ liệu giải trình tự và dữ liệu sàng lọc SNP, chỉ những đoạn trình tự chứa SNP được sử dụng để chú giải nhằm tìm kiếm sự tương đồng với các trình tự gen chức năng được lưu trữ ở GenBank (NCBI). Toàn bộ 2887 đoạn trình tự chứa SNP ở cả hai nhóm tôm sú Lớn nhanh và Lớn chậm được chú giải. Kết quả có 510 (17,67%) contig Hình 3.4. Kết quả chú giải gen chức năng chứa SNP có trình tự nucleotide tương đồng Có 2377 contig chứa SNP không cho kết quả chú với các trình tự trên cơ sở dữ liệu nrNCBI giải, 510 contig chứa SNP cho kết quả chú giải, trong đó: (với tham số Evalue
13 tính trạng tăng trưởng trong họ giáp xác (Jung et al., 2013) với các protein đã chú giải được để rà soát và tìm ra loại protein tương ứng với trình tự contig chứa SNP của hai nhóm tôm sú nghiên cứu. Kết quả đã xác định được hai contig (contig83953 dài 98 bp và contig260347 dài 80 bp) ở nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh có trình tự amino acid tương ứng tương đồng với trình tự amino acid của protein Myosin Heavy Chain (MHC). Trong đó, contig83953 tương đồng với MHC type a (MHCa) và contig260347 tương đồng với MHC type 1 (MHC1). Trong nghiên này, chúng tôi không tìm thấy contig nào của nhóm tôm sú Lớn chậm có sự tương đồng với 22 protein liên quan đến tính trạng tăng trưởng trong họ giáp xác đã được công bố bởi nhóm tác giả Jung et al. (2013). Trình tự nucleotide của contig83953 và contig260347 được trình bày ở Bảng 3.6. 3.3.4. Xác định chỉ thị SNP và tương quan giữa các contig chứa SNP với gen MHC Từ các kết quả sàng lọc SNP và kết quả chú giải protein liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tôm sú (chỉ các contig chứa SNP được chọn để chú giải gen chức năng, sau đó so sánh trình tự của contig chứa SNP với trình tự của gen chức năng tương ứng để xác định loại nucleotide thay thế), chúng tôi đã xác định được vị trí SNP trên contig83953 và contig260347 như sau (Bảng 3.6): SNP T C tại vị trí nucleotide thứ 20 trên mạch bổ sung với contig83953, tức là SNP A G trên mạch gốc contig83953 và SNP G A tại vị trí nucleotide thứ 19 trên contig260347. Bảng 3.7. Kết quả xác định SNP trên contig83953 và contig260347 Nucleotide Ký pháp HGVS của SNP Nucleotide Tên Contig tham Ghi chú tương ứng thay thế chiếu Contig83953 Contig83953:g.20T>C C T Trình tự bổ sung G A Trình tự mạch gốc Contig260347 Contig260347:g.19G>A A G Mạch gốc Để xác định tương quan giữa các contig83953 và contig260347 chứa SNP với gen mã hóa protein MHC liên quan đến tăng trưởng ở tôm sú, chúng tôi đã tiến hành dịch mã các trình tự nucleotide của contig83953 và contig260347 thành các chuỗi amino acid tương ứng, sau đó so sánh với trình tự amino acid của gen mã hóa protein MHC. Kết quả dịch mã được trình bày ở Bảng 3.8. Bảng 3.8. Trình tự amino acid tương ứng của contig83953 và contig260347 Trình tự amino acid tương ứng Tổng số Tên contig amino acid (http://web.expasy.org) của chuỗi Contig83953 AERAQTLANSAEKKQKNFDKIISEWKLKIDDL 32 Contig260347 RLEEAEMetQIESLNVKNLHLEKTKMetRA 30 Để kiểm tra sự chính xác của các trình tự amino acid, chúng tôi đã tiến hành Blast (Basic Local Alignment Search Tool) bằng công cụ Uniprot (http://www.uniprot.org) với cả hai loại
14 dữ liệu đầu vào là trình tự amino acid và trình tự nucleotide của contig83953 và contig260347. Kết quả thu được từ hai loại dữ liệu đầu vào hoàn toàn trùng khớp nhau về tỷ lệ tương đồng giữa chuỗi amino acid của contig83953 và contig260347 so với protein MHC ở các loài khác nhau (Bảng 3.9 và Bảng 3.10). Kết quả ở Bảng 3.9 cho thấy: trình tự amino acid tương ứng của contig83953 đạt tỷ lệ tương đồng cao nhất (90,6%) với trình tự amino acid của protein MHCa ở loài tôm P. japonicus, tỷ lệ tương đồng với MHC1 ở hai loài tôm khác là P. monodon và L. vannamei cũng tương đối cao (đều đạt 87,5%). Kết quả ở Bảng 3.10 cho thấy: trình tự amino acid tương ứng của contig260347 đạt tỷ lệ tương đồng cao nhất (96,2%) với trình tự amino acid của protein MHC ở cả ba loài tôm P.monodon, P. japonicus và L. vannamei. Bảng 3.9. Các tỷ lệ tương đồng cao nhất giữa contig83953 với protein MHC GenBank Protein MHC Tỷ lệ tương Vị trí amino acid STT ID (loài tương ứng) đồng (%) trên protein MHC 1 F8WR03 Myosin heavy chain type a 90,6% 14311462 (Penaeus japonicus) 2 K4Q111 Myosin heavy chain type 1 87,5% 14311462 (Litopenaeus vannamei) 3 K4Q4N8 Myosin heavy chain type 1 87,5% 14321463 (Penaeus monodon) 4 Q6XGZ8 Slow muscle myosin S1 heavy 83,9% 3060 chain (Homarus americanus) 5 B0W188 Myosin heavy chain 80,6% 13991429 (Culex quinquefasciatus) Bảng 3.10. Các tỷ lệ tương đồng cao nhất giữa contig260347 với protein MHC GeneBank Protein MHC Tỷ lệ tương Vị trí amino acid STT ID (loài tương ứng) đồng (%) trên protein MHC 1 K4Q4N8 Myosin heavy chain type 1 96,2 13961425 (Penaeus monodon) 2 F8WR03 Myosin heavy chain type a 96,2 13951420 (Penaeus japonicus) 3 K4Q111 Myosin heavy chain type 1 96,2 13951420 (Litopenaeus vannamei) 4 K4Q2Y1 Myosin heavy chain type 2 76,0 13961418 (Penaeus monodon) 5 K4Q2S1 Myosin heavy chain type 2 76,0 13961418 (Litopenaeus vannamei) 3.3.5. Xác định vùng tương đồng giữa contig chứa SNP so với gen mã hóa protein MHC, xác định codon chứa SNP và vị trí tương ứng của chỉ thị SNP trên gen MHC Bằng cách so sánh các chuỗi trình tự (nucleotide, amino acid) của contig83953 và contig260347 với trình tự của gen MHCa và MHC1 để xác định vùng tương đồng giữa chúng, chúng tôi đã xác định được vị trí phân vùng chức năng trên gen MHCa và MHC1 phù hợp với
15 trình tự các contig83953 và contig260347 chứa SNP, đồng thời xác định chính xác codon chứa SNP cũng như sự biến đổi của amino acid có thể xảy ra do sự xuất hiện SNP (Hình 3.5, Hình 3.6, Hình 3.7, Hình 3.8). Kết quả ở Hình 3.5 và Hình 3.6 cho thấy: vùng tương đồng về amino acid của contig83953 ở tôm sú P. Monodon trong nghiên cứu này so với protein MHCa ở tôm he Nhật bản P. Japonicus nằm trong khoảng vị trí amino acid 1431 1462; vị trí nucleotide tương đồng từ 4408 4505. Vùng tương đồng này thuộc phân vùng chức năng LMM (light meromyosin) trên phân tử protein myosin. Kết quả ở Hình 3.7 và Hình 3.8 cho thấy: vùng tương đồng về amino acid của contig260347 ở tôm sú P. monodon trong nghiên cứu này so với protein MHC 1 ở tôm sú trên genBank nằm trong khoảng vị trí amino acid 1396 1422; vị trí nucleotide tương đồng từ 4302 4379. Vùng tương đồng này cũng thuộc phân vùng chức năng LMM (light meromyosin) trên phân tử protein myosin. Các kết quả chỉ ra trên Hình 3.5, Hình 3.6, Hình 3.7, Hình 3.8 cho thấy rõ các codon chứa các SNP. Cụ thể như sau: SNP T  C tại vị trí nucleotide thứ 20 trên mạch bổ sung với contig83953 [Contig83953:g.20T>C], tức là SNP A  G trên mạch gốc contig83953 được xác định là vị trí SNP A4486G trên gen MHCa (Hình 3.5). SNP này là nucleotide thứ 3 trong bộ ba (codon) mã hóa amino acid, làm bi Contig 83953 ến đổi codon AAA thành AAG. Cả hai codon này đều mã hóa amino acid Lysine (K) với vị trí amino acid tương ứng trên protein MHCa là K1456K (Hình 3.6). Nói cách khác, SNP này không làm thay đổi amino acid tương ứng. SNP G  A tại vị trí nucleotide thứ 19 trên contig260347 [Contig260347:g.19G>A] Contig 83953 được xác định là vị trí SNP G4320A trên gen MHC1 (Hình 3.7). SNP này là nucleotide thứ 2 trong bộ ba mã hóa amino acid, làm biến đổi codon GGA (mã hóa amino acid Glycine G) thành GAA (mã hóa amino acid Glutamic E). Vị trí amino acid tương ứng Contig 83953 trên protein MHC 1 là G1401E (Hình 3.8). Như vHình 3.5. Vùng t ậy, với việc sươ ử d ụng hệ gen tham chiếu tạm thời của tôm sú P. monodon được thiết ng đồng nucleotide giữa mạch bổ sung của contig83953 của tôm sú P. lập de novo đ ể sàng l monodon so v ọc SNP, nghiên c ới trình t ứu của chúng tôi đã xác đ ự gen MHCa ở tôm he Nh ịnh đ ật Bản P. japonicus (v ược hai SNP ở nhóm tôm ị trí nucleotide 4408 4505) sú tăng trưởng nhanh. Hai SNP này nằm trong phân vùng chức năng LMM của gen MHC liên quan đến tính trạng tăng trưởng. S2 LMM Contig 83953 Contig 83953 Contig 83953 Hình 3.6. Ánh xạ trình tự amin oacid thể hiện vùng tương đồng giữa contig83953 của tôm sú P. monodon với protein MHCa ở tôm he Nhật Bản P. japonicus (vị trí amino acid 1431 1462)
16 Contig260347 Contig260347 Hình 3.7. Vùng tương đồng nucleotide giữa contig260347 so với trình tự gen MHC1 ở tôm sú P. monodon (vị trí nucleotide 4302 4379) S2 LMM Contig260347 Contig260347 Hình 3.8. Ánh xạ trình tự acid amin thể hiện vùng tương đồng giữa contig260347 với MHC1 ở tôm sú P. monodon (vị trí acid amin 1396 1422) 3.4. Sàng lọc chỉ thị SNP G>A ở tôm sú tăng trưởng nhanh bằng phương pháp KASP Kết quả kiểm tra trên 40 mẫu tôm sú cái tăng trưởng nhanh thế hệ G 1 (Hình 3.9) cho thấy: hầu hết mẫu tôm sú tăng trưởng nhanh (28/40 mẫu) chứa SNP dạng đồng hợp tử A:A (màu xanh dương); chỉ có 2/40 mẫu chứa SNP dạng đồng hợp tử G:G (màu đỏ); còn lại là 10/40 mẫu chứa SNP dạng dị hợp tử G:A (màu xanh lá cây). Kết quả này cho thấy: việc sử dụng các mồi xuôi và mồi ngược được thiết kế đặc hiệu với trình tự DNA chứa SNP G>A, trong đó trình tự mồi xuôi đặc hiệu với alen kiểu dại được gắn HEXtail (màu đỏ) và trình tự mồi xuôi đặc hiệu với alen đột biến được gắn FAMtail (màu xanh dương) đã phát hiện thấy đột biến G4320A thuộc gen MHC1 có mặt ở 38 trong số 40 mẫu tôm sú được kiểm tra (chiếm 95%). Trong số 38 cá thể tôm sú mang đột biến G4320A, có 28 cá thể mang kiểu gen đồng hợp tử (tương ứng với 28 tín hiệu huỳnh quang màu xanh dương) và có 10 cá thể mang kiểu gen dị hợp tử (tương ứng với 10 tín hiệu huỳnh quang màu xanh lá cây).
17 Hình 3.9. Kết quả phân tích tín hiệu huỳnh quang trong kỹ thuật KASP sàng lọc chỉ thị SNP G>A thuộc gen MHC1 ở tôm sú tăng trưởng nhanh Các chấm màu xanh dương thể hiện các mẫu tôm sú tăng trưởng nhanh có đồng hợp tử A:A (28/40 mẫu); Các chấm màu đỏ thể hiện các mẫu tôm tăng trưởng nhanh có đồng hợp tử G:G 2/40 mẫu; Các chấm màu xanh lá cây thể hiện các mẫu tôm tăng trưởng nhanh có dị hợp tử G:A 10/40 mẫu. Các chấm màu đen là tín hiệu huỳnh quang bị nhiễu; Các mẫu đối chứng không có tín hiệu huỳnh quang (không xuất hiện trên hình). Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Đa hình AFLP ở các quần đàn tôm sú Kết quả phân tích đa hình AFLP sử dụng cặp mồi chọn lọc MseICTT/EcoRIACC JOE đối với các mẫu tôm sú thuộc ba quần đàn BTB, NTB và NB với số lượng alen ở các quần đàn là khác nhau, không có sự trùng nhau hoàn toàn về vị trí xuất hiện của các alen đã cho thấy genome của các mẫu tôm sú có cấu trúc khác nhau, tức là có sự đa hình về mặt di truyền giữa các cá thể. Khi so sánh chi tiết vị trí các alen của các mẫu tôm sú giữa các quần đàn với nhau cho thấy: không những các alen ở các mẫu là không trùng nhau hoàn toàn khi so sánh hai mẫu bất kỳ thuộc cùng một quần đàn hay thuộc hai quần đàn khác nhau, mà ở mỗi quần đàn đều có những alen đặc trưng cho quần đàn đó, tức là chỉ xuất hiện ở một hoặc một vài cá thể của một quần đàn mà không thấy có ở các quần đàn khác. Trong đó: Quần đàn BTB có số lượng alen đặc trưng quần đàn nhiều hơn hẳn so với quần đàn NTB và NB. Trong phạm vi từng quần đàn, khi so sánh sự đa hình AFLP giữa các cá thể thuộc cùng một quần đàn cho thấy: trong khi ở quân đan NTB co 4 alen trung nhau, ̀ ̀ ́ ̀ ở quân đan NB có 8 alen ̀ ̀ trùng nhau thì điểm đặc biệt của quần đàn Bắc Trung Bộ là không có bất kì alen nào trùng nhau. Điều này cho thấy tính đa dạng di truyền rất cao của các cá thể trong quần đàn này. Phân tich sâu h ́ ơn chung tôi nh ́ ận thây, gi ́ ữa 3 quân đan nay không co alen nao trùng nhau. ̀ ̀ ̀ ́ ̀ Từ những nhận định trên đây có thể kết luận: các mẫu tôm sú nghiên cứu thuộc 3 quần đàn khác nhau thể hiện tính đa hình di truyền rõ rệt. Mỗi cá thể đều là khác biệt hay nói cách khác chúng có kiểu gene khác nhau. Sự đa hình này không chỉ thể hiện giữa các cá thể bên trong mỗi quần đàn mà còn là sự đa hình giữa các quần đàn tôm sú thuộc các khu vực phân bố khác nhau về mặt địa lý. Trong số 3 quần đàn tôm sú nghiên cứu, quần đàn BTB thể hiện tính đa hình di truyền (đa hình AFLP) cao nhất và thấp nhất là quần đàn NB.