Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số hợp chất từ vi nấm biển phân lập tại miền trung Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

27
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án nhằm thu nhận các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển phân lập ở vùng biển miền Trung và xác định một số hoạt tính sinh học (kháng sinh, gây độc tế bào, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào thần kinh) của các hợp chất sạch thu được.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số hợp chất từ vi nấm biển phân lập tại miền trung Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phan Thị Hoài Trinh NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ VI NẤM BIỂN PHÂN LẬP TẠI MIỀN TRUNG VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2019
Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS. Phí Quyết Tiến Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS. Trần Thị Thanh Vân Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Ngày nay, cùng với công cuộc phát triển kinh tế xã hội thì việc chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng luôn là mối quan tâm đặc biệt của mọi quốc gia trên thế giới. Mặc dù nền y học của con người đã đạt đến trình độ tiến bộ nhất định nhưng các bệnh truyền nhiễm và bệnh nan y vẫn đang diễn biến khá phức tạp và là mối đe doạ lớn đối với sức khoẻ cộng đồng. Vì vậy, việc nghiên cứu phát hiện các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học, đặc biệt là các hợp chất có nguồn gốc từ vi nấm biển đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trong nước và trên thế giới. Việt Nam là một quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới và có hệ sinh thái biển được đánh giá đa dạng. Đây chính là cơ sở cho các nghiên cứu điều tra về đa dạng sinh học cũng như tiềm năng các hoạt chất sinh học từ nguồn vi nấm biển. Theo công bố của Trần Hồng Quang và cộng sự (2018), năm hợp chất mới gồm modiolide D-G và 1-(2,5-dihydroxyphenyl)-3- methoxy-butan-1-one cùng với 3 hợp chất đã biết gồm modiolide A-B và 1-(2,5-dihydroxyphenyl)-2-buten-1-one được thu từ dịch lên men chủng vi nấm nội sinh Paraconiothyrium sp. VK-13. Hai trong số năm hợp chất thu được thể hiện hoạt tính kháng viêm. Bên cạnh đó, chủng vi nấm Penicillium sp. KMM 4672 có nguồn gốc từ rong Padina spp. thu ở vịnh Vân Phong, Khánh Hòa cũng sinh tổng hợp 3 hợp chất mới gồm 4- hydroxy-3,6-dimethyl-2-pyrone, 4-methoxy-isoquinolin-1(2H)-one và N,N-diethyl-3-methyl-benzamide. Với mục tiêu thu nhận các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ nguồn vi nấm biển nhằm định hướng phát hiện nguồn dược liệu mới, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số hợp chất từ vi nấm biển phân lập tại miền Trung Việt Nam”.
2 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án Thu nhận các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển phân lập ở vùng biển miền Trung và xác định một số hoạt tính sinh học (kháng sinh, gây độc tế bào, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào thần kinh) của các hợp chất sạch thu được. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án - Phân lập, đánh giá hoạt tính kháng sinh và tuyển chọn các chủng vi nấm biển cho nghiên cứu tiếp theo. - Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thô của chủng vi nấm biển tuyển chọn. - Phân tách, tinh sạch và xác định cấu trúc của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ cặn chiết lên men chủng vi nấm tuyển chọn. - Xác định hoạt tính sinh học của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp thu nhận. 4. Bố cục của luận án Luận án có 149 trang bao gồm: Mở đầu 2 trang, Chương 1. Tổng quan 33 trang, Chương 2. Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu 13 trang, Chương 3. Kết quả nghiên cứu 54 trang, Chương 4. Thảo luận kết quả 16 trang, Kết luận và Kiến nghị 2 trang, Danh mục công trình của tác giả 2 trang, Tài liệu tham khảo 27 trang. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Luận án là nghiên cứu mới có hệ thống về phân lập và đánh giá hoạt tính kháng sinh của các chủng vi nấm phân lập từ vùng biển miền Trung Việt Nam. - Tinh sạch và đánh giá được hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào ung thư, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào thần kinh của 14 hợp chất chuyển hóa thứ cấp thu nhận được từ 3 chủng vi nấm biển A. flocculosus 01NT.1.1.5, Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 và P. chrysogenum 045-357-2, gồm:
3 phomaligol A2 (1), wasabidienone E (2), aspertetranone D (3), mactanamide (4), cycloechinulin (5), asteltoxin (6), ochraceopone F (7), asterriquinone C1 (8), dihydroaspyrone (9) và aspilactonol F (10), 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin (11), 6β,9α,14-trihydroxycinnamolide (12), andrastin A (13) và citreohybridonol (14). - Xác định được 4 hợp chất mới gồm phomaligol A2 (1), ochraceopone F (7), 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin (11), và 6β,9α,14- trihydroxycinnamolide (12). CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Vi nấm biển được đánh giá là nguồn tài nguyên VSV biển có giá trị với khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất kháng sinh, kháng viêm, kháng ung thư và chống oxy hóa đang được nghiên cứu và ứng dụng trong y dược. Chính quá trình thích nghi với điều kiện sống khắc nghiệt của môi trường biển như độ mặn cao, dinh dưỡng thấp, áp suất cao, biến đổi nhiệt độ đồng thời cạnh tranh với các sinh vật khác đã tạo điều kiện để VSV biển sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học mới, ưu việt hơn so với VSV trên cạn. Theo các công bố, vi nấm biển rất đa dạng và hiện diện hầu hết trong hệ sinh thái biển bao gồm nước biển, trầm tích biển, nền gỗ trong đại dương, cộng sinh với hải miên, san hô, rong biển và các sinh vật biển khác. Các nhà khoa học ước tính rằng có đến 1500 loài vi nấm biển tồn tại, tuy nhiên cho đến nay, có ít hơn 10% sự đa dạng sinh học vi nấm biển được phát hiện và đang trong tiến trình nghiên cứu. Các nhà khoa học cho rằng việc thay đổi các điều kiện lên men hoặc nuôi cấy kết hợp với vi sinh vật khác sẽ kích hoạt con đường trao đổi chất của VSV để sản sinh ra các hợp chất chuyển hóa thứ cấp mới. Để đáp ứng được nhu cầu thuốc mới hiện nay, các nhà khoa học đã mở rộng phạm vi nghiên cứu vi nấm biển từ các vùng biển ôn đới đến nhiệt đới,
4 và cả ở những vùng biển có nhiệt độ thấp quanh năm như Nam Cực. Việt Nam là một quốc gia nằm ở khu vực nhiệt đới với bờ biển dài và có hệ sinh thái đa dạng. Tuy nhiên, theo tài liệu cho thấy số lượng công trình nghiên cứu còn hạn chế so với tiềm năng khai thác vi nấm biển ở Việt Nam. Vì vậy, hướng nghiên cứu phát hiện các hợp chất tự nhiên từ vi nấm biển Việt Nam là cần thiết, góp phần khai thác các hoạt chất sinh học mới đồng thời bảo vệ chủ quyền vùng biển quốc gia. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và môi trường nghiên cứu 2.1.1. Mẫu nghiên cứu, các chủng VSV kiểm định và các dòng tế bào - Mẫu nghiên cứu: 4 mẫu hải miên, 11 mẫu san hô mềm, 9 mẫu rong biển và 8 mẫu trầm tích biển được thu từ vùng biển Ninh Thuận (11o70’B; 109o21’Đ) ở độ sâu 10-20 m, tháng 06/2013; 17 mẫu hải miên, 3 mẫu san hô mềm, 8 mẫu rong biển và 9 mẫu trầm tích biển được thu từ vùng biển Nha Trang (12o18’B; 109o31’Đ) ở độ sâu 5-10 m, tháng 02/2016; 8 mẫu hải miên, 14 mẫu san hô mềm, 16 mẫu rong biển và 4 mẫu trầm tích được thu từ vùng biển Đà Nẵng (16o11’ B; 108o31’ Đ) ở độ sâu 8-15 m, tháng 08/2016. - Các chủng VSV kiểm định: B. cereus ATCC 11778, E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25923, P. aeruginosa ATCC 27853, S. faecalis ATCC 19433, L. monocytogenes ATCC 19111 và C. albicans ATCC 10231 do Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam cung cấp. - Các dòng tế bào ung thư ở người: HCT-15 (ung thư đại tràng), NUGC-3 (ung thư dạ dày), NCI-H23 (ung thư phổi), ACHN (ung thư thận), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt) và MDA-MB-231 (ung thư biểu mô tuyến vú) do Viện KH&CN Hải dương Hàn Quốc cung cấp. - Dòng tế bào thần kinh Neuro2a (ATCC® CCL-131™) do Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương, Viện Hàn lâm Khoa học Nga cung cấp.
5 2.1.2. Môi trường nghiên cứu - Môi trường phân lập: môi trường thạch Sabouraud có bổ sung kháng sinh gồm 10 g pepton, 20 g glucose, 18-20 g agar, 1000 mL nước biển tự nhiên, 1,5 g penicillin, 1,5 g streptomycin, pH 6,0-7,0. - Môi trường lên men rắn (RYE): môi trường được chuẩn bị trong bình Erlenmeyer 500 mL gồm 20 g gạo, 20 mg dịch chiết nấm men, 10 mg KH2PO4 và 40 mL nước biển. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phân lập vi nấm biển Vi nấm biển được phân lập trên môi trường Sabouraud ở 28°C. 2.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng VSV kiểm định của vi nấm biển Xác định theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của Becerro và cộng sự (1994). 2.2.3. Phân tích cặn chiết của các chủng vi nấm có hoạt tính kháng sinh cao Cặn chiết thô của các chủng vi nấm có hoạt tính kháng sinh cao được phân tích trên sắc ký bản mỏng (TLC Silica gel 60 F254) với hệ dung môi toluen : isopropanol (6:1, v/v) và phổ 1H-NMR. 2.2.4. Xác định đặc điểm hình thái và phân loại vi nấm biển Đặc điểm hình thái và tên vi nấm được xác định theo sách phân loại của Raper và Thom (1949), Samson và cộng sự (2011), Crous và Groenewald (2015), Stolk và Samson (1972). Ngoài ra, vi nấm còn được phân loại dựa trên phân tích trình tự vùng ITS/28S rDNA và so sánh với các trình tự gen tương ứng trên Ngân hàng Gen NCBI. 2.2.5. Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của vi nấm biển Các yếu tố lên men gồm thời gian, nồng độ muối và pH môi trường được khảo sát để đánh giá ảnh hưởng của điều kiện lên men trên môi trường RYE
6 đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng vi nấm tuyển chọn. 2.2.6. Phân tách các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển Sinh khối vi nấm và môi trường lên men được ngâm chiết với ethyl acetate ở nhiệt độ phòng ở trạng thái tĩnh trong 48 giờ và tiến hành cô quay ở 40oC để thu cặn chiết ethyl acetate thô. Cặn chiết được tiếp tục phân tách dựa trên các phương pháp sắc ký gồm sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột (CC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để thu nhận các hợp chất sạch. 2.2.7. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định dựa trên sự kết hợp giữa các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và phổ khối lượng (ESI-MS hoặc HR-ESI-MS). 2.2.8. Xác định hoạt tính sinh học của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển 2.2.8.1. Xác định hoạt tính kháng VSV kiểm định Đánh giá theo phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). 2.2.8.2. Xác định hoạt tính gây độc tế bào Xác định theo phương pháp nhuộm SRB (sulforhodamine B). 2.2.8.3. Xác định hoạt tính chống oxy hóa Xác định theo khả năng khử gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl) và ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulphonic acid). 2.2.8.4. Xác định hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh Xác định theo phương pháp MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5- diphenyltetrazolium bromide). 2.2.9. Xử lý số liệu nghiên cứu Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần và dữ liệu được biểu thị bằng trung bình ± độ lệch chuẩn được tính toán qua Microsoft Excel 2010.
7 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và sàng lọc hoạt tính kháng VSV kiểm định của vi nấm biển Từ 29 mẫu hải miên, 28 mẫu san hô mềm, 33 mẫu rong biển và 21 mẫu trầm tích biển thu nhận từ các vùng biển Đà Nẵng, Nha Trang và Ninh Thuận đã phân lập và thuần khiết được 273 chủng vi nấm biển (Hình 3.1). Hình 3.1. Số lượng các chủng vi nấm biển được phân lập từ Ninh Thuận, Nha Trang và Đà Nẵng Phân tích đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 273 chủng vi nấm thu được cho thấy hầu hết các chủng có hình dạng khuẩn lạc tròn (81,6%, n=235), bề mặt trơn, mịn (54,2%, n=148). Khuẩn lạc phẳng và có viền/mép liền cũng được ghi nhận với tỷ lệ cao lần lượt 55,3% (n=151) và 74,7% (n=204). Các chủng vi nấm có bề mặt khuẩn lạc thuộc nhiều nhóm màu khác nhau, trong đó khuẩn lạc màu xanh rêu/xanh lá cây chiếm tỷ lệ cao nhất (31,9%, n=87). Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng sinh cho thấy có 54,2% (n=148) chủng thể hiện hoạt tính kháng sinh đối với ít nhất một chủng VSV kiểm định. Nghiên cứu cũng cho thấy có 43,9% (n=109) chủng kháng B. cereus, 34,4% (n=94) kháng S. faecalis, 42,1% (n=115) kháng S. aureus và 29,7% (n=81) kháng L. monocytogenes. Khả năng kháng vi khuẩn Gram âm gồm E. coli, P. aeruginosa và nấm men C. albicans được ghi
8 nhận với tỷ lệ thấp hơn, lần lượt 4,4% (n=12), 2,2% (n=6) và 4,8% (n=13). Số lượng chủng vi nấm phân lập từ vùng biển Nha Trang thể hiện hoạt tính kháng sinh chiếm tỉ lệ cao hơn so với Đà Nẵng và Ninh Thuận. Cụ thể, hoạt tính kháng S. aureus của các chủng vi nấm thu nhận từ 3 vùng biển Nha Trang, Ninh Thuận và Đà Nẵng chiếm tỷ lệ lần lượt 57, 42 và 21%. Kết quả khảo sát cũng được ghi nhận tương tự đối với B. cereus, S. faecalis và L. monocytogenes. Điều này được dự đoán hệ sinh thái khác nhau ở các vùng biển đã tác động đến đặc tính sinh học của các chủng vi nấm nghiên cứu. Nghiên cứu của Zhou và các cộng sự (2016) đã chứng minh rằng địa điểm và nguồn phân lập không chỉ có liên quan đến sự đa dạng loài vi nấm mà còn cả khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học từ chúng. Trong số 273 chủng vi nấm khảo sát, có 8 chủng thể hiện hoạt tính kháng sinh mạnh và kháng phổ rộng đối với hầu hết các chủng VSV kiểm định gồm 01NT.1.1.5, 01NT.1.5.4, 01NT.1.9.4, 01NT.1.12.3, 045-357-2, 168ST.16.1, 168ST.35.2 và 168ST.51.1 nên được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo về phân tích cặn chiết thô trên TLC và phổ NMR đồng thời xác định đặc điểm hình thái và phân loại. 3.2. Phân tích cặn chiết thô và xác định đặc điểm phân loại của 8 chủng vi nấm tuyển chọn Kết quả cho thấy cặn chiết thô của 8 chủng vi nấm thể hiện các vệt chất với màu sắc và hệ số di chuyển khác nhau trên bản TLC (Hình 3.9). Ba chủng vi nấm 01NT.1.1.5, 01NT.1.12.3 và 045-357-2 được dự đoán có sự đa dạng các lớp chất chứa trong cặn chiết, tiếp đến là các chủng 01NT.1.5.4 và 168ST.16.1. Ba chủng còn lại gồm 01NT.1.9.4, 168ST.35.2 và 168ST.51.1 thể hiện các vệt chất không rõ ràng trên bản sắc ký. Vì vậy, năm chủng 01NT.1.1.5, 01NT.1.12.3, 045-357-2, 01NT.1.5.4 và 168ST.16.1 được lựa chọn để phân tích cặn chiết thô trên phổ 1H NMR.
9 Phổ 1H NMR của các cặn chiết từ 3 chủng vi nấm 01NT.1.1.5, 01NT.1.12.3 và 045-357-2 thể hiện rõ các tín hiệu proton ở vùng trường thấp (5-8 ppm) nên được dự đoán có chứa các hợp chất có cấu trúc vòng thơm trong cặn chiết thu nhận. Cặn chiết từ 2 chủng 168ST.16.1 và 01NT.1.5.4 được ghi nhận rất ít các tín hiệu proton ở vùng trường thấp đồng thời phổ 1H NMR thể hiện các tín hiệu đơn giản hơn so với 3 chủng 01NT.1.1.5, 01NT.1.12.3 và 045-357-2 (Hình 3.10). Hình 3.9. Phân tích cặn chiết thô của 8 chủng vi nấm tuyển chọn trên TLC (hệ dung môi toluen : isopropanol, 6:1 v/v) 01NT.1.1.5 01NT.1.12.3
10 045-357-2 168ST.16.1 01NT.1.5.4 Hình 3.10. Phổ 1H-NMR của cặn chiết thô từ 5 chủng vi nấm 01NT.1.1.5, 01NT.1.12.3, 045-357-2, 168ST.16.1 và 01NT.1.5.4 Đặc điểm hình thái của 8 chủng vi nấm biển tuyển chọn được xác định sau nuôi cấy 5-10 ngày trên môi trường thạch đĩa Sabouraud ở 28oC và được mô tả ở Bảng 3.4. Bảng 3.4. Đặc điểm hình thái của 08 chủng vi nấm biển tuyển chọn T Chủng vi Hình ảnh Đặc điểm hình thái khuẩn lạc T nấm khuẩn lạc 1 01NT.1.1.5 - Màu vàng kem, tròn, đường kính 22-25 mm - Bề mặt dạng sợi bông, có nhiều hạt bào tử màu vàng kem, mọc vòng tròn đồng tâm - Sắc tố hòa tan màu vàng nhạt - Viền dạng sợi ngắn mịn 2 01NT.1.5.4 - Màu vàng pha xám, tròn, đường kính 22-25 mm - Bề mặt dạng sợi bông, có nhiều hạt bào tử màu vàng kem sau chuyển màu đen - Sắc tố hòa tan màu nâu nhạt - Viền dạng sợi
11 3 01NT.1.12. - Màu trắng xám, tròn, đường kính 18-22 mm 3 - Bề mặt dạng sợi bông mịn, có nhiều hạt bào tử màu vàng úa ở giữa - Sắc tố hòa tan màu vàng - Mép dạng sợi bông dày mịn 4 168ST.16.1 - Màu vàng kem, tròn, đường kính 18-25 mm - Có hệ sợi nấm khí sinh trên thạch mọc dạng vòng tròn đồng tâm - Tạo giọt tiết trên bề mặt khuẩn lạc, có sắc tố hòa tan màu vàng nâu - Viền liền 5 01NT.1.9.4 - Màu nâu xám, tròn, đường kính 15-18 mm - Bề mặt dạng sợi bông mịn, mọc lồi cao - Sắc tố hòa tan màu xám đen - Viền cuộn tròn 6 045-357-2 - Màu xanh rêu pha xám nhạt, tròn, đường kính 20- 25 mm - Mọc dạng vòng tròn đồng tâm, bề mặt mịn, có vách chia ở giữa - Có tạo giọt tiết trên bề mặt khuẩn lạc - Viền liền 7 168ST.35.2 - Màu xanh rêu, tròn, đường kính 20-24 mm - Bề mặt mịn, có sợi bông ở giữa - Không tiết sắc tố hòa tan - Viền liền 8 168ST.51.1 - Màu trắng, tròn, đường kính 22-26 mm - Bề mặt dạng sợi bông xốp mịn - Không có giọt tiết trên bề mặt khuẩn lạc, có sắc tố hòa tan màu nâu - Viền liền Dựa trên đặc điểm hình thái quan sát dưới kính hiển vi, bốn chủng vi nấm nghiên cứu gồm 01NT.1.1.5, 01NT.1.5.4, 01NT.1.12.3 và 168ST.16.1 được xác định thuộc chi Aspergillus. Chủng 045-357-2 được xác định thuộc chi Penicillium (Bảng 3.5). Từ sự kết hợp giữa đặc điểm hình thái và phân tích trình tự gen vùng ITS/28S rDNA đã đưa đến kết quả phân loại 8 chủng vi nấm tuyển chọn đều thuộc ngành
12 Ascomycota. Trong đó, có 7 chủng thuộc bộ Eurotiales gồm A. flocculosus 01NT.1.1.5 (MG972941), A. niger 01NT.1.5.4 (MH095994), Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 (MH101466), Aspergillus sp. 168ST.16.1 (MG920345), P. chrysogenum 045-357-2 (MH753592), Talaromyces sp. 168ST.35.2 (MK080561) và Talaromyces sp. 168ST.51.1 (MK072976). Một chủng vi nấm thuộc bộ Dothideales là Biatriospora sp. 01NT.1.9.4 (MK072974). Các báo cáo cho thấy vi nấm thuộc chi Aspergillus và Penicillium có khả năng sản sinh phần lớn các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học. Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái của 08 chủng vi nấm biển quan sát dưới kính hiển vi T Chủng vi Hình thái Đặc điểm hình thái T nấm vi nấm 1 01NT.1.1.5 - Bào tử hình cầu, có kích thước 2,5-3 µm, mọc dạng tỏa tròn - Thể bình có hai tầng - Bọng hình cầu, có chiều rộng 35-45 µm - Cuống sinh bào tử có thành xù xì, không bị thóp lại chỗ dưới bọng 2 01NT.1.5.4 - Bào tử hình cầu, kích thước 3,5-4,5 µm, bề mặt gồ ghề, mọc tỏa tròn - Bọng hình cầu, có chiều rộng 30-75 µm - Cuống sinh bào tử có thành mịn 3 01NT.1.12.3 - Bào tử hình cầu, có kích thước 2-2,5 µm, mọc dạng tỏa tròn - Bọng hình cầu, có chiều rộng 25-35 µm - Cuống sinh bào tử có thành xù xì 4 168ST.16.1 - Bào tử hình cầu, nhẵn, mịn, kích thước 2- 2,5 µm, mọc đính tròn - Bọng hình cầu, có chiều rộng 25-35 µm - Cuống sinh bào tử trong suốt
13 5 01NT.1.9.4 - Sợi nấm màu xám, rộng 2,5–3,9 µm, phân cành thưa thớt. - Các sợi nấm có thành mịn và trong suốt. 6 045-357-2 - Bào tử nhẵn, ban đầu hình elip, kích thước 2-2,5 x 2,5-3 µm, khi già có hình cầu - Cuống sinh bào tử nhẵn, có nhiều vách ngăn, phân nhánh điển hình, kích thước đạt đến 100 µm 7 168ST.35.2 - Bào tử đính kiểu hình kim, đính từ một đến ba bào tử. - Bào tử nhẵn, có hình elip, kích thước 2-3 x 1,5-2,5 µm. - Cuống sinh bào tử có thành dày. - Sợi nấm có vách ngăn 8 168ST.51.1 - Cuống sinh bào tử dạng ống, có thành mịn, thon ở phần đỉnh. - Cuống sinh bào tử được sinh trực tiếp từ sợi nấm và có kích thước 12-20 x 1,5-2,0 µm. - Sợi nấm phân nhánh Năm chủng vi nấm nghiên cứu gồm A. flocculosus 01NT.1.1.5, A. niger 01NT.1.5.4, Aspergillus sp. 01NT.1.12.3, P. chrysogenum 045- 357-2, Aspergillus sp. 168ST.16.1 thể hiện các vệt chất khá đa dạng khi phân tích trên bản TLC. Tuy nhiên, chỉ có 3 chủng A. flocculosus 01NT.1.1.5, Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 và P. chrysogenum 045-357-2 xuất hiện rõ các tín hiệu proton ở vùng trường thấp trên phổ 1H NMR dự đoán hiện diện các hợp chất có cấu trúc vòng thơm trong cặn chiết thu nhận. Vì vậy, ba chủng vi nấm trên được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo về khảo sát điều kiện lên men thích hợp và phân tách các hợp chất tự nhiên. Đây là công trình nghiên cứu mới về hoạt chất sinh học từ các chủng vi nấm thuộc loài A. flocculosus và P. chrysogenum được phân lập ở vùng biển miền Trung Việt Nam.
14 3.3. Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của 03 chủng vi nấm biển tuyển chọn - Chủng A. flocculosus 01NT.1.1.5 sản sinh 363 mg cặn chiết thô/ 40 g gạo trong môi trường có nồng độ muối 35 g/L, pH môi trường ban đầu 6,0 và sau thời gian lên men 20 ngày. - Chủng Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 sản sinh 564 mg cặn chiết thô/40 g gạo trong môi trường có nồng độ muối 25 g/L, pH môi trường ban đầu 6,0 và sau thời gian lên men 22 ngày. - Chủng P. chrysogenum 045-357-2 sản sinh 264 mg cặn chiết thô/40 g gạo trong môt trường có nồng độ muối 35 g/L, pH môi trường ban đầu 7,0 và sau thời gian lên men 14 ngày. 3.4. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ chủng vi nấm biển tuyển chọn 3.4.1. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất từ chủng vi nấm A. flocculosus 01NT.1.1.5 Cặn chiết của chủng vi nấm A. flocculosus 01NT.1.1.5 được phân tách trên sắc ký cột gel C18 và tinh chế bằng HPLC thu nhận được 8 hợp chất sạch 1-8 (Hình 3.15). Dựa trên phân tích phổ ESI-MS, HR- ESI-MS kết hợp với dữ liệu phổ NMR và các tài liệu công bố đã xác định tên của 8 hợp chất lần lượt phomaligol A2 (1), wasabidienone E (2), aspertetranone D (3), mactanamide (4), cycloechinulin (5), asteltoxin (6), ochraceopone F (7) và asterriquinone C1 (8). Trong đó 2 hợp chất 1 và 7 được xác định là hợp chất mới. Hợp chất 1: Phomaligol A2 (Hợp chất mới) Chất dầu màu vàng, phổ ESI-MS (m/z 300,88 [M+H]+), công thức phân tử (CTPT) C14H20O7. Phổ 1H NMR của hợp chất 1 có tín hiệu của 4 nhóm methyl, 2 nhóm methine, 1 nhóm methoxy (δH 3,89/H-12) và 1 proton vòng thơm ở δH 5,62 (H-4). Hai carbon olefinic, 3 ketone carbon,
15 2 carbon có liên kết trực tiếp với oxy, và 1 carbon methoxy được quan sát thấy ở phổ 13C NMR. Sáu tín hiệu carbon còn lại được cho là một sec-butyl (δC 20,2/C-10, 12,1/C-11, 68,4/C-9, và 46,5/C-8) và hai nhóm methyl (δC 22,7/C-14 , 20,7/C-13). Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất 1 tương tự với hợp chất phomaligol A được phân lập từ vi nấm Paecilomyces lilacinus F-9, ngoại trừ nhóm -OH tại C-9. Hợp chất 1 là một hợp chất mới và được đặt tên là phomaligol A2. 1 2 3 4 5 8 7 6 Hình 3.15. Cấu trúc hóa học của các hợp chất 1-8 phân lập từ chủng vi nấm A. flocculosus 01NT.1.1.5 Hợp chất 7: Ochraceopone F (Hợp chất mới) Chất dầu màu nâu, phổ HR-ESI-MS (m/z 397,1987 [M+Na]+), CTPT C22H30O5. Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR cùng với phổ COSY, HSQC cho thấy sự xuất hiện của 1 nhóm methine tại δH 2,47 (H-7), 5 nhóm methylene tại vị trí H-16, H-10, H-9, H-6, H-15, 6 nhóm methyl, 10 tín hiệu carbon bậc bốn, 1 ketone carbonyl tại δC 218,0 (C-14), 1 ester carbonyl tại δC 165,7 (C-1), 2 carbon được oxy hóa liên hợp tại δC 97,6 (C-2), 107,5 (C-4), 2 carbon bậc bốn có gắn với oxy tại δC 80,4 (C-8),
16 78,2 (C-11), hai carbon bậc bốn aliphatic tại δC 53,1 (C-13), 40,4 (C-12). Dữ liệu phổ cũng cho thấy vòng tetracyclic của hợp chất 7 gần giống với hợp chất ochraceopone E, một α-pyrone merosesquiterpenoid từ chủng vi nấm Aspergillus ochraceopetaliformis SCSIO 05702 được phân lập từ Nam Cực. Điểm khác biệt giữa hợp chất 7 và ochraceopone E là hợp chất 7 không có nhóm hydroxyl tại C-9. Vì vậy, cấu trúc của hợp chất 7 được xác định là 9-deoxy ochraceopone E và được đặt tên là ochraceopone F. 3.4.2. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất từ chủng vi nấm Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 Từ cặn chiết của chủng vi nấm biển Aspergillus sp. 01NT.1.12.3, tiến hành phân tách trên sắc ký cột silica gel và tinh chế bằng HPLC thu nhận được 4 hợp chất 9-12 (Hình 3.26). Dựa trên phân tích phổ HR-ESI-MS kết hợp với dữ liệu phổ NMR và các tài liệu công bố đã xác định tên của 4 hợp chất lần lượt dihydroaspyrone (9), aspilactonol F (10), 6β,9α,14- trihydroxycinnamolide (11) và 6β,7α,14-trihydroxyconfertifoline (12). Trong đó, hợp chất 11 và 12 được xác định là hợp chất mới. 9 10 11 12 Hình 3.26. Cấu trúc hóa học của các hợp chất 9-12 từ chủng vi nấm A. flocculosus 01NT.1.12.3 Hợp chất 11: 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin (Hợp chất mới) Chất bột màu trắng, HR-ESI-MS (m/z 305,1361 [M + Na]+), CTPT C15H22O5. Dữ liệu phổ cho thấy cấu trúc của hợp chất 11 gần giống với
17 hợp chất 6β,14-dihydroxy-7α-methoxyconfertifoline được thu nhận đầu tiên từ chủng vi nấm A. versicolor CNC 327 phân lập từ rong biển Penicillus capitatus ở đảo Bahamas. Đến năm 2018, hợp chất 6β,14- dihydroxy-7α-methoxyconfertifoline tiếp tục được Tan và cộng sự phân tách từ chủng A. ochraceus Jcma1F17 có nguồn gốc từ mẫu rong Coelarthrum sp. thu nhận ở vùng biển phía Nam Trung Quốc. Điểm khác biệt giữa hợp chất 11 và 6β,14-dihydroxy-7α- methoxyconfertifoline là hợp chất 11 có nhóm hydroxyl tại C-7 thay cho nhóm methoxy. Vì vậy, hợp chất 11 được xác định là hợp chất mới và được đặt tên là 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin. Hợp chất 12: 6β,9α,14-trihydroxycinnamolide (Hợp chất mới) Chất bột màu trắng, HR-ESI-MS (m/z 281,1390 [M-H]-), CTPT C15H22O5. Dữ liệu phổ cho thấy cấu trúc của hợp chất 12 gần giống với hợp chất pereniporin B được phân lập từ chủng vi nấm Perenniporia medullaepanis Aj 8345. Điểm khác biệt giữa hợp chất 12 và pereniporin B là hợp chất 12 có nhóm hydroxyl gắn với nhóm methyl tại C-14. Vì vậy, hợp chất 12 được xác định là hợp chất mới và được đặt tên là 6β,9α,14-trihydroxycinnamolide. 3.4.3. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất từ chủng vi nấm P. chrysogenum 045-357-2 Cặn chiết của chủng vi nấm P. chrysogenum 045-357-2 được phân tách trên sắc ký cột gel C18 và tinh chế bằng HPLC thu nhận được 2 hợp chất 13 và 14 (Hình 3.31). Dựa trên phân tích phổ ESI-MS kết hợp với dữ liệu phổ NMR và các tài liệu công bố đã xác định tên của 2 hợp chất lần lượt andrastin A (13) và citreohybridonol (14). Andrastin A là hợp chất với cấu trúc dạng khung meroterpenoid được mô tả đầu tiên bởi Omura và cộng sự (1996) thu nhận từ chủng vi nấm Penicillium sp. FO-3929. Nghiên cứu cũng cho thấy hợp chất này được
18 sản sinh chủ yếu từ các chủng vi nấm thuộc chi Penicillium khi được lên men trên môi trường rắn và chiết bằng ethyl acetate, cụ thể như P. roqueforti CECT 2905, Penicillium sp. FO-3929, P. albocorenium IBT 16884, và P. crustosum 1088. 13 14 Hình 3.31. Cấu trúc hóa học của hợp chất 13-14 từ chủng vi nấm P. chrysogenum 045-357-2 Tương tự andrastin A, hợp chất citreohybridonol cũng được sản sinh bởi nhiều chủng vi nấm thuộc chi Penicillium. Vào năm 2018, hợp chất citreohybridonol cũng được nhóm nghiên cứu của Özkaya phát hiện từ vi nấm Penicillium atrovenetum có nguồn gốc từ hải miên. Tuy nhiên, Özkaya và các cộng sự không xác định cấu trúc dựa trên phổ NMR mà thực hiện trên cơ sở phân tích nhiễu xạ tia X đơn tinh thể. Từ kết quả nghiên cứu cho thấy cả 14 hợp chất thu nhận từ 3 chủng vi nấm tuyển chọn đều chứa cấu trúc vòng thơm và phù hợp với kết quả sàng lọc chất ban đầu dựa trên phân tích TLC và 1H-NMR. 3.5. Xác định hoạt tính sinh học của 14 hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ 03 chủng vi nấm tuyển chọn 3.5.1. Xác định hoạt tính kháng VSV kiểm định Kết quả cho thấy 14 hợp chất thu nhận thể hiện hoạt tính kháng phần lớn các chủng VSV kiểm định với giá trị MIC 8-128 µg/mL (Bảng 3.7). Trong đó, hợp chất mới ochraceopone F (7) từ chủng vi nấm A. flocculosus 01NT.1.1.5 và 4 hợp chất 9-12 từ chủng Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 thể hiện hoạt tính ức chế hiệu quả sự phát triển của 6 chủng VSV thử nghiệm (MIC, 8-32 µg/mL). Hoạt tính kháng sinh của hợp chất mới phomaligol A2