Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn Bản địa Việt Nam bằng kỹ thuật in vitro

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

15
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu được tiến hành trên mô hình lợn Bản với các mục tiêu: Xác định được tiềm năng khai thác trứng của buồng trứng lợn Bản; xác định được các điều kiện nuôi thành thục trứng lợn Bản; thiết lập thành công hệ thống tạo phôi lợn Bản bằng thụ tinh ống nghiệm (TTON) và nhân bản vô tính (NBVT).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn Bản địa Việt Nam bằng kỹ thuật in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀ TẠO PHÔI LỢN BẢN ĐỊA VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9 42 02 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC Hà Nội, 2021
Công trình được hoàn thành tại: 1. Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2. Viện Công nghệ sinh học Người hướng dẫn khoa học 1: TS. Bùi Xuân Nguyên Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Nguyễn Việt Linh Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: …. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ...’, ngày …. tháng .… năm 2021. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Viện Công nghệ sinh học
NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 1. Nguyễn Thị Nhung, Nguyễn Thị Hồng, Nguyễn Tiến Đạt, Nguyễn Hoàng Thịnh, Tamas Somfai, Kazuhiro Kikuchi, Ngô Thị Kim Cúc, Nguyễn Thanh Sơn, Đồng Văn Quyền, Chu Hoàng Hà, Bùi Xuân Nguyên, Nguyễn Việt Linh. Ảnh hưởng của môi trường nuôi đến sự phát triển của phôi lợn nhân bản vô tính. Tạp chí sinh học, 2018, 40(2se):101-105.. 2. Nguyen Thi Nhung, Dong Van Quyen, Chu Hoang Ha, Tamas Somfai, Kazuhiro Kikuchi, Ngo Thi Kim Cuc, Nguyen Thi Hong, Bui Xuan Nguyen, Barbara Beck-Woerner, Nguyen Viet Linh. Effect of donor cell type on the development of pig embryos produced by somatic cell nuclear transfer. Journal of Biotechnology 17(2): 1-5, 2019. 3. Nhung Thi Nguyen, Nguyen Xuan Bui, Viet Linh Nguyen, Van Khanh Nguyen, Kazuhiro Kikuchi, Hiep Thi N Nguyen, Hong Thi Nguyen, Hoang Thinh Nguyen, Quyen Van Dong, Hoang Ha Chu, Ngo Thi Kim Cuc, Tamas Somfai. Optimization of in vitro embryo production and zygote vitrification for the indigenous Vietnamese Ban pig: the effects of different in vitro oocyte maturation systems. Anim Science Journal. 2020;91:e13412 4. Nguyen Viet Linh, Thi Hiep Nguyen, Nguyen Thi Nhung, Nguyen Thi Hong, Nguyen Tien Dat, Nguyen Hoang Thinh, Nguyen Khanh Van, Tamas Somfai, Kazuhiro Kikuchi. Optimization of the in vitro fertilization protocol for frozen epididymal sperm with low penetration ability in a native Vietnamese pig. Anim Science Journal. 2018 Aug;89(8):1079- 1084. -3, Issue-1, Jan-Feb, 2019 ISSN: 2456-8635. 5. Huỳnh Thị Hường, Nguyễn Thị Nhung, Nguyễn Hoàng Thịnh, Nguyễn Việt Linh. Ảnh hưởng của giới tính dòng tế bào cấy lên sự phát triển của phôi lợn Bản nhân bản vô tính. Tạp chí hội chăn nuôi Việt Nam. Số 256 tháng 4 năm 2020.
1 MỞ ĐẦU Phát triển công nghệ sinh học sinh sản với sự bùng nổ các thành tựu mới về cấy chuyển phôi, thụ tinh ống nghiệm, nhân bản vô tính, bảo quản lạnh tế bào sinh sản và phôi, sự giao thoa giữa công nghệ sinh sản và các liệu pháp công nghệ di truyền trên tế bào sinh sản đã và đang mở ra những tiềm năng ứng dụng to lớn trong các lĩnh vực cải tiến năng suất vật nuôi, đảm bảo an ninh lương thực, bảo tồn và khai thác đa dạng sinh học (ĐDSH), cân bằng sinh thái và phát triển công nghệ y dược hiện đại. Lợn là một trong các đối tượng quan trọng nhất của công nghệ sinh học. Ngoài mục đích cung cấp thực phẩm cho con người, lợn còn là một trong những nhân tố trong hệ thống bảo tồn đa dạng sinh học và có triển vọng lớn ứng dụng trong y học. Lợn là loài động vật có kích thước các cơ quan nội tạng tương đồng với các cơ quan của người, có hệ gen, quá trình sinh lý học, thể chất và hệ miễn dịch gần giống với người, vì vậy là đối tượng khả thi nhất được lựa chọn cho hướng nghiên cứu cấy ghép tạng khác loài (xenotransplantation). Do khả năng tồn tại các cá thể không mang virus Porcine Endogenous Retrovirus (PERVs), giống lợn Bản đang được đánh giá là đối tượng tiềm năng quan trọng đối với công nghệ cấy ghép mô tạng khác loài và là nguồn gen quý cần được bảo tồn và phát triển. Vì vậy chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn Bản địa Việt Nam bằng kỹ thuật in vitro”. Mục tiêu: Nghiên cứu được tiến hành trên mô hình lợn Bản với các mục tiêu: (1). Xác định được tiềm năng khai thác trứng của buồng trứng lợn Bản; (2). Xác định được các điều kiện nuôi thành thục trứng lợn Bản; (3). Thiết lập thành công hệ thống tạo phôi lợn Bản bằng thụ tinh ống nghiệm (TTON) và nhân bản vô tính (NBVT). Dựa trên các nội dung nghiên cứu: (1). Nghiên cứu đặc điểm hình thái buồng trứng và tiềm năng khai thác trứng ở lợn Bản theo mùa; (2). Nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản bằng phương pháp chuẩn hóa môi trường nuôi; (3). Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình tạo phôi lợn Bản TTON thông qua môi trường thụ tinh, điều kiện thụ tinh và nuôi phôi; (4). Nghiên cứu tạo phôi lợn Bản bằng NBVT khác loài. Tính mới của luận án: (1). Luận án đã cung cấp các thông tin mới về ảnh hưởng của mùa vụ, môi trường nuôi thành thục trứng, môi trường và chế độ thụ tinh, nuôi phôi và bảo quản lạnh phôi TTON, tạo phôi NBVT bằng cấy nhân khác giống làm cơ sở thiết lập thành công hệ thống tạo phôi lợn Bản có hiệu quả cao, có thể phát triển nhằm mục đích bảo tồn đa dạng sinh học. (2). Là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam về sử dụng hệ thống Piezo để tạo phôi NBVT trên đối tượng lợn.
2 CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. Cấu tạo buồng trứng, sự thành thục trứng, quá trình thụ tinh và phát triển phôi in vivo ở lợn 1.1.1. Cấu tạo buồng trứng và sự thành thục in vivo trứng lợn Buồng trứng là một bộ phận của cơ quan sinh dục cái, có chức năng tạo tế bào trứng (giao tử cái -noãn bào). Miền vỏ buồng trứng chứa nang ở các giai đoạn phát triển khác nhau gồm nang nguyên thủy, nang sơ cấp, nang thứ cấp và nang trứng thành thục. Nang trứng là đơn vị cấu trúc cơ bản của buồng trứng, có chức năng duy trì quá trình phát triển trứng (oogenesis), bảo đảm khả năng thụ tinh và hình thành phôi. 1.1.2. Sự thụ tinh và phát triển phôi lợn in vivo 1.1.2.1. Các giai đoạn thụ tinh Cũng như các loài khác, quá trình thụ tinh ở lợn gồm các giai đoạn: Hoạt hóa tinh, tinh trùng gắn vào màng zona của trứng, phản ứng acrosome, tinh trùng xuyên qua màng zona, tinh trùng vào tế bào chất của trứng và liên kết với trứng, trứng được kích hoạt và phản ứng vỏ trứng xảy ra. 1.1.2.2. Các giai đoạn phát triển của phôi lợn Khoảng 30 giờ sau thụ tinh trứng phân chia thành 2 tế bào, tiếp tục quá trình phân chia nhanh chóng đề tạo phôi 4, 8 tế bào. Phôi dâu hình thành vào ngày 3-4 sau thụ tinh. Phôi tiếp tục phân chia và tạo thành phôi nang và bắt đầu làm tổ trong tử cung. 1.1.3. Ảnh hưởng của mùa vụ đến hoạt động sinh sản ở lợn Lợn là loài động vật đa thai, mặc dù việc khai thác trứng lợn có thể thực hiện trong suốt cả năm, các yếu tố mùa vụ có ảnh hưởng đáng kể tới chất lượng buồng trứng, từ đó ảnh hưởng tới số lượng và chất lượng trứng. 1.2. Tình hình nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro 1.2.1. Nuôi thành thục trứng lợn in vitro, ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu trứng và điều kiện nuôi thành thục Kết quả thí nghiệm nuôi thành thục trứng thu từ các nang có kích thước khác nhau cho thấy chất lượng và trạng thái nang có ảnh hưởng lớn tới sự thành thục của trứng. Môi trường nuôi trứng lợn thành thục thông thường bao gồm môi trường nền (môi trường Hank với L-glutamine và Hespes) được bổ sung huyết thanh (fetal calf serum: FCS) hoặc dịch nang trứng (follicular fluid: FF) và các thành phần khác như gonadotropin, các nhân tố tăng trưởng Hormone (LH, FSH), Dibutyryl-cAMP (dbc-AMP). Kết hợp hài hòa sự thành thục tế bào chất và thành thục nhân của trứng trong quá trình nuôi in vitro là yếu có ảnh hưởng quan trọng lên chất lượng thụ tinh và sự phát triển phôi. 1.2.2. Tạo phôi lợn thụ tinh ống nghiệm, ảnh hưởng của chất lượng tinh trùng, chế độ thụ tinh, nuôi và bảo quản phôi
3 TTON bị chi phối bởi nhiểu yếu tố ảnh hưởng, từ phương pháp bảo quản và hoạt hóa tinh, tác động môi trường nuôi thành thục trứng, chế độ thụ tinh đến môi trường nuôi phôi và phương pháp bảo quản phôi. 1.2.2.1. Bảo quản và hoạt hóa tinh Nghiên cứu sử dụng tinh lợn đông lạnh để tạo phôi TTONđược Nagai và cs thực hiện thành công lần đầu tiên vào năm 1988. Nghiên cứu của nhóm các tác giả Nagai (1988) và Kikuchi (1998) cho thấy tinh trùng thu từ mào tinh hoàn có khả năng khả năng chịu lạnh cao hơn so với tinh trùng thu được sau xuất tinh, có thể đông lạnh và sử dụng để thụ tinh với trứng thành thục. 1.2.2.2. Môi trường thụ tinh, nuôi phôi và các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ tinh Hai loại môi trường cơ bản được sử dụng phổ biến là môi trường Tyrode’s albumin lactate pyruvate (TALP) và môi trường Fertilization Medium for Porcine oocytes (Pig-FM). Bổ sung 10 mg/mL BSA và 2 mmol/L caffein, dịch nang trứng (pFF) vào môi trường nuôi trứng và môi trường thụ tinh làm tăng đáng kể tỷ lệ tinh trùng xâm nhập, tỷ lệ phân chia và phát triển của phôi. Các môi trường Porcine Zygote Medium-3 (PZM-3) và PZM-5 được cho là có hiệu quả tạo phôi cao hơn và bắt đầu được sử dụng nhiều hơn những năm gần đây. Trở ngại lớn nhất ảnh hưởng tới hiệu quả tạo phôi tạo phôi lợn in vitro là hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng (polyspermic). Tỷ lệ phôi đa tinh trùng ở lợn dao động từ 13% đến 90%. Tế bào cận noãn có vai trò quan trọng, ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ tinh đơn tinh trùng. Hiệu quả TTON cao nhất trong điều kiện tế bào trứng còn các lớp tế bào cận noãn và được thụ tinh với nồng độ ở 0.5 × 105 tinh trùng/ml. 1.2.2.3. Đông lạnh phôi lợn thụ tinh ống nghiệm Nghiên cứu đông lạnh phôi lợn được tiến hành từ khá sớm, tuy nhiên việc bảo quản phôi gặp khá nhiều khó khăn do phôi lợn rất nhạy cảm với sự thay đổi của nhiệt độ. Các phương pháp đông lạnh nhanh với thể tích tối thiểu (minimum volume cooling: MVC), phương pháp thả trực tiếp phôi vào nito lỏng (microdrop), hoặc lên bề mặt kim loại đã được làm lạnh bằng nito lỏng (Solid Surface Vitrification- SSV), phương pháp mới Hollow Fiber Vitrification (HFV) đã được áp dụng để đông lạnh phôi lợn ở giai đoạn phôi nang. 1.2.3. Tạo phôi lợn bằng kỹ thuật nhân bản vô tính 1.2.3.1. Kỹ thuật nhân bản vô tính, quá trình methyl hóa và sự tái lập trình trong phôi nhân bản NBVT là kĩ thuật tạo ra những bản sao của một cá thể mà không qua sinh sản hữu tính. Cơ thể sống đầu tiên được tạo ra nhờ kỹ thuật NBVT theo phương pháp này là chú cừu Dolly sinh ngày 5 tháng 7 năm 1996 tại Viện Nghiên cứu Roslin. Yếu tố kỹ thuật ảnh hưởng quan trọng đến hiệu quả của NBVT. Các kỹ thuật NBVT phổ biến là kỹ thuật kinh điển sử dụng kính
4 hiển vi vi phẫu thuật để loại và cấy nhân bằng kim vi tiêm, kỹ thuật loại và cấy nhân kết hợp kính hiển vi vi phẫu thuật có gắn hệ thống piezo và kỹ thuật handmade cloning. 1.2.3.2. Nhân bản vô tính khác loài NBVT khác loài là kỹ thuật tạo phôi nhân bản do cấy nhân tế bào cho nhân của một loài này vào trứng đã loại nhân của loài khác (Interspecies somatic cell nuclear transfer –iSCNT). NBVT khác loài được xem là một giải pháp tiềm năng để tái tạo, bảo tồn các loài động vật quý hiếm đã và đang có nguy cơ bị tuyệt chủng. Wells và cs, 1998 đã công bố nhân bản thành công cá thể bò đảo Enderby (là cá thể duy nhất còn sống sót của giống giá súc quý hiếm bậc nhất thế giới). 1.2.3.3. Nhân bản vô tính trên lợn. Các nhóm nghiên cứu của Onishi và Polejaeva đã thông báo thành công trong việc tạo lợn nhân bản vào năm 2000. Tuy nhiên, cho đến nay hiệu quả NBVT trên lợn vẫn còn rất thấp. Tỷ lệ lợn con được sinh ra chỉ dao động khoảng 1-3% tổng số phôi được cấy. Chất lượng trứng, mùa vụ, yếu tố môi trường như photoperiod, nhiệt độ có thể ảnh hưởng lên chất lượng trứng và qua đó lên hiệu quả NBVT. Nghiên cứu của Kurome và cs, 2013 cho thấy khi tiến hành cấy phôi NBVT, tỷ lệ đậu thai đạt cao nhất vào mùa đông (5,3%) và thấp nhất vào mùa hạ. Hiệu suất NBVT cao nhất, đạt 4.1% lợn sinh ra sau cấy phôi đã được thông báo trong thời gian gần đây. 1.3. Nghiên cứu tạo phôi in vitro lợn Bản 1.3.1. Một số đặc điểm hình thái và sinh sản của lợn Bản Lợn Bản được xem là đối tượng lý tưởng đối với công nghệ ghép mô tạng khác loài (xenotransplantation) do nó có đặc điểm về kích thước, hệ gen tương đồng với con người. Ngoài ra lợn Bản là giống lợn duy nhất hiện nay có số lượng bản sao virus PERV thấp, vì vậy chúng có tiềm năng to lớn trong nghiên cứu và ứng dụng y-sinh đặc biệt là cấy tạng khác loài. Hiện nay, quần thể lợn Bản có khoảng 30.000 – 32.000 con nhưng đã bị lai tạp nhiều, phân bố ở khắp các huyện vùng núi cao của tỉnh Hòa Bình, trong đó chủ yếu tập trung ở Đà Bắc, Cao Phong, Lạc Sơn, Mai Châu, Tân Lạc 1.3.2. Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn Bản tại Việt Nam Các thí nghiệm về nuôi thành thục trứng và tạo phôi in vitro trên lợn Bản được triển khai lần đầu tiên trong khuôn khổ dự án hợp tác khoa học Việt-Nhật (JSPS-VAST, 2005-2007). Năm 2008, Ước và cs thông báo kết quả nghiên cứu sản xuất phôi lợn mini nội địa bằng tổ hợp công nghệ TTON và NBVT. Các tác giả cũng đã tiến hành thành công thí nghiệm thử nghiệm tạo phôi NBVT bằng cấy nhân tế bào sinh dưỡng của lợn Bản vào tế bào trứng của lợn Landras, với tỷ lệ hợp nhất giữa trứng và tế bào đạt 70% và tỷ lệ phôi nang đạt 12%.
5 CHƯƠNG 2- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phân loại tháng theo mùa 2.2.2. Phương pháp thu, bảo quản buồng trứng 2.2.3. Phương pháp đo kích thước và trọng lượng buồng trứng 2.2.4. Phương pháp phân chia nhóm nang 2.2.5. Phương pháp thu trứng 2.2.6. Phương pháp phân loại chất lượng trứng 2.2.7. Phương pháp đo kích thước trứng lợn 2.2.8. Phương pháp nuôi trứng 2.2.9. Phương pháp đánh giá thành thục sau nuôi 2.2.10. Phương pháp đông lạnh tinh từ mào tinh 2.2.11. Phương pháp kiểm tra chất lượng tinh trước và sau đông lạnh 2.2.12. Phương pháp thụ tinh ống nghiệm 2.2.13. Phương pháp đánh giá trạng thái thụ tinh 2.2.14. Phương pháp đông lạnh phôi 2.2.15. Phương pháp thu, nuôi tế bào sinh dưỡng lợn 2..2.16. Phương pháp nhân nuôi tế bào 2.2.17. Phương pháp đông lạnh tế bào 2.2.18. Phương pháp nhân bản vô tính 2.2.19. Phương pháp nuôi phôi 2.2.20. Phương pháp nhuộm Hoechst 2.2.21. Phương pháp nhuộm Orcein 2.2.22. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
6 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU Tiềm năng Khảo sát kích Khảo sát Khảo sát chất khai thác thước và khối kích thước lượng trứng trứng theo lượng BT nang bề mặt sau thu mùa NỘI DUNG 1 Tỷ lệ thành thục Chọn lọc môi của trứng theo trường nuôi thành mùa thục trứng tối ưu NỘI DUNG 2 MT thụ tinh (TALP, Pig), NĐ tinh Chọn lọc môi 5 6 trường nuôi trứng (1x10 , 1x10 tối ưu (TCM-199, Trứng sau nuôi TT/ml) POM) Hệ thành thục thống Chế nuôi (ND2) TTON Trạng thái TB độ trứng, cận noãn (để thụ TTON Thu và bảo nguyên, tách 1 tinh MT nuôi % phôi và quản lạnh phần, bỏ hoàn tối phôi nuôi nang, số tinh lợn toàn ) ưu (NCSU-37, phôi TB/phôi Bản PZM-3) tối ưu NĐ cafein (2 mM, 5 mM) và thời gian thụ Ngân hàng Đông tinh (3 giờ, 6 phôi lạnh giờ) phôi NỘI DUNG 3 Loại tế bào cấy nhân Hệ thống Ngân hàng tế bào tạo phôi lợn Bản lợn Bản NBVT NBVT Nuôi thành Môi trường thục trứng nuôi phôi lợn Landrace (NCSU-37, PZM-3) NỘI DUNG 4
7 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đặc điểm hình thái buồng trứng và tiềm năng khai thác trứng ở lợn Bản theo mùa Phần nội dung này được thực hiện với 3 nghiên cứu cơ bản: 1. Khảo sát ảnh hưởng của các mùa xuân, hạ, thu, đông lên kích thước và khối lượng buồng trứng lợn Bản. 2. Khảo sát ảnh hưởng của các mùa lên tiềm năng khai thác trứng căn cứ theo tỷ lệ trứng loại A,B,C thu được/BT. 3. Khảo sát ảnh hưởng của các mùa lên kích thước trứng loại A, B sau thu. Thí nghiệm được tiến hành trên các cá thể lợn Bản có cùng độ tuổi, chế độ chăm sóc nuôi dưỡng, có khối lượng từ 20-25 kg. 3.1.1. Đặc điểm hình thái, kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa Bảng 3.1. Kích thước và khối lượng buồng trứng lợn Bản theo mùa Số Mùa xuân Mùa hạ Mùa Thu Mùa đông BT(n) ( TB±SEM) ( TB±SEM) ( TB±SEM) ( TB±SEM) Chiều dài 10 (17±0,8)a (15±1)b (15,2±0,6)b (17,4±0,8)a (mm) Chiều rộng 10 (12,2±0,3)a (10,9±0,7)b (11,3±0,4)b (11,9±0,5)a (mm) Chiều dầy 10 (8,1±0,4)a (6,3±0,3)b (7±0,3)b (8±0,5)a (mm) Khối lượng 10 (2,4±0,1)a (2.0±0,2)b (2,1±0,2)b (2,3±0,2)ab (g) Thí nghiệm được lặp lại 5 lần, mỗi lần thu buồng trứng từ 1 lợn cái.Số liệu với chú thích khác nhau (a,b) trong cùng một hàng là sai khác có ý nghĩa thống kê (P
8 Bảng 3.2. Số lượng nang trung bình theo kích thước Số nang (n, TB số nang/buồng trứng) Tổng số nang Mùa (n,TB số < 2 mm 2-3 mm 3-5 mm >5mm nang/BT) 102 56 7 165 Xuân a a 0 (0) (10,2±0,7) (5,6±0,3) (0,7±0,2) (16,5±0,8)a 93 39 1 133 Hạ b b 0 (0) (9,3±0,6) (3,9±0,4) (0,1±0,1) (13,3±0,7)b 105 59 1 165 Thu a b 0 (0) (10,5±0,5) (5,9±0,3) (0,1±0,1) (16,5±0,6)a 94 53 6 153 Đông a a 0 (0) (9,4±0,4) (5,3±0,4) (0,6±0,2) (15,3±0,7)a Số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a,b) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P
9 thấy mùa vụ không ảnh hưởng lên kích thước trứng của các trứng có chất lượng A+B. Trong đó kích thước trứng không có màng sáng dao động từ 110,1±2,4 tới 113,6±2,1. Tổng hợp phần nghiên cứu ở phần này chúng tôi nhận thấy ảnh hưởng của mùa vụ lên tiềm năng khai thác trứng ở lợn Bản thể hiện qua các biến đổi có quy luật về sự tương quan về kích thước buồng trứng, sự phát triển của nang và chất lượng trứng. BT được thu vào mùa xuân và mùa đông kích thước lớn hơn so với mùa thu và hạ, tương ứng với tỷ lệ trứng A+B thu được/BT trong mùa xuân và mùa đông cũng cao hơn so với mùa hạ và mùa thu. Tương tự, trung bình số nang có kích thước lớn (>2 mm) trên mỗi buồng trứng có mối liên quan tỷ lệ thuận với số trứng loại A+B thu được/BT lợn Bản và có sự phụ thuộc vào mùa vụ. Tỷ lệ thuận với số nang có kích thước > 2 mm, trung bình số trứng loại A+B thu được/BT lợn Bản trong mùa xuân cũng đạt cao nhất (18,1), tuy nhiên kế tiếp là số trứng A+B thu được vào mùa đông (17,5), tiếp theo là mùa thu (16,3) và mùa hạ đạt tỷ lệ này thấp nhất (13,4). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy mùa vụ không ảnh hưởng lên kích thước trứng của các trứng có chất lượng A+B. Kết quả tương tự về sự thay đổi về kích thước của tế bào trứng các giống lợn ngoại theo mùa vụ cũng đã được một số tác giả thông báo trên đối tượng lợn ngoại. Nghiên cứu của Kyzekova và cs, 2019 cho thấy các trứng thu từ các nang ≤ 3mm có kích thước trung bình nhỏ nhất vào mùa xuân và lớn nhất vào mùa đông, song với sự sai khác không có ý nghĩa thống kê [33]. 3.2. Kết quả nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản Phần nghiên cứu này được tiến hành nhằm tìm hiều khả năng thành thục của trứng lợn Bản theo từng mùa vụ, qua đó xác định thời gian thu mẫu đạt hiệu quả tối ưu, đồng thời lựa chọn được loại môi trường nuôi thành thục phù hợp với sự phát triển của trứng lợn Bản. Nghiên cứu được bố trí với 2 thí nghiệm cơ bản: 1) Khảo sát trạng thái phát triển của trứng trong 4 mùa sau 44-46 giờ nuôi trong môi trường NCSU-37 với các chỉ tiêu: Tỷ lệ trứng ở giai đoạn GV, GVDB, MI, MII, tỷ lệ trứng ở giai đoạn khác; 2) Nghiên cứu nuôi thành thục trứng trong 5 loại môi trường cơ bản được sử dụng phổ hiến hiện nay là: NCSU-37+pFF, NCSU-37+FBS, TCM-199+pFF, TCM199+FBS, POM và chọn lựa loại môi trường nuôi phù hợp với sự phát triển của trứng lợn Bản. 3.2.1. Ảnh hưởng của mùa vụ lên kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản Trứng lợn Bản sau khi thu được nuôi trong môi trường NCSU-37+10% pFF có bổ sung hormone trong 22 giờ, sau đó nuôi trong NCSU-37+10% pFF không bổ sung hormone trong 22 giờ tiếp theo. Sau 44 h nuôi, trứng được tách tế bào cận noãn và nhuộm với Orcein 1% để kiểm tra tỷ lệ trứng ở các giai đoạn GV, GVDB, MI, MII tại thời điểm 44 giờ. Kết quả thu được cho thấy trong cùng môi trường nuôi là NCSU- 37+10% pFF và cùng điều kiện nuôi thành thục thì tỷ lệ thành thục của trứng
10 lợn Bản khác nhau giữa các mùa, cụ thể tỷ lệ này trong mùa xuân và mùa đông cao hơn so với mùa hạ và mùa thu (67,8±0,7% và 67,9±0,5% so với 58,8±1,0% và 61,2±1,8%) (sai khác có ý nghĩa thống kê, P
11 NCSU-37+pFF và NCSU-37+FBS có tỷ lệ trứng phát triển tới giai đoạn MI khá tốt, tuy nhiên trứng sau khi phát triển đến giai đoạn MI thì dừng lại, không tiếp tục phát triển đến giai đoan MII (tỷ lệ trứng MI lần lượt là: 17,9±3,7 và 23,8±0,5). Kết quả nghiên cứu thu được cho thấy, tỷ lệ trứng thành thục (trứng phát triển đến giai đoạn MII) trong môi trường POM (Hình 3.7A) và môi trường TCM-199+pFF (Hình 3.7D) là tương đương nhau (74,5±2,7% và 73,4±2,5%) và cao hơn trong các môi trường NCSU-37+pFF (Hình 3.7B), NCSU-37+FBS (Hình 3.7C), TCM-199+FBS (Hình 3.7E) (64,1±0,6%; 61,6±2,4%; 55,8±2,0%) (Bảng 3.6). Như vậy môi trường TCM-199+pFF và POM phù hợp hơn với sự phát triển của trứng lợn Bản. Bảng 3.6. Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản Môi trường Tổng số Số trứng GV Số trứng MI Số trứng MII Số trứng giai trứng (n,%) (n,%) (n,%) đoạn khác (n) (n,%) NCSU- 131 12 23 84 12 37+pFF (9,0±1,9) (17,9±3,7)b (64,1±0,6) b (9,0±2,1) NCSU- 130 12 31 80 7 37+FBS (9,3±1,5) (23,8±0,5)a (61,6±2,4) b (5,2±3,5) TCM- 135 13 8 99 15 199+pFF (9,6±1,3) (5,9±1,2)c (73,4±2,5) a (11,1±3,0) TCM- 136 15 21 91 24 199+FBS (11,2±2,4) (15,6±1,8)b (55,8±2,0) c (17,4±2,5) POM 145 11 9 108 17 (7,6±1,3) (6,2±0,6)c (74,5±2,7) a (11,7±3,5) Thí nghiệm lặp lại 4 lần, mỗi lần thu trứng từ 5 lợn cái, số liệu% biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a,b,c) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P
12 để tính số liệu trung bình. Kết quả nghiên cứu về thể tích tinh dịch, hoạt lực tinh trùng, nồng độ tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống, tỷ lệ kỳ hình của tinh dịch ngay sau khi thu được trình bày ở bảng 3.7. Bảng 3.7. Chất lượng tinh sau khi thu Ký hiệu Thể tích thu Hoạt lực Nồng độ Tỷ lệ tinh Tỷ lệ kỳ được V tinh trùng tinh trùng sống hình (%) (ml) (Triệu/ml) (%) TLB 001 3,2 50±1,1 6406±137,8 58±1,5 31±0,5 TLB 002 3 72±1,5 9332±119,3 76,3±0,8 12,3±0,6 TLB 003 4 76±1,1 11337±56,1 85,6±0,6 10,6±1,4 TLB 004 3,5 61,6±1,6 8772±14,8 73,3±0,6 11±1,7 Thu tinh từ 4 lợn đực. Số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, TLB:Tinh lợn Bản Từ kết quả bảng 3.7 ta thấy tỷ lệ tinh trùng sống và hoạt lực của tinh trùng ở cả 4 lô tinh trong nghiên cứu của chúng tôi đều đạt >50%, trong đó hoạt lực của TLB 001 và TLB 004 thấp hơn so với TLB 002 và TLB 003 (72±1,5 và 76±1,1 so với 50±1,1 và 61,6±1,6%). Kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, tỷ lệ sống và hoạt lực ở lô tinh TLB 002 và TLB 003 có thể sử dụng để đông lạnh và tạo phôi ống nghiệm. Như vậy, căn cứ vào các chỉ tiêu của tinh dịch sau khi thu, chúng tôi nhận thấy lô tinh TLB 002 và TLB 003 có các chỉ tiêu phù hợp và tốt nhất phục vụ cho nghiên cứu TTON và tạo phôi lợn Bản. 3.3.1.2. Chất lượng tinh sau đông lạnh Bảng 3.8. Chất lượng tinh lợn Bản sau đông lạnh Ký hiệu Hoạt lực tinh trùng Tỷ lệ tinh trùng Tỷ lệ kỳ hình (%) sống (%) (%) a TLB 002 26,6±0,8 38,6±2,3b 13±0,5 a a TLB 003 25,7±1,4 45,8±0,6 12±1,5 Số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a,b) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P
13 tôi cao hơn so với công bố tương tự trên lợn Bản của Nguyen và cs, 2015 (45,8±0,6 và 38,6±2,3 so với 31,9±2). 3.3.1.3. Kiểm tra chất lượng tinh thông qua kết quả thụ tinh ống nghiệm Trứng sau khi thu và nuôi trong môi trường TCM-199 sau 44-46 h được chia thành 2 lô thí nghiệm: Lô thụ tinh với TLB 002, lô 2 thụ tinh với TLB 003 trong môi trường Pig FM với nồng độ tinh 1x106 tinh trùng/ml, phôi được nuôi trong môi trường PZM-3 và theo dõi tỷ lệ phân chia, tỷ lệ hình thành phôi nang ở ngày thứ 5, 6, 7 sau thụ tinh. Bảng 3.9. Thử nghiệm khả năng tạo phôi của tinh trùng sau đông lạnh Số phôi Số phôi Số phôi Số phôi Số phôi thoát màng Ký hiệu phân chia nang ngày nang nang ngày ngày 7 (n,%) 5 (n,%) ngày 6 7 (n,%) (n,%) (n,%) 47 8 12 16 1 TLB 002 (52,2±1,1) (8,9±2,9) (13,3±1,9) (17,7±2,9) (1,1±1,1) 49 9 13 17 4 TLB 003 (54,4±4,4) (10±1,9) (14,4±1,1) (18,8±1,1) (2,2±1,1) Số liệu % biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, (Aspin-Welch T-test) Kết quả trình bày ở bảng 3.9 cho thấy, mặc dù tỷ lệ sống và hoạt lực tinh trùng sau giải đông của TLB 003 cao hơn so với TLB 002 (Bảng 3.8), tuy nhiên tỷ lệ phôi phân chia ở ngày thứ 2, tỷ lệ phôi nang ở các ngày 5,6,7 sau thụ tinh không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa 2 lô tinh. Mặc dù tỷ lệ sống và hoạt lực tinh trùng sau giải đông của TLB 003 cao hơn so với TLB 002 (Bảng 3.8), tuy nhiên tỷ lệ phôi phân chia ở ngày thứ 2, tỷ lệ phôi nang ở các ngày 7 (17,7±2,9 sv 18,8±1,1%) sau thụ tinh không có sự khác biệt giữa 2 lô tinh (Bảng 3.9). Như vậy chúng tôi đã chọn lựa và đông lạnh thành công 2 lô tinh là TLB 002 và TLB 003 làm nguyên liệu cho TTON trong các bước nghiên cứu tiếp theo. 3.3.2. Nghiên cứu chế độ thụ tinh tối ưu 3.3.2.1. Ảnh hưởng môi trường thụ tinh và nồng độ tinh lên kết quả thụ tinh ống nghiệm Tỷ lệ tinh trùng xâm nhập cao nhất khi sử dụng môi trường Pig-FM với nồng độ 1×106 tinh trùng/ml, tỷ lệ tinh trùng xâm nhập ở các lô còn lại thấp hơn đáng kể nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (Bảng 3.10). Không có sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ trứng có tinh trùng xâm nhập và tỷ lệ trứng thụ tinh đơn tinh trùng giữa 4 lô (Bảng 3.10). Như vậy trong nghiên cứu này chúng tôi đã chọn lọc được môi trường thụ tinh Pig-FM và nồng độ tinh 1x106 tinh trùng/ml dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
14 Bảng 3.10. Đánh giá trạng thái thụ tinh của trứng Môi Nồng độ Tổng Số trứng có Số trứng thụ Số trứng thụ trường tinh trùng số tinh trùng tinh bình tinh đơn tinh thụ tinh (tinh trứng xâm nhập thường (n,% (n,% số trứng trùng/ml) (n) (n,% tổng số) tổng số) có tinh trùng xâm nhập) 5 Pig-FM 1x10 138 19 11 16 b (11,9±3,7) (6,0±3,2) (74,7±18,8) 6 Pig FM 1x10 181 47 21 28 a (25,8±4,4) (11,5±3,3) (61,4±9,9) 5 TALP- 1x10 177 13 7 10 b PVA (7,2±2,1) (3,8±1,3) (78,3±15,7) 6 TALP- 1x10 159 17 4 10 b PVA (10,5±1,8) (2,3±1,1) (63,3±11,0) IVF được thực hiện trong 3 h, trứng được tách 1 phần tế bào cận noãn, thí nghiệm lặp lại 5 lần, số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a,b) trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P
15 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của lớp tế bào cận noãn lên trạng thái thụ tinh ở lợn Bản Trạng thái lớp Tổng số Số trứng có Số trứng thụ Số trứng thụ tinh tế bào cận noãn trứng (n) tinh trùng xâm tinh bình đơn tinh (n,% số nhập (n,% thường (n,% trứng có tinh trùng tổng số) tổng số) xâm nhập) b b Không loại bỏ 96 4 (4,2±1,2) 3 (3,1±0,1) 3 (83,3±16,6)b Loại bỏ 1 phần 87 13 (15,2±1,9)a 13 (15,2±1,9)a 13 (100±0)a tế bào cận noãn Loại bỏ hoàn 84 0 (0)c 0 (0) c 0 (NA) toàn TTON được thực hiện trong môi trường Pig-FM, trong thời gian 3 giờ nồng độ tinh là 1x106 tinh trùng/ml, thí nghiệm lặp lại 3 lần, số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a,b,c) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P
16 trùng vào tế bào trứng ở lô thí nghiệm sử dụng môi trường có chứa 5mM/l cafein, thụ tinh trong 6 giờ cao hơn đáng kể so với lô sử dụng môi trường có chứa 2mM/l cafein, thụ tinh trong 3 giờ (58,8±10,9% so với 15,2±1,9%) (Bảng 3.12). Bên cạnh đó, tỷ lệ thụ tinh đơn tinh trùng cũng tăng lên trên 50%. Kết quả cho thấy tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng vào tế bào trứng ở lô thí nghiệm sử dụng môi trường có chứa 5mM/l cafein, thụ tinh trong 6 giờ cao hơn đáng kể so với lô sử dụng môi trường có chứa 2mM/l cafein, thụ tinh trong 3 giờ (58,8±10,9% so với 15,2±1,9%). 3.3.3. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục lên sự thụ tinh và phát triển phôi 3.3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi trứng lên kết quả thụ tinh và nuôi phôi Bảng 3.13. Sự thành thục và khả năng thụ tinh của trứng lợn Bản sau khi nuôi Môi Tổng GVBD* Thành Trứng có Thụ tinh Tiền nhân Thụ tinh trường số (n,% tổng thục (n,% tinh trùng bình đực (n,% đơn tinh nuôi trứng số) tổng số) xâm nhập thường tinh trùng trùng (n,% trứng (n) (n,% (n,% xâm nhập) tinh trùng GVBD) GVBD) xâm nhập) TCM- 133 116 101 35 87 40 b b 199+10% 134 (99,1±0,8) (85,7±4,4) (75,7±1,3) (26,6±3,5) (86,5±2,1) (40,6±4,0) pFF POM 142 124 124 45 122 46 145 a a (97,8±0,9) (85,5±4,5) (87,5±2,9) (32,1±7,1) (98,3±1,1) (38,2±7,2) Thí nghiệm lặp lại 5 lần, số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM số liệu với chú thích khác nhau (a,b) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P
17 tr.89). Trứng sau thụ tinh được nuôi trong môi trường TCM-199 và môi trường POM và theo dõi sự phát triển của phôi trong 7 ngày sau nuôi. Bảng 3.14. Ảnh hưởng của môi trường nuôi trứng lên sự phát triển của phôi lợn Bản sau thụ tinh Môi Tổng Số trứng Số phôi Số phôi Số phôi Số phôi Số phôi Số tế trường số thành thục phân chia nang ngày nang ngày nang thoát bào/phôi nuôi trứng (n,%) (n,% tổng 5 (n,% 6 (n,% ngày 7 màng nang ở trứng (n) số) tổng số) tổng số) (n,% tổng ngày 7 ngày 7 số) (n,% tổng số) TCM- 132 111 14 25 32 3 52,1 199+10% 195 (67,6±2,5)a (57,4±3,4) (7,5±3,2) (13,3±4,3) (16,8±4,3)a (1,5±1,0) ±1,2b pFF 147 106 23 34 41 11 75,6 a a 199 (73,8±3,0) (53,7±3,9) (12,1±3,6) (17,8±5,2) (21,4±5,0) (5,7±1,1) ±3,4a POM Thí nghiệm lặp lại 5 lần, số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a,b) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P0.05 (Bảng 3.14). 3.3.3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi lên sự phát triển của phôi lợn Bản thụ tinh ống nghiệm Thí nghiệm được bố trí nhằm đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi lên chất lượng phôi TTON trên trứng lợn Bản sau khi đã tối ưu các chỉ tiêu về môi trường nuôi trứng và các điều kiện thụ tinh đã được kiểm soát ở trên. Trứng được nuôi môi trường POM trong thời gian 44-46 giờ. Pig-FM có bổ sung 5 mmol/l cafein được sử dụng làm môi trường thụ tinh, tách 1 phần tế bào cận noãn, nồng độ tinh trùng là 1x106 tinh trùng/ml, thời gian thụ tinh 6 giờ. Trứng sau TTON được tách sạch tinh trùng và được chia làm 2 lô thí nghiệm như sau: Lô 1: Nuôi phôi trong NCSU-37; Lô 2: Nuôi phôi trong PZM-3. Phôi được kiểm tra tỷ lệ phân chia vào ngày thứ 2 sau nuôi, tỷ lệ phôi nang ở ngày thứ 5,6,7 và tỷ lệ phôi thoát màng và số tế bào/phôi nang ở ngày thứ 7 bằng phương pháp nhuộm. Kết quả thu được cho thấy mặc dù tỷ lệ phân chia của phôi, tỷ lệ hình thành phôi nang ở ngày 5 ở hai lô thí nghiệm không có sự khác biệt, tuy nhiên tỷ lệ hình thành phôi nang ở ngày 6,7 trong môi trường PZM- 3 cao hơn so với trong môi trường NCSU-37 (16,3±1,0% so với 12,8±0,4% và 20,6±0,8% so với 17,7±1,4%, P