Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:26

Thêm vào BST

Báo xấu

9
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án "Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng" là phát triển được bộ chỉ thị phân tử liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tu hài góp phần phát triển nghề nuôi tu hài nói riêng và nghề nuôi biển của Việt Nam nói chung.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI TRIỆU ANH TUẤN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG TU HÀI (Lutraria rhynchaena Jonas, 1844) THEO HƯỚNG TĂNG TRƯỞNG CHUYÊN NGÀNH DI TRUYỀN HỌC MÃ SỐ: 9.42.01.21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2023
Công trình được hoàn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS Nguyễn Xuân Viết 2. PGS. TS Thái Thanh Bình Phản biện 1: PGS. TS Nguyễn Đăng Tôn Viện Nghiên cứu hệ gen – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Phản biện 2: PGS. TS Đặng Thị Lụa Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản I Phản biện 3: PGS. TS Nguyễn Quang Huy Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội vào hồi …..giờ … ngày … tháng… năm 2023 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Thư viện Quốc Gia, Hà Nội hoặc Thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Tu hài (Lutraria rhynchaena Jonas, 1844) là loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ, ưa sống ở vùng biển nước ấm, từ 18-30oC và độ mặn dao động từ 25-30‰ (Hà Đức Thắng, 2010). Tu hài chủ yếu lọc ăn mùn bã hữu cơ, tảo khuê và sinh vật phù du (Hà Đức Thắng, 2010). Ở Việt Nam, tu hài phân bố tự nhiên cũng như được nuôi nhiều ở vùng biển thuộc tỉnh Quảng Ninh, Hải Phòng và tỉnh Khánh Hòa với tổng diện tích mặt nước nuôi tu hài đạt khoảng 1.000 ha, sản lượng nuôi đạt khoảng 2.621,6 tấn, thu nhập ước tính trên 200 tỷ đồng/ năm (Tổng cục Thủy sản, 2014). Thịt tu hài có giá trị dinh dưỡng cao, giàu đạm và khoáng chất, đặc biệt trong thịt tu hài có chứa nhiều axit amin không thay thế (Đỗ Đăng Khoa và cs, 2014). Những năm gần đây, nhu cầu tiêu thụ tu hài ngày càng tăng, hiệu quả kinh tế mang lại từ nuôi tu hài lớn, nên diện tích nuôi trồng tu hài thương phẩm đã tăng lên đáng kể, nhu cầu con giống chất lượng với số lượng lớn vì thế không ngừng tăng lên. Theo báo cáo tổng cục thủy sản, ước tính mỗi năm thị trường nuôi tu hài thương phẩm cần khoảng 100 triệu con giống cấp I (Tổng cục Thủy sản, 2014). Trong khi đó, các chương trình chọn giống tiên tiến ở nước ta đối với nghề nuôi tu hài thương phẩm hiện vẫn chưa được áp dụng, việc sản xuất con giống theo phương pháp truyền thống vừa không cung cấp đủ nhu cầu con giống đạt chuẩn vừa gây ra hiện tượng thoái hóa giống do giao phối cận huyết trong khâu sản xuất con giống. Tu hài nuôi biểu hiện tăng trưởng chậm hơn, không đồng đều và dễ bị nhiễm bệnh (Phòng NN&PTNT Vân Đồn, 2019). Theo Quyết định 1664/QĐ-Tg ngày 04/10/2021 về chiến lược phát triển đối nuôi trồng thủy sản trên biển đến năm 2030 và tầm nhìn đến năm 2045, về nuôi biển nói chung và nuôi nhuyễn thể nói riêng, trong đó có tu hài là hướng tới phát triển sản xuất bền vững, hạn chế tối thiểu các tác động tiêu cực đến môi trường và hệ sinh thái biển (Chính Phủ, 2021). Để thực hiện được chiến lược này cần chú trọng khai thác và phát triển nguồn giống bản địa có ứng dụng các chương trình chọn giống khoa học để nâng cao tỷ lệ sống, tăng trưởng nhanh và có khả năng chống chịu với các điều kiện môi trường.
2 Chọn giống với sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử đang ngày càng được chú trọng và những ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống nói chung và với nghề nuôi thủy sản nói riêng đã đạt được những thành tựu đáng tự hào (Gjedrem và cs, 2012). Với sự ra đời và ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gene thế hệ mới (NGS), nhiều hệ gene sinh vật nói chung, các loài thủy sản nói riêng đã được giải trình tự. Khai thác trình tự hệ gene và hệ gene phiên mã (transcriptome), nhiều bộ chỉ thị phân tử đã được công bố đang là những công cụ đáng tin cậy và hiệu quả đối với nhà chọn tạo giống trong việc nhanh chóng tạo ra những giống mới cũng như cải thiện di truyền của các giống hiện có (Hetzel và cs, 2000). Trong số đó, chỉ thị đa hình nucleotide đơn (SNP) được xem là một trong những chỉ thị chính xác, hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay được áp dụng trong chọn tạo giống liên quan đến năng suất và chất lượng (Liu, 2007). Với những thế mạnh vượt trội, chỉ thị SNP đang được sử dụng như một công cụ chọn lọc đắc lực đối với các tính trạng quan tâm trong các chương trình chọn giống ở nhiều loài vật nuôi nói chung và các loài thủy sản nói riêng (Liu, 2007). Điều quan trọng là các SNP có thể xuất hiện ở vùng gen mã hóa, tác động trực tiếp đến tính trang quan tâm, rất hiệu quả trong việc xác định mối tương quan giữa SNP và tính trạng nào đó (Beuzen và cs, 2000). Do đó, việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử nhận dạng chính xác loài quan tâm và việc sử dụng thành công kỹ thuật giải trình tự gene thế hệ mới có thể cung cấp bộ tư liệu trình tự hệ gene để từ đó phát triển được bộ chỉ thị phân tử nói chung, bộ chỉ thị phân tử liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tu hài nói riêng sẽ có ý nghĩa cả về lý luận và thực tiễn đối với nghề nuôi tu hài. Xuất phát từ những lý luận và thực tiễn nêu trên, chúng tôi lựa chọn và tiến hành đề tài “Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena Jonas, 1844) theo hướng tăng trưởng”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Phát triển được bộ chỉ thị phân tử liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tu hài góp phần phát triển nghề nuôi tu hài nói riêng và nghề nuôi biển của Việt Nam nói chung. 3. Nội dung nghiên cứu
3 - Điều tra, đánh giá được thành phần loài tu hài, hiện trạng tiềm năng nghề nuôi tu hài của huyện Vân Đồn – tỉnh Quảng Ninh. - Nghiên cứu xây dựng DNA barcoding cho tu hài vòi trắng (Lutraria rhynchaena). - Nghiên cứu giải trình tự hệ gene tu hài và phát triển bộ chỉ thị SNP cung cấp cơ sở dữ liệu hệ gene tu hài (Lutraria rhynchaena) thu tại huyện Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh. - Nghiên cứu phát triển một số chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tu hài. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học: - Đề tài luận án đã cung cấp một số dữ liệu quan trọng về thành phần tu hài tự nhiên phân bố tại Vân Đồn, hiện trạng và tiềm năng nghề nuôi tu hài ở huyện Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh. - Kết quả của nghiên cứu xây dựng mã vạch DNA của tu hài là cơ sở khoa học quan trọng để nhận dạng chính xác loài tu hài phục vụ lấy mẫu nghiên cứu giải trình tự hệ gene và có thể có ý nghĩa phục vụ truy xuất nguồn gốc các sản phẩm từ thịt tu hài của Việt Nam. - Dữ liệu trình tự hệ gene của tu hài xây dựng được từ kết quả của đề tài luận án có giá trị đối với khoa học nghiên cứu hệ gene, là cơ sở để khai thác và phát triển bộ chỉ thị phân tử cho các nhà nghiên cứu chọn tạo giống tu hài. - Phát triển số chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tu hài cung cấp công cụ sinh học phân tử có giá trị đối với công tác chọn giống tu hài theo hướng tăng trưởng ở Việt Nam. Ý nghĩa thực tiễn: - Mã vạch DNA được phát hiện cung cấp công cụ phân tử có thể nhận dạng chính xác tu hài phục vụ nghiên cứu và truy xuất nguồn gốc. - Với bộ dữ liệu hệ gene lần đầu tiên cung cấp hệ gene tham chiếu tu hài (Lutraria rhynchaena). - Một số chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng được phát triển có ý nghĩa phục vụ công tác chọn tạo giống tu hài theo hướng tăng trưởng nhờ chỉ thị phân tử.
4 5. Những đóng góp mới của luận án - Luận án đã đánh giá được thành phần loài tu hài phân bố tự nhiên tại Vân Đồn, tiềm năng của nghề nuôi tu hài tại huyện Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh. - Xây dựng được mã vạch DNA cho tu hài dựa trên các trình tự gene 16S rRNA và COI, cung cấp thêm công cụ có thể nhận dạng và phân loại chính xác loài tu hài (Lutraria rhynchaena). - Giải trình tự và công bố hệ gene tu hài (Lutraria rhynchaena) trên GenBank đã góp phần cung cấp dữ liệu hệ gene tham chiếu, phục vụ nghiên cứu khai thác dữ liệu hệ gene tu hài. - Qua sàng lọc dữ liệu hệ gene, đã phát hiện và tuyển chọn được 11 chỉ thị SNPs liên quan đến tăng trưởng phục vụ cho công tác chọn giống tu hài theo hướng tăng trưởng. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. Giới thiệu hung về tu hài 1.1.1. Vị trí phân loại học Ngành động vật thân mềm: Mollusca Linnaeus, 1758 Lớp hai mảnh vỏ: Bivalvia Linnaeus, 1758 Bộ ngao (biện mang): Veneroida Bieler R., 2010 Họ vọp: Mactridae Lamarck, 1799 Giống: Lutralia Lamarck, 1799 Loài: Lutralia rhynchaena, Jonas 1844 (Tên đồng danh L. philippinarum Reeve, L. philippinarum Deshayes) Loài Lutralia rhynchaena (Jonas 1844), có tên tiếng Việt là tu hài vòi trắng và tên tiếng Anh là Snout Otter Clam, Otter Clam. Hình 1.1. Tu hài (Lutralia rhynchaena) được thu tại Vân Đồn, Quảng Ninh
5 1.1.2. Phân bố tự nhiên của tu hài Trên thế giới, tu hài phân bố chủ yếu ở vùng biển phía Tây và Nam nước Úc, một số nước châu Á như: Trung Quốc, Thái Lan, Philippine và vùng Bắc Mỹ (Beuzen và cs, 2000). Ở Việt Nam, tu hài phân bố chủ yếu ở vùng biển phía Bắc, độ mặn ổn định từ 25 – 30 ‰, có nền đáy là cát, cát sỏi nhỏ, hoặc vỏ động vật thân mềm ở vùng biển vịnh Lan Hạ thuộc đảo Cát Bà - TP. Hải Phòng đến huyện đảo Vân Đồn - Quảng Ninh (Phạm Thược, 2006). 1.1.3. Tình hình nuôi, khai thác tu hài Trên thế giới, theo thống kê sản lượng khai thác thủy sản toàn cầu năm 2018 đạt gần 80 triệu tấn, năm 2020 đạt 94,6 triệu tấn, trong đó sản lượng động vật thân mềm chiếm 1/3, sản lượng tu hài ước đạt 4 triệu tấn (FAO, 2020). Ở trong nước, sản lượng tu hài khai thác ước đạt 2.621,6 tấn (Tổng cục Thủy sản, 2020). 1.2. DNA barcoding và ứng dụng trong việc phân loại, nhận dạng loài 1.2.1. DNA barcoding DNA barcoding (Mã vạch DNA) đã trở thành thuật ngữ phổ biến, quan trọng và có ý nghĩa trong hơn thập kỷ qua trên toàn thế giới. Năm 2003, lần đầu tiên khái niệm mã vạch DNA được giáo sư Paul Hebert đưa ra giúp nhận dạng mẫu vật, bằng cách sử dụng đoạn DNA ngắn từ đoạn gene cụ thể hoặc kết hợp nhiều gen (Hebert và cs, 2003). Sử dụng kỹ thuật DNA barcoding trong nghiên cứu sẽ giúp các nhà phân loại học định danh chính xác các loài, đồng thời góp phần đánh giá được đa dạng di truyền của các loài sinh vật (Zalapa và cs, 2012). 1.2.2. Ứng dụng DNA barcoding trong phân loại động vật và nhuyễn thể Mã vạch DNA được ứng dụng để phân loại cho nhiều loài sinh vật: phân loại cá (Lara và cs, 2010), (Murgarella và cs, 2016), (Weigt và cs, 2012), phân loại 4 loài tôm hùm nhờ trình tự vùng gene COI, trong đó có một loài tôm hùm Việt Nam và 3 loài khác được thu tại Úc và Sri Lanka (Hiếu và cs, 2019). Trên đối tượng nhuyễn thể, mã vạch DNA đã được ứng dụng thành công trong việc xác định 14 loài hai mảnh vỏ, các trình tự COI đã đóng góp vào những phát hiện mới liên quan đến tính đa dạng sinh học cao của động vật thân mềm (Moira, 2021), mã vạch DNA đã được ứng dụng và chứng minh rất hiệu quả trong việc phân loại ở hàu biển (Trivedi và cs, 2012), ở da gai (Ward,
6 2019), và ốc hương (Bình và cs, 2017). Trong phân tích mã vạch của ngao, Liu (2018) đã sử dụng trình tự DNA vùng gen COI của 56 loài và trình tự gene 16S của 19 loài để xác định mối quan hệ phát sinh loài ngao (Liu và Zhang, 2018). 1.3. Công nghệ giải trình tự gene và chỉ thị phân tử SNPs 1.3.1. Công nghệ giải trình tự gene và ứng dụng Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Next generation sequencing – NGS) đã ra đời trong bối cảnh đó, sự ra đời của công nghệ NGS dựa trên sự phát triển đồng loạt các kỹ thuật chuẩn bị mẫu (Template preparation), nguyên lý đọc trình tự mới (Sequencing and imaging), so sánh và lắp ráp bộ gene (Genome aligment and assembly). Việc sử dụng công nghệ NGS tạo ra một khối lượng dữ liệu khổng lồ (Giải được từ 8 Gb đến 600 Gb), giá thành rẻ, chi phí thấp và ưu điểm vượt trội giải trình tự nhanh và chính xác. Hệ thống giải trình tự thế hệ mới được sử dụng phổ biến như giải trình tự Roche 454 (454 Life Sciences), HiSeq 2000/4000 (Illumina) và AB SOLiD (Life Technologies). Kỹ thuật giải trình tự RAD- Sequencing (Restriction site Associated DNA Sequencing) là kỹ thuật giải trình tự hệ gen bằng cách sử dụng enzyme cắt giới hạn để phân cắt DNA bộ gen thành những phân đoạn ngắn và được gắn các adapter vào 2 đầu, số lượng lớn các biến thể di truyền như SNPs có thể được xác định từ những dữ liệu trình tự DNA bằng giải trình tự thế hệ mới (Baird và cs, 2008). Công nghệ giải trình tự gene được ứng dụng để giải mã thành công bộ gene của 13 loài nhuyễn thể, bao gồm: Argopecten purpuratus (Li và cs, 2018), Bathymodiolus platifrons (Sun và cs, 2017), Chlamys farreri (Li và cs, 2017), C. gigas (Zhang và cs, 2012), Limnoperna fortunei (Uliano-Silva và cs, 2018), Modiolus philippinarum (Sun và cs, 2017), Mytillus galloprovosystemis (Nguyen và cs, 2014), Patinopecten yessoensis (Wang và cs, 2017), Pinctada fucata (Takeuchi và cs, 2012), (Du và cs, 2017), Ruditapes philippinarum (Mun và cs, 2017), Saccostrea glomerata (Powell và cs, 2018), Scapharca bringonii (Bai và cs, 2019) và Venustaconcha ellipsiformis (Renaut và cs, 2018). 1.3.2. Chỉ thị phân tử SNPs và ứng dụng Đa hình nucleotide đơn (SNP) là những biến đổi trình tự DNA xảy ra khi một đơn nucleotide (A, T, C hoặc G) trong trình tự bộ gene bị thay đổi xảy ra
7 trong một quần thể. Sự phân bố của các SNP trong hệ gen không đồng nhất, SNP thường xảy ra với tần số khác nhau trong các phần nhiễm sắc thể khác nhau và trong các vùng không mã hóa thường cao hơn so với các vùng mã hóa (Liu và Cordes, 2004), hầu hết các SNP đều ở dạng hai alen và liên quan đến sự thay thế Cytosine (C) với Thymine (T), đây là biến thể phong phú nhất trong chuỗi DNA giữa các cá thể trong một quần thể. Chỉ thị SNP đã được ứng dụng trong trong nghiên cứu ở một số vật nuôi có tầm quan trọng, mật độ SNP thay đổi từ 6,5K đến 930K (Wall và cs, 2014). Trong vùng gên mã hóa protein của hàu Thái Bình Dương, cứ 60 bp chứa một SNP, ở vùng gên không mã hóa cứ 40 bp chứa một SNP (Sauvage và cs, 2007). Trong khi đó ở hàu dẹt châu Âu, mật độ SNP được chứng minh tương đối cao, ở vùng mã hóa protein cứ 76 bp chứa một SNP và vùng không mã hóa protei cứ 47 bp chứa một SNP (Harrang và cs, 2013). 1.4. Một số gen liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ Một số nghiên cứu đã chỉ ra sự đa hình ở các gene có liên quan đến tăng trưởng ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ, nhóm nghiên cứu của Liying và cs (2014) cũng đã được tiến hành nghiên cứu đặc điểm gene IGFBP (PyIGFBP) liên quan đến tính trạng tăng trưởng của loài sò điệp Yesso (Liying và cs, 2014). Hai SNP có liên quan đến tăng trưởng ở sò gồm PyE2F3-1 và PyE2F3-2, trong đó gene PyE2F3-1 có tương quan đến sự tăng trưởng của chiều dài, chiều cao của vỏ, trọng lượng cơ thể và trọng lượng cơ (Xianhui và cs, 2019). Trên đối tượng hàu đã được phân tích liên kết và haplotype của đa hình nucleotide đơn (SNP), xác định được bốn SNP (ở vị trí - 904, - 522, - 272, - 262 bp) và hai haplotype (CCCC và TCTC) có liên quan trực tiếp đến tốc độ tăng trưởng của C. gigas (Liting và cs, 2021). CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu: Mẫu được thu thập tại Trung tâm giống Thủy sản lợ mặn, Trường Cao đẳng Kinh tế, Kỹ thuật và Thủy sản. Mẫu thu gồm 01 mẫu mô cơ màng áo tu hài được thu thập phục vụ giải trình tự hệ gen tu hài. Mẫu mô cơ màng áo của 30 cá thể tu hài tăng trưởng nhanh, 30 cá thể tu hài tăng trưởng
8 chậm phục vụ gải trình tự sàng lọc SNP. Mẫu mô tiêu hóa tu hài được thu để phục vụ giải trình tự hệ gene phiên mã. Địa điểm nghiên cứu: Việc tách chiết, tinh sạch sản phẩm DNA được thực hiện tại phòng công nghệ sinh học, Trường Cao đẳng Kinh tế, Kỹ thuật và Thủy sản, thành phố Từ Sơn – tỉnh Bắc Ninh. Giải trình tự và đọc kết quả được tiến hành tại Trung tâm công nghệ Genomic, Đại học Deakin, Victoria – Australia. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Điều tra thành phần loài tu hài, hiện trạng nghề nuôi tu hài tại huyện Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh và tiềm năng phát triển nghề nuôi tu hài 2.2.1.1. Khảo sát thành phần loài tu hài tại huyện Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh - Sử dụng phương pháp khảo sát được áp dụng cho vùng triều, sử dụng kĩ thuật khung định lượng (10m2) đối với các điểm thu mẫu. Mẫu thu được bảo quản theo tài liệu của English (1994) (English và cs, 1997). Quy phạm điều tra tổng hợp biển của Ủy ban Khoa học và Kỹ thuật Nhà nước (Ủy ban khoa học và Kỹ thuật nhà nước, 1981) và Quy trình điều tra Tài nguyên và Môi trường biển (Viện tài nguyên và Môi trường biển, 1994). - Định danh loài tu hài bằng phương pháp hình thái: Các cá thể tu hài thu thập được định loại dựa trên đặc điểm hình thái ngoài (hình dạng, màu sắc vỏ, màu sắc vòi, các chỉ tiêu phân loại hình thái) theo khóa phân loại về động vật thân mềm hai mảnh vỏ của Đặng Ngọc Thanh (Đặng Ngọc Thanh, 2007). 2.2.1.2. Đánh giá hiện trạng và tiềm năng nghề nuôi tu hài tại huyện Vân Đồn Thông tin diện tích, hình thức nuôi, mật độ thả nuôi, thời gian nuôi thương phẩm, kích cỡ thu hoạch, tình hình dịch bệnh, tỷ lệ sống, sản lượng và hiệu quả kinh tế, việc tuân thủ quy định của pháp luật về thực hiện các biện pháp bảo vệ môi trường tại cơ sở được khảo sát từ 400 hộ có nghề nuôi tu hài tại các xã Thắng Lợi, Quan Lạn, Đoàn Kết, Ngọc Vừng, Đông Xá, Bản Sen, Vạn Yên và Thị trấn Cái Rồng thuộc huyện Vân Đồn. Thông tin về điều kiện tự nhiên, điều kiện môi trường nước biển, thị trường tiêu thụ, giá bán tu hài thương phẩm... được thu thập từ Chi cục Thủy sản tỉnh Quảng Ninh và phòng Nông nghiệp và Phát triển nông thôn huyện Vân Đồn sử dụng để phân tích, đánh giá tiềm năng phát triển nghề nuôi tu hài.
9 2.2.2. Phương pháp xây dựng mã vạch DNA cho tu hài L. rhynchaena 2.2.2.1. So sánh tương đồng trình tự vùng gene 16S rRNA và COI Khai thác và truy vấn tất cả các trình tự DNA vùng gene 16S rRNA, COI của các giống Lutraria đã được công bố trên ngân hàng Genebank đến thời điểm nghiên cứu. Mức độ tương đồng của các loài tu hài trong giống Lutraria được so sánh bằng BLAST (Altschul và cs, 1997). 2.2.2.2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa vào vùng gen 16S rRNA và COI Cây tiến hóa được xây dựng cho 5 loài tu hài trong nghiên cứu này dựa vào thuật toán Maximum likelihood (ML) với mô hình tiến hóa K2P (Kumar và cs, 2018), thuật toán Bayesian inference (BI) (Ronquist và Huelsenbeck, 2003), BEAST v2.6.3 (Rambaut và Drummond, 2007). 2.2.2.3. Xây dựng mã vạch DNA để nhận dạng tu hài L. rhynchaena Trình tự gene 16S rRNA, COI của các loài Lutraria được phân tích bằng phần mềm BioEdit và phần mềm MEGA X. 2.2.3. Phương pháp giải trình tự hệ gene và hệ gene phiên mã tu hài (L. rhynchaena) 2.2.3.1. Thiết lập thư viện và giải trình tự hệ gene cho tu hài *Thiết lập thư viện genomic DNA tu hài: Hai thư viện giải trình tự mẫu mô cơ tu hài được chuẩn bị (01 chuẩn bị bằng NuGen Celero DNA-Seq (Tecan Genomics, San Carlos, CA), 01 chuẩn bị bằng NEBNext Ultra DNA (New England Biolabs, Ipwich, MA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. *Giải trình tự DNA: Giải trình tự DNA của bộ gene tu hài được kết hợp thực hiện giữa máy giải trình tự Illumina NovaSeq6000 và máy giải trình tự MinION (ONT), tại Trung tâm Genomemic, Đại học Deakin, Victoria – Australia. 2.2.3.2. Thiết lập thư viện và giải trình tự hệ gene phiên mã cho tu hài RNA được thực hiện bằng bộ kit Zymo Quick-RNA Miniprep, thư viện RNA được phát triển bằng Nugen Universal Plus mRNA-Seq Kit (Tecan Genomics, San Carlos, CA) theo nhà sản xuất hướng dẫn. Giải trình tự hệ gene phiên mã của tu hài được thực hiện bằng máy giải trình tự Illumina NovaSeq6000. 2.3.4. Giải trình tự ezRAD cho tu hài (L. rhynchaena) để tìm kiếm SNP liên
10 quan đến tính trạng tăng trưởng Thư viện DNA hệ gen của tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm được phát triển bằng kỹ thuật ezRAD (Toonen và cs, 2013), sử dụng bộ kit TruSeq Nano HT Library Preparation (Illumina). Thư viện DNA thu được từ kỹ thuật ezRAD là dải band có kích thước từ 350 – 550 bp. Giải trình tự ezRAD: Giải trình tự bằng hệ thống máy giải trình tự thế hệ mới HiSeq6000 (Illumina), tại Trung tâm Công nghệ genomic, Trường Đại học Deakin, Australia. 2.3.5. Phương pháp phân tích và xử lý dữ liệu 2.3.5.1. Khảo sát thành phần loài tu hài và đánh giá hiện trạng, tiềm năng nghề nuôi tu hài: Thực hiện theo tài liệu Quy trình điều tra Tài nguyên và Môi trường biển, 2014 thuộc phần điều tra khảo sát động vật đáy biển. Việc tính toán giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức được xử lý bằng thống kê, phân tích ANOVA một nhân tố bằng phần mềm Minitab 16.4 và ứng dụng Microsoft Office Excel 2016 để thống kê, phân tích nhằm thể hiện rõ kết quả bằng biểu đồ, đồ thị. 2.3.5.2. Xây dựng mã vạch DNA để nhận dạng tu hài L. rhynchaena: Các trình tự DNA vùng gene 16S rRNA, COI của các loài Lutraria được căn chỉnh bằng sử dụng phần mềm Bioedit và MAFFT (Katoh và Standley, 2013). Sau đó tiến hành phân tích bằng phần mềm BioEdit (Hall và cs, 1999), MEGA X (Kumar và cs, 2018). 2.3.5.3. Phân tích hệ gene và hệ gene phiên mã của tu hài L. rhynchanena: Xác định kích thước bộ gene tu hài: Tiền xử lý bộ dữ liệu thô bằng sử dụng công cụ Fastp (v0.19.4) (Chen và cs, 2018), chất lượng bộ dữ liệu được tiền xử lý với chương trình Trimmomatic (v0.36) (Bolger và cs, 2014). Đánh giá chất lượng lắp ráp trình tự gene tu hài bằng phần mềm bowtie2 v2.3.3.1 (Langmead và Salzberg, 2012). Ước lượng kích thước hệ gene tu hài bằng giá trị kmer trong chương trình với Jellyfish v2.2.6 (Marçais và Kingsford, 2011). Sử dụng phầm mềm GenomeScope để xây dựng biểu đồ k-mer và ước tính kích thước bộ gene của tu hài (Vurture và cs, 2017). Lắp ráp hệ gene tu hài bằng phần mềm MaSuRCA (De novo) (Zimin và cs, 2013), đánh giá mức độ hoàn chỉnh của quá trình lắp ráp bằng BUSCO v3.0.2 (Simão và cs, 2015). Chỉnh sửa
11 các lần đọc dài và lắp ráp bằng phần mềm minimap2 (Li, 2018), chỉnh sửa lỗi bằng phần mềm Purge Haplotigs (Renaut và cs, 2018). *Ước lượng dị hợp tử, trình tự lặp và tìm kiếm đa hình: Phát hiện đa hình nucleotide đơn (SNP) bằng phầm mềm bowtie2 (Langmead và Salzberg, 2012), xác định trình tự lặp lại bằng phần mềm RECON và RepeatScout (Chen, 2018), (Price và cs, 2005). Xác định kích thước hệ gene phiên mã tu hài (L. rhynchaena) *Lắp ráp hệ gene phiên mã: Thư viện RNA-seq đã được giải trình tự, bộ dữ liệu thô được tiền xử lý và một hệ phiên mã được tạo ra để hỗ trợ cho việc dự đoán hệ gene. Lắp ráp de novo thực hiện bằng phần mềm Trinity (Grabherr, 2011). Xử lý trình tự đọc ngắn bằng phần mềm Bowtie2 (Langmead và Salzberg, 2012). Căn chỉnh hệ gene phiên mã bằng phần mềm GMAP (Zalapa và cs, 2012). *Dự đoán và chú thích gene: Dự đoán gene được thực hiện bằng phần mềm MAKER (Holt và Yandell, 2011), các nhóm protein chính được căn chỉnh bằng phần mềm MAFFT v7.394 (Katoh và Standley, 2013), protein được xác định bằng phần mềm IQ-TREE v1.5.5 (Nguyen và cs, 2014). Phân tích bộ chỉ thị phân tử SNP bằng phần mềm BWA (Li và Durbin, 2009) và phát hiện các SNP bằng SAMtools (Li, 2009). Các SNP được gióng hàng các contig và sự sai khác nucleotide được phát hiện trên ít nhất bốn trình tự đọc (Read) (Gao và cs, 2012). Xử lý số liệu theo quy trình Stacks (Catchen và cs, 2011), (Rochette và cs, 2019). Xác định SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tu hài (L. rhynchaena): Bộ dữ liệu trình tự của nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm được tiền xử lý bằng phần mềm Trimmoatic, đoạn trình tự có chất lượng thấp (Q< 10) được loại bỏ (Bolger và cs, 2014). Quá trình xử lý số liệu được thực hiện theo quy trình của dDocent v2.24 (http://dDocent.com). Các bước tuyển chọn SNPs được thực hiện bao gồm: Lắp ráp hệ gen tham chiếu (de novo reference asembly), dóng hàng (Maping) bằng phần mềm Stacks (Rochette và cs, 2019), phát hiện và lọc chỉ thị SNPs bằng phần mềm vcftools v.0.1.13 (Danecek và cs, 2011). Outlier loci là những vị trí loci có giá trị khác biệt so với phần còn lại của bộ
12 gene (Neutral loci) bằng và sử dụng phương pháp linkage disequibrium (LD) để phát hiện các outlier loci bằng phần mềm R (Gregor và cs, 2019). Sàng lọc phát hiện các SNP được thực hiện dựa trên các tiêu chí sàng lọc được tích hợp khi chạy chương trình VariantFiltration thuộc GATK giúp đánh dấu các điểm biến dị có: giá trị Fisher Strand: FS > 30.0; giá trị Qual by Depth: QD < 2.0; xuất hiện 3 SNP trở lên trong 1 khung cửa sổ 35bp (SnpCluster); SNP nằm cách 2 đầu trình tự đọc 20-25bp. Sàng lọc riêng biệt: File vcf kết quả sau khi chạy GATK sẽ được đưa vào công cụ vcfisec để lọc ra các vị trí trên cùng một transcript mà chỉ phát hiện được biến dị tại 1 trong 2 nhóm tu hài sinh trưởng nhanh hoặc chậm. Thiết kế các cặp mồi cho các SNP tương ứng ở cả hai nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm dựa trên các file fasta được trích xuất và dựa vào phần mềm thiết kế mồi với các tham số đặt sẵn: độ dài primer, vị trí gắn mồi, nhiệt độ gắn mồi (Tm). CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thành phần loài tu hài phân bố tự nhiên tại huyện Vân Đồn, hiện trạng và tiềm năng phát triển nghề nuôi tu hài tại huyện Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh 3.1.1. Khảo sát thành phần loài tu hài phân bố tự nhiên tại huyện Vân Đồn Kết quả khảo sát thành phần loài tu hài L. rhynchaena tại 8 xã, thị trấn thuộc huyện Vân Đồn với 40 địa điểm thu được 66 mẫu tu hài. Dựa trên khóa phân loại và mô tả hình thái của nhuyễn thể hai mảnh vỏ để xác định các loài tu hài. Kết quả đã xác định được tại huyện Vân Đồn hiện có hai loài tu hài phân bố, thành phần các loài tu hài khảo sát được mô tả tại Bảng 3.1. Thành phần loài tu hài ghi nhận phân bố tự nhiên ở 8/8 xã, thị trấn chủ yếu là loài tu hài vòi trắng L. rhynchaena, loài tu hài vòi đỏ L. arcuata chỉ phát hiện duy nhất tại xã Đông Xá. Bảng 3.1. Thành phần loài tu hài phân bố tự nhiên tại huyện Vân Đồn Thành phần loài tu hài Chỉ tiêu Lutraria rhynchaena, Lutraria arcuata Jonas 1844 Deshayes in Reeve,1854 Số mẫu thu (con) 61 5 Khối lượng mẫu thu (kg) 3,317 0,112
13 Mật độ (con/m2) 0,15 ± 0,03 0,1 ± 0,02 3.1.2. Đánh giá hiện trạng và tiềm năng phát triển nghề nuôi tu hài tại huyện Vân Đồn hiện nay Qua kết quả điều tra 400/1250 hộ nuôi trồng thủy sản tại Vân Đồn năm 2019 cho thấy, tổng số hộ nuôi tu hài là 152 hộ, đối tượng nuôi là loài Lutraria rhychaena, Jonas 1884. Với tổng diện tích ước đạt 209 ha, quy mô diện tích trung bình nuôi thủy sản đạt 1,38 ha/hộ, quy mô nuôi tu hài trung bình đạt 0,18 ha/hộ. Diện tích nuôi tu hài lớn nhất đạt 9,25 ha ở xã Bản Sen, diện tích nhỏ nhất nuôi tu hài đạt 1,5 ha ở xã Ngọc Vừng. Quy mô trung bình nuôi tu hài dao động từ 0,08-0,3 ha/hộ. Độ mặn của môi trường nước biển ở Vân Đồn luôn ổn định, dao động từ 28,2 - 29,3‰, nằm trong ngưỡng phát triển của tu hài (Hà Đức Thắng, 2010). Khảo sát của chúng tôi cho thấy, về mùa hè, lượng mưa lớn, độ mặn có giảm nhưng vẫn dao động trong khoảng 25,65 - 28,75‰; Mùa thu, đông có lượng mưa thấp, độ mặn không có sự chênh lệch, dao động trong khoảng 28,5 - 29,5‰. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của độ mặn đến sinh trưởng và tỷ lệ sống của tu hài được trình bày tại cũng cho thấy, độ mặn của nước biển tại Vân Đồn là hoàn toàn phù hợp để tu hài sinh trưởng và phát triển. Thêm vào đó, các hộ dân nuôi tu hài có kinh nghiệm nuôi trung bình 12,68 ± 15,54 năm, được tích lũy qua thực tiễn nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng trong nhiều năm, trao đổi thông tin và chia sẻ kinh nghiệm giữa những người tham gia nuôi tu hài tại địa phương. Giá tu hài thương phẩm luôn ổn định trong khoảng 100.000 – 120.000 nghìn đồng/ kg, cao hơn các loại nhuyễn thể khác, nhu cầu tiêu thụ lớn. 3.2. Xây dựng mã vạch DNA cho tu hài L. rhynchaena 3.2.1. Khảo sát dữ liệu để xây dựng mã vạch DNA vùng gene 16S rRNA, COI của các loài thuộc giống Lutraria được công bố trên GenBank Để phát triển chỉ thị phân tử DNA nhằm nhận dạng và phân biệt được loài tu hài Việt Nam với các loài thuộc giống Lutraria, tập hợp cơ sở dữ liệu riêng cho giống Lutraria đã được xây dựng dựa trên kết quả sàng lọc trình tự liên quan đến các loài thuộc giống Lutraria có mặt trong GenBank. Ngoài ra, trình tự vùng gene 16S rRNA và COI của loài Spisula solida (MG934910.1) cũng được khai thác để đối chứng khi xây dựng cây phân loại.
14 So sánh trình tự DNA vùng gene 16S rRNA của các loài thuộc giống Lutraria Từ kết quả so sánh trình tự DNA của vùng gene 16S rRNA của tu hài L. rhynchaena so với 4 trình tự DNA của 3 loài tu hài đã được công bố trên GenBank cho thấy, tu hài Việt Nam có mức tương đồng (ident) cao với loài L. australia, mức độ tương đồng đạt 100%, trong khi so với 2 loài còn lại mức độ tương đồng dao động từ 92,24-92,43%. So sánh trình tự DNA vùng gene COI của các loài thuộc giống Lutraria Kết quả so sánh trình tự DNA vùng gene COI của tu hài ở Việt Nam L. rhynchaena so với các trình tự DNA của loài tu hài đã được công bố trên GenBank cho thấy, tu hài Việt Nam có mức độ tương đồng cao so với loài L. australia, mức tương đồng đạt 99,84 %, nhưng lại thấp so với loài L. maxima, L. arcuata, mức tương đồng đạt từ 86,73-87,18 %. Nếu so sánh trình tự DNA có chỉ số giống nhau lớn hoặc bằng 97 % được coi là cùng một loài và ngược lại nếu chỉ số phân tích nhỏ hơn 97 % được coi là khác loài (Stackebrandt và Ebers, 2006). Điều này khẳng định tu hài ở Việt Nam (L. rhynchaena) và loài tu hài L. australis là cùng một loài và có tên đồng danh L. philippinarum. 3.2.2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại vùng gene 16S rRNA, COI cho các loài tu hài Cây tiến hóa xây dựng từ trình tự gene 16S rRNA bằng thuật toán ML (Hình 3.1A), BI (Hình 3.1B). Từ sơ đồ cây phát sinh loài ở hình 3.1A, B cho thấy, cây gồm có 2 nhánh, nhánh 1 là giống Spisula, nhánh 2 gồm các loài Lutraria, trong đó các loài L. maxima và loài L. arcuate, có quan hệ gần gũi với loài L. arcuate được xếp vào một phân nhánh, phân nhánh còn lại gồm hai loài L. rhynchaena và L. australis có quan hệ gần gũi với nhau. Hình 3.1. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài Lutraria dựa vào phân tích
15 trình tự gen 16S rRNA bằng thuật toán ML của chương trình MEGA X (A) và thuật toán BI của chương trình BEAST (B) Do đó, trình tự gene 16S rRNA có thể sử dụng làm mã vạch để nhận dạng loài tu hài L. rhynchaena với các loài khác. Kết quả xây dựng cây tiến hóa từ trình tự vùng gen COI bằng thuật toán ML (Hình 3.2A) và BI (Hình 3.2A) cho thấy, 5 loài thuộc giống Lutraria nằm trong cùng một nhóm lớn của cây phát sinh loài, nhánh còn lại là loài đối chứng S. solida. Nhánh thứ nhất của cây phát sinh gồm hai phân nhóm, phân nhóm một gồm hai nhóm nhỏ, nhóm thứ nhất gồm loài L. rhynchaena và L. australis, nhóm thứ hai gồm L. arcuate và L. maxima, hai nhóm này có mối quan hệ gần gũi với nhau, phân nhánh còn lại là L. lutraria. Kết quả nghiên cứu cho thấy, trình tự gene COI có thể sử dụng làm mã vạch để nhận dạng loài tu hài L. rhynchaena với các loài khác. Hình 3.2. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài Lutraria dựa vào phân tích trình tự gen COI sử dụng thuật toán ML của chương trình MegaX (A) và thuật toán BI của chương trình BEAST (B) Như vậy, đối với trình tự gene COI khi sử dụng cả 2 chương trình MEGA X và BEAST cho kết quả tương tự nhau, trong đó các loài L. rhynchaena và L. australis nằm trong cùng một nhóm có quan hệ gần gũi với nhau, phân nhóm còn lại gồm L. maxima, Lutraria còn lại. Kết quả nghiên cứu cho thấy, trình tự COI có thể sử dụng làm chỉ thị để nhận dạng loài L. rhynchaena với các loài khác trong giống Lutraria. 3.2.3. Xây dựng mã vạch DNA để nhận dạng tu hài (L. rhynchaena) Kết quả phân tích trình tự vùng gene 16S rRNA với chiều dài chung 438 nucleotide của loài Lutraria để đưa ra vùng trình tự đặc trưng cho loài L. rhychaena dựa vào xuất hiện của các nucleotide tiêng biệt trong trình tự, khi
16 phân tích toàn bộ chuỗi, có 35 vị trí sai khác nucleotid giữa loài L. rhynchaena với 3 loài còn lại (L. australis A1, L. maxima, L. arcuata G1 và L. arcuata G3). Trong đó, giữa loài tu hài Việt Nam L. rhynchaena với loài L. australis A1 có 2 điểm sai khác tại nucleotid số 66 và 67. Kết quả phân tích trình tự vùng gene COI của 5 loài Lutraria sau khi được dóng hàng và căn chỉnh có chiều dài 615 nucleotide, đã xác định được 143 vị trí sai khác trong các giống Lutraria. Giữa loài L. rhynchana với loài L. australis đã xác định được một vị trí sai khác nucleotide ở vị trí số 265, trong khi đó với loài L. maxima và L. arcuata, đã xác định được lần lượt 78 và 79 vị trí sai khác. Giữa loài L. rhynchana với loài L. lutraria đã xác định được 117 vị trí nucleotide sai khác. Kết quả cho thấy sự khác biệt đáng kể đối với vùng gene 16S và COI. Do đó, gene 16S và COI có thể sử dụng làm mã vạch DNA để nhận diện loài L. rhynchaena với các loài khác trong giống Lutraria. 3.3. Giải trình tự hệ gene, hệ gene phiên mã tu hài (L. rhychaena) 3.3.1. Thiết lập thư viện và giải trình tự hệ gene tu hài Hai thư viện giải trình được phát triển theo hướng dẫn của nhà sản xuất, đảm bảo đủ điều kiện để tiến hành giải trình tự hệ gen. Kết quả giải trình tự và phân tích dữ liệu bộ gene tu hài được tạo thành từ 122 Gbp (55,16 Gbp + 66,77 Gbp) lần đọc ngắn với độ dài ghép nối (150 bp) và 14 Gbp của lần đọc dài. Độ dài trung bình là 4.960 bp, đoạn dài nhất 58.804 bp, đoạn ngắn nhất 200 bp. Ngoài ra, 34 Gbp bản đọc phiên mã được tạo ra phục vụ cho việc dự đoán hệ gene. 3.3.2. Thiết lập thư viện và giải trình tự hệ gene phiên mã của tu hài Thư viện tao thành được kiểm tra đảm bảo chất lượng và đạt tiêu chuẩn theo yêu cầu của Illumina để có thể sử dụng để giải trình tự. Kết quả giải trình tự và phân tích dữ liệu hệ gene phiêm mã tu hài được tạo thành với độ dài đoạn đọc 150bp. Ngoài ra, 34 Gbp bản đọc phiên mã được tạo ra phục vụ cho việc dự đoán hệ gene. 3.3.3. Ước lượng kích thước bộ gene Phân tích kmer trên bộ dữ liệu đã xác định được kích thước bộ gene của tu hài được ước tính nằm trong khoảng từ 545 đến 547 Mbp. Dựa trên kết quả phân tích từ trình tự đọc ngắn và trình tự đọc dài với độ bao phủ giải trình tự lần lượt là 200X và 25X.
17 3.3.4. Lắp ráp bộ gene của tu hài Lắp ráp hệ gene tu hài bao gồm 1.502 bộ ba, chiều dài vùng gene N50 tương ứng 1,84 Mbp và kích thước lắp ráp là 586,5 Mbp. Mức độ hoàn chỉnh của quá trình lắp ráp đạt 95,9%. Kết quả đã tạo ra một tổ hợp hệ gene có dung lượng 544 Mbp chứa trong 622 bộ ba với kích thước chiều dài vùng gene N50: 2,14 Mbp, trong đó chứa 95,6% trình tự đọc ngắn (Illumina). Độ chính xác đạt 95,8%, có 1,5% BUSCO được phát hiện trong các bản sao. Kết quả của giải trình tự hệ gene tu hài đã được gửi và công bố trên GenBank. 3.3.5. Lắp ráp hệ gene phiên mã, dự đoán và chú thích hệ gene tu hài Kết quả đã tạo ra các đoạn đọc RNA đặc hiệu dạng sợi ngắn, với chiều dài 34,6 Gbp, hệ gene phiên mã có độ dài 295.234 bộ ba, độ hoàn chỉnh đạt 83,9%. Tổng cộng 96,4% số lần đọc RNA được đối chiếu với các bản sao đã lắp ráp và có 79% được chỉnh sửa bộ gene theo nhận biết đoạn nối. Kết quả chú thích hệ gene tu hài đã xác định được 26.380 gene mã hóa protein (AED ≤ 0,5), 89,8% trong số đó đã được chú thích về mặt chức năng. 3.3.6. Ước lượng dị hợp tử, trình tự lặp lại và tìm kiếm đa hình Kết quả gióng hàng các trình tự contig và sàng lọc đã phát hiện tổng số 4.903.576 điểm đa hình nucleotide đơn (SNP) với ước tính tỷ lệ dị hợp tử đạt 0,90%, sử dụng phần mềm GenomeScope dựa trên các giá trị kmer đã xác định được tỷ lệ dị hợp tử đạt 1,60%. Như vậy tỷ lệ dị hợp tử nằm trong giới hạn cho phép đối với loài hai mảnh vỏ đã được nghiên cứu và công bố trước đó (Giá trị dao động từ 0,51 đến 2,02%). 3.3.6. Lắp ráp hệ gene phiên mã Kết quả tập hợp hệ gene phiên mã có độ dài 295.234 bộ ba, chiều dài 34,6 Gbp. BUSCO xử lý với độ hoàn chỉnh đạt 83,9%. Tổng cộng 96,4% số lần đọc RNA được đối chiếu với các bản sao đã lắp ráp và có 79% được chỉnh sửa hệ gene theo nhận biết đoạn nối. Cả hai tỷ lệ liên kết đã chỉ ra chất lượng của bộ gene phiên mã là đủ và đảm bảo để thực hiện việc dự đoán gene. 3.3.7. Dự đoán và chú thích hệ gene tu hài Dựa trên kết quả lắp ráp đã cho đã xác định được 26.380 gene mã hóa protein (AED ≤ 0,5), 89,8% trong số đó đã được chú thích về mặt chức năng,
18 một protein sẽ có ít nhất một chú thích chức năng được liên kết. 3.3.8. So sánh đặc điểm hệ gene L. rhynchaena với các loài hai mảnh vỏ Hiện nay đã có 13 bộ gene của các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ được giải trình tự và công bố. Dựa trên (http://www.genomesize.com) cơ sở dữ liệu kích thước bộ gen động vật, kích thước bộ gen cuả các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ thay đổi rất nhiều, ngay cả trong cùng nhóm. Chúng nằm trong khoảng từ 0,54 Mb đến 1,8 Gb (trung bình 1,6 Gb) thấp hơn so với bộ gen của các loài chân đầu (trung bình 3,8 Gb) và chân bụng (trung bình 2,2 Gb), kích thước này đã phản ánh một phần số lượng trình tự lặp lại trong bộ gene. Kích thước bộ gen lớn nhất của các loài thân mềm hai mảnh vỏ đã được giải mã là M. philippinarum (2,38 Gb), tiếp đến Venustaconcha ellipsiformis nay (1,8 Gb), trong khi đó loài L. rhychaena là 0,55 Mb. Tỷ lệ các yếu tố lặp lại ở các loài hai mảnh vỏ nằm trong khoảng từ 25% (P. yessoensis) đến 60% (V. ellipsiformis), với loài L. rhychaena đạt 29%. 3.4. Sàng lọc, tuyển chọn và phát triển chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tu hài Kết quả lựa chọn 30 cá thể thuộc 63 gia đình có giá trị EBV cao và 30 cá thể thuộc 42 gia đình có giá trị EBV thấp, giá trị chọn giống được mô tả tại Bảng 3.2. Bảng 3.2. Giá trị chọn giống ước tính cho tính trạng tăng trưởng giữa hai nhóm tu hài Nhóm tăng trưởng Nhóm tăng Giá trị nhanh trưởng chậm Số lượng mẫu (con) 30 30 Số lượng gia đình 63 43 Khối lượng trung bình (g) 56,4 ± 0,20 38,5 ± 0,18 EBV trung bình 32,6 ± 28,3 -21,7 ± 0,27 Ghi chú: Số liệu biểu diễn ở dạng trung bình ± độ lệch chuẩn. 3.4.1. Xây dựng thư viện và giải trình tự ezRAD Kết quả đã phát triển được tổng số 02 thư viện gene, gồm 01 thư viện gene (DNA library) cho tu hài tăng trưởng nhanh và 01 thư viện gene cho nhóm tu hài tăng trưởng chậm. Giải trình tự các thư viện và phân tích Stacks