Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:15

Thêm vào BST

Báo xấu

25
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài lầ xác định điều kiện thích hợp cho tách chiết, làm sạch squalene từ sinh khối chủng S. mangrovei PQ6 lựa chọn được; đánh giá độ an toàn và tác dụng sinh học, dược lý của squalene tách chiết được theo định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN CẨM HÀ NGHIÊN CỨU SQUALENE TỪ VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG SHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 ĐỊNH HƯỚNG LÀM NGUYÊN LIỆU CHO THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE, MỸ PHẨM VÀ DƯỢC PHẨM Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9 42 01 16 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – Năm 2020
Công trình được hoàn thành tại: Viện Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: GS. TS. Đặng Diễm Hồng Viện Công nghệ Sinh học Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: …. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ …, ngày … tháng … năm 202…. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
3 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ (09 bài) 1. Nguyễn Cẩm Hà, Hoàng Thị Minh Hiền, Nguyễn Hoàng Ngân, Đặng Diễm Hồng, Đánh giá mức độ an toàn và tác dụng của squalene tách chiết từ Schizochytrium mangrovei PQ6 đến sự tăng cholesterol của lipoprotein tỷ trọng cao (HDL-C) ở động vật thực nghiệm. Tạp chí Sinh học, 2019, 41(2), 39-48. 2. Hoang Thi Lan Anh, Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Hoang Thi Huong Quynh, Pham Van Nhat, Hoang Thi Minh Hien, Ngo Thi Hoai Thu, Dang Diem Hong, Different fermentation strategies by Schizochytrium mangrovei strain PQ6 to produce feedstock for exploitation of squalene and omega-3 fatty acids. Journal of Phycology, 2018, 54 (4), 550- 556 (SCI, Q1; IF-3,0). 3. Nguyễn Cẩm Hà, Hoàng Thị Minh Hiền, Đặng Diễm Hồng, Cơ chế giảm cholesterol của squalene tách chiết từ Schizochytrium mangrovei PQ6. Báo cáo toàn văn tại Hội thảo Khoa học công nghệ sinh học toàn quốc 2018 tại Trung tâm Hội nghị quốc gia Hà Nội 26.10.2018, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ; 2018, 589-594. 4. Nguyen Cam Ha, Hoang Thi Minh Hien, Le Thi Thom, Hoang Thi Huong Quynh, Dang Diem Hong, Optimization of fermentation conditions for squalene production by heterotrophic marine microalgae Schizochytrium mangrovei. Academia Journal of Biology, 2017, 39(3), 449-458. 5. Hoang Thi Minh Hien, Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Dang Diem Hong, Squalene promotes cholesterol homeostasis in macrophage and hepatocyte cells via activation of liver X receptor (LXR) α and β. Biotechnology Letters, 2017, 39 (8), 1101-1107 (SCI, Q2; IF-1,7). 6. Đặng Diễm Hồng, Nguyễn Cẩm Hà, Lê Thị Thơm, Lưu Thị Tâm, Hoàng Thị Lan Anh, Ngô Thị Hoài Thu, Nhiên liệu sinh học từ vi tảo biển dị dưỡng của Việt Nam: Biodiesel và tận thu các sản phẩm phụ (acid béo không bão hòa đa nối đôi - PUFAs, glycerol và squalene) trong quá trình sản xuất biodiesel. Tạp chí Sinh học, 2017, 39 (1), 51-60. 7. Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Hoang Thi Huong Quynh, Pham Van Nhat, Hoang Thi Lan Anh and Dang Diem Hong, Extraction of squalene from Vietnam heterotrophic marine microalga. Proceeding of The 4 the Academic conference on natural Science for Yong Scientists, Master & PhD. Student from Asian Countries. 15-18 December, 2015 - Bangkok, Thailand, 2016, 46-56. 8. Hoang Thi Lan Anh, Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Dang Diem Hong, Optimization of culture conditions and squalene enrichment from heterotrophic marine microalga Schizochytrium mangrovei PQ6 for squalene production. Research Journal of Biotechnology, 2016, 14 (2), 337-346 (SCI-E). 9. Nguyễn Cẩm Hà, Lê Thị Thơm, Đặng Diễm Hồng, Hoàng Minh Hiền, Nghiên cứu tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium sp. trên tế bào Hep G2. Tạp chí Dược liệu, 2016, 21 (4), 270 -274.
4 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Việt Nam có trên 3.200 km bờ biển với một nguồn sinh vật biển nhiệt đới rất đa dạng, phong phú về thành phần loài và giàu các hợp chất tự nhiên có thể ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y dược.... Vi tảo với ưu điểm chính là giàu dinh dưỡng, kích thước nhỏ (< 10 µm), dễ tiêu hóa, không độc, có tốc độ sinh trưởng và sức chống chịu cao với điều kiện khắc nghiệt của môi trường, được coi là mắt xích đầu tiên, nguồn sinh khối sơ cấp quan trọng trong chuỗi thức ăn ở hệ sinh thái dưới nước. Ngoài ra, sinh khối vi tảo cũng chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng cho người và động vật như: các loại sắc tố, vitamin, khoáng chất, protein, các acid béo không bão hòa đa nối đôi (polyunsaturated fatty acid - PUFAs)....đặc biệt là squalene. Squalene- một tripterpene tự nhiên là tiền chất steroid của động, thực vật thường được sử dụng trong các sản phẩm dinh dưỡng, chăm sóc sức khỏe, mỹ phẩm và y học. Squalene được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp mỹ phẩm với tác dụng chống khô da và làm mềm da, bảo vệ da khỏi các tác hại do ánh sáng và tia UV gây ra. Các nghiên cứu dịch tễ học đã cho thấy squalene ức chế hiệu quả các tác nhân hóa học có khả năng gây ung thư ruột kết, phổi, da ở động vật thực nghiệm. Squalene cũng là một chất chống oxy hoá tự nhiên, bảo vệ các tế bào khỏi các gốc tự do và oxy phân tử có hoạt tính cao, có khả năng tăng cường hoạt động của hệ miễn dịch. Việc cung cấp thực phẩm chức năng có thành phần squalene cao (khoảng 500 mg/ngày) đã được chứng minh là cần thiết cho sức khỏe dinh dưỡng của con người, làm giảm đáng kể bệnh tim mạch và ung thư. Vì vậy, chúng cũng được dùng phổ biến trong dược phẩm. Cho đến nay, các nguồn sản xuất squalene được biết đến nhiều nhất là các loại dầu động, thực vật. Tuy nhiên, việc khai thác quá mức làm ảnh hưởng đến sự bảo tồn nguồn lợi cá biển trong tự nhiên, cũng như sự phụ thuộc vào thổ nhưỡng, mùa vụ của các loại cây trồng có dầu dẫn đến nguồn khai thác squalene đang bị giảm sút. Trong khi đó, hiện nay nhu cầu về squalene trong các ngành công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm đang ngày càng tăng. Do vậy, việc tìm kiếm và phát triển các nguồn nguyên liệu mới thay thế nguồn truyền thống để tách chiết squalene là rất cần thiết và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Trong đó, vi sinh vật nói chung và vi tảo biển nói riêng là một nguồn tiềm năng cho sản xuất squalene trên quy mô lớn. Gần đây, một số các loài vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) như thraustochytrids được xem như là các nhà máy tế bào tiềm năng để sản xuất các chất có giá trị cao trong đó có squalene. Tuy nhiên, việc nghiên cứu squalene ở Việt Nam mới được bắt đầu từ 2012, kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc cung cấp cơ sở khoa học ban đầu về hàm lượng squalene từ một số chủng vi tảo, chưa có được các phương pháp tối ưu cho tách chiết, làm giàu và tinh sạch squalene; chưa có được điều kiện nuôi trồng tối ưu vi tảo tiềm năng có sức sản xuất sinh khối có hàm lượng squalene cao; chưa có được quy trình công nghệ tạo chế phẩm squalene có hoạt tính sinh học bảo đảm an toàn cho sử dụng theo định hướng làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm ở Việt Nam. Chính vì vậy, với mục tiêu lớn là cung cấp được các sản phẩm giàu squalene phục vụ cho sức khỏe cộng đồng từ nguồn tài nguyên thiên nhiên sẵn có trong nước trong đó có vi tảo, chúng tôi mong muốn thực hiện đề tài “Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm”. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án - Sàng lọc và xác định được điều kiện nuôi trồng thích hợp của chủng Schizochytirum mangrovei PQ6 của Việt Nam tiềm năng lựa chọn được cho sản xuất squalene. - Xác định điều kiện thích hợp cho tách chiết, làm sạch squalene từ sinh khối chủng S. mangrovei PQ6 lựa chọn được; đánh giá độ an toàn và tác dụng sinh học, dược lý của squalene tách chiết được theo định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án - Sàng lọc được chủng/loài vi tảo biển của Việt Nam tiềm năng cho sản xuất squalene từ một số chủng vi tảo biển Việt Nam - Tối ưu điều kiện nuôi cấy để thu được sinh khối tảo có hàm lượng squalene cao ở chủng tiềm năng lựa chọn được ở quy mô bình tam giác; bình lên men 30 Lít. - Tối ưu điều kiện tách chiết, làm giàu và tinh sạch squalene từ sinh khối chủng vi tảo biển lựa chọn được; xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene; xác định độ sạch và cấu trúc của squalene tách chiết được.
5 - Đánh giá tính an toàn của squalene bao gồm độc tính cấp và bán trường diễn, tác dụng sinh dược trên mô hình in vivo (mô hình động vật thực nghiệm). - Bước đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm cholesterol của squalene trên mô hình in vitro (mô hình tế bào). Chương 1. Tổng quan Squalene (2,6,10,15,19,23-hexanmethyltetracosa 2,6,10,14,18,22 -hexane) là một hydrocacbon hợp chất béo không bão hòa (C30H50), với 6 liên kết đôi, chứa 6 đơn vị isoprene để cung cấp bộ khung cho tổng hợp cholesterol, acid mật và steroid. Squalene đóng vai trò quan trọng trong hoạt động miễn dịch, chống oxy hóa, giảm cholesterol, bảo vệ tim mạch và giải độc gan, làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm hỗ trợ bảo vệ sức khỏe hay được sử dụng chủ yếu trong công nghiệp mỹ phẩm như là một chất có tác dụng giữ ẩm và làm mềm da. Ngoài ra, nó còn có hiệu quả cao trong việc điều trị bệnh và ứng dụng tốt trong dược phẩm như hoạt tính chống phát triển khối u rất rõ rệt trên các mô hình động vật thực nghiệm. Các nghiên cứu gần đây cho thấy vi tảo là nguồn thay thế tiềm năng cho việc sản xuất squalene. Trong tất cả các nhóm vi tảo, VTBDD Schizochytrium được xem như là các nhà máy tế bào tiềm năng cho sản xuất các chất có giá trị cao trong đó có squalene. Theo công bố mới nhất của Martins và cộng sự (2018) cho thấy loài Aurantiochytrium sp. sau 48 h nuôi cấy dưới điều kiện độ mặn 1,5%, nồng độ glucose ban đầu 3%, ở 26°C đã cho sản lượng squalene cao nhất là 7,3 g/100 g. Ở Việt Nam, chủng VTBDD S. mangrovei PQ6 được phân lập tại huyện đảo Phú Quốc, Kiên Giang từ 2006-2008 là một chủng vi tảo tiềm năng, dễ nuôi trồng trong các hệ thống bình lên men có thể tích 5, 10, 30 và 150 lít, lượng sinh khối tươi (SKT) đạt 70-100 g/L tương đương với sinh khối khô (SKK) là 20-30 g/L, hàm lượng lipid có thể lên tới 50-70 % SKK. Vì vậy, loài vi tảo biển này được xem là tiềm năng cho sản xuất sinh khối và các chất chuyển hóa như là PUFAs và squalene trên quy mô lớn. Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu 2.1.1. Mẫu vật - 40 chủng VTBDD trong đó có 31 chủng thuộc chi Schizochytrium, 8 chủng thuộc chi Thraustochytrium phân lập từ các vùng bờ biển và rừng ngập mặn ở Hải Phòng, Nam Định, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Nghệ An và Bình Định năm 2013-2014, chủng S. mangrovei PQ6 phân lập ở Huyện đảo Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang năm 2006- 2008 được sử dụng cho nghiên cứu. 2.1.2. Các bộ kit sinh phẩm: Kit tinh sạch sản phẩm PCR (Genjet Purification, Thermo ScientificTM (EU)), kit tách chiết ARN tổng số RNAiso Plus (Takara, Tokyo, Nhật Bản), kit tổng hợp cDNA (RevertAid First Strand cDNA - Thermo Fisher Scientific Inc., Singapore) đã được sử dụng trong nghiên cứu. Trình tự các cặp mồi nhân các gen (CYP7A1, LDL-R, ABCA-1, LXRα, ABCA-1, ABCG-1, ApoE, LXRß GADPH) do Phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học thiết kế. 2.1.3. Động vật thí nghiệm: Chuột cống trắng, chuột nhắt trắng do Ban động vật thí nghiệm - Học Viện Quân Y cung cấp. 2.1.4. Các dòng tế bào: Dòng tế bào gan người HepG2 và tế bào đại thực bào từ chuột RAW264.7 có nguồn gốc từ ngân hàng Tế bào sống, trường Đại Học Seoul, Hàn Quốc và do GS. TS. Sung-Joon Lee, Trường Đại học Korea, Hàn Quốc tặng. 2.1.5. Hóa chất: Các hóa chất sử dụng là các hóa chất thông dụng trong phòng thí nghiệm, đạt độ tinh khiết cần thiết cho các nghiên cứu. 2.1.6. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm: Sử dụng các máy móc và thiết bị thông dụng trong phòng thí nghiệm. 2.1.7. Môi trường nuôi cấy - Môi trường giữ giống và cấy chuyển chi Schizochytrium: ký hiệu GPY bao gồm glucose (2 g/L), polypepton (1 g/L), cao nấm men (0,5 g/L), muối biển nhân tạo (17,5 g/L), agar (15 g/L). - Các chủng tảo thuộc chi Schizochytrium được nuôi trong các bình tam giác 1.000 mL chứa 300 mL môi trường M1, chế độ lắc 200 vòng/phút ở 25-28oC.
6 - Chủng tảo thuộc chi Thraustochytrium được nuôi trên môi trường Bajpai cải tiến, chế độ lắc 200 vòng/ phút ở 25-28oC. - Môi trường nuôi trồng Schizochytrium spp. trong bình lên men 30L gồm Môi trường M12 cho lên men theo mẻ (9% glucose, 1% cao nấm men, muối biển nhân tạo 17,5 g/L); Môi trường sử dụng để nhân giống cấp 1 (CNT1), giống cấp 2 (CNT2), cho lên men theo mẻ (CNT3) có bổ sung cơ chất gồm: Môi trường CNT1 (%): glucose - 3, cao nấm men -0,4, monosodium glutamate- 6,42, NaCl - 1,25, MgSO4 - 0,4, KCl - 0,05, CaCl2 - 0,01, NaHCO3 - 0,05, KH2PO4 - 0,4, hỗn hợp vitamin - 0,14 (vitamin B1 - 45 g/L, vitamin B6 - 45 g/L và vitamin B12 - 0,25 g/L) và vi lượng - 0,8; Môi trường CNT2 (%) gồm: glucose - 8,57, cao nấm men - 0,64, monosodium glutamate - 6,42, NaCl - 2, KH2PO4 - 0,64, MgSO4 - 2,29, CaCl2 - 0,03, NaHCO3 - 0,03, Na2SO4 - 0,03, hỗn hợp vitamin - 0,14, và vi lượng - 0,2; Môi trường CNT3 (%) gồm: glucose- 7,5, cao nấm men - 1,2, monosodium glutamate- 6,42, NaCl - 0,25, KH2PO4- 0,96, MgSO4- 1,2, CaCl2- 0,12, NaHCO3- 0,12, KCl-0,08, hỗn hợp vitamin - 0,4. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Nhóm phương pháp xác định chủng/loài; đặc điểm sinh học; điều kiện nuôi trồng tối ưu của chủng/loài tiềm năng cho sản xuất squalene cao 2.2.1.1. Phương pháp xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào và sinh khối khô: sử dụng buồng đếm Burker - Turk (Đức), sấy sinh khối tảo ở 105oC đến khối lượng không đổi (Dang Diem Hong và cs, 2011) 2.2.1.2. Phương pháp chụp ảnh hình thái: chụp bằng máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY 7.0 của Nhật Bản dưới kính hiển vi quang học Olympus CX21. 2.2.1.3. Phương pháp xác định hàm lượng lipid tổng số trong sinh khối tảo: theo phương pháp của Bligh và Dyer (1959) với một số cải tiến. 2.2.1.4. Phương pháp nhuộm lipid bằng Nile Red (Doan và Obbard, 2010). 2.2.1.5. Phương pháp xác định đường khử bằng DNSA: theo Miller (1959). 2.2.1.6. Phương pháp xác định sơ bộ hàm lượng squalene: định lượng squalene bằng phương pháp so màu (Rothblat và cs, 1962). 2.2.1.7. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu điều kiện nuôi trồng tối ưu của chủng/loài tiềm năng thuộc chi Schizochytrium cho sản xuất squalene cao Cấp độ bình tam giác Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ cao nấm men, nồng độ glucose ban đầu, nồng độ terbinafie (TBNF): sử dụng bình tam giác 250 mL chứa 100 mL môi trường M1, lắc 200 vòng/phút trong 5 ngày để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy (15oC, 20oC, 25oC, 30oC), nồng độ glucose ban đầu (15, 30, 40, 60 và 90 g/L), cao nấm men (0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4%); và TBNF (0, 0,1, 1, 10, 100, 150, 200 µg/mL) trong khi các thành phần khác vẫn giữ nguyên như trong môi trường cơ bản. Nghiên cứu ảnh hưởng của hỗn hợp vitamin (B1, B6, B12): Tảo nuôi trong bình tam giác 250 mL chứa 100 mL môi trường CNT3 có bổ sung 0; 0,2; 0,4; 0,6% hỗn hợp vitamin (vitamin B1- 45 g/L, vitamin B6- 45 g/L và B12- 0,25 g/L). Sau 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 h nuôi, tiến hành thu, đếm mật độ tế bào (MĐTB), xác định sinh khối tươi (SKT), SKK, và squalene. Cấp độ bình lên men 30 L Nghiên cứu ảnh hưởng của glucose: - Giống cấp 1: S. mangrovei PQ6 được nuôi cấy trên môi trường thạch GPY, sau đó được cấy chuyển sang các bình nuôi 1 L có chứa 300 mL môi trường M1, lắc ở 200 v/p, nhiệt độ nuôi 28C trong thời gian 96 h. - 2% giống cấp 1 được bổ sung vào bình lên men 30 L chứa 15 L môi trường M12 với nồng độ glucose thay đổi từ 3, 6, 9, 12, 22%. Sau 24, 48, 72, 96 và 120 h lên men, tiến hành thu mẫu, chụp ảnh hình thái tế bào, đếm MĐTB, xác định SKT, SKK, hàm lượng lipid và squalene. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ: 2% giống cấp 1 được bổ sung vào bình lên men 30 L chứa 15 L môi trường M12 với nguồn nitơ là 1% cao nấm men hoặc kết hợp 1,2% cao nấm men (Y) và 6,42% monosodium glutamate (YM). Sau 24, 48, 72, 96 và 120 h lên men, tiến hành thu, chụp ảnh hình thái tế bào, đếm MĐTB, xác định SKT, SKK, hàm lượng đường dư và squalene. Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch):
7 - Giống cấp 1: Khuẩn lạc S. mangrovei PQ6 được cấy chuyển sang bình nuôi 500 mL có chứa 200 mL môi trường CNT1, nuôi lắc ở 28oC, 200 v/p trong 24 h. - Giống cấp 2: 1% giống cấp 1 được bổ sung vào bình tam giác 2 L có chứa 1 L môi trường CNT2, nuôi lắc ở 28oC, 200 v/p trong 24 h. - 2% giống cấp 2 được bổ sung vào bình lên men 30 L có chứa 15 L môi trường CNT3. Tại thời điểm 48 h, bổ sung glucose đến nồng độ 22%. Sau 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 và 108 h, thu mẫu, đếm MĐTB, xác định SKT, SKK, hàm lượng đường dư và squalene. Nghiên cứu ảnh hưởng của vitamin trong lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất - Giống cấp 1: Khuẩn lạc S. mangrovei PQ6 được cấy chuyển sang bình nuôi 500 mL có chứa 200 mL môi trường CNT1, nuôi lắc ở 28oC, 200 v/p trong 24 h. - Giống cấp 2: 1% giống cấp 1 được bổ sung vào bình tam giác 2 L có chứa 1 L môi trường CNT2, có hoặc không có bổ sung 0,14% hỗn hợp vitamin, nuôi lắc ở 28oC, 200 v/p trong 24 h. - 2% giống cấp 2 được bổ sung vào bình lên men 30 L có chứa 15 L môi trường CNT3 có hoặc không có bổ sung 0,4% hỗn hợp vitamin. Sau 12, 24, 36, 48 h xác định hàm lượng đường dư trong môi trường nuôi. Khi hàm lượng đường dư nhỏ hơn 2% thì bổ sung glucose để đạt nồng độ 22%. Sau khi bổ sung glucose 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, và 108 h tiến hành thu mẫu, đếm MĐTB, xác định SKT, SKK, hàm lượng đường dư và squalene. 2.2.2. Nhóm phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch squalene từ S. mangrovei PQ6 2.2.2.1. Phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch lượng nhỏ squalene từ sinh khối S. mangrovei PQ6 - Phương pháp tách chiết lipid không xà phòng hóa (KXPH) từ lipid tổng số: theo phương pháp của Lewis và cs (2001). Lipid KXPH được sử dụng để chạy sắc ký lớp mỏng (TLC). - Tối ưu điều kiện tách chiết lipid tổng số từ sinh khối S. mangrovei PQ6: nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi khác nhau (n-hexane, chloroform, petroleum ether; nhiệt độ (0, 30, 50 và 80C); thời gian phản ứng (1, 3, 4, 5 giờ); điều kiện khuấy trộn (không khuấy trộn, khuấy trộn liên tục, gián đoạn); số lần chiết (1, 2, 3 lần); tỷ lệ sinh khối/dung môi (1:8, 1:10, 1:12), nhiệt độ sấy sinh khối (60, 70, 80, 90C) và độ ẩm sinh khối 3, 30, 50, 80%). - Tối ưu điều kiện tách chiết lipid KXPH từ lipid tổng số: nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp dung môi n- hexane: chloroform là 1:1; 2:1; 3:1; 4:1 và 5:1 trong khi các bước còn lại trong quy trình vẫn được giữ nguyên. - Tách chiết, tinh sạch và làm giàu squalene bằng phương pháp dung môi như mô tả trong báo cáo của Choo và cộng sự (2005). 2.2.2.2. Phương pháp xây dựng quy trình tách chiết và làm sạch squalene ở quy mô pilot từ sinh khối tảo S. mangrovei PQ6 - Tách chiết squalene thô từ sinh khối tế bào theo phương pháp của Lu và cộng sự (2003). Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi (ethanol và methanol), độ ẩm sinh khối (20% đến 100%) lên tách chiết và hàm lượng squalene. - Tách chiết squalene thô từ dịch tế bào theo công bố của Pora và cộng sự (2015), tinh sạch squalene thô bằng sắc ký cột. 2.2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của squalene bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) (Định Thị Ngọc và cs., 2013) 2.2.2.4. Phương pháp xác định cấu trúc của squalene: bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) sử dụng máy Bruker Avance-500 MHz spectrometer (Poucher và cộng sự, 1993). 2.2.3. Nhóm phương pháp xác định các chỉ tiêu chất lượng của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 Phương pháp xác định chỉ tiêu cảm quan theo TCVN 2627-1993 Phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lý: độ ẩm theo TCVN 6120:2007; trị số acid, xà phòng hóa, peroxyt, Iod theo TCVN 6127:2010; TCVN 6126:2007; TCVN 6121:2010 và TCVN 6122: 2010, tương ứng. Phương pháp xác định chỉ tiêu vi sinh vật Phương pháp xác định chỉ tiêu kim loại 2.2.4. Nhóm phương pháp đánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên động vật thực nghiệm (in vivo) và mô hình tế bào (in vitro) 2.2.4.1. Nhóm phương pháp đánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vivo
8 - Nghiên cứu độc tính cấp của squalene theo phương pháp của Litchfield - Wincoxon (Đỗ Trung Đàm, 2014), quy định của Bộ Y tế Việt Nam (2018), hướng dẫn của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD) (2002) và Tổ chức Y tế thế giới (2000). - Đánh giá độc tính bán trường diễn: qui định của Bộ Y tế Việt Nam (2018), hướng dẫn của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD) (2000) và Tổ chức Y tế thế giới (2000). - Tác dụng làm tăng HDL-C của squalene trên chuột nhắt trắng được tiến hành đánh giá theo phương pháp được mô tả bởi Clara Gaba´s-Rivera và cộng sự (Đỗ Trung Đàm, 2006). 2.2.4.2. Nhóm phương pháp đánh giá bước đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vitro - Tế bào HepG2 và RAW264.7 được nuôi cấy trên môi trường DMEM/high glucose có chứa 10% FBS, 100 U/mL penicillin, và 0,1 mg/mL streptomycin trong tủ nuôi cấy vô trùng ở 37C, 5% CO2. - Độc tính của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên tế bào HepG2 được phân tích theo phương pháp MTT. - Nhuộm lipid bằng Oil red O (ORO) theo phương pháp của Hoang và cộng sự (2012). - Tách chiết lipid nội bào. - Hàm lượng cholesterol và triglyceride nội bào được xác định bằng phương pháp enzyme - Tách chiết RNA tổng số (theo kit RNAiso PlusTakara - Tokyo, Nhật Bản), tổng hợp cDNA (theo kit RevertAid First Strand cDNA - Thermo Fisher, Scientific Ins., Singapore). Các cDNA sau đó được sử dụng như khuôn mẫu cho phản ứng qPCR. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase được sử dụng để chuẩn hóa số liệu. 2.2.5. Thống kê phân tích số liệu Số liệu được trình bày bằng số trung bình ± sai số chuẩn. Sự sai khác được coi là có ý nghĩa thống kê ở mức P
9 glucose sau 6 và 5 ngày nuôi tương ứng là (51,02 ± 1,54% SKK), (62,89 ± 2,59) mg/g SKK và (640,94 ±10,04) mg/L. Khi chủng này được nuôi trồng trong bình tam giác ở điều kiện tối ưu, hàm lượng squalene chiếm 6,3% SKK đã được xác định bằng phương pháp TLC và HPLC. Giá trị này cao hơn hàng trăm lần so với các chủng thraustochytrids đã được thông báo trước đây (0,002-0,150% SKK) (Jiang và cs, 2004; Li và cs, 2009; Chen và cs, 2010; Lewis và cs, 2001; Fan và cs, 2010). 3.2.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ terbinafine lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác TBNF là một chất ức chế enzyme squalene monooxygenase trong con đường sinh tổng hợp sterol. Enzyme này có vai trò xúc tác quá trình oxy hóa squalene thành 2,3 oxidosqualene trong sự có mặt của phân tử ôxy và NADH (Ono 2002; Ryder và cs, 1992). Việc bổ sung TBNF từ 0,1 lên 200 µg/mL vào môi trường làm giảm đáng kể MĐTB và lượng SKK sau 5 ngày nuôi. Tuy nhiên, hàm lượng lipid và squalene lại tăng lên đáng kể. Hàm lượng squalene thay đổi không đáng kể khi tăng nồng độ TBNF lên 10 lần (0,1-1 µg/mL). Khi tăng nồng độ TBNF lên 1000 lần (100 g/mL), hàm lượng squalene đạt cực đại (97,34 ± 1,97) mg/g SKK sau 5 ngày nuôi. 3.2.1.5. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp vitamin lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác Nghiên cứu của Pora và cộng sự (2014) cho thấy các vitamin như B1, B6 và B12 có tác dụng làm tăng sản xuất squalene trong nuôi cấy tảo Schizochytrium. Khi nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp các vitamin này với nồng độ 0- 0,6% lên quá trình tổng hợp squalene của chủng PQ6 đã cho thấy, sinh trưởng và hàm lượng squalene của chủng này đạt cao nhất khi bổ sung tổ hợp vitamin ở nồng độ 0,4 và 0,6%. Do không có sự khác biệt đáng kể giữa 2 nồng độ này, nên nồng độ 0,4% được lựa chọn cho các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo. Sau 6 ngày nuôi cấy, SKK và hàm lượng squalene của chủng PQ6 đạt được cao nhất khi bổ sung 0,4% tổ hợp vitamin tương ứng là (39,98 ± 0,35) g/L và (76, 16 ± 2,34) mg/g SKK (tăng 34,43% so với đối chứng không bổ sung vitamin). 3.2.2. Tối ưu điều kiện nuôi trồng chủng S. mangrovei PQ6 ở bình lên men 30 lít để thu sinh khối tảo giàu squalene 3.2.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 nuôi trồng theo mẻ trong hệ thống bình lên men 30 L Nồng độ glucose ban đầu có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và khả năng tích lũy squalene của loài A. mangrovei (tên trước đây là S. mangrovei) đã được chứng minh trong các nghiên cứu của Fan và cs (2010), Nakazawa và cộng sự (2012). Kết quả đạt được khi nuôi chủng PQ6 ở bình lên men 30 L với nồng độ glucose từ 3- 22% đã cho thấy MĐTB, SKK và sản lượng squalene của chủng PQ6 tăng mạnh khi nồng độ glucose tăng từ 3 đến 9%. Với nồng độ glucose ban đầu là 9% cho lượng SKK và lượng squalene đạt giá trị cao nhất. Lượng SKK và squalene đạt giá trị cực đại tương ứng là (35,5 ± 0,1) g/L và (1,1 ± 0,1) g/L. Kích thước tế bào đồng đều ở nồng độ 6% - 9% glucose và lớn hơn so với nồng độ cao là 12% và 22% glucose. Do vậy, nồng độ glucose ban đầu là 9% được lựa chọn để nuôi trồng chủng PQ6 bằng hệ thống lên men 30 L theo mẻ. 3.2.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 nuôi trồng theo mẻ trong hệ thống lên men 30 L Khi kết hợp cả hai nguồn nitơ là cao nấm men và monosodium glutamate, MĐTB, SKK và sản lượng squalene đạt cực đại, tương ứng là (3,3 x 108) tế bào/mL, 46,7 g/L và 1,6 g/L sau 72 h nuôi cấy. Hàm lượng squalene không có sự thay đổi đáng kể khi sử dụng nguồn nitơ là cao nấm men hoặc kết hợp cả cao nấm men và monosodium glutamate. Tuy nhiên, khi kết hợp hai nguồn nitơ nói trên thì sản lượng squalene đạt giá trị cao nhất sau 72 h (1605,5 mg/L), trong khi đó sử dụng cao nấm men chỉ đạt 1195,2 mg/L. Điều này có thể là do tăng lượng sinh khối trong môi trường khi kết hợp cả hai nguồn nitơ. Vì vậy, nguồn nitơ trong thí nghiệm của chúng tôi chỉ có tác dụng làm tăng tốc độ sinh trưởng của tảo dẫn đến tăng sản lượng squalene chứ không làm tăng sự tích lũy squalene. Điều này cũng tương tự như mô tả của Chen và cộng sự (2010). 3.2.2.3. Ảnh hưởng của lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 Pora và cộng sự (2014) đã thông báo hàm lượng squalene của một số loài thraustochytrid có thể tăng từ 5- 10 lần khi nuôi cấy theo mẻ có bổ sung cơ chất là glucose lên tới 22% (fed-batch). Đối với chủng PQ6, nuôi theo kiểu fed-batch cũng làm tăng sinh trưởng và tích lũy squalene. MĐTB và SKK đạt cực đại tại thời điểm 108 h sau khi bổ sung glucose (392,53 ± 1,91) × 106 TB/mL và (100,41 ± 1,43) g/L, tương ứng. Sản lượng squalene cao nhất đạt được là (4592,53 ± 0,3) mg/L ở 84 h, tăng 2-3 lần so với lên men theo mẻ. 3.2.2.4. Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6
10 Việc bổ sung 0,4% tổ hợp vitamin vào môi trường nuôi cũng đã làm tăng sinh khối và hàm lượng squalene của chủng PQ6 khi nuôi theo kiểu fed-batch. SKK cao nhất đạt (105,25 ± 0,75) g/L sau 96 h. Hàm lượng và sản lượng squalene đạt cực đại tương ứng là (91,53  2,45) mg/g SKK và (6928,6  14,6) mg/L sau 48 h, cao gấp 2-3 lần so với kiểu fed-batch không bổ sung vitamin và cao gấp 4-6 lần so với lên men theo mẻ. Sản lượng squalene của chủng PQ6 đạt được cao hơn so với các chủng Schizochytrium sp., Schizochytrium sp. ATCC 20888 và Aurantiochytrium sp. ATCC PRA 276 trong nghiên cứu của Pora và cộng sự (2014). Nile Red là thuốc nhuộm huỳnh quang được sử dụng để phát hiện các hạt lipid trung tính trong tế bào nhân sơ và tế bào nhân chuẩn (Cooksey và cs, 1987). Vì squalene nằm trong phần lipid không xà phòng hóa nên có thể quan sát định tính sự tích lũy squalene thông qua nhuộm Nile Red (Hình 3.13). Hình 3.13. Hình thái tế bào chủng PQ6 ở các giai đoạn nuôi cấy của quá trình lên men fed-batch. A- Trước thời điểm bổ sung glucose; B- Sau khi bổ sung glucose lên 22%. (a) Kính hiển vi quang học; (b) Nile red; (c) Kính hiển vi điện tử truyền qua. L- thể lipid; Mi- ty thể; N- nhân; V- không bào. Thanh kích thước: a-b=10 m; c=2 m 3.3. Xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene từ S. mangrovei PQ6 3.3.1. Tối ưu điều kiện tách chiết và tinh sạch lượng nhỏ squalene từ S. mangrovei PQ6 3.3.1.1. Tách chiết lipid tổng số từ sinh khối S. mangrovei PQ6 Các điều kiện thích hợp cho quá trình tách chiết lipid tổng số của S. mangrovei PQ6 là sinh khối ban đầu sấy ở 80oC đến độ ẩm 3%, sử dụng dung môi n-hexane, nhiệt độ tách chiết 70-75oC, khuấy liên tục trong thời gian 4 giờ, chiết 1 lần với tỷ lệ sinh khối: dung môi là 1:8 (w/v). 3.3.1.2. Tách chiết lipid không xà phòng hóa- lipid KXPH từ lipid tổng số Trong các tỷ lệ khảo sát của tỷ lệ hỗn hợp dung môi n-hexane: chloroform là 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 và 5:1, hàm lượng squalene trong lipid KXPH ở tỷ lệ 2:1 đạt cao nhất là (8,1 ± 0,14)%. 3.3.1.3. Tinh sạch và định lượng squalene bằng sắc ký mỏng và sắc kỷ lỏng cao áp Kết quả chỉ ra trên Hình 3.15 A cho thấy mẫu lipid KXPH tách chiết từ chủng PQ6 xuất hiện băng tương đồng với squalene chuẩn. Định lượng bằng HPLC, hàm lượng squalene khoảng (50,10 ± 0,03) mg/g SKK. Squalene tách chiết được có độ tinh sạch cao (98,6%) (Hình 3.15 B). Hàm lượng squalene thu được bằng phương pháp này cao hơn Aurantiochytrium limacinum 9F-4a (0,6 mg/g SKK), 4W-1b (0,5 mg/g SKK), Schizochytrium limacinum SR21 (0,2 mg/g) nhưng lại thấp hơn A. limacinum SR21 (171,1 mg/g SKK) (Nakazawa và cộng sự (2012). A B Hình 3.15. Sắc ký lớp mỏng mẫu lipid không xà phòng hóa (A) và sắc kí đồ squalene tinh sạch từ sinh khối chủng PQ6 (B) (A: giếng 1: squalene chuẩn - 2 mg; giếng 2, 3, 4, 5, 6, 7: lipid KXPH tách từ sinh khối chủng PQ6)
11 3.3.1.4. Tách chiết, tinh sạch và làm giàu squalene bằng phương pháp dung môi Do hàm lượng squalene thu được sau khi sử dụng phương pháp TLC và HPLC thấp nên đã tiến hành làm giàu squalene theo mô tả của Choo và cộng sự (2005) bằng phương pháp dung môi. Hàm lượng squalene đã tăng 1,7 lần (từ 61,76 ± 0,12 lên 104,99 ± 0,34 mg/g SKK). Squalene thu được có độ tinh sạch cao (>98%) và qua phân tích cấu trúc bằng bằng 1H NMR 1H (500 MHz, CDCl3) có thể khẳng định chất tách chiết được là squalene. 3.3.2. Xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene ở quy mô pilot từ S. mangrovei PQ6 3.3.2.1. Ảnh hưởng của các tác nhân lên hiệu quả tách chiết squalene từ sinh khối S. mangrovei PQ6 Ảnh hưởng của dung môi: Hỗn hợp KOH/ ethanol cho kết quả tốt nhất với hàm lượng squalene thô đạt (123 ± 11) mg/g SKK, trong đó hàm lượng squalene thực tế là (0,32 ± 0,04) mg/mg squalene thô. Ảnh hưởng của độ ẩm sinh khối: độ ẩm của sinh khối không ảnh hưởng đến hàm lượng squalene tách chiết. Hàm lượng squalene thô và thực tế tách chiết được từ sinh khối có độ ẩm 20 và 100% tương ứng là (128 ± 31) mg/g SKK và (0,30 ± 0,02) mg/mg squalene thô; (126 ± 14) mg/g SKK và (0,32 ± 0,03) mg/mg squalene thô. 3.3.2.2. Tách chiết squalene từ dịch tế bào chủng S. mangrovei PQ6 sau quá trình nuôi cấy lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất Môi trường kiềm và nhiệt độ cao có thể phá vỡ màng tế bào các loài thuộc chi thraustochytrids (Pora và cs, 2014). Dịch tế bào chủng PQ6 có mật độ tương đương với 250-300 g/L được chỉnh pH đến 10 bằng KOH 45%, được khuấy ở 60oC, 150 vòng/phút trong 6 h. Kết quả thu được cho thấy, không có sự khác biệt đáng kể về hàm lượng squalene khi tách chiết từ dịch lên men ((0,29 ± 0,02) mg/mg squalene thô) và từ sinh khối khô ((0,28 ± 0,03) mg/mg squalene thô). Vì vậy, để hướng tới việc sản xuất squalene theo quy mô công nghiệp, phương pháp tách chiết squalene trực tiếp từ dịch chiết lên men đã được lựa chọn. 3.3.2.3. Điều kiện tinh chế squalene bằng phương pháp pháp sắc ký cột Các phân đoạn squalene thu được sau khi qua cột sắc ký với hệ dung môi rửa giải n-hexane, squalene thu được sau khi qua cột có độ tinh sạch cao (chiếm 90-95% khi so sánh phần trăm diện tích peak). Bên cạnh đó, hiệu suất thu hồi đạt khoảng 50-60%. Kết quả nghiên cứu của Watanabe và cộng sự (2013) cũng cho thấy n-hexane đã cho phép thu squalene có độ tinh sạch cao và hiệu suất thu hồi có thể đạt tới 70-80%. Do vậy, dung môi rửa giải cho sắc ký cột để tinh chế squalene là n-hexane đã được lựa chọn. 3.3.2.4. Xây dựng quy trình tách chiết và làm sạch nguyên liệu squalene từ sinh khối tảo S. mangrovei PQ6 Hình 3.26. Quy trình tách chiết squalene từ S. mangrovei PQ6 Dựa vào các nghiên cứu tách chiết và tinh chế squalene có tính ổn định và lặp lại cao, quy trình tách chiết và làm sạch nguyên liệu squalene từ dịch lên men sau quá trình lên men có bổ sung cơ chất của chủng PQ6 đã được xây dựng (Hình 3.26). Sử dụng quy trình này, đã tách chiết được squalene tinh khiết ở dạng dịch lỏng không màu, không mùi với độ tinh sạch đạt 90-95%. 3.3.3. Tách chiết và tinh chế lượng lớn squalene từ S. mangrovei PQ6 Với quy trình đã xây dựng ở trên (Hình 3.26), từ 46 L dịch lên men (khoảng (3,9 ± 0,1) kg SKK) đã tách chiết được (1,08 ± 0,29) kg squalene thô, tinh chế được khoảng 131 mL squalene tinh khiết ở dạng dịch lỏng không
12 màu, không mùi, có hàm lượng squalene là (305,23 ± 2,34) g (Hình 3.27). Kết quả phân tích sắc ký HPLC cho thấy squalene thu được có độ tinh sạch cao (chiếm từ 90-95%; Hình 3.28) và không bị tạp nhiễm. Phân tích phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3), phân tích khối phổ 13C NMR (125 MHz, 140 CDCl3) (Hình 3.29) và so sánh với squalene chuẩn (Pouchert và Behnke, 1993), có thể khẳng định đã tách được squalene từ VTBDD S. mangrovei PQ6. 3.3.4. Phân tích các chỉ tiêu về cảm quan, hóa lý, vi sinh vật và kim loại của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 Kết quả phân tích chất lượng squalene tách chiết được tại Trung tâm Chứng nhận phù hợp (Quacert), Trung tâm Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng, Bộ KH và CN đã cho thấy squalene đạt yêu cầu chất lượng để làm nguyên liệu cho định hướng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm: dạng lỏng, không màu, không mùi; chỉ số acid- 0,524 mgKOH/g; chỉ số peroxyt- 4,2 Meq O2/kg, không có chứa dư lượng urê, các chỉ tiêu về kim loại nặng đều nằm trong giới hạn cho phép. B Hình 3.27. Ảnh minh họa sản A phẩm squalene thô (A), squalene tinh sạch và hỗn hợp acid béo (B) tách từ dịch lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất từ sinh khối tảo chủng PQ6 Hình 3.28. Sắc ký đồ HPLC của squalene Hình 3.29. Phổ 1H (A) và 13C (B) chuẩn (A) và squalene (B) tinh sạch từ NMR của squalene tinh sạch từ sinh khối S. mangrovei PQ6 sinh khối S. mangrovei PQ6 3.4. Tính an toàn và tác dụng dược lý của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình động vật thực nghiệm (in vivo) và mô hình tế bào (in vitro) 3.4.1. Độc tính cấp của squalene trên mô hình động vật thực nghiệm Chưa xác định được LD50 của squalene theo đường uống trên chuột nhắt trắng với mức liều cao nhất là 50 mL/kg KLCT (tương đương 58,25 g/kg KLCT) sau 178 h. Kết quả thu được của chúng tôi cũng hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của CTFA (1971) là không xác định được ảnh hưởng gây độc và gây chết trên chuột được cho uống squalene với liều cao nhất là 50 mL/kg thể trọng trong vòng 7 ngày. Do đó, squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 là không độc. 3.4.2. Độc tính bán trường diễn của squalene trên mô hình động vật thực nghiệm 3.4.2.1. Ảnh hưởng của squalene lên tình trạng chung và sự thay đổi thể trọng của chuột cống trắng khi dùng dài ngày
13 Squalene với các mức liều 400 mg/kg KLCT/24 h và 1.200 mg/kg KLCT/24 h chưa thấy gây ra các thay đổi lên sự phát triển thể trọng của chuột, chuột hoạt động bình thường, lông mượt, da niêm mạc và ăn uống bình thường, phân thành khuôn sau 30 và 60 ngày thí nghiệm. 3.4.2.2. Ảnh hưởng của squalene đối với một số chỉ tiêu huyết học và sinh hóa của chuột Squalene với các mức liều 400 mg/kg KLCT/24 h và 1.200 mg/kg KLCT/24 h không làm thay đổi các chỉ tiêu huyết học và sinh hóa máu sau 30 ngày và 60 ngày nghiên cứu. Tuy nhiên, tại thời điểm sau 60 ngày, chỉ số HDL-C tăng cao hơn so với thời điểm ban đầu. 3.4.2.3. Đánh giá mức độ tổn thương chức năng gan, thận chuột khi dùng squalene dài ngày Sau 60 ngày cho chuột uống liên tục squalene ở liều 1.200 mg/kg KLCT/ngày không làm thay đổi hoạt độ các enzyme AST và ALT, các chỉ số bilirubin toàn phần, albumin huyết tương và cholesterol toàn phần, không gây tổn thương tế bào gan và không ảnh hưởng đến chức năng gan, không ảnh hưởng lên chức năng thận của chuột trong nghiên cứu. Kết quả giải phẫu mô bệnh gan, thận, lách cũng cho thấy không xuất hiện bất cứ tổn thương nào ở các cơ quan này ở chuột được uống với liều 400 và 1.200 mg/kg KLCT/ngày sau 60 ngày dùng liên tục. 3.4.3. Tác dụng dược lý của squalene trên chuột nhắt trắng thí nghiệm Để làm rõ hơn tác dụng của squalene khi làm tăng chỉ số HDL-C trong máu chuột, khối lượng cơ thể, cân nặng gan, và các chỉ số lipid máu chuột nhắt trắng thí nghiệm đã được đánh giá. Với liều 600 mg/kg/ngày và liều 1.200 mg/kg/ngày, uống liên tục trong 60 ngày, squalene có tác dụng làm tăng hàm HDL-C và tỷ lệ HDL- C/cholesterol toàn phần trong máu, làm giảm hàm lượng LDL-C và VLDL-C trong máu và không ảnh hưởng đến các chỉ số cholesterol toàn phần và TG máu, cân nặng gan và sự phát triển cân nặng cơ thể. Kết quả thu được tương tự với các nghiên cứu của Pallavi và cộng sự (2013), Gabas-Rivena và cộng sự (2014). 3.5. Bước đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vitro 3.5.1. Đánh giá độc tính của squalene trên các dòng tế bào Kết quả đánh giá độc tính của squalene trên 2 dòng tế bào HepG2 và RAW264.7 đã cho thấy squalene không gây độc ở tất cả các nồng độ thử nghiệm. Khoảng 95 đến 100% tế bào vẫn sinh trưởng bình thường sau khi bổ sung squalene trong 72 h. 3.5.2. Tác dụng giảm lipid của squalene lên tế bào gan và tế bào đại thụ thể 3.5.2.1. Tối ưu hóa thời gian và nồng độ ủ squalene lên sự thay đổi hàm lượng lipid trong tế bào gan HepG2 Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của thời gian ủ và nồng độ squalene lên sự thay đổi nồng độ lipid trên dòng tế bào HepG2 bị rối loạn chuyển hóa đã cho thấy, hàm lượng TG trong tế bào HepG2 được ủ với acid oleic (OA) và acid palmitic (PA) đều tăng 85% so với đối chứng không được ủ với acid. Sau 72 h ủ với squalene ở các nồng độ 20, 50 và 100 M, sự tích lũy lipid nội bào của HepG2 giảm 20% so với đối chứng. Do đó, nồng độ 50 và 100 M squalene được sử dụng để xử lý tế bào trong các thí nghiệm tiếp theo trong thời gian 72 h. 3.5.2.2. Tác dụng của squalene lên sự thay đổi hàm lượng lipid nội bào trong tế bào gan HepG2 và RAW64.7 Ủ tế bào HepG2 với 100 M squalene đã làm giảm cholesterol và trigyceride từ 100% trong tế bào đối chứng xuống tương ứng 80% (P < 0,05) và 65% (P
14 tác dụng giảm cholesterol và tăng HDL-C của squalene có thể là do squalene điều hòa biểu hiện các gen tham gia vào quá trình vận chuyển và thoái hóa cholesterol như LDL-R, CYP7A1, thụ thể LXR và các gen đích của thụ thể LXR. 3.5.4. Tác dụng giảm triglyceride của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 Hình 3.39. Sơ đồ tóm tắt bước đầu nghiên cứu cơ chế phân tử tác dụng giảm cholesterol và tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 Ghi chú: LDL-R: The low - Density Lipoprotein Reccetor; CYP7A1: cholesterol 7a- hydroxylase; LXR: liver X receptor; ABC: ATP-binding cassette transporter member 1; ApoE : apoliprotein; Insig-2a: insulin induced gene 2-a; SREBP-1c: sterol regulatory element-binding protein 1c; FAS: Fatty acid synthase; FATP4: fatty acid transport protein 4; SCD-1: stearoyl-Coenzyme A desaturase 1; CPT-1: Carnitine palmitoyltransferase ; ACOX: acyl-CoA oxidase; LPL: lipoprotein lipase; MCAD: medium-chain acyl CoA dehydrogenase; HMGCS2- hydroxymethylglutaryl CoA synthase 2 Hàm lượng TG nội bào tăng từ 51 g/mg protein ở đối chứng lên gần 70 g/mg protein trong tế bào HepG2 được ủ với T0901317. Ngược lại, tế bào được ủ với 100 µM squalene đã làm giảm nồng độ TG xuống 17% so với đối chứng. Kết quả nhuộm ORO cũng cho kết quả tương tự. Như vậy, không giống như các chất kích hoạt thụ thể LXR bằng phương pháp tổng hợp hóa học, squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 có thể kích hoạt một cách chọn lọc các gen đích của LXR mà không gây ra sự tổng hợp lipid trong tế bào gan. Từ kết quả trên, sơ đồ cơ chế tác dụng giảm cholesterol và tác dụng giảm triglycerid của squalene đã được đưa ra (Hình 3.39). KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Lựa chọn được chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong số 32 chủng Schizochytrium spp. và 8 chủng Thraustochytrium spp. từ Bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ Sinh học có khả năng tổng hợp squalene cao nhất (đạt 102,01 mg/g sinh khối khô). 2. Điều kiện thích hợp cho sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 khi nuôi ở bình tam giác là 28oC, nồng độ glucose 3%, cao nấm men 1% và bổ sung tebinafine với nồng độ 100 g/mL.
15 3. Điều kiện thích hợp cho sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 khi nuôi ở bình lên men 30 lít tự tạo là lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất; môi trường nuôi cấy được bổ sung 0,4% hỗn hợp vitamin (vitamin B1 - 45 g/L, vitamin B6 - 45 g/L và vitamin B12 - 0,25 g/L) với nguồn nitơ là 1,2% cao nấm men và 6,42% monosodium glutamate; thời gian tối ưu để bổ sung glucose là tại thời điểm 36 giờ và tiến hành thu sinh khối tảo sau 48 giờ bổ sung glucose, mật độ tế bào tảo đạt (369,35 ±7,94) x 106 tế bào/mL; sinh khối khô đạt (75,41± 1,35) g/L, hàm lượng squalene đạt (93,53 ± 2,45) mg/g sinh khối khô và sản lượng squalene đạt (6928,6± 14,6) mg/L. 4. Đã xây dựng được quy trình tách chiết và tinh sạch squalene ở quy mô nhỏ và quy mô pilot từ sinh khối chủng S. mangrovei PQ6. Từ 46 L dịch lên men (tương đương 3,9 ± 0,1 kg sinh khối khô), squalene tinh khiết có hàm lượng (305,23±2,34)g với độ tinh sạch đạt 90-95%, đảm bảo yêu cầu chất lượng theo định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm. 5. Những thử nghiệm độc tính cấp và bán trường diễn trên mô hình động vật thực nghiệm cho thấy squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 là không độc. Sau 60 ngày sử dụng liên tục, chuột đuợc uống squalene với liều 400 và 1.200 mg/kg khối lượng cơ thể chuột/ngày đảm bảo an toàn, không làm thay đổi các chỉ tiêu huyết học, sinh hoá, không gây tổn thương tế bào và chức năng gan, thận và lách của chuột thực nghiệm so với công thức đối chứng. 6. Trên mô hình in vivo và in vitro đã cho thấy squalene có tác dụng tăng lipoprotein có tỷ trọng cao gắn với cholesterol và tỷ lệ HDL-cholesterol/cholesterol toàn phần trong máu; có tác dụng giảm cholesterol và tryglyceride nội bào, làm giảm cholesterol gắn với lipoprotein tỷ trọng thấp và rất thấp trong máu mà không gây ảnh hưởng đến sự phát triển cân nặng cơ thể và gan, cholesterol toàn phần và tryglyceride máu. Trên mô hình tế bào, bước đầu đã xác định được cơ chế tác dụng giảm cholesterol của squalene là điều hòa biểu hiện của các gen mã hóa cho protein, enzyme tham gia vào quá trình vận chuyển (như thụ thể LDL- low density lipoprotein - receptor, LDL-R; thụ thể trong gan - Liver - X receptor, LXRs) và thoái hóa cholesterol (CYP7A1- enzyme cholesterol 7 alpha - hydroxylase). Ngoài ra, squalene có tác dụng giảm tryglyceride trong máu. KIẾN NGHỊ 1. Cần tiếp tục nghiên cứu về cơ chế tác dụng giảm cholesterol và tryglyceride của squalene là do tăng cường mức độ biểu hiện của gen mã hóa cho protein Insig-2a dẫn đến ức chế quá trình vận chuyển SREBP-1c vào trong nhân tế bào. 2. Nghiên cứu mức độ biểu hiện của các gen tham gia vào quá trình hấp thu acid béo trong tế bào gan, giảm điều hòa biểu hiện các gen tham gia vào quá trình tổng hợp tryglyceride, tăng điều hòa biểu hiện các gen tham gia vào quá trình beta-ôxy hóa và hấp thu acid béo, quá trình ketosis và vận chuyển ngược cholesterol thông qua việc kích hoạt thụ thể PPARα. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách bài bản, có hệ thống về: sàng lọc; nuôi trồng chủng tiềm năng Schizochytrium mangrovei PQ6 có hàm lượng squalene cao (sản lượng squalene đạt được sau quá trình lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất là 6,9 g/L); lựa chọn được điều kiện thích hợp cho tách chiết, làm sạch squalene từ chủng PQ6 có độ tinh sạch đạt 90-95%; squalene tách chiết được là an toàn, có tác dụng làm giảm cholesterol tổng số và làm tăng hàm lượng lipoptrotein có tỷ trọng cao gắn với cholesterol ở mô hình động vật thực nghiệm, định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm. - Lần đầu tiên ở Việt Nam đã chứng minh được squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 có tác dụng giảm cholesterol do tăng điều hòa biểu hiện của các gen tham gia vào quá trình hấp thu, vận chuyển, lưu thông cholesterol từ các mô ngoại biên đến tế bào gan; bước đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm triglyceride của squalene.