Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) ở Việt Nam và đặc tính sinh học của hoạt chất từ chủng Streptomyces cavourensis YBQ59

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

70
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm đánh giá được sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) thu thập tại miền Bắc Việt Nam và tinh sạch được một số cấu trúc hóa học có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư và các gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces cavourensis YBQ59.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) ở Việt Nam và đặc tính sinh học của hoạt chất từ chủng Streptomyces cavourensis YBQ59

viÖn hµn l©m khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam viÖn c«ng nghÖ sinh häc VŨ THỊ HẠNH NGUYÊN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG, KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY QUẾ (Cinnamomum cassia Presl) Ở VIỆT NAM VÀ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA HOẠT CHẤT TỪ CHỦNG Streptomyces cavourensis YBQ59 Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 9 42 01 07 tãm t¾t luËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc hµ néi - 2019
Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Phí Quyết Tiến Viện Công nghệ sinh học 2. PGS. TS. Chu Kỳ Sơn Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án phiên chính thức tại Viện Công nghệ sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2019. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Viện Công nghệ sinh học - Trang web của Bộ GD&ĐT
1 MỞ ĐẦU Một trong những thành tựu của y học hiện đại là phát triển các chất kháng sinh và kháng vi sinh vật (VSV). Cho đến nay, sử dụng kháng sinh là phương thức quan trọng trong điều trị các bệnh truyền nhiễm do VSV gây ra. Tuy nhiên việc lạm dụng thuốc kháng sinh đã trở thành yếu tố chính dẫn tới xuất hiện các chủng VSV gây bệnh kháng đa thuốc (Singh, 2012). Theo Demain và Sanchez (2009), VSV đã và đang thay đổi tính kháng với các thuốc kháng sinh hiện đang sử dụng trong điều trị nhờ xuất hiện các đột biến mới hoặc thay đổi thông tin di truyền. Vì vậy, hướng nghiên cứu và phát triển các tác nhân kháng khuẩn mới là ưu tiên của nhiều nhà khoa học và các công ty dược phẩm trên thế giới (Alekshun, 2007). Theo Bérdy (2012), khoảng 70% chất kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng trong lâm sàng được sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn. Trong số 33.500 hợp chất hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ VSV, xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces đóng vai trò quan trọng và cho thấy đã sinh tổng hợp 10.400 hợp chất. Vì vậy, sự đa dạng của xạ khuẩn trong tự nhiên nói chung và XKNS nói riêng rất phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác và ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn trong nhiều lĩnh vực của đời sống. Ngoài ra, nhiều chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn được sinh tổng hợp bởi các enzyme polyketide synthase (PKS) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) nên việc nghiên cứu những gen pks, nrps liên quan đến quá trình trao đổi chất thứ cấp rất hữu ích trong việc đánh giá tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng sinh (CKS) từ xạ khuẩn (Ayuso và cs., 2005). Cho đến nay, rất ít nghiên cứu về tài nguyên XKNS trên cây dược liệu Việt Nam được công bố và cần được nghiên cứu nhằm bảo tồn, lưu giữ và khai thác nguồn gen VSV bản địa. Trong y học cổ truyền Việt Nam tinh dầu của cây quế (Cinnamomum sp.) đã được chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm và chống ung thư (Singh và cs., 1995; Tariq và cs., 2006) nhưng các nghiên cứu về XKNS trên cây quế chưa được công bố nhiều. Trong nghiên cứu này, các XKNS được phân lập trên các môi trường chọn lọc và đa dạng sinh học của XKNS được đánh giá qua đặc điểm sinh học, phân bố, khả năng sinh kháng sinh và đặc điểm di truyền. Các chủng XKNS có hoạt tính kháng VSV kiểm định, ức chế phát triển tế bào ung thư phổi, mang các gen chức năng pks-I, pks-II, nrps được sàng lọc. Từ đó, nghiên cứu xác định điều kiện nuôi cấy phù hợp và tách chiết, tinh sạch các hợp chất và giải trình tự, lắp ráp de novo, dự đoán và chú giải hệ gen của XKNS được tuyển chọn để tìm kiếm thông tin về những gen liên quan đến quá trình tổng hợp kháng sinh. Từ những lý do trên nghiên cứu sinh thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) ở Việt Nam và đặc tính sinh học của hoạt chất từ chủng Streptomyces cavourensis YBQ59”
2 1. Mục tiêu Đánh giá được sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) thu thập tại miền Bắc Việt Nam và tinh sạch được một số cấu trúc hóa học có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư và các gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces cavourensis YBQ59. 2. Nội dung nghiên cứu - Phân lập và nghiên cứu sự đa dạng sinh học của các chủng XKNS trên cây quế (C. cassia Presl) thu thập tại các điểm thuộc tỉnh Hòa Bình, Yên Bái và Lai Châu. - Tuyển chọn xạ khuẩn sinh chất kháng sinh hoạt tính cao và xác định một số gen liên quan đến tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn. - Nghiên cứu đặc điểm di truyền, lên men, tách chiết và xác định một số cấu trúc kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces cavourensis YBQ59. 3. Những đóng góp mới của luận án - Là nghiên cứu đầu tiên, có hệ thống về đa dạng, sinh tổng hợp chất kháng sinh của XKNS trên cây quế (C. cassia Presl) tại miền Bắc Việt Nam. - Sàng lọc được chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 sinh kháng sinh phổ rộng và phân lập được 8 hợp chất kháng sinh: 1-monolinolein (1), bafilomycin (2), nonactic acid (3), daidzein (4), 3′-hydroxydaidzein (5), 5,11-epoxy-10-cadinanol (6), prelactone B (7), daucosterol (8), trong đó các hợp chất 1, 3-8 được phát hiện lần đầu từ loài S. cavourensis và hợp chất 1, 2 có hoạt tính kháng vi khuẩn kháng kháng sinh cao (MIC50 8,5-30,3 µg/ml) và ức chế phát triển ba dòng tế bào ung thư A549, MCF, Hep3B (IC50 3,6-24,7 µM). 4. Bố cục của luận án Luận án gồm 150 trang: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (32 trang, 3 bảng, 6 hình); Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (11 trang); Chương 3: Kết quả nghiên cứu (37 trang, 10 bảng, 20 hình); Chương 4: Bàn luận kết quả (28 trang, 8 hình); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Danh mục các công trình công bố (2 trang); Tóm tắt luận án bằng tiếng Anh (7 trang); Tài liệu tham khảo (28 trang với 7 tài liệu tiếng Việt, 243 tài liệu tiếng Anh); Phụ lục (63 trang). CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Thuật ngữ nội sinh “endophytic” được đưa ra bởi de Bary (1866), theo định nghĩa của ông, “VSV nội sinh là những VSV sống bên trong các mô thực vật và có sự khác biệt đáng kể so với những loại VSV được tìm thấy trên bề mặt thực vật”. Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ XKNS được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt tính sinh học như các chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV gây bệnh, kháng nấm, tiêu diệt tế bào ung thư, kháng viêm, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng... (Bacon và White, 2000; Qin và cs., 2011). Cho
3 đến nay rất nhiều kháng sinh mới được tìm ra như munumbicin A-D (Castillo và cs., 2002), celastramycin A-B (Pullen và cs., 2002), kakadumycin (Castillo và cs., 2003) và demethylnovobiocin (Igarashi, 2004) từ XKNS hiện đang có các ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và y dược (Golinska và cs., 2015). XKNS là một trong những nhóm VSV rất đa dạng và còn ít được nghiên cứu, có khả năng sinh ra những chất có ích cho cây chủ (Golinska và cs., 2015; Nalini và Prakash, 2017). Theo quan niệm đó, sự đa dạng sinh học của XKNS là sự đa dạng về thành phần loài, chi về các taxon, nhưng đồng thời cũng là một sự đa dạng về các hợp chất tự nhiên có hoạt tính do chúng sinh ra. XKNS rất đa dạng và mức độ đa dạng có thể thay đổi giữa các vùng lấy mẫu và các loài thực vật khác nhau. Sự đa dạng về chi và số lượng xạ khuẩn nội sinh phần lớn phụ thuộc vào phương pháp và môi trường phân lập (Qin và cs., 2011; Nalini và Prakash, 2017). Nghiên cứu này không những mở ra hướng nghiên cứu mới về VSV học ứng dụng ở Việt Nam, mà còn góp phần quan trọng trong việc xác định được mức độ đa dạng sinh học nguồn tài nguyên XKNS trên một số cây dược liệu của Việt Nam. Việc phát hiện được các nguồn gen xạ khuẩn mới, tiềm năng nhằm ứng dụng và phát triển các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp do chúng sản sinh trong lĩnh vực nông nghiệp, y dược và thực phẩm một cách bền vững, không dẫn đến việc huỷ hoại cây chủ, bảo vệ sự đa dạng tài nguyên thực vật cũng như VSV của Việt Nam là cấp thiết. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu - Mẫu nghiên cứu: 9 mẫu (rễ, thân, lá) cây quế thu thập từ xã Thung Nai, Cao Phong, Hòa Bình (20°47’21”N;105°21’20”E) ở độ cao 399 m, tháng 12/2013; 9 mẫu từ xã Tân Hợp, Văn Yên, Yên Bái (21°53’14”B;104°35’9”Đ) ở độ cao 700 m, tháng 02/2014 và 9 mẫu từ xã Phăng Sô Lin, Sìn Hồ, Lai Châu (22°21’41”B;103°16’4”Đ) ở độ cao 800 m, tháng 02/2014. Mẫu thực vật Cinnamomum cassia Presl được lưu trữ tiêu bản và phân loại vào tháng 01/2106 bởi TS. Nguyễn Thế Cường tại Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện HL KH&CN VN. - Các chủng VSV kiểm định: Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 (viết rút gọn Salmonella Typhimurium ATCC 14028), Escherichia coli ATCC 11105, Sarcina lutea ATCC 9341, Bacillus cereus ATCC 11778, Proteus vulgaris ATCC 49132, Pseudomonas auroginosa ATCC 9027, Candida albicans ATCC 10231, Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Staphylococcus epidermidis kháng methicilin (MRSE) ATCC 35984 và Staphylococcus aureus kháng methicilin (MRSA) ATCC 33591 nhận từ Bộ sưu tập
4 giống VSV của Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Các dòng tế bào ung thư: Hep3B (tế bào ung thư gan ở người); MCF7 (tế bào ung thư vú người) và A549 (ung thư phổi ở người) được cung cấp bởi GS. Jeong- Hyung Lee, trường ĐHQG Kangwon, Hàn Quốc. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 1. Xử lý bề mặt mẫu thực vật và phân lập XKNS theo Qin và cs. (2009). 2. Đánh giá sự đa dạng di truyền DNA bằng phản ứng BOX-PCR (Nurjasmi và cs., 2009). 3. Xác định hoạt tính kháng VSV kiểm định theo phương pháp của Saadoun và Muhana (2008) và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC50) theo Andrews (2001). 4. Đánh giá khả năng sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline của các chủng xạ khuẩn bằng phép thử màu theo Trease và Evans (1996). 5. Xác định gen mã hóa PKS-I, PKS-II và NRPS được khuếch đại bằng phản ứng PCR dựa trên 3 bộ mồi suy biến K1F ⁄M6R, KSaF ⁄KSaR, A3F ⁄A7R theo Li và cs. (2008). 6. Xác định hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp so mầu MTT (3-(4,5- dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) theo Cree (2011). 7. Phân loại VSV bằng phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA theo Sambrook và cs. (2001); so sánh độ tương đồng bằng phần mềm Clustal W (Thompson và cs., 1997); cây phát sinh loài theo phương pháp Maximum-likelihood, thuật toán gamma và Kimura 2 với giá trị bootstrap 1000 (Felsenstein, 1985; Tamura và cs., 2013). 8. Xác định đặc điểm sinh học của xạ khuẩn và định tên xạ khuẩn theo Sổ tay phân loại VSV của Bergey (Holtet và cs., 1989) và Chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) (Shirling và Gottlieb, 1966). 9. Tách chiết và giải trình tự hệ gen xạ khuẩn bằng máy giải trình tự gen thế hệ mới IonTorrent PGM; hệ gen được lắp ráp phần mềm VelvetOptimiser (Gladman và Seemann, 2012); dự đoán gen theo phần mềm Prodigal (Hyatt và cs., 2010), GeneMarkS (Besemer và cs., 2001) và antiSMASH (Blin và cs., 2013; Weber và cs., 2015). 10. Xác định cấu trúc của các CKS từ dịch lên men xạ khuẩn theo các phương pháp đo phổ, phân tích cấu trúc bằng các phổ ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT, HSQC, HMBC theo Nguyễn Đình Triệu (2005). 11. Xử lý thống kê: dùng toán thống kê, phần mềm Excel 2010 và phần mền XLSTAT 2016 để phân tích độ sai lệch một chiều (ANOVA) được thực hiện để phân tích những khác biệt đáng kể (P=0,05).
5 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Sự đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) 3.1.1. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) Từ 27 mẫu cây quế (C. cassia Presl) thu thập được từ vùng Tây Bắc, Việt Nam, sau khi xử lý bề mặt và nuôi cấy trên các môi trường phân lập đặc hiệu (TWYE, STA, HV, TA, SA, CA, SPA, RA và ISP5), trong 6-8 tuần ở 28°Ccho thấy tỷ lệ các chủng XKNS phân bố không đều (Hình 3.1). Hình 3.1. Khuẩn lạc các chủng xạ khuẩn nội sinh tại Hòa Bình (A), Lai Châu (B) và Yên Bái (C) phân lập trên một số môi trường đặc hiệu sau 4-6 tuần nuôi cấy. Nhìn chung, các chủng xạ khuẩn phát triển khá chậm trên 9 loại môi trường với số lượng đạt 2-3 chủng/mẫu. Sau thời gian nuôi cấy từ 4-6 tuần, 297 chủng XKNS đã phân lập và thuần khiết từ các bộ phận của cây, trên môi trường phân lập đặc hiệu khác nhau (Phụ lục 5). Trong đó, 111 chủng từ các mẫu quế Hòa Bình, chiếm 37,3%; 81 chủng từ Lai Châu, chiếm 27,3% và 105 chủng từ Yên Bái, chiếm 35,4%. Đặc điểm hình thái và màu sắc khuẩn lạc XKNS đĩa thạch trên môi trường YIM38 cho thấy, số lượng xạ khuẩn khác nhau tùy thuộc vào khu vực lấy mẫu. 3.1.2. Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) 3.1.2.1. Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo bộ phận của cây quế (C. cassia Presl) Trong số 297 chủng xạ khuẩn được phân lập ở Hòa Bình số lượng xạ khuẩn thu được từ thân, rễ, lá lần lượt đạt 60,4% (n=67), 26,1% (n=29) và 13,5% (n=15) trên
6 tổng 111 chủng XKNS; ở Yên Bái số lượng xạ khuẩn thu được từ thân cao nhất 38,2% (n=40), rễ 35,2% (n=37) và lá thấp nhất 26,7% (n=28) trên tổng 105 chủng XKNS (Hình 3.2A). Ngược lại số lượng xạ khuẩn phân lập từ quế tại Lai Châu đạt cao nhất ở rễ 43,2% (n=35), tiếp đến là thân 34,6% (n=28) và thấp nhất ở lá 22,2% (n=18) trên tổng 81 chủng XKNS. Tuy nhiên, theo số liệu tổng hợp tại 3 khu vực cho thấy, số lượng XKNS cao nhất ở thân 45,5% (n=135) tiếp theo rễ 34,0% (n=101) và thấp nhất ở lá 20,5% (n=61) (Hình 3.2B). Hình 3.2. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh trên các bộ phận của cây quế: số liệu tổng hợp tại ba vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B). 3.1.2.2. Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) theo môi trường phân lập Theo các nghiên cứu về XKNS, phương pháp xử lý mẫu và thành phần môi trường là yếu tố chính quyết định đến kết quả phân lập, đánh giá sự đa dạng của XKNS và tìm ra các loài xạ khuẩn mới (Okazaki, 2003). Kết quả đánh giá đa dạng xạ khuẩn phân lập trên 9 loại môi trường được thể hiện trên Hình 3.3. Số lượng XKNS tại 3 vùng lấy mẫu đạt cao nhất trên các môi trường CA, STA lần lượt đạt 20,5% và 19,2%, số lượng XKNS trên các môi trường còn lại chỉ đạt từ 3,0-16,5% trên tổng số chủng xạ khuẩn phân lập được (n=297). TA SA 19.2% 16.5% CA SPA 7.7% 12.8% HV 12.1% ISP5 3.0% 20.5% TWYE 4.0% 4.0% RA A STA B Hình 3.3. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh trên các môi trường phân lập khác nhau: số liệu tổng hợp tại ba vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B).
7 3.1.2.3. Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) theo nhóm mầu khuẩn ty Mầu khuẩn ty được coi là tiêu chí cơ bản để chọn lọc các chủng xạ khuẩn trên các môi trường phân lập, tránh chọn lọc các chủng có cùng đặc điểm hình thái, màu sắc giống nhau. Sự khác biệt về màu sắc hệ khuẩn ty xạ khuẩn được hình thành do nhiều nguyên nhân khác nhau như: khí hậu, nhiệt độ, độ ẩm, chất dinh dưỡng, pH,... (Shirling và Gottlieb, 1966). Số lượng xạ khuẩn phân lập trên cả 3 khu vực có màu sắc hệ khuẩn ty thuộc 6/7 nhóm mầu xuất hiện với tỷ lệ khác nhau. Trong đó, tỷ lệ các chủng xạ khuẩn phân lập thuộc nhóm màu xám là cao nhất (42,1%; n=125), tiếp theo là vàng (22,6%; n=67), trắng (17,8%; n=53), đỏ (14,5%; n=43), xanh (2,00%; n=6)và tím(1,00%; n=3) trên tổng số chủng xạ khuẩn (n=297) (Hình 3.4). Xám Trắng Vàng Đỏ Xanh Tím 2.0% 1.0% 14.5% 0.0% 42.1% 22.6% 17.8% A B Hình 3.4. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh theo nhóm mầu khuẩn ty: số liệu tổng hợp tại ba vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B). 3.1.2.4. Sự đa dạng di truyền DNA của một số chủng xạ khuẩn nội sinh Trên cơ sở 297 chủng XKNS chọn ngẫu nhiên 16 chủng XKNS phân lập trên cây quế HBQ7; HBQ8; HBQ9; HBQ10; HBQ11; HBQ16; HBQ19; HBQ33; HBQ40; HBQ43; HBQ46; HBQ47; HBQ49; HBQ55; HBQ56; HBQ62 được lựa chọn để đánh giá đa dạng di truyền DNA bằng phản ứng BOX-PCR. Phân tích sản phẩm phản ứng BOX-PCR của 16 chủng xạ khuẩn được lựa chọn cho 15 băng có kích thước khác nhau trên bản điện di tương ứng với 15 vùng gen khác nhau trên hệ gen của các chủng xạ khuẩn (Hình 3.5). Xác định quan hệ di truyền cho thấy đa số các chủng xạ khuẩn có độ tương đồng di truyền 90%, chứng tỏ các chủng XKNS nghiên cứu có độ sai khác về di truyền trong hệ gen của XKNS. Kết quả nghiên cứu trên bước đầu đánh giá đa dạng XKNS, cho thấy các chủng XKNS phân lập từ cây quế có độ đa dạng di truyền cao hay tần suất phân lập các chủng trùng
8 lặp về di truyền thấp. Ngoài ra, đặc điểm hình thái của 16 xạ khuẩn trên cũng cho thấy tính đa dạng về mầu sắc khuẩn lạc, hình dạng tế bào. Hình 3.5. Đa dạng di truyền của 16 chủng xạ khuẩn nội sinh dựa trên phân tích đa hình sản phẩm phản ứng BOX-PCR. Băng M: Thang DNA chuẩn (100 bp). 3.1.3. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn nội sinh Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng 09 VSV kiểm định của 297 chủng XKNS được tổng hợp trong Bảng 3.1. Bảng 3.1. Số liệu thống kê hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của 297 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây quế Số chủng xạ khuẩn kháng Tỷ lệ (%) vi sinh vật kiểm định Chủng vi sinh vật kiểm định Hòa Lai Yên Hòa Lai Yên Tổng Bình Châu Bái Bình Châu Bái số (111) (81) (105) Vi khuẩn Gram âm E. coli ATCC 11105 25 6 9 22,5 7,4 8,6 13,5 P. vulgaris ATCC 49132 29 5 20 26,1 6,2 19,0 18,2 S. TyphimuriumATCC 14028 1 6 19 0,9 7,4 18,1 8,8 E. aerogenes ATCC 13048 28 4 8 25,2 4,9 7,6 13,5 P. aeruginosa ATCC 9027 0 6 16 0,0 7,4 15,2 7,4 Vi khuẩn Gram dương S. lutea ATCC 9341 28 4 4 25,2 4,9 3,8 12,1 MRSE ATCC 35984 28 10 22 25,2 12,3 21,0 20,2 B. cereus ATCC 11778 28 8 15 25,2 9,9 14,3 17,2 Nấm men C. albicans ATCC 10231 10 2 13 9,0 3,7 12,4 8,4
9 Trong số 297 chủng xạ khuẩn được thử nghiệm, có 96 chủng (chiếm 32,3%) kháng ít nhất một VSV kiểm định, chiếm đa số là các chủng xạ khuẩn Hòa Bình (n=40; 41,7%), tiếp đến Yên Bái (n=36; 37,5%) và Lai Châu (n=20; 20,8%). Tổng số 96 chủng xạ khuẩn có 37 chủng thể hiện phổ kháng khuẩn rộng (cùng kháng nhiều hơn 6 loại vi sinh vật kiểm định). Trong số 96 chủng phân lập, tác dụng ức chế tác nhân gây bệnh cao nhất đối với MRSE (n = 60, 62,5%), P. vulgaris (n = 54, 56,3%), tiếp đến là B. cereus (n = 51, 53,1%), E. coli và E. aerogenes (n = 40, 41,7%), S. lutea (n = 36, 37,5%), S. Typhimurium (n = 26, 27,1%), C. albicans (n = 25, 26,0%) và P. aeruginosa (n = 22, 22,9%). 3.1.4. Phân tích trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn nội sinh sinh kháng sinh Trong khuôn khổ của luận án đã phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA của 82/96 chủng XKNS sinh kháng sinh và xác định được trình tự của 82 chủng XKNS có độ tương đồng cao (97,9 - 100%) so với các trình tự tương ứng trên GenBank (NCBI). 82/96 chủng XKNS đã được phân loại tới loài và đã được đăng ký trên GenBank (NCBI). Kết quả phân loại các chủng được tập hợp theo các chi, họ thuộc ngành xạ khuẩn (Actinobacteria) trên Bảng 3.2 cho thấy, 82 chủng XKNS được phân thành 6 chi thuộc 6 họ khác biệt: Streptomyces thuộc họ Streptomycetaceae, Microbacterium thuộc họ Microbacteriaceae, Brevibacterium thuộc họ Brevibacteriaceae, Micromonospora thuộc họ Micromonosporaceae, Saccharothrix thuộc họ Actinosynnemataceae và Nocardia thuộc họ Nocardiaceae. Trong đó, số chủng thuộc chi Streptomyces chiếm tỷ lệ cao nhất (92,7%), tiếp theo là chi Microbacterium (2,5%), còn các chi Micromonospora, Nocardia và Saccharothrix chiểm tỷ lệ thấp nhất (mỗi loại chiếm 1,2%). Bảng 3.2. Kết quả phân loại các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái dựa trên kết quả phân tích trình tự gen 16S rDNA STT Họ Chi Số lượng chủng Tỷ lệ (%) 1 Brevibacteriaceae Brevibacterium 1 1,2 2 Microbacteriaceae Microbacterium 2 2,5 3 Micromonosporaceae Micromonospora 1 1,2 4 Nocardiaceae Nocardia 1 1.2 5 Actinosynnemataceae Saccharothrix 1 1,2 6 Streptomycetaceae Streptomyces 76 92,7 Tổng số 82 100 XKNS trên cây quế có sự đa dạng mức độ loài tương đối cao, chi Streptomyces là chi phổ biến nhất tại Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái, chi Microbacterium xuất hiện
10 tại ở tại hai khu vực Hòa Bình và Lai Châu, còn chi Nocardia chỉ xuất hiện ở Hòa Bình. Tuy nhiên, một số chủng thuộc các chi hiếm Saccharothrix chỉ phân lập được từ Lai Châu (Bảng 3.2). Điều này cho thấy, số lượng XKNS khác nhau giữa các vị trí lấy mẫu có khả năng bị ảnh hưởng bởi điều kiện khí hậu khác nhau. 3.1.5. Khuếch đại gen mã hóa polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh tổng hợp kháng sinh Theo nhiều tài liệu trên thế giới công bố, một số sản phẩm trao đổi chất bậc hai có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư… của xạ khuẩn được tổng hợp bởi 3 nhóm enzyme chính là PKS-I, PKS-II và NRPS. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh ba gen pks-I, pks-II và nrps mã hóa enzyme có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp kháng sinh (Minotti và cs., 2004). Hòa Bình Lai Châu Yên Bái Tổng số 59 Số lượng chủng xạ khuẩn 60 50 37 35 40 30 23 23 17 19 20 9 11 11 13 5 10 0 PKS-I PKS-II NRPS Gen mã hóa Hình 3.6. Số liệu thống kê khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS của 96 chủng xạ khuẩn nội sinh cây quế Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái Trong nghiên cứu này, xác định sự có mặt của các gen liên quan đến tổng hợp kháng sinh là một trong những đặc điểm sinh học của XKNS sinh kháng sinh. Kết quả cho thấy, sản phẩm PCR khuếch đại các gen của 96 chủng xạ khuẩn cho băng DNA có kích thước khoảng 1400 bp (đối với gen pks-I), 600 bp (pks-II) và 750 bp (nrps), tương ứng với kích thước mồi sử dụng khuếch đại gen pks-I, pks-II, nrps đã đưa ra. Điều đó cho thấy, 03 cặp mồi suy biến (K1F/M6R; A3F/A7R; KSαF/KSαR) sử dụng trong thí nghiệm là phù hợp. Tỷ lệ mang gen pks-I, pks-II và nrps lần lượt là 38,5% (n=37/96), 61,5% (n=59/96) và 36,5% (n=35/96) (Hình 3.6). Hoạt tính kháng VSV kiểm định và khả năng tổng hợp các hoạt chất sinh học (PKS-I, PKS-II và NRPS) là khác nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính sinh học của các chủng XKNS có thể liên quan trực tiếp tới sự có mặt của các gen mã hóa PKS-I, PKS-II và NRPS và các chủng XKNS trên cây quế có thể là nguồn sinh các chất kháng sinh và kháng ung thư quan trọng.
11 3.1.6. Khả năng sinh chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline Kháng sinh thuộc nhóm anthracycline sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn phần lớn cho thấy độc tính đối với các khối u ở người hoặc các dòng tế bào ung thư (Minotti và cs., 2004; Nakashima và cs., 2013). Ngoài ra, nhóm chất anthracycline từ xạ khuẩn là một trong nhóm chất có hiệu quả nhất được sử dụng phổ biến trong điều trị nhiều loại ung thư (McGowan và cs., 2017). Trong số 96 chủng XKNS tuyển chọn có 70 chủng (72,9%) có khả năng sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline (chuyển màu cam với môi trường acid và tím trong môi trường kiềm). Trong đó, các chủng phân lập được từ cây quế ở Yên Bái sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline chiếm tỷ lệ cao nhất (31,3%), tiếp theo là Hòa Bình (28,1%), Lai Châu (13,5%). Đặc biệt, 14/96 chủng XKNS không có khả năng sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline, nhưng 14 chủng này lại có hoạt tính kháng khuẩn chống lại ít nhất 3 VSV kiểm định, do các hợp chất được tạo ra bởi các xạ khuẩn có thể không thuộc nhóm anthracycline. 3.2. Đặc điểm sinh học và điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh kháng sinh của chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 Từ các kết quả sàng lọc hoạt tính kháng VSV kiểm định cũng như khả năng mang các gen liên quan tới quá trình sinh tổng hợp kháng sinh và sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracyclin, trong luận án này nghiên cứu sinh đã lựa chọn chủng S. cavourensis YBQ59 thể hiện phổ kháng rộng, kháng mạnh với 8/9 chủng VSV kiểm định cho các nghiên cứu tiếp theo. Đồng thời, chủng YBQ59 mang gen mã hóa PKS- I, PKS-II, NRPS và sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline. Trong đó các vi khuẩn gây bệnh như E. coli, P. vulgaris, S. Typhimurium và P. aeruginosa là những tác nhân gây bệnh cần ưu tiên kiểm soát và phát triển kháng sinh điều trị theo khuyến cáo của tổ chức y tế thế giới (WHO) công bố vào tháng 2/2017. Ngoài ra, chủng YBQ59 thể hiện tính kháng khuẩn mạnh với S. epidermidis kháng methicillin gây bệnh cơ hội phổ biến ở người khó điều trị (Otto, 2009). Vì vậy, chủng YBQ59 được tuyển chọn cho những nghiên cứu về đặc điểm sinh học, khai thác hệ gen, điều kiện lên men, thu hồi và tách chiết các chất có hoạt tính sinh học. 3.2.1. Đặc điểm sinh học của chủng S. cavourensis YBQ59 Chủng YBQ59 phát triển tốt trên môi trường ISP2 ở pH 7,0, nhiệt độ 30°C với nồng độ NaCl là 2%. Nhiệt độ, pH, nồng độ muối là đặc điểm có ý nghĩa quan trọng đối với việc ứng dụng xạ khuẩn trong lên men thu nhận các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn carbon, nitơ của chủng YBQ59 cho thấy, chủng YBQ59 sử dụng được hầu hết các nguồn carbon (11/13) thử nghiệm ngoại trừ D-glucosamine, D-sorbitol, nhưng chỉ sử dụng được 6/13 nguồn nitơ thử nghiệm (L-asparagin monohydrat, L-arginin, L-valin, L-methionin, L- threonin, L-cystein) và chủng YBQ59 còn có khả năng sinh một số enzyme ngoại bào
12 như urease, gelatinase, amylase, cellulase và xylanase. Dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý-sinh hóa của chủng YBQ59 cho thấy, chủng YBQ59 có đặc diểm hình thái và sinh lý-sinh hóa giống loài S. cavourensis (El-Naggar và cs., 2016). Dựa vào so sánh đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân tích trình tự gen 16S rRNA chủng YBQ59 được định danh là Streptomyces cavourensis YBQ59 với mã số GenBank MF950891. 3.2.2. Đặc điểm di truyền và một số gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 Dữ liệu được giải trình tự trên máy giải trình tự gen thế hệ mới IonTorrent PGM chủng YBQ59 thu được 2.856.000 đoạn DNA ngắn (read, từ 25-373 bp) với tổng dung lượng dữ liệu là 512.914.080 bp. Tiền xử lý được bộ dữ liệu tinh sạch với 2.042.979 (71,5%) đoạn trình tự có điểm chất lượng trên 20 và độ dài từ 36 đến 211. Lắp ráp de novo dữ liệu tinh sạch của chủng S. cavourensis YBQ59 bằng phần mềm VelvetOptimser với kích thước k-mer = 87, ghép nối dữ liệu cho thấy kích thước genome được dự đoán là 10.232.294 bp, bao gồm 4.428 đoạn ghép nối (contig), chỉ số N50=12.307 bp, contig dài nhất: 161.472 bp với độ bao phủ trung bình 26X và tỷ lệ GC trong hệ gen là 64%. Dự đoán và chú thích gene nhờ kết hợp ba phần mềm Prodigal, GeneMarkS (Besemer và cs., 2001) và NCBI Prokaryotic genome annotation pipeline (PGAP) version 4.5 (Tatusova và cs., 2016). Đã chú giải được 8.958 trình tự gen mã hoá protein (protein-coding), 76 gen tRNA, 4 operons rRNA và 3.145 gen giả định (pseudogene). Trong số các gen chú giải bằng NCBI có 6758 gen có kết quả chú giải trên cơ sở dữ liệu Gene Ontology (GO) chiếm 73% số lượng gen thu được chia thành 03 nhóm: nhóm Biological Process (các quá trình sinh học) chứa thông tin các quá trình mà các gen chú giải tham gia, nhóm Cellular component (thành phần trong tế bào hoặc bào quan) cung cấp thông tin vị trí hoạt động của các gen và nhóm Molecular Function (chức năng phân tử) cho biết chức năng của mỗi gen. Thống kê kết quả thu được từ Blast2GO PRO (Conesa và cs., 2005), cho thấy nhóm Biological Process có số lượng gen thực hiện quá trình chuyển hóa nhiều nhất với 6292 gen, nhóm Cellular component có nhiều gen hoạt động trong tế bào hơn so với các vị trí khác với 3083 gen và nhóm Molecular Function cho biết số lượng gen thực hiên chức năng chuyển hóa chiếm phần lớn với 5961 gen. Ngoài ra, chú giải hệ gen của chủng S. cavourensis YBQ59 sử dụng cơ sở dữ liệu KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (Kanehisa và Goto, 2000) chỉ ra có 140 con đường chuyển hóa (pathway) liên quan đến sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp. Bên cạnh đó, tổng cộng 717 enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp, trong đó 158 enzyme trực tiếp liên quan đến
13 quá trình tổng hợp kháng sinh như macrolide, ketolide (12, 14, 16 macrolide), các cấu trúc peptide nonrobosomal, cấu trúc polyketide loại I và loại II và dự đoán khả năng sinh kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 bao gồm penicillin, cephamycin C, nocardicin A, clavaminate, erythromycin A/B, oleandomycin, picromycin, methymycin, neomethymycin, avermectin, tetracycline, oxytetracycline, chlortetracycline, mithramycin, tetracenomycin C, elloamycin, rebeccamycin, vancomycin và validamycin A. A A B Hình 3.7. Cấu trúc gen/nhóm gen tham gia quá trình sinh tổng hợp kháng ung thư bleomycin (ctg328_1), jamaikamide (ctg328_1) (A) và kháng sinh macrotetrolide (ctg1114_1) (B) Ghi chú: Màu tím đậm chỉ ORF, mũi tên chỉ chiều tổng hợp protein. A: Nhóm gen bao gồm 2 gen chính ctg328_1 và ctg328_2 được dự đoán mang chức năng tổng hợp beta-ketoacyl, ngoài ra còn có 2 NRPS/PKS motif tên PKSI-KS_m6 và PKSI-KS_m3, 1 domain và 1 vùng hoạt động cysteine. B: gen ctg1114_1 mã hóa cho 3-oxoacyl synthase III, gen ctg1114_2 theo blast hiện chưa xác định được chức năng Hơn nữa, phân tích hệ gene của chủng S. cavourensis YBQ59 bằng phần mềm antiSMASH v3.0 (Weber và cs., 2015) cho thấy, hệ gene của chủng S. cavourensis YBQ59 chứa 37 nhóm gene liên quan đến quá trình sinh tổng hợp các hợp chất trao đổi thứ cấp, trong đó 14 con đường sinh tổng hợp liên quan tới sinh tổng hợp chất có hoạt tính sinh học như NRPS, PKS-II, hybrid PKS-NRPS, PKS-III, Beta-ketoacyl synthase và những hoạt chất dự đoán được từ hệ gene của chủng S. cavourensis YBQ59 bao gồm bacteriocin, bleomycin, calyculin, coelimycin, colonic acid, chlorizidine A, desferrioxamine B, ectoine, arylpolyene, macrotetrolides, naringenin, landepoxcin, terpene và svaricin. Dữ liệu chú giải hệ gen của chủng S. cavourensis YBQ59 đã được đăng ký trên NCBI dưới mã số QLNH00000000.
14 Trong số các nhóm gen có gen ctg328_1 tham gia vào con đường sinh tổng hợp chất kháng ung thư bleomycin có độ tương đồng 59% với gen bleom_AAG02357_H nguồn gốc từ Streptomyces verticillus ATCC 15003 (Du và cs., 2000) và ctg328_2 tham gia vào con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh jamaicamide với ctg328_1 có độ tương đồng 51% với gen JamM_AAS98784_H nguồn gốc từ Lyngbya majuscula (Edwards và cs., 2004) (Hình 3.7A). Hai gen ctg1114_1 và ctg1114_2 khác tham gia vào con đường sinh tổng hợp kháng sinh macrotetrolide (Hình 3.7B). 3.2.3. Lựa chọn môi trường cơ sở và điều kiện lên men thích hợp sinh kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 Chủng S. cavourensis YBQ59 sinh tổng hợp chất kháng khuẩn cao nhất trên môi trường lên men MT6 với đường kính vòng vô khuẩn kháng S. Typhimurium ATCC 14028 và MRSE ATCC 35984 lần lượt đạt 25,6 mm và 27,1 mm. MT6 (g/l): CaCO3 1,0; tinh bột tan 10,0; bột đậu tương 10,0; nước cất 1000 ml được lựa chọn làm môi trường lên men chủng YBQ59 trong các nghiên cứu tiếp theo. Điều kiện lên men thích hợp nhất cho sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng S. cavourensis YBQ59 nuôi ở 25-37°C, pH 6,0-8,0; tỷ lệ tiếp giống 5%, độ thông khí bề mặt (surface aeration) 20%, chủng cho hoạt tính kháng khuẩn cao nhất. Khi khảo sát độ thái lên men chủng S.cavourensis YBQ59 trên bình lên men Bioflo 110 5 lít kết quả cho thấy thời điểm thích hợp thu hồi kháng sinh ở 72-78 giờ lên men với đường kính VVK trên VSV kiểm định S. Typhimurium ATCC 14028 và MRSE ATCC 35984 lần lượt đạt 34,0 và 41,2 mm. 3.2.4. Hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào ung thư của chủng S. cavourensis YBQ59 Chủng S. cavourensis YBQ59 có khả năng kháng 7/8 chủng vi khuẩn thử nghiệm với đường kính VVK trên 20 mm và hoạt tính kháng sinh mạnh nhất đối với chủng MRSE ATCC 35984 (đường kính VVK đạt 41,2 mm), tiếp theo là S. Typhimurium ATCC 14028 có hoạt tính kháng khuẩn với đường kính VVK 34,0 mm. Chủng S. cavourensis YBQ59 có hoạt tính kháng nấm men C. albicans ATCC 10231 cao (đường kính VVK đạt 21,5 mm) (Bảng 3.3). Kết quả trên cho thấy chủng S. cavourensis YBQ59 rất có tiềm năng sinh các hợp chất kháng sinh ứng dụng trong điều trị nhiễm khuẩn ở người. Chủng S. cavourensis YBQ59 có hoạt tính ức chế đối với cả 3 dòng tế bào ung thư ở mức độ khác nhau (Bảng 3.4). Hoạt tính gây độc tế bào được thể hiện thông qua phần trăm tế bào sống sót, ở cả hai nồng độ 30 µg/ml và 100 µg/ml lượng tế bào ung thư còn sống nhỏ hơn 50% trên dòng tế bào A549 và Hep3B, riêng với dòng tế bào ung thư vú MCF7 chủng S. cavourensis YBQ59 ức chế được ở nồng độ 30
15 µg/ml. Từ đó, ta có thể nghiên cứu các ứng dụng để sản xuất các loại thuốc có khả năng ức chế hoạt động của các dòng tế bào ung thư gan Hep3B, ung thư phổi A549 và ung thư vú MCF7. Trong khuôn khổ luận án các hợp chất tách được bước đầu sàng lọc khả năng kháng tế bào ung thư. Việc đánh giá khả năng gây độc đối với tế bào thường sẽ được nghiên cứu sâu khi các hoạt chất được lựa chọn trong phát triển nghiên cứu lâm sàng tiếp theo. Bảng 3.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của dịch lên men chủng S. cavourensis YBQ59 Chủng vi sinh vật kiểm Đường kính vòng vô khuẩn (D-d, mm)* định Vi khuẩn Gram âm E. coli ATCC 11105 25,3e ± 0.12 P. vulgarisATCC 49132 27,5d ± 0.11 S. Typhimurium ATCC 14028 34,0c ± 0.08 P. aeruginosa ATCC 9027 23,6f ± 0,21 E. aerogenes ATCC 13048 25,5e ± 0.09 Vi khuẩn Gram dương S. lutea ATCC 9341 0h MRSAATCC 35984 41,2a ± 0.14 B. cereus ATCC 11778 30,2b ± 0.17 Nấm men C.albicans ATCC 10231 21,5g ± 0.13 Ghi chú: Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g, h trên cùng một cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê theo đánh giá của Fisher (p
16 3.3. Tách chiết, tinh sạch và đặc tính của các hoạt chất thứ cấp từ chủng S. cavourensisYBQ59 3.3.1. Tách chiết và tinh sạch các hoạt chất thứ cấp Sơ đồ quy trình phân tích các hoạt chất thứ cấp từ dịch lên men của chủng S. cavourensis YBQ59 được trình bày trên Hình 3.8. Hình 3.8. Sơ đồ phân lập và tinh chế các chất sạch từ chủng S. cavourensis YBQ59 Cặn chiết ethyl acetat từ dịch lên men của chủng S. cavourensis YBQ59 được phân đoạn bằng các cột sắc ký lặp lại nhiều lần bằng cột pha đảo gel thường và cột pha đảo silica gel C18 đã đưa ra các thông số vật lý và dữ liệu phổ MS, NMR của các hợp chất của chủng S. cavourensis YBQ59 để thu được 8 hợp chất sinh học: 1- monolinolein – M2B5.1 (1), bafilomycin D - M2B5.0 (2), nonactic acid - M2B9.8 (3), daidzein - M2B8.3 (4), 3′-hydroxydaidzein - M2B7.5 (5), 5,11-epoxy-10- cadinanol - M2B3.8 (6), prelactone B - M2B3.8 (7) và daucosterol - M2B6.17 (8) đã được phân lập (Hình 3.8). * Hợp chất 1-monolinolein – M2B5.1 (1) O 3 1 3' 5' 7' 9' 10' 12' 13' 15' 17' 2 HO O 1' 2' 4' 6' 8' 11' 14' 16' 18' OH Hình 3.9. Cấu trúc hợp chất M2B5.1: 1-monolinolein B (1) (C21H38O4)
17 Hợp chất M2B5.1 thu được dưới dạng chất dạng dầu vàng. Phổ 1H NMR trên vùng trường mạnh xuất hiện tín hiệu của một nhóm methyl tại δH 1,37 (3H, t, J = 1,5 Hz, H-18′), dịch về vùng trường yếu hơn xuất hiện 5 tín hiệu proton của các nhóm oxymethine và oxy methylene tại δH 3,70 (1H, m, Hb-3); 3,83 (1H, d, J = 7,5 Hz, Ha- 3); 3,93 (1H, t, J = 4,0 Hz, Ha-1); 4,15 (1H, dd, J = 6,0; 11,5 Hz, H-2); 4,21 (1H, dd, J = 4,5; 11,5 Hz, Hb-1). Trên vùng trường thấp xuất hiện tín hiệu của 4 proton olefin trong khoảng 5,32 → 5,38 (4H, m, H-9′, H-10′, H-12′, H-13′). Trên phổ 13C NMR kết hợp phổ DEPT cho thấy hợp chất chứa 21 nguyên tử carbon trong đó trên vùng trường trung bình xuất hiện 3 tín hiệu δC 65,1 (C-1); 70,2 (C-2); 63,3 (C-3) gợi ý cho thấy hợp chất chứa dẫn xuất một phân tử glycerol. Còn lại là 18 nguyên tử carbon gồm 1 nhóm carbonyl, 4 nhóm methine, 12 nhóm methylene và 1 nhóm methyl. Kết quả phân tích ESI-MS của hợp chất cho thấy có một ion phân tử tại m/z = 377,2 [M + Na]+. Hợp chất này được đặc trưng bởi một ester của glycerol và acid béo không no nhiều nối đôi bằng cách so sánh dữ liệu của MS và NMR với các công bố khác. Từ những phân tích này và kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo kết luận được hợp chất M2B5.1 là glyxerilin linoleate hoặc 1-monolinolein (1) (Hình 3.9) (Tuntiwachwuttikul và cs., 2004). Hợp chất 1-monolinolein trước đây đã được tìm thấy ở một loài Streptomyces khác và nó có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế sự nhân lên của virut gây bệnh dịch tả ở lợn (Sola và cs., 1986). * Hợp chất bafilomycin D - M2B5.0 (2) HO 2 O HO O 1 1 6 4 7 3 5 O O 8 O OH O OH 8 O OH O OH 13 21 25 9 11 15 25 15 10 12 18 20 24 14 16 22 24 17 19 23 H H O O Hình 3.10. Cấu trúc và tương tác HMBC chính của hợp chất M2B5.0: bafilomycin D (2) (C35H56O8) Hợp chất M2B5.0 thu được dưới dạng bột màu vàng. Ở phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) cho 29 tín hiệu, trong đó vùng trường yếu xuất hiện 7 tín hiệu của proton olefin tại δH 5,18 (1H, dd, J = 9,0; 15,0 Hz, H-13); 5,74 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5); 5,81 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-11); 6,28 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-20); 6,48 (1H, dd, J = 10,5; 15,0 Hz, H-12); 6,64 (1H, s, H-3) và 6,91 (1H, dd, J = 9,0; 15,5 Hz, H-21), dịch chuyển về vùng trường mạnh hơn xuất hiện tín hiệu của 4 nhóm oxymethine tại δH 3,18 (1H, t, J = 6,0 Hz, H-23); 3,30 (1H, m, H-7); 3,76 (1H, m, H-17); 3,81 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-14), bên cạnh xuất hiện 2 tín hiệu singlet đặc trưng cho nhóm oxymethyl tại δH 3,22 (3H, s, 14-OCH3) và 3,67 (3H, s, 2-OCH3).
18 Kết hợp trên phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) và phổ HSQC cho thấy hợp chất cho 35 tín hiệu của carbon. Trên phổ HMBC xuất hiện những tương tác chính: 4-CH3 trương tác với C-3; C-4 và C-5; 6-CH3 với C-5; 6 và 7; 8-CH3 với C-8; 10-CH3 với C-9; C-10 và 11; H-15; 16 với 16-CH3; 18-CH3 với C-17; C-18 và C-19; 22-CH3 với C-21; C-22 và C-23; 24-CH3 với C-23; C-24 và C-25. Từ những dữ kiện này cho thấy các nhóm methyl được thế vào các vị trí tại C-4; C-6; C-8; C-10; C-16; C-18; C-22 và C-24. Ngoài ra còn có các tương tác 2-OCH3 với C-2; 14-OCH3 với C-14 kết luận được có hai nhóm oxymethyl được thế vào vị trí C-2 và C-14 của hợp chất. Phân tích phổ ESI-MS cho một ion phân tử tại m/z = 605,2 [M + H]+. Từ những phân phân tích trên và so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố xác định được hợp chất M2B5.0 là bafilomycin D (2) với công thức phân tử C35H56O8 và khối lượng phân tử M = 604 (Hình 3.10) (Kim và cs., 1993). Như đã đề cập, hợp chất phân lập trước đây từ loài S. cavourensis cho thấy hoạt tính chống nấm (Xu và cs., 2013; Pan và cs., 2015). * Hợp chất nonactic acid - M2B9.8 (3) 4 5 7 HO 3 6 8 9 HO 1 2 O O O H H OH O H H OH Hình 3.11. Cấu trúc hợp chất M2B9.8: nonactic acid (3) (C10H18O4) Hợp chất M2B9.8 thu được dưới dạng dầu không màu. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD 3 OD) cho 11 tín hiệu vùng trường mạnh xuất hiện hai tín hiệu nhóm methyl tại δH 1,13 (1H, d, J = 6,5 Hz, 2-CH3); 1,18 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-9), dịch về vùng trường yếu hơn từ δH 1,57 → 2,47 là những tín hiệu của nhóm methine và nhóm methylene. Bên cạnh đó xuất hiện 3 tín hiệu của nhóm oxymethine tại δH 3,92 (1H, m, H-8), 4,01 (1H, m, H-3) và 4,04 (1H, m, H-6). Kết hợp trên phổ 13C NMR và phổ DEPT cho thấy hợp chất có 10 nguyên tử carbon, trong đó gồm các nhóm: 2 nhóm methyl, 3 nhóm methylene, 4 nhóm methine và 1 nhóm carboxyl. Trên phổ HMBC xuất hiện những tương tác chính: 2-CH3 tương tác với C-1; 2 và 3; H-9 với C-7; 8; H- 8 với C-6; H-5 với C-4; 7. ESI-MS (âm) phân tích xác định một ion phân tử tại m/z = 201,2 [M - H]’. Đồng thời đối chiếu những dữ liệu phổ với tài liệu tham khảo xác định được hợp chất M2B9.8 là nonactic acid (3) (Hình 3.11) (Huang và cs., 2015). * Hợp chất daidzein – M2B8.3 (4) (4’,7-dihydroxyisoflavone) Hợp chất M2B8.3 thu được dưới dạng chất kết tinh màu vàng nhạt. Trên phổ 1H NMR tại vùng trường yếu xuất hiện tín hiệu của 3 proton vòng thơm tại δH 6,85 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8); 6,93 (1H, dd, J = 2,0; 9,0 Hz, H-6); 7,97 (1H, d, J = 9,0 Hz , H- 5) đặc trưng cho hệ vòng thơm ABX, các tín hiệu tại δH 6,81 (2H, dd, J = 2,0; 6,5 Hz, H-3′, H-5′); 7,38 (2H, dd, J = 2,0; 6,5 Hz, H-2′, H-6′) đặc trưng cho hệ vòng thơm