Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Phát hiện người mang đột biến gen ATP7B trong các thành viên gia đình bệnh nhân Wilson

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:37

Thêm vào BST

Báo xấu

62
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm phát hiện người mang đột biến gen ATP7B cho các thành viên trong gia đình có tiền sử mắc bệnh Wilson. Bước đầu chẩn đoán trước sinh cho thai phụ có tiền sử sinh con mắc bệnh Wilson.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Phát hiện người mang đột biến gen ATP7B trong các thành viên gia đình bệnh nhân Wilson

Công trình được hoàn thành tại Khoa Di truyền và Sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi Trung Ương Trung tâm GenProtein, Trường Đại học Y Hà Nội Viện Công nghệ sinh học Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Tạ Thành Văn Trường Đại học Y Hà Nội 2. GS. TS. Phan Văn Chi Viện Công nghệ sinh học Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án Phiên chính thức Họp tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi: giờ phút, ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện quốc gia Thư viện Viện Công nghệ sinh học
Website: http://luanan.moet.gov.vn
4 MỞ ĐẦU Bệnh Wilson là một bệnh di truyền lặn hiếm gặp trên thế giới với tỷ lệ mắc bệnh từ 1/5000 đến 1/30000 trẻ đẻ sống do đột biến gen ATP7B. Gen ATP7B mã hóa protein ATPase, có chức năng vận chuyển đồng từ gan để bài tiết ra ngoài thông qua mật. Rối loạn chức năng ATPase dẫn đến đồng tích lũy phần lớn tại gan và một số cơ quan khác chẳng hạn như não, thận và do đó gây ra các bệnh liên quan đến gan, tâm thần và thần kinh. Wilson là bệnh có biểu hiện lâm sàng vô cùng phong phú và phát bệnh ở nhiều độ tuổi khác nhau. Trên thực tế, bệnh nhân Wilson ở Việt Nam thường được chẩn đoán ở giai đoạn muộn do bệnh nhân không có điều kiện khám, chữa bệnh hoặc không được thăm khám đúng chuyên khoa vì kiểu hình của bệnh rất đa dạng. Nếu bệnh nhân Wilson không được chẩn đoán và điều trị sớm, đồng dư thừa sẽ tích lũy trong các mô của cơ thể, làm tổn thương nghiêm trọng các cơ quan này và có thể tử vong do suy gan cấp và suy gan tối cấp. Bởi vậy chẩn đoán xác định bệnh Wilson có ý nghĩa quan trọng trong thực hành lâm sàng và tiên lượng bệnh. Bệnh Wilson có thể được chẩn đoán theo thang điểm Leipzig nhưng khi đó bệnh nhân đã có nhiều triệu chứng khiến cho việc điều trị bệnh tốn kém và gặp nhiều khó khăn. Trong khi xét nghiệm di truyền dựa trên phát hiện đột biến gen ATP7B không những là phương pháp duy nhất được sử dụng trong chẩn đoán xác định bệnh ở bất kì giai đoạn nào của bệnh mà còn là xét nghiệm được dùng để chẩn đoán phân biệt bệnh Wilson với nhiều bệnh lý khác liên quan đến gan và thần kinh chưa rõ nguyên nhân. Đặc biệt, người mắc bệnh Wilson chưa có biểu hiện lâm sàng chỉ có thể được phát hiện sớm bằng xét nghiệm di truyền. Khi được chẩn đoán sớm, bệnh nhân sẽ được điều trị sớm do đó tiết kiệm chi phí chữa bệnh, tránh các biểu hiện và biến chứng nguy hiểm. Một trong những nghĩa quan trọng khác của phân tích đột biến gen ATP7B là vai trò của của nó trong phát hiện người mang gen bệnh Wilson. Nếu bệnh nhân Wilson có thể được chẩn đoán theo thang điểm Leipzig thì người mang gen bệnh không thể phát hiện được bởi họ hầu như không có biểu hiện lâm sàng và bất thường trên xét nghiệm sinh hóa. Vì vậy, xét nghiệm di truyền là phương pháp duy nhất để xác định người mang gen bệnh, đặc biệt trong các trường hợp sàng lọc đột biến gen ATP7B cho người hiến tạng trước khi ghép gan cho bệnh nhân Wilson thể suy gan tối cấp bởi người hiến tạng phù hợp phải là người không bị bệnh hoặc không mang gen bệnh Wilson. Hơn thế nữa phát hiện người mang gen bệnh còn là cơ sở của
5 tư vấn di truyền tiền hôn nhân và chẩn đoán trước sinh giảm tỷ lệ sinh con mắc bệnh và nâng cao chất lượng cuộc sống của người bệnh và gia đình. Cho đến nay, một số nghiên cứu về đột biến gen ATP7B ở Việt Nam đã được thực hiện trên qui mô nhỏ nên chưa đại diện cho đặc điểm đột biến gen ATP7B ở người Việt Nam, cũng như chưa xác định được tần suất các loại đột biến gen. Việc phát hiện đột biến cho bệnh nhân Wilson cần thực hiện trên toàn bộ gen ATP7B khiến cho chi phí xét nghiệm rất tốn kém và cần nhiều thời gian, do đó có thể ảnh hưởng đến điều trị bệnh. Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài “Phát hiện người mang đột biến gen ATP7B trong các thành viên gia đình bệnh nhân Wilson” được thực hiện nhằm phát hiện được đột biến thường gặp và vùng thường xảy ra đột biến của gen ATP7B ở Việt Nam để từ đó xây dựng quy trình phát hiện đột biến cho bệnh nhân Wilson, đồng thời phát hiện sớm người bệnh chưa có biểu hiện lâm sàng và người mang gen để làm cơ sở tư vấn di truyền, điều trị, tiên lượng bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson. Xét nghiệm di truyền đã mở ra một bước tiếp cận mới trong chẩn đoán và điều trị bệnh Wilson nói riêng và các bệnh di truyền nói chung ở Việt Nam. Vì vậy, nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu sau: 1. Phát hiện người mang đột biến gen ATP7B cho các thành viên trong gia đình có tiền sử mắc bệnh Wilson. 2. Bước đầu chẩn đoán trước sinh cho thai phụ có tiền sử sinh con mắc bệnh Wilson. Nội dung nghiên cứu: 1. Thu thập mẫu máu ngoại vi của các thành viên trong gia đình có tiền sử sinh con mắc bệnh Wilson để tách chiết DNA. 2. Xây dựng sơ đồ phả hệ của bệnh nhân. 3. Phát hiện đột biến gen ATP7B cho bệnh nhân Wilson và sàng lọc đột biến đích cho các thành viên trong viên trong gia đình bệnh nhân, bao gồm: bố, mẹ, anh, chị, em… 4. Phân tích ảnh hưởng của một số đột biến mới bằng các phần mềm tin sinh. 5. Xây dựng và áp dụng quy trình chẩn đoán trước sinh cho thai phụ có tiền sử sinh con mắc bệnh Wilson. Những đóng góp mới của luận án 1. Chẩn đoán xác định bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh Wilson chưa đủ tiêu chuẩn chẩn đoán trên lâm sàng. 2. Phát hiện 7 đột biến mới trên gen ATP7B ở bệnh nhân Wilson người Việt Nam, bao gồm: H251AfsX19, P868PfsX5, (R723S;H724TfsX34), V1042CfsX79, F1026Y, IVS6+3A>G, IVS20+4A>G.
6 3. Chẩn đoán xác định thêm 13 trường hợp mắc Wilson trong các gia đình tiền sử mắc bệnh Wilson, trong đó có 5 trường hợp bị bệnh Wilson được phát hiện sớm khi chưa có biểu hiện lâm sàng. 4. Phát hiện người mang gen bệnh cho các thành viên trong gia đình bệnh nhân Wilson, làm cơ sở cho tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh. 5. Đã chẩn đoán trước sinh thành công cho 3 thai phụ có tiền sử sinh con mắc bệnh Wilson. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 123 trang (không kể tài liệu tham khảo và phần phụ lục), được chia thành các phần sau: Mở đầu: 02 trang Chương 1: Tổng quan tài liệu (32 trang) Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (17 trang) Chương 3: Kết quả nghiên cứu (44 trang) Chương 4: Bàn luận (25 trang) Kết luận và kiến nghị: 02 trang Các công trình công bố của tác giả: 02 trang Tóm tắt luận án bằng tiêng Anh: 06 trang Tài liệu tham khảo: 15 trang Luận án gồm 21 bảng, 33 hình,143 tài liệu tham khảo gồm tiếng Việt và tiếng Anh, một số trang Web và 8 phụ lục. NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh Wilson 1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Bệnh Wilson là một bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường (NST). Bệnh biểu hiện triệu chứng liên quan đến các bệnh gan, thần kinh, tâm thần (Ferenci và cs, 2012). Năm 1850, Wilson lần đầu tiên được báo cáo là một hội chứng mang đặc điểm lâm sàng có tính chất di truyền trên nhiều y văn. Năm 19021902, Kayser và Fleicher (KF) đã phát hiện đồng lắng đọng ở giác mạc. Vài thập kỉ sau, các nhà khoa học mới hiểu rõ được bệnh học của bệnh Wilson là một bệnh di truyền lặn. Năm 1912, bệnh Wilson được nhà thần kinh học người Anh, Samuel Alexander Kinnier Wilson (18781937) mô tả là bệnh “thoái hóa tiến triển hình hạt đậu”, mang tính chất gia đình, có thể tử vong do bệnh thần kinh kèm theo các bệnh về gan mãn tính dẫn tới xơ gan (Wilson, 1912). Năm 19931994, gen gây bệnh Wilson đã được tách dòng thành công và đã được phân loại là một thành viên của nhóm ATPase vận chuyển cation (Yamaguchi và cs, 1993; Tanzi và cs, 1993; Wu và cs, 1994). Nhiều nghiên cứu phát hiện đột biến gen ATP7B và nghiên cứu ảnh hưởng
7 của đột biến mới trên gen ATP7B đã được thực hiện trên thế giới (Firneisz và cs, 2002; Ferenci và cs, 2006, Zhang và cs, 2011; Forbes và Cox, 1998; Squitti và cs, 2014). 1.1.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam Năm 1965, bệnh Wilson trên người Việt Nam được Scheinberg mô tả lần đầu tiên. Cho đến này, các nghiên cứu về gen ATP7B vẫn còn đang được thực hiện. Năm 20052006, bệnh Wilson trên người Việt Nam đã được mô tả đặc điểm lâm sàng, một số thay đổi trên hình ảnh học và chỉ số sinh hóa (Thái Duy Thành, 2005; Lê Đức Hinh và cs, 2006). Năm 2008, Hoàng Lê Phúc là người đầu tiên đã thực hiện nghiên cứu đột biến gen ATP7B trên bệnh nhân Wilson ở miền Nam, Việt Nam(Hoàng Lê Phúc và cs, 2008). Từ năm 2010, một số nghiên cứu đã bắt đầu được tiến hành lần lượt trên bệnh nhân Wilson ở khu vực miền Bắc và bước đầu xác định được một số đột biến gen ATP7B trên bệnh nhân Wilson ở người Việt Nam (Nguyễn Thị Mai Hương và cs, 2010; Đỗ Thanh Hương và cs, 2010; Phan Tôn Hoàng, 2015; Pham Lê Anh Tuấn và cs, 2017). Tuy nhiên, các nghiên cứu này được thực hiện tại nhiều đơn vị khác nhau, cỡ mẫu tập trung ở một số khu vực dân cư nhất định, nên vẫn chưa đưa ra được kết luận về đặc điểm đột biến gen ATP7B đại diện cho người Việt Nam. Vì vậy, việc phát hiện đột biến gen ATP7B cho bệnh nhân Wilson cần tiếp tục để tìm ra đột biến đặc trưng trên gen ATP7B để có được dữ liệu đột biến gen cho người Việt Nam và làm cơ sở cho sàng lọc đột biến cho bệnh nhân Wilson, đồng thời có ý nghĩa quan trọng trong thực hành lâm sàng (Kusuda và cs, 2000; Leggio và cs, 2007). 1.1.3. Dịch tễ học và phân loại Tần suất mắc bệnh được ước tính vào khoảng từ 1/5000 đến 1/30000, tần suất người mang gen bệnh (carrier) là khoảng 1/90 (Forbes và cs, 1998; Das và cs, 2006). Bệnh gồm 2 thể lâm sàng chính là thể bệnh gan và thể bệnh thần kinh. Ngoài ra, bệnh nhân có thể có kiểu hình kết hợp của thể thần kinh và thể gan (Ferenci và cs, 2012). 1.2. Cơ sở di truyền phân tử bệnh Wilson 1.2.1. Vị trí, cấu trúc phân tử gen ATP7B Gen ATP7B nằm trên nhiễm sắc thể 13 (13q14.3) mã hóa protein ATPase có vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển và đào thải đồng. Kích thước toàn bộ gen vào khoảng 80 kb, gồm có 21 exon và 20 intron, khung đọc mở dài 4,3 kb (Kenney và cs, 2007). 1.2.2. Cấu trúc và chức năng Protein ATP7B (Ptype ATPase) Khối lượng phân tử của Protein ATP7B là 159 kilo Dalton, thuộc ATPase nhóm photphat, có chức năng vân chuyên đông trong tê bao (Fatemi và cs, ̣ ̉ ̀ ́ ̀
8 2002), biểu hiện chức năng chính ở gan, một phần nhỏ hơn ở thận, não và các mô của nhau thai (Kenney và cs, 2007; Galehdari và cs, 2012). 1.2.3. Đặc điểm đột biến gen ATP7B Đột biến gen ATP7B rất đa dạng, có thể xảy ra trên toàn bộ gen (Ferenci, 2006). Cho đến nay, hơn 800 loại đột biến đã được phát hiện (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/all.phptrong), trong đó đột biến sai nghĩa và vô nghĩa thường phổ biến hơn, tiếp đến là đột biến mất đoạn hoặc thêm đoạn nhỏ, đột biến splice site (Ferenci, 2006; Zhang và cs, 2011; Pfeiffer, 2007). Đột biến gen ATP7B thường hiếm gặp và có đặc trưng chủng tộc: đột biến H1069Q phổ biến nhất ở người châu Âu, Bắc Mỹ (1040%) và người Địa Trung Hải (1030%); các nước châu Á bao gồm Trung Quốc, Hàn Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, đột biến thường gặp nhất là R778L (Ferenci và cs, 2006; Zhang và cs, 2011; Chang và cs, 2017). Kiểu hình của bệnh nhân Wilson không chỉ phụ thuộc vào thể đột biến gen ATP7B mà còn phụ thuộc vào vị trí xảy ra đột biến gen (Fan và cs, 2000; Lei và cs, 2004; Bie và cs, 2007; Chang và cs, 2017). Các thể đột biến làm thay đổi khung đọc do đột biến thêm hay mất nucleotid và đột biến vô nghĩa thường dẫn đến thể bệnh nặng (Das và cs, 2006) và vị trí xảy ra đột biến có ảnh hưởng khác nhau đến đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân (Zali và cs, 2011). 1.3. Cơ chế bệnh sinh bệnh Wilson Đồng là một kim loại quan trọng, cần thiết với nhiều hoạt động tế bào khác nhau, bao gồm: hô hấp, chống oxi hóa, tổng hợp dẫn truyền thần kinh, sự hình thành mô liên kết, hình thành sắc tố, cơ chế chuyển hóa sắt (Chaudhry và cs, 2017; Fatemi và cs, 2002; Ferenci, 2004). Bình thường, cơ thể loại bỏ lượng đồng dư thừa ra ngoài nhưng người bị đột biến gen ATP7B sẽ không thể đào thải đồng (Ala, 2007; Chaudhry và cs, 2017) và tích tụ lại trong cơ thể trong khi ceruloplasmin vẫn được bài tiết nhưng ở dạng không bền vững do thiếu liên kết với đồng và nhanh chóng giảm xuống trong máu (Lutsenko và cs, 2007). Ngược lại, khi vượt quá nhu cầu của tế bào, đồng lại trở thành một chất độc và phá hủy chức năng gan, do nó có khả năng sản sinh gốc tự do oxi hóa theo cơ chế hóa học Fanton (Roberts và cs, 2003; Vassiliki và cs, 2010).
9 Hình 1.2.Quá trình chuyển hóa đồng trong gan (Nguồn: Ferenci, 2006) Sinh lý học của bệnh Wilson thể bệnh gan là hậu quả trực tiếp của việc tích lũy đồng trong tế bào gan dưới dạng đồng oxy hóa (Cu1+) dẫn đến phá hủy các tế bào gan (Ferenci, 2004), tế bào gan bị phá hủy tiến triển, cuối cùng dẫn tới viêm gan mãn tính hoạt động, xơ hóa và xơ gan (Lutsenko và cs, 2004). Đồng dư thừa được giải phóng vào dòng máu ở dạng không gắn ceruloplasmin (apoceruloplasmin), hậu quả là đồng tự do lắng đọng khắp cơ thể nhưng nhiều nhất là ở thận, mắt và não bộ. Tại mắt, đồng thường lắng đọng ở mống mắt tạo triệu chứng vòng KayerFleisher (KF) (Ferenci, 2006; Lutsenko và cs, 2007) trong khi tại não, hầu hết đồng lắng đọng ở các nhân não, hay gặp nhất là ở nhân bèo và nhân đậu (con ngươi mắt) (Ferenci, 2006; Lutsenko và cs, 2007). Đồng dư có xu hướng lắng đọng ở gan trước khi tiếp tục tích tụ lại ở hệ thần kinh do vậy hệ thần kinh thường bị ảnh hưởng muộn hơn so với ảnh hưởng của gan. Thông thường, một số biến chứng liên quan đến gan xảy ra trong khoảng 10 năm đầu, số khác có các biểu hiện về thần kinh và tâm thần vào những năm 30 tuổi hoặc muộn hơn (Ala, 2007). 1.5. Phát hiện người mang gen ATP7B bị đột biến và chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson 1.5.1. Phát hiện người mang gen ATP7B bị đột biến Mục tiêu của sàng lọc là phát hiện người mang gen ATP7B bị đột biến hay còn gọi là người mang gen bệnh (carrier), từ đó có thể ước tính được nguy cơ sinh con mắc bệnh cho một cặp vợ chồng có mang gen bệnh, và cung cấp các thông tin cần thiết để phòng tránh được nguy cơ đó. Ngoài ra, nguy cơ mắc bệnh của các anh chị em ruột của bệnh nhân là 25%, nguy cơ mang gen bệnh là 50%, do đó các thành viên trong của gia đình có bệnh nhân Wilson nên được sàng lọc đột biến gen ATP7B trên ca chỉ điểm mắc Wilson (Ferenci và cs, 2012). Người mang gen bệnh là người truyền gen bị đột biến dị hợp tử cho các thế hệ tiếp theo (Ala và cs, 2007), con của họ có nguy cơ mắc bệnh là 5% (Ferenci và cs, 2012). Vì vậy xác định người mang gen bệnh bằng phương pháp di truyền phân tử có ý nghĩa quan trọng trong tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson.
10 1.5.2. Chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson Vì Wilson là bệnh di truyền không chữa khỏi được hoàn toàn, bệnh nhân sẽ phải tuân thủ phác đồ điều trị kết hợp với chế độ dinh dưỡng hợp lý (Ala và cs, 2007). Cách phòng bệnh hiệu quả nhất là tư vấn tiền hôn nhân và chẩn đoán trước sinh nhằm giảm sự phát tán gen bệnh và nguy cơ sinh con mắc bệnh. Chẩn đoán trước sinh cho bệnh Wilson thường được tiến hành cho các gia đình đã có tiền sử sinh con bị bệnh và đã xác định được đột biến gen ATP7B. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2. Đối tượng nghiên cứu 2.2.1. Nhóm bệnh nhân và các thành viên trong gia đình 78 bệnh nhân Wilson thuộc 78 gia đình từ 3 đến 18 tuổi được chẩn đoán và điều trị tại khoa GanMật, Bệnh viện Nhi Trung Ương từ tháng 1/2010 đến 31/11/2017. 208 thành viên thuộc 55 phả hệ của bệnh nhân bị đột biến trên 2 bản sao của gen ATP7B bao gồm: 49 người bố; 53 người mẹ; 83 anh, chị, em ruột của bệnh nhân; 23 các thành viên khác trong dòng họ của bệnh nhân bao gồm anh, chị, em họ, cô, dì, chú, bác… Mẫu bệnh phẩm: 2ml máu ngoại vi chống đông EDTA. 2.2.2. Nhóm chẩn đoán trước sinh Các thai phụ đã có con được chẩn đoán xác định mắc Wilson và đã phát hiện được đột biến trên 2 bản sao của gen ATP7B. Mẫu bệnh phẩm: 1215 ml dịch ối đựng trong ống vô trùng sẽ được nuôi cấy và thu hoạch sau hai tuần để tách DNA tổng số và xác định đột biến đích. 2.2.3. Tiêu chuẩn lựa chọn Bệnh nhân: tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân dựa trên Bảng đánh giá theo tiêu chuẩn của Leipzig 2001 (Ferenci và cs, 2012). Các thành viên trong gia đình trong gia đình bệnh nhân: các thành viên trong gia đình của bệnh nhân, bao gồm: bố, mẹ, anh, chị, em ruột và họ hàng có quan hệ huyết thống. Chẩn đoán trước sinh: thai phụ đã sinh con mắc bệnh Wilson và được chẩn đoán xác định bằng xét nghiệm di truyền, có 2 đột biến dị hợp tử trên 2 bản sao của gen hoặc 1 đột biến đồng hợp tử trên gen ATP7B. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 1. Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả, chọn mẫu theo phương pháp thuận tiện trên cơ sở bệnh nhân có đủ tiêu chuẩn lựa chọn và các tiêu chuẩn loại trừ.
11 2.3.2. Xây dựng phả hệ và thu thập mẫu 2.3.2.1. Biến số nghiên cứu 2.3.2.2. Vẽ phả hệ 2.3.2.3. Công cụ thu thập số liệu 2.3.3. Các phương pháp sử dụng trong phát hiện đột biến gen ATP7B Tách DNA tổng số từ máu ngoại vi và tế bào ối: DNA tổng số được tách chiết bằng kit tách DNA của Qiagen (QiagenDNA blood mini kit, Đức) và điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR: 21 exon của gen ATP7B, trong đó exon 2 được chia thành 5 đoạn nhỏ sẽ được khuếch đại bằng các cặp mồi đặc hiệu. Giải trình tự gen theo phương pháp Sanger: Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng Kit tinh sạch của QIAGEN Qiagen, Đức) và giải trình tự trên máy đọc trình tự gen tự động ABI 3130 Applied Biosystems, Foster city, Hoa Kỳ). Các trình tự gen được, phân tích bằng phần mềm Chromas/Chromas Pro, Seqscape v2.5 và so sánh với trình tự chuẩn trên Ngân hàng gen quốc tế (Gene Bank, NT_024524) bằng chương trình Blast. Đột biến được viết theo danh pháp quốc tế ”Genome Variation Nonmenclature” và tra cứu trong dữ liệu Human Gene Mutation database (HGMDhttp://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/all.php) hoặc cơ sở dữ liệu về các biến dị di truyền (http://www.lovd.nl/3.0/home). Đột biến mới (novel mutation) không được tìm thấy trên các dữ liệu về đột biến gen quốc tế sẽ được phân tích bằng một số phần mềm tin sinh, chẳng hạn như SIFT, Polyphen2, Mutation Taster, BDGP, để dự đoán sự ảnh hưởng của đột biến đến chức năng của gen. 2.3.4. Phân tích đột biến gen ATP7B và xác định kiểu gen của thai nhi DNA của thai nhi sẽ được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR và giải trình tự gen để phát hiện các đột biến đích trên gen ATP7B. Nếu thai nhi chỉ bị một đột biến dị hợp tử, thì thai nhi mang gen bệnh. Nếu thai nhi không có đột biến của bố hoặc mẹ, thì kiểu gen của thai nhi hoàn toàn bình thường. Nếu thai nhi có cả hai đột biến thì thai nhi bị bệnh. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả phát hiện đột biến ATP7B trên 78 bệnh nhân Wilson 3.1.1. Kiểu gen của 78 bệnh nhân Wilson Tỷ lệ nam/nữ trong nghiên cứu là 1,4; tuổi phát bệnh trung bình của nam và nữ là 10,88±4,836, 11,50±4,015. Nghiên cứu đã xác định được 47 loại kiểu gen. Kiểu gen dị hợp tử kép chiếm 62,8%, kiểu gen đồng hợp tử chiếm 33,3%.
12 Đặc điểm và tỷ lệ các đột biến gen ATP7B Nghiên cứu đã phát hiện 27 đột biến gen ATP7B khác nhau, thuộc 4 thể đột biến, bao gồm: đột biến lệch khung; đột biến vô nghĩa; đột biến sai nghĩa; đột biến vùng cắt, nối. + 20 đột biến đã được công bố: S105X, V176SfsX28, D765G, R778L, M769HfsX28, T850I, P902P, IVS122A>G, P992L, K1010T, D1027H, P1052L, I1148T, E1173K, P1245S, N1270S, P1273Q, G1281D, L1371P. + 7 đột biến mới: H251AfsX19, P868PfsX5, (R723S; H724TfsX34), V1042CfsX79, F1026Y, IVS6+3A>G, IVS20+4A>G. Tỷ lệ các loại đột biến và các exon, intron xảy ra đột biến gen ATP7B + Tỷ lệ alen bị đột biến là 96,8 % (151/156 alen nghiên cứu) + Các đột biến có tỷ lệ phát hiện cao, bao gồm: S105X (37,1%), I1148T (7,3%), IVS142A>G (6,6%), L1371P (6,0%), T850I và V176SfsX28 (5,3%). + Đột biến gen ATP7B được phát hiện trên 9 exon và 4 intron. Các exon và intron có tỷ lệ phát hiện đột biến cao, bao gồm: exon 2 (43,0%), exon 16 (9,9%), exon 8 (8,3%), exon 14 và intron 14 (6,6%). Phân tích các đột biến mới trên gen ATP7B bằng chương trình tin sinh Nghiên cứu phát hiện 4/7 đột biến là đột biến thêm/mất 1 nucleotid hoặc 1 đoạn nucleotid; 3 đột biến mới còn lại là đột biến thay thế và đột biến vùng cắt, nối gen. Đột biến F1026Y được phân tích bằng chương trình SIFT, Polyphen, Mutation Taster; IVS6+3A>G, IVS20+4A>G được phân tích bằng phần mềm BDGP và/hoặc MaxEntScan để dự đoán ảnh hưởng của đột biến đến protein ATP7B (Bảng 3.8). Bảng 3.7. Kết quả phân tích đột biến mới bằng chương trình tin sinh Số thứ tự Đột biến Kết quả phân tích Polyphen Mutation BDGP/ acid amin cDNA SIFT 2 (Score) Taster MaxEntScan 1 F1026Y c.3077T>A 1,0 0,00 0,99 2 IVS6+3A>G c.1946+3A>G + 3 IVS20+4A>G c.4124+4 A>G +
13 Kết quả phân tích bằng chương trình SIFT, Popyphen2 và Mutation Taster cho thấy F1026Y là đột biến gây bệnh. Đột biến IVS6+3A>G, IVS20+4A>G đã làm thay đổi vị trí cắt nối mRNA, và do vậy chúng có thể ảnh hưởng đến trượt gen. Từ các kết quả thu được, nghiên cứu đã xác định được vị trí và tỷ lệ xảy ra đột biến trên gen ATP7B (Hình 3.8) và qui trình phát hiện đột biến gen cho bệnh nhân nhi mắc bệnh Wilson (Hình 3.10). Hình 3.8.Vị trí và tỷ lệ các đột biến gen ATP7B trong nghiên cứu Chú thích: chữ màu đỏ là các đột biến mới, chữ màu xanh là các đột biến đã được công bố; exon đổ màu đỏ là các exon có tỷ lệ phát hiện đột biến cao.
14 Hình 3.10. Sơ đồ các bước phát hiện đột biến gen ATP7B cho bệnh nhân Wilson 3.1.2.Kết quả xác định đột biến gen ATP7B trên các thành viên gia đình bệnh nhân 3.1.2.1. Kết quả sàng lọc đột biến đích trên các thành viên của 53 phả hệ Trong 55 phả hệ nghiên cứu, một số bố, mẹ của bệnh nhân đã mất hoặc không thể thu thập được mẫu nên nghiên cứu chỉ tiến hành phát hiện đột biến cho 49 người bố và 53 người mẹ (Bảng 3.11. Kết quả phân tích đột biến gen ATP7B cho thấy, bố mẹ bệnh nhân Wilson đều là người mang gen bệnh. Bảng 3.11. Tỷ lệ người mang gen bệnh ở bố, mẹ của bệnh nhân Wilson Kết quả Tỷ lệ (%) Bố/mẹ bệnh nhân Có mang gen bệnh Không mang gen bệnh Người bố 49 0 100
15 Người mẹ 53 0 100
16 3.1.2.2. Kết quả xác định đột biến gen ATP7B cho anh, chị, em ruột của bệnh nhân Wilson Qua phân tích kết quả sàng lọc đột biến đích 83 cho anh, chị, em ruột của bệnh nhân Wilson, kết quả phân tích đột biến được thể hiện trên Bảng 3.12. Bảng 3.12. Tỷ lệ người mang gen bệnh ở nhóm anh, chị, em ruột của bệnh nhân Wilson Kết quả Tần suất (n) Tỷ lệ (%) Bị bệnh 13 15,7 Có mang gen bệnh 53 65,0 Không mang gen bệnh 17 20,1 Tổng 83 100 Tỷ lệ người bị bệnh và người mang gen bệnh của anh, chị, em ruột của bệnh nhân Wilson lần lượt là 15,7% (13/83) và 65% (53/78). Nghiên cứu đã phát hiện thêm 13 trường hợp là anh, chị, em của bệnh nhân bị bệnh Wilson (Bảng 3.13), trong đó 8/13 trường hợp đã có biểu hiện lâm sàng và 5/13 trường hợp còn lại chưa có triệu chứng của bệnh. Bảng 3.13. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 13 trường hợp bị bệnh Wilson được phát hiện qua sàng lọc gia đình C Đồng Ca Mã bệnh Tuổi/ p Vòng Điể Kiểu hình niệu/24h Kiểu gen Điểm** bệnh nhân giới* (g KF m** (mg) /l) Chỉ điểm WBW100605 nam/14 suy gan tối không S105X/S105X cấ p Sàng lọc WBW160401 nam/11 thể gan S105X/S105X 4
17 Chỉ điểm WBW100901 nữ/10 0,02 thần kinh có 6 S105X/S105X 10 0 Sàng lọc nam/3t 0,02 ≤0,05 không 2 S105X/S105X 6 1 WBW151002B Chỉ điểm WBW120501 nam/11 0,06 V176SfsX28/P1 thể gan 0,516 có 6 10 0 273Q Sàng lọc nam/9 V176SfsX28/P1 thể gan 0 4 273Q WBW120501B Chỉ điểm nữ/18 T850I/IVS14 thể gan không 0 4 2A>G PWBW160402S Sàng lọc WBW160402 nam/11 0,11 T850I/IVS14 thể gan 0,200 không 2 6 33 2A>G Chỉ điểm WBW160604 nữ/13 thể gan không 0 S105X/S105X 4 Sàng lọc nam/9 0,03 thể gan 0,235 không 4 S105X/S105X 8 00 WBW160604B6
18 Chỉ điểm WBW160608 nam/10t 0,02 IVS142A>G/ thể gan 0,216 không 4 8 20 IVS142A>G Sàng lọc WBW170604S3 nữ/7t 0,02 IVS142A>G/ thể gan 0,283 không 4 8 14 IVS142A>G Chỉ điểm WBW160610S2 nữ/ suy gan tối 0,00 5,235 có 7 P992L/P992L 11 cấ p 11 Sàng lọc nam/13 0,04 thể gan 0,240 không 4 P992L/P992L 8 00 WBW160610 Chỉ điểm WBW160802S2 nữ/11 thể gan 0 S105X/S105X 4 Sàng lọc 0,04 nam/8 thể gan 2,930 không 4 S105X/S105X 8 28 WBW160802 Chỉ điểm WBW120601 Nữ/18 0,00 thể gan 2 S105X/I1148T 6 87 Sàng lọc nam/7 0,01 0,072 không 2 S105X/I1148T 6 00 WBW161001B
19 Chỉ điểm WBW160904 nam/4 0,01 0,293 không 4 L902P/P1273Q 8 79 Sàng lọc nam/3th 0,01 không 2 L902P/P1273Q 6 04 WBW170304B Chỉ điểm WBW161202 nữ/13 0,02 Thể gan 2,230 không 4 K1010T/L1371P 8 47 Sàng lọc nam/25 0,00 Thần kinh có 4 K1010T/L1371P 8 14 PWBW17050B Chỉ điểm WBW170303 nữ/11 0,03 thể gan 1,950 có 6 R778L/R778L 10 0 Sàng lọc nữ/6 0,01 thể gan 0,46 không 4 R778L/R778L 8 2 WBW170305 Chỉ điểm nữ/14 0,08 thể gan 0,406 có 6 T850I/D1027H 10 5 WBW170806 Sàng lọc WBW170805 nam/12 0,10 0,121 không 2 T850I/D1027H 6 7
20 Chú thích: Cp (Ceruloplasmin); chữ đậm chữ nghiêng (chưa đủ tiêu chuẩn chẩn đoán khi không có phân tích gen); đổ màu (đã tử vong) ; B (Brotheranh/em trai); S (Sisterchị/em gái); *tính tại thời điểm được chẩn đoán; ceruloplasmin (bình thường 0,200,60 g/L); **: Điểm Leipzig; Đồng niệu/24h (bình thường