Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Tách dòng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất của endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:30

Thêm vào BST

Báo xấu

18
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm thu nhận được chủng vi khuẩn Bt bản địa có khả năng sinh chitinase cao và biểu hiện được chitinase tái tổ hợp trong E. coli phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm hỗ trợ khả năng diệt côn trùng của chế phẩm sinh học BT và ức chế nấm hại cây trồng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Tách dòng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất của endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRỊNH THỊ THU HÀ TÁCH DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENDOCHITINASE TỪ Bacillus thuringiensis PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Ngô Đình Bính Viện Công nghệ sinh học 2. PGS. TS. Đồng Văn Quyền Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: PGS. TS. Lê Mai Hương Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên Phản biện 2: PGS. TS. Dương Văn Hợp Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học Phản biện 3: PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sỹ Phiên Chính thức tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. Vào hồi:……giờ ngày…..tháng…..năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại:
Thư viện Quốc gia Việt Nam Viện Công nghệ sinh học Trang web của Bộ GDĐT
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ̣ ̣ 1. Trinh Thi Thu Hà ̣ , Đông Văn Quyên, Đăng Văn Tiên, Ngô ̀ ̀ ́ Đinh Binh (2014). Phân l ̀ ́ ập gen ma hoa endochitinase t ̃ ́ ừ vi khuẩn Bacillus thuringiensis serovar kurstaki tai Ha Nôi. ̣ ̀ ̣ Tạ p chí Công nghệ Sinh học, 12(4): 757763. 2. Trinh Thi Thu Ha, ̣ ̣ ̀ Đông Văn Quyên, Ngô Đinh Binh (2017). ̀ ̀ ̀ ́ Biểu hiện và tinh sạch protein chitinase của Bacillus thuringiensis serovar kurstaki trong vi khuẩn Escherichia coli. Tạp chí Công nghệ sinh học 15(3): 571579. ̣ ̣ 3. Trinh Thi Thu Hà , Đông Văn Quyên, Ngô Đinh Binh (2018). ̀ ̀ ̀ ́ Tối ưu điều kiện biểu hiện nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng vi khuẩn tái tổ hợp bằng phương pháp bề mặt đáp ứng. Tạp chí Sinh học 40(1): 115 123, DOI: 10.15625/08667160/v40n1.10495.
1 MỞ ĐẦU Trong nhiều năm qua, thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis (Bt) đã được nghiên cứu và ứng dụng để diệt trừ các loại côn trùng hại cây trồng. Trong những năm gần đây, một số nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu tác dụng hỗ trợ khả năng diệt côn trùng của enzyme ngoại bào (chitinase) đối với protein tinh thể của Bt. Chitinase được sử dụng như thuốc trừ sâu sinh học trong nông nghiệp nhờ khả năng phân hủy chitin cấu trúc trong thành tế bào của nấm, côn trùng gây bệnh , tăng hoạt tính diệt côn trùng của chế phẩm Bt và xử lý các chất thải giàu chitin. Ngoài ra, chitinase còn được ứng dụng nhiều trong sản xuất chitooligosaccharide, nano chitin, Nacetyl Dglucosamine. Đây là những sản phẩm giá trị ứng dụng cao và được sử dụng trong thực phẩm, nông nghiệp, y dược. Vì vậy, việc tìm ra chủng sinh chitinase cao và qui trình tạo ra chitinase có hoạt tính cao bằng công nghệ gen nhằm góp phần tăng hiệu quả của chế phẩm sinh học và khai thác ứng dụng trong các lĩnh vực khác là rất cần thiết. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành lựa chọn đề tài luận án: “Tách dòng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất của endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam”. Mục tiêu của đề tài: Thu nhận được chủng vi khuẩn Bt bản địa có khả năng sinh chitinase cao và biểu hiện được chitinase tái tổ hợp trong E. coli phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm hỗ trợ khả năng diệt côn trùng của chế phẩm sinh học BT và ức chế nấm hại cây trồng. Những đóng góp mới của luận án 1. Tuyển chọn được 36 chủng vi khuẩn B. thuringiensis Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao. 2. Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống về endochitinase (tự nhiên và tái tổ hợp) từ chủng B. thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 của Việt Nam có khả năng bảo vệ kép (Dual control) vừa kháng nấm F. oxysporum, R. solani gây bệnh thực vật vừa tăng hoạt tính diệt côn trùng của chế phẩm BT nhằm phục vụ cho phát triển thuốc trừ sâu bệnh sinh học thế hệ mới. 3. Bổ sung cơ sở dữ liệu nguồn gen chitinase của các chủng B. thuringiensis Việt Nam phục vụ cho nghiên cứu, đào tạo và ứng dụng sau này. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 159 trang được chia thành các phần: Mở đầu 4 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu 34 trang; Chương 2: Vật liệu và phương pháp 19 trang; Chương 3: Kết quả 41 trang; Chương 4: Thảo luận 23 trang; Kết luận và kiến nghị 1 trang;
2 Các công trình công bố của tác giả 1 trang; Tóm tắt kết quả luận án bằng tiếng anh 6 trang; Tài liệu tham khảo 17 trang; Phụ lục 13 trang. Luận án có 15 bảng số liệu, 44 hình và 152 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt và tiếng Anh. NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis (Bt) là vi khuẩn đất thuộc chi Bacillus, môi trường sống chính của Bt gồm đất, côn trùng, hạt ngũ cốc, bề mặt thực vật. Bt có dạng hình que, gram dương, hô hấp hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, sinh bào tử, bào tử hình oval, trong quá trình hình thành bào tử hầu hết các chủng Bt đều tổng hợp protein tinh thể độc đối với côn trùng. Tùy theo thành phần protein cấu tạo khác nhau mà các tinh thể có hình dạng khác nhau: hình cầu, hình lưỡng tháp, hình khối lập phương… Bt được phân loại theo nhiều phương pháp khác nhau. Trong đó, phương pháp phân loại theo de Barjac và Bonnefoi dựa trên nguyên lý của phản ứng kháng nguyên kháng thể được sử dụng rộng rãi (khi kháng nguyên tiêm mao kết hợp với kháng thể xảy ra phản ứng ngưng kết tạo cặn lắng màu trắng xuống đáy ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường. Dưới kính hiển vi quang học hoặc đối pha có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lại không chuyển động được. Trong qua trinh sinh tr ́ ̀ ưởng, phat triên vi khuân ́ ̉ ̉ Bt con san sinh chât chuyên hoa ̀ ̉ ́ ̉ ́ co tiêm năng ́ ̀ ứng dung rông rai trong nhiêu linh v ̣ ̣ ̃ ̀ ̃ ực như: môi trường, thực phâm, y ̉ ̣ ̣ ̣ ̣ tê, nông nghiêp, công nghiêp, công nghê sinh hoc… đo chinh la enzyme thuy phân ́ ́ ́ ̀ ̉ chitin (chitinase). Chitinase tư Bt đ ̀ ược biêt đên do tac dung t ́ ́ ́ ̣ ương hô gi ̃ ữa chitinase ́ ừ sâu sinh hoc̣ . Chitinase san sinh t va thuôc tr ̀ ̉ ừ Bt. pakistani co kha năng lam tăng ́ ̉ ̀ ̣ ́ ̣ ́ hoat tinh diêt âu trung ̉ ̉ ̀ Spodoptera exigua cua chung Bt DL5789 lên 2,35 lân (Liu et ̀ al., 2002). Năm 2011, Usharani phân lâp đ ̣ ược gen exochitinase co kich th ́ ́ ươc 1129 ́ ̣ bp, ma hoa 360 acid amin va khang 4 loai nâm gây bênh th ̃ ́ ̀ ́ ́ ̣ ực vât. Vào năm 2015, ̣ các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập gen chi9602 mã hóa chitinase họ 18 từ chủng B. thuringiensis YBT9602, rồi tiến hành gây đột biến gen và biểu hiện trong E. coli. Hoạt tính thủy phân chitin của đột biến ChiW50A tăng 60% với yêu cầu về pH, nhiệt độ, ion kim loại tương tự như chủng dại. Hơn nữa, đột biến ChiW50A thể hiện khả năng kiểm soát sâu bệnh và hoạt động kháng nấm. Tác động cộng hưởng đáng kể của đột biến này với các chế phẩm bào tử tinh thể của B. thuringiensis chống lại ấu trùng Helicoverpa armigera và Caenorhabditis elegans và khả năng ức chế sự phát triển một số nấm gây bệnh thực vật (Ni et al., 2015). Qua thời gian dài phát triển đến năm 2016, gen chiA mã hóa endochitinase của chủng B. thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 2803 đã được tạo dòng và biểu
3 hiện trong E. coli. Protein tái tổ hợp có gắn thêm đoạn 6Histidine được tinh sạch bằng sắc ký ái lực. Emzym tái tổ hợp tinh sạch có tác dụng làm giảm sự tăng trưởng của nấm Colletotrichium gloeosporioides – tác nhân gây bệnh thán thư ở thực vật (FuenteSalcido et al., 2016). Từ những ứng dụng của chitinase từ Bt nêu trên cho thấy, qua trinh nghiên c ́ ̀ ưú ̀ ̉ ̀ đây đu vê chitinase t ừ khâu phân lâp chung Bt co kha năng sinh chitinase đên viêc ̣ ̉ ́ ̉ ́ ̣ lựa chon điêu kiên môi tr ̣ ̀ ̣ ương thich h ̀ ́ ợp cho viêc nâng cao kha năng tông h ̣ ̉ ̉ ợp ́ ̣ chitinase, xac đinh cac điêu kiên anh h ́ ̀ ̣ ̉ ưởng tơi hoat tinh enzym; cung nh ́ ̣ ́ ̃ ư viêc nhân ̣ ̀ ̉ ̣ dong va biêu hiên gen ma hoa chitinase t ̀ ̃ ́ ừ vi khuân Bt trong ̉ ̉ E. coli đê nâng cao hoat ̣ ̉ tinh thuy phân chitin nhăm hô tr ́ ̀ ̃ ợ hoat tinh diêt sâu cua chê phâm BT va kha năng ̣ ́ ̣ ̉ ́ ̉ ̀ ̉ khang nâm gây bênh th ́ ́ ̣ ực vât la h ̣ ̀ ương nghiên c ́ ứu cân thiêt đê tăng hiêu qua cua ̀ ́ ̉ ̣ ̉ ̉ ́ ̉ chê phâm sinh hoc. ̣ 1.2. Chitinase Chitinase (EC 3.2.1.14) thuộc nhóm enzyme thủy phân, là enzyme xúc tác quá trình phân hủy cơ chất chitin không tan trong nươc thành các s ́ ản phẩm chitin oligosaccharide hòa tan trong nước thông qua quá trình thủy phân liên kết β(1,4) glucoside giữa C1 và C4 của hai phân tử Nacetyl Glucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Dựa vào trình tự amino acid đầu ni tơ, sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại chitinase thành 5 nhóm: Nhóm I, nhóm II, nhóm III, nhóm IV và nhóm V. Dựa vao phan ̀ ̉ ưng phân căt ́ ́ chitin, chitinase được phân thành 2 dang: d ̣ ạng 1 là endochitinase (EC.3.2.1.14), dạng 2 là exochitinase gồm 2 loại là chitobiosidase (EC.3.2.1.29) và Nacetyl glucosaminidase (EC.3.2.1.30). Dựa vao câu truc phân t̀ ́ ́ ử, chitinase được chia thanh ̀ ̣ 3 ho: glycohydrolase 18, 19 va 20. ̀ Cac chitinase co nguôn gôc khac nhau co thanh phân câu tao va câu truc khac ́ ́ ̀ ́ ́ ́ ̀ ̀ ́ ̣ ̀ ́ ́ ́ nhau. Sự khác nhau về cấu trúc của các enzyme còn thể hiện ở sự sắp xếp trong không gian của các chuỗi polypeptide, các trung tâm xúc tác và các vùng liên kết cơ chất. Sự khác nhau về cấu trúc không gian của các enzyme dẫn tới sự khác nhau về các tính chất hóa lý của chúng. Cấu trúc điển hình của chitinase gồm 3 vùng: vùng xúc tác (catalytic domain), vùng fibronectin (fibronectinlike domain: FLD) và vùng liên kết cơ chất (chitinbinding domain: CBD). Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của chitinase ma ho ̀ ạt tính enzyme mạnh nhất ở nhiệt độ và pH khac nhau. Anh h ́ ̉ ưởng cua các ion kim lo ̉ ại, chất tẩy rửa, dung môi hữu cơ đôi v ́ ơi chitinase t ́ ừ cac nguôn thu nhân khac nhau cung có s ́ ̀ ̣ ́ ̃ ự khác nhau. Dựa vaò phan̉ ưng ́ phân căt́ chitin, chitinase được phân thành 2 dang: ̣ endochitinase và exochitinase. Endochitinase là nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn oligosaccharide với mức trùng hợp khác nhau, exochitinase là enzyme phân cắt chitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các
4 đơn phân NacetylDglucosamine. Do kiểu phân cắt đặc biệt mà endochitinase thích hợp với cơ chất là chitin và vách tế bào nấm chứa chitin hơn so với exochitinase. Vì vậy, endochitinase có khả năng ức chế sự phát triển của một số nấm gây bệnh thực vật và làm tăng hoạt tính diệt côn trùng của protein tinh thể Bt. ̉ ̣ ̉ ̣ ̉ ̣ ́ ̣ ́ Đê tăng hiêu qua diêt côn trung cua đôc tô Bt va khăc phuc tinh khang thuôc cua côn ̀ ̀ ́ ́ ́ ̉ ̣ trung gây hai, cac nha khoa h ̀ ́ ̀ ọc trên thế giới đã nghiên cứu sử dung hôn h ̣ ̃ ợp giưã protein đôc ṭ ố Bt vơi chitinase (đ ́ ặc biệt là với endochitinase). Chitinase được tạo ra từ nhiều loài vi sinh vật trong tự nhiên, trong đó vi khuẩn được xem là đối tượng sản sinh chitinase phong phú nhất. Trong các loài vi khuẩn thì Bt luôn sản sinh chitinase với hoạt tính cao và chitinase của vi khuẩn Bt thích hợp nhất với cơ chất là bột chitin từ vỏ tôm. Tuy nhiên, chitinase từ các chủng tự nhiên thường tạo ra với hàm lượng rất thấp. Các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng công nghệ protein tái tổ hợp để sản xuất chitinase qui mô công nghiệp. Hướng đi này giúp nâng cao năng suất sinh tổng hợp enzyme đồng thời lượng enzyme thu được dễ dàng tinh sạch hơn khi sử dụng chủng tự nhiên. Hệ biểu hiện E. coli thường được lựa chọn để biểu hiện gen ngoại lai do E. coli dễ nuôi cấy trên môi trường rẻ tiền, tốc độ sinh trưởng nhanh nên co kha năng tông h ́ ̉ ̉ ợp lượng lơn protein tai tô h ́ ́ ̉ ợp. Hàm lượng protein tái tổ hợp thu được phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện lên men chủng tái tổ hợp: nhiệt độ và thời gian cảm ứng, loại chất cảm ứng và nồng độ chất cảm ứng, mật độ tế bào tại thời điểm cám ứng. Khi biểu hiện ở điều kiện tối ưu nhất thì hàm lượng protein tái tổ hợp sẽ thu được ở mức tối đa, đồng nghĩa với việc hạ giá thành sản phẩm tái tổ hợp. Một số chitinase từ vi khuẩn Bt và những loài khác đã được biểu hiện thành công trong E. coli. Vào năm 2013, hai gen chitinase LbCHI31 và LbCHI32 từ Limonium bicolor đã được biểu hiện trong E. coli BL21, enzyme tái tổ hợp tạo ra dưới 2 hình thức là nội bào và ngoại bào. Protein tái tổ hợp ngoại bào được tiết vào môi trường nuôi cấy giúp thuận lợi trong việc thu hồi sản phẩm và đặc biệt protein ngoại bào có hoạt tính enzyme cao hơn so với protein tái tổ hợp nội bào (Liu et al., 2013). Cũng trong thời gian này, tác giả CastanedaRamirez đã biểu hiện gen mã hóa chitinase từ vi khuẩn Bt, chiA74 vào chủng E. coli K12. Kết quả thu được protein tái tổ hợp có hoạt tính enzyme tăng gấp khoảng 500 lần so với E. coli DH5α (CastanedaRamirez et al., 2013). Gần đây, FuenteSalcido và cộng sự đã tạo dòng và biểu hiện gen chiA mã hóa endochitinase từ chủng vi khuẩn Bt tenebrionis DSM2803 trong E. coli. Protein tái tổ hợp có kích thước khoảng 74 kDa được tinh sạch qua cột sắc ký ái lực có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Colletotrichium gloeosporioides gây bệnh thán thư ở thực vật (FuenteSalcido et al., 2016). Như vậy, chitinase co y nghia quan trong trong đ ́ ́ ̃ ̣ ời sông, đăc biêt v ́ ̣ ̣ ới xu hương ́ ̉ ̣ ̣ phat triên môt nên nông nghiêp sach, bên v ́ ̀ ̣ ̀ ưng thi cac loai phân bon, thuôc bao vê ̃ ̀ ́ ̣ ́ ́ ̉ ̣
5 thực vât h ̣ ưu c ̃ ơ hoăc co nguôn gôc sinh hoc đang đ ̣ ́ ̀ ́ ̣ ược đê cao nghiên c ̀ ứu va phat ̀ ́ ̉ Ở Việt Nam, các nghiên cứu về chitinase chủ yếu tập trung vào quá trình tối triên. ưu sinh tổng hợp chitinase ở một số loài vi sinh vật nhằm thu nhận lượng enzym cao nhất, nghiên cứu tính chất của chitinase và biểu hiện gen chitinase trong thực vật giúp cây trồng có khả năng chống lại một số nấm gây bệnh. Do đó quá trình biểu hiện gen mã hóa chitinase từ Bt nhằm thu enzym có hoạt tính cao, có tác dụng ức chế sự phát triển của một số nấm gây bệnh cây trồng, đồng thời hỗ trợ hoạt tính diệt sâu của protein tinh thể Bt là một hướng nghiên cứu mới và rất cần thiết ở Việt Nam. Hướng nghiên cứu này góp phần nâng cao hiệu quả của chế phẩm sinh học bảo vệ cây trồng. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Các mẫu đất và lá (320 mẫu), kit huyết thanh, nấm F. oxysporum và R. solani, sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura), cặp mồi chi F và chi R để khuếch đại gen chiA mã hóa chitinase. Plasmid pGEM®Teasy (Promega) được sử dung trong thi nghiêm tach dong gen. Vector pET28b(+) (Novagen) đ ̣ ́ ̣ ́ ̀ ược sử ̣ ̉ ́ ́ ̉ ̣ dung đê thiêt kê vector biêu hiên gen chiA trong E. coli. 2.2. Phương pháp Phân lập vi khuẩn Bt theo phương pháp của Thiery và Frachon (1997). Phân loại vi khuẩn Bt theo phương pháp của de Barjac va Bonnefoi (1990) ̀ Hoạt tính chitinase được định tính theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Định lượng chitinase theo phương pháp Miller (1959) Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford (1986) Tách chiết DNA của vi khuẩn được tiến hành theo phương pháp của Sambrook và Russell (2001) Tối ưu điều kiện biểu hiện theo phương pháp bề mặt đáp ứng, sử dụng phần mềm Design expert 10.0.6 Quá trình điện di protein được thực hiện theo phương pháp Laemli (1970) Thí nghiệm Zymogram (điện di không biến tính) theo phương pháp của BarbozaCorona (2003) có cải tiến.
6 Thử sâu theo phương pháp của Park và cộng sự (1997) Thử khả năng kháng nấm và kiểm tra sự thủy phân thành tế bào nấm theo Harighi và cộng sự (2007). 2.3. Sơ đồ nghiên cứu Toàn bộ quá trình nghiên cứu được tóm tắt bằng sơ đồ sau: Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis có khả năng sinh chitinase ở Việt Nam. 3.1.1. Phân lâp vi khuân B. thuringiensis ̣ ̉ Từ 320 mẫu đất và lá thu thập từ 7 tỉnh thành khác nhau của Việt Nam đã phân lập được 1026 khuân lac v ̉ ̣ ơi cac đăc tinh cua nhom ́ ́ ̣ ́ ̉ ́ Bacillus cereus. Trong đó, đã xác định được 452 khuẩn lạc là vi khuân Bt nh ̉ ờ khả năng hình thành tinh thể cùng với bào tử. Đã xác định được chỉ số Bt là 0,44; tần suất xuất hiện Bt là 60,94%; chủng sinh tinh thể hình lưỡng tháp chiếm số lượng nhiều nhất (38,93 %), hinh ̀ câu ( ̀ 38,49%) va hinh lâp ph ̀ ̀ ̣ ương (1,54%). Môt sô chung ( ̣ ́ ̉ ̣ ̉ ̣ 4,64%) tao tinh thê dang ́ ̣ ̀ ́ ́ ̉ ̀ ̣ ̣ ̉ ̣ ưng nhưng môṭ không xac đinh. Hâu hêt cac chung đêu sinh môt loai tinh thê đăc tr sô (1 ̉ ́ 6,37%) sinh cac tinh thê khac nhau ́ ́ (Bảng 3.1; Hình 3.1). Bang 3.1. ̉ Kết quả phân lập và xác định hinh dang tinh thê cua cac chung Bt phân lâp ̀ ̣ ̉ ̉ ́ ̉ ̣ Tỉnh Số mẫu Sô chung ́ ̉ Tinh thể Tinh thể Tinh thể Tinh Tinh thành/khu có Bt/số Bt/số hình hình cầu hình lập thể thể vực mẫu khuẩn lạc lưỡng phương hình hình kiểm tra kiêm tra ̉ tháp khác không (%) (chi sô ̉ ́Bt) nhau xác
7 định Hòa Bình/ 38/48 146/356 63/146 70/146 3/146 5/146 5/146 Tây Bắc Bộ (79,2) (0,46) (43,15) (47,94) (2,05) (3,42) (3,42) Hà Nội/ 87/120 158/256 48/158 35/158 1/158 69/158 5/158 Đông Bắc Bộ (72.5) (0,54) (30,38) (22,15) (9.4) (43,67) (4.3) Thừa Thiên 10/46 12/36 6/12 6/12 Huế/Bắc (21,7) (0,33) (0,50) (0,50) Trung Bộ Quảng 16/27 56/136 33/56 20/56 3/56 Nam/Nam (59.2) (0,41) (58,92) (35,71) (5,35) Trung Bộ Đắc Lắc/Cao 26/56 46/154 10/46 27/46 1/46 8/46 nguyên (46) (0,30) (21,73) (58.69) (2,17) (17,39) Đồng 12/15 18/52 12/18 4/18 2/18 Nai/Đông (80) (0,23) (66,66) (22,22) (11,11) Nam Bộ Kiên Giang/ 6/8 16/36 4/16 12/16 Đồng bằng (75.0) (0,44) (25,0) (75.0) sông Mê Kông Tổng số 195/320 452/1026 176/452 174/452 7/452 74/452 21/452 (60,94) (0,44) (38,93) (38,49) (1,54) (16,37) (4,64) 3.1.2. Phân loại dưới loài các chủng B. thuringiensis phân lập Tiến hành phân loại 452 chủng Bt phân lập thu được kết quả: 29,2% (132 chủng) số chủng thuộc typ huyết thanh 3a, 3b, 3c (dươi loai ́ ̀ kurstaki), 16,4% thuôc̣ dươi loai ́ ̀ ̣ ươi loai ̀ aizawai va 16,4% thuôc d ́ ̀ morrisoni. Dươi loai ́ ̀ novosibirsk và ̀ ưng chung kha hiêm pondicheriensis la nh ̃ ̉ ́ ́ ở Viêt Nam v ̣ ơi ty lê 0,6% môi d ́ ̉ ̣ ̃ ưới loai, ̀ ̉ ́ ̉ ưng v 10 chung không co phan ́ ơi khang thê (B ́ ́ ̉ ảng 3.2). Bảng 3.2. Phân loại Bt bằng phương pháp huyết thanh Số Dươi loai ́ ̀ Type huyêt thanh ́ Sô chung phan ́ ̉ ̉ Ty lê (%) ̉ ̣ TT H ứng ngưng kêt́ 1 alesti 3a, 3c 35 7,7 2 sumiyoshiensis 3a, 3d 6 1,3 3 kurstaki 3a, 3b, 3c 132 29,2 4 fukuokaensis 3a, 3d, 3e 18 3,9 5 gallariae 5a, 5b 7 1,5 6 aizawai 7 74 16,4 7 morrisoni 8a, 8b 74 16,4 8 nigeriensis 8b, 8d 16 3,5 9 tolwothy 9 13 2,8 10 israelensis 14 7 1,5 11 indiana 16 13 2,8 12 yunnanensis 20a, 20b 4 0,8
8 13 pondicheriensis 20a, 2oC 3 0,6 14 colmeri 21 12 2,6 15 novosibirsk 24a, 24c 3 0,6 16 coreanensis 25 6 1,3 17 leesis 33 8 1,7 18 konkukian 34 11 2,4 Tông sô chung ̉ ́ ̉ phan ̉ ưng ́ dương 442 97,8 Sô chung phan ́ ̉ ̉ ưng âm ́ 10 2,2 Hình 3.1. Hình dạng tinh thể và bào tử của một số chủng Bt chụp dưới kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 5000 lần 1. Hình lưỡng tháp, 2. Hình cầu, 3. Hình cầu, hình lưỡng tháp và hình khối lập phương, 4. Hình lập phương, C. Tinh thể (Crystal), S. Bào tử (Spore). Theo các nghiên cứu trên thế giới, các chủng vi khuẩn thuộc dưới loài B. thuringiensis var. kurstaki (Btk) vưa có kh ̀ ả năng chống lại ấu trùng bộ Canh vây ́ ̉ (Lepidoptera) vưa co kha năng sinh endochitinase – enzyme co kha năng khang nâm ̀ ́ ̉ ́ ̉ ́ ́ ̣ thực vâṭ va lam gây bênh ̀ ̀ tăng hoaṭ tinh diêt ́ ̣ côn trung cua ̀ ̉ Bt (Barboza, 2008; ̀ ̣ Gomaa, 2012). Vi vây, các ch ủng Btk được sử dụng để kiểm tra khả năng thuy ̉ phân chitin nhằm tìm ra chủng có hoạt tính mạnh nhất. 3.1.3. Sang loc hoat tinh thuy phân chitin cua cac chung B. thuringiensis serovar ̀ ̣ ̣ ́ ̉ ̉ ́ ̉ kurstaki Từ 132 chung Btk, tiên hanh sang loc kha năng sinh enzym thuy phân chitin trên ̉ ́ ̀ ̀ ̣ ̉ ̉ môi trương thach co bô sung chitin nh ̀ ̣ ́ ̉ ư nguôn cac bon (Kamil et al., 2007), thu ̀ ́ được 99 chung sinh chitinase v ̉ ới đường kính vòng phân giải 3 29 mm, trong đó chủng MSS1.1 có đường kính vòng phân giải lớn nhất 29 mm và hoạt tính chitinase cao nhất đạt 0,54 U/ml (Hình 3.2A, B). B B
9 Hinh 3.2. ̀ ̀ ̉ ̣ ̣ ́ ̉ ̉ Hinh anh sang loc hoat tinh thuy phân chitin cua m ̀ ột số chung Bt (A) ̉ và hoạt tính chitinase của 11 chủng Bt có đường kính vòng phân giải ≥ 25mm (B). 3.1.4. Sang loc gen endochitinase (chiA) cua cac chung B. thuringiensis serovar ̀ ̣ ̉ ́ ̉ kurstaki Sử dụng cặp mồi đặc hiệu chi F và chi R để khuếch đại gen chiA (Hình 3.3) từ DNA hệ gen của 99 chủng sinh chitinase, thu được 73 chủng mang gen chiA (chiếm 73,74%). 3kb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 2kb 1,5kb Hinh 3. ̀ 3. Kêt qua sang loc gen ́ ̉ ̀ ̣ chiA từ cac chung Btk phân lâp ́ ̉ ̣ ở Ha Nôi. ̀ ̣ ́ ̉ 18: cac chung Bt1.43, Bt1.55, Bt1.56, Bt1.58, Bt6.12, CM2.3, CM3.3, CM5.9; 1017: HN1.2, TQ3.3, MSS1.1, MSS6.1, HDC4.7, RH2.15, MSS6.3, AV125.9, 9: ̉ DNA chuân (hang Thermo scientific, kich th ̃ ́ ươc 10kb). ́ 3.1.5. Sang ̀ loc̣ hoaṭ tinh ́ khang ́ nâm ́ cuả cać chung ̉ B. thuringiensis serovar kurstaki Từ 36 chung Bt có đ ̉ ường kính vòng thủy phân chitin lớn (1729 mm), đồng thời có hoạt tính chitinase cao (0,31 0,54 U/ml) và có mang gen chiA, tiên hanh ́ ̀ thử hoat tinh khang nâm ̣ ́ ́ ́ F. oxysporum va ̀R. solani thu được 5 chung co kha năng ̉ ́ ̉ khang nâm. ́ ́ Trong đó, chủng MSS1.1 có đường kính vòng ức chế đối với 2 loại nấm F. oxysporum (Hình 3.4) va ̀R. solani lần lượt là 13 và 8 mm. Chủng MSS1.1 được lựa chọn để khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase, nhân dòng và biểu hiện chitinase tái tổ hợp. Hình 3.4. Ảnh kháng nấm F. oxysporum của một số chủng Btk
10 3.2. Khaỏ sat́ điêu ̀ kiên ̉ hợp chitinase của chủng Bacillus ̣ sinh tông thuringiensis MSS1.1 Qua quá trình khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase của chủng Btk MSS1.1 thu được kết quả như sau: Chủng MSS1.1 khi được lên men trong môi trường tối ưu gồm các thành phần (g/l): bột ngô 10, K2HPO4 1, KH2PO4 1, bột đậu tương 10, NaCl 2, MgSO4 0,5, CaCl2 1, MnSO4 0,01, ZnSO4 0,01, FeSO4 0,01; bổ sung chitin huyền phù 0,5%, pH môi trường 7, nhiệt độ nuôi 28oC thì sau 96 giờ lên men hoạt tính chitinase thu được là 0,87 U/ml, tăng 1,36 lần so với môi trường cơ sở ban đầu. 3.3. Nhân dong gen ̀ chiA ma hoa chitinase t ̃ ́ ừ chung vi khuân ̉ ̉ B. thuringiensis var. kurstaki MSS1.1 Gen chiA được nhân dòng trong vector pGEM®Teasy. Kết quả đọc trình tự cho thấy, đoạn gen chiA từ DNA của chủng vi khuẩn MSS1.1 có chiều dài 2031 ́ ̣ ương đông 99% so v nucleotide, co đô t ̀ ơi đoan gen ́ ̣ ̉ chiA cua ch ủng B. thuringiensis serovar kurstaki HD73 trên GenBank có mã số EF581163.2 với 10 vi tri sai khac va ̣ ́ ́ ̀ ́ ̣ ̣ ́ ́ ̉ xuât hiên vi tri căt cua enzym gi ơi han ́ ̣ BamHI (GGATCC) trong khoảng giữa đoạn gen do sự sai khác ở vị trí nucleotide C915T. Trinh t ̀ ự amino acid do gen chiA mã hoa có đ ́ ộ tương đồng 99% so vơi trinh t ́ ̀ ự amino acid của chủng HD73 có mã số ABQ65137.2 với sự thay đổi của 5 amino acid. Phân tích trình tự gen chiA của chủng Bt MSS1.1 cho thấy gen chiA có 34 amino acid đầu N là peptide tín hiệu (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), với vị trí cắt ở giữa amino acid thứ 34 và 35. Phân tích cấu trúc dự đoán của protein ChiA từ chủng Bt MSS1.1 cho thấy, chitinase ChiA có cấu trúc 3 vùng đặc trưng cho họ glycosyl hydrolase 18: vùng thủy phân, vùng fibronectin và vùng gắn kết chitin. 3.4. Biêu hiên gen ̉ ̣ chiA trong vi khuân ̉ E. coli BL21 3.4.1. Thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen chiA trong vi khuẩn E.coli BL21 (DE3) Đoạn gen chiA được gắn vào vector biểu hiện pET28b(+) tại vị trí cắt của EcoRI và XhoI, sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH10B khả biến. Plasmid tái tổ hợp có chứa gen chiA được tách, tinh sạch từ chủng DH10B và biến nạp vào tế bào E. coli BL21(DE3) khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt và cấy trải trên môi trường LB thạch bổ sung 50 µg/ml kanamycin, nuôi 37oC qua đêm. Khuẩn lạc mang gen chiA được nuôi trong môi trường LB lỏng chứa 50 µg/ml kanamycin, ở 37oC và cảm ứng bởi IPTG nồng độ cuối 0,5 mM. Mức độ biểu hiện protein của dòng tế bào được kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide (Hình 3.5A). Kết quả xuất hiện một băng protein khoảng 70 kDa đậm hơn so với mẫu còn lại.
11 Để khẳng định, tiến hành kiểm tra bằng Western blot sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng đuôi His tag. Kết quả (hình 3.5B) cho thấy xuất hiện băng tín hiệu đậm khoảng 70 kDa tương ứng với kết quả biểu hiện. Ngoài ra trên phổ Western blot cũng thấy xuất hiện một số băng tín hiệu thấp hơn so với băng đậm chính (70 kDa) và hoàn toàn không thấy xuất hiện băng nào cao hơn băng đậm chính này. Sự xuất hiện của băng thấp hơn có thể giải thích là do protein chitinase tái tổ hợp bị thủy phân không đặc hiệu bởi protease trong quá trình chuẩn bị mẫu. Xác định hoạt tính enzyme của protein tái tổ hợp qua phản ứng DNS, thu được kết quả 1,10 ± 0,02 U/ml, cao hơn hoạt tính của chủng tự nhiên 1,26 lần. A B Hình 3.5. Phổ điện di protein trên gel SDSPAGE (A) và phân tích Western blot (B) Hình A. Băng 1: Protein tổng số từ chủng E. coli BL21(DE3)pET28b/chiA sau cảm ứng IPTG; Băng 2: Protein tổng số từ chủng E. coli BL21(DE3)pET28b/chiA không cảm ứng IPTG; Hình B: Băng 1: Dịch chiết protein từ E. coli BL21(DE3) mang pET28chiA sau cảm ứng; Băng 2: Dịch chiết protein từ E. coli BL21(DE3) mang pET28chiA không cảm ứng;M: Thang protein chuẩn 3.4.2. Nghiên cứu điều kiện biểu hiện gen chiA của chủng tái tổ hợp 3.4.2.1. Nhiệt độ cảm ứng Kết quả thể hiện ở hình 3.6A cho thấy, ở các điều kiện nhiệt độ 28, 30, 34 và 37oC bản điện di đều cho băng đậm kích thước khoảng 70 kDa. Đặc biệt, mức độ biểu hiện ở 30, 34 và 37oC không khác nhau nhiều. Tuy nhiên, hoạt tính enzym thu được có sự khác biệt đáng kể. Hoạt tính chiA thu được khi biểu hiện ở 30 oC là cao nhất (Bảng 3.3), đồng thời protein tái tổ hợp thể tan thu được khi biểu hiện ở 30ºC cũng cao nhất (Hình 3.6B). Bảng 3.3. Sinh trưởng của tế bào và hoạt tính enzyme ở các nhiệt độ cảm ứng khác nhau Nhiệt độ cảm Mật độ tế bào Hoạt tính
12 ứng (oC) (OD600nm) (U/ml) 25 1,45 ± 0,11 0,76 ± 0,03 28 2,13 ± 0,12 1,22 ± 0,08 30 2,07 ± 0,15 2,27 ± 0,02 34 2,99 ± 0,09 2,16 ± 0,07 37 3,41 ± 0,17 1,12 ± 0,19 A B Hình 3.6. Điện di protein rChiA biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau Hình A. Băng 15: protein tái tổ hợp biểu hiện ở 25, 28, 30, 34 và 37oC sau 6 giờ cảm ứng. Hình B. Protein tổng số, thể tan và thể vùi khi biểu hiện ở 30, 34 và 37oC; M: Maker protein 3.4.2.2. Nồng độ chất cảm cảm ứng Vector biểu hiện pET28b(+) có chứa promoter T7, quá trình biểu hiện gen ngoại lai cần được cảm ứng bởi IPTG, tuy nhiên cần phải xác định nồng độ chất cảm ứng phù hợp, vừa đủ để trung hòa chất ức chế và không ảnh hưởng đến giá thành sản phẩm. Chủng tái tổ hợp E. coli BL21(DE3)pET28b/chiA được biểu hiện ở các nồng độ chất cảm ứng IPTG khác nhau. Sau đó mẫu được thu hồi và đánh giá bằng kiểm tra hoạt tính cùng với điện di SDSPAGE (Hình 3.7A, B). Kết quả cho thấy, ở n ồng đ ộ ITPG 0,05 mM thì hoạt tính enzyme đ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M kDa ạt được cao nhất (đạt 3,17 U/ml). A B Hình 3.7. Kết quả di protein ChiA tái tổ hợp biểu hiện ở các nồng độ IPTG khác nhau (A) và ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng đến hoạt tính protein tái tổ hợp (B). Giếng 1: Mẫu không cảm ứng (nồng độ IPTG là 0); Giếng 29: Protein tái tổ hợp biểu hiện ở các nồng độ IPTG 0,05; 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1,0; 1,3 và 1,5 mM;
13 Giếng M: Thang protein chuẩn. 3.4.2.3. Thời gian cảm ứng Chủng tái tổ hợp được biểu hiện theo mô tả ở phần phương pháp, mẫu được thu sau các khoảng thời gian khác nhau để xác định hoạt tính enzyme. Kết quả cho thấy, sau khi cảm ứng 3 giờ hoạt tính enzyme của protein tái tổ hợp bắt đầu tăng đến 9 giờ sau cảm ứng thì đạt cực đại (4,83 U/ml), kéo dài thời gian sau cảm ứng đến 12 giờ thì hoạt tính bắt đầu giảm (chỉ còn 3,74 U/ml). 3.4.2.4. Mật độ tế bào tại thời điểm cảm ứng Mật độ tế bào trong môi trường lên men ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp protein của chủng tái tổ hợp. Kết quả thể hiện hoạt tính enzyme đạt cao nhất (5,73 U/ml) khi mật độ tế bào OD600nm = 0,7. 3.4.2.5. Chất cảm ứng lactose Lactose được nghiên cứu như chất cảm ứng thay thế IPTG. Ở nồng độ lactose 7 mM mật độ tế bào đạt 4,34 đơn vị và hoạt tính chitinase đạt cao nhất là 5,71 U/ml, hoạt tính này thấp hơn không đáng kể so với khi cảm ứng bằng IPTG nồng độ 0,05 mM (hoạt tính 5,73 U/ml) (Hình 3.8A). Mặt khác, điện di protein tái tổ hợp thu được từ mẫu cảm ứng bằng lactose và IPTG trên gel polyacrylamide cho thấy, cả 2 mẫu đều xuất hiện băng protein đậm trong khoảng 70 kDa, tương ứng với trọng lượng của protein ChiA (Hình 3.8B). A B Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ lactose đến hoạt tính chitinase và sinh trưởng của chủng E. coli tái tổ hợp (A); Phổ điện di protein tái tổ hợp khi cảm ứng bằng lactose (B). Hình B. Băng 1: protein rChiA khi cảm ứng bằng ITPG 0,05mM; Băng 2: protein rChiA khi cảm ứng bằng lactose 7mM; M: Thang protein chuẩn. 3.4.3. Tối ưu khả năng biểu hiện rChiA bằng phương pháp bề mặt đáp ứng Những kết quả trên mới chỉ đánh giá được tác động độc lập của các yếu tố mà chưa đánh giá được tác động cộng hưởng, tương tác giữa các yếu tố với nhau. Với mục tiêu thu được protein ChiA có hoạt tính cao nhất, chúng tôi tìm sự tương tác đồng thời của các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp rChiA như: nồng độ chất cảm ứng, thời gian cảm ứng và mật độ tế bào tại thời điểm cảm ứng.
14 Tiến hành tối ưu theo phương pháp bề mặt đáp ứng với các miền khảo sát của 3 yếu tố ảnh hưởng: Nồng độ chất cảm ứng lactose (A) 5 7 mM; Thời gian cảm ứng (B) 6 12 giờ và mật độ tế bào (C) (OD 600 nm) 0,6 1. Bằng phần mềm Design expert 10.0.6, thu được ma trận gồm 20 thí nghiệm cho 3 yếu tố ảnh hưởng. Các thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần. Kết quả phân tích hồi quy (Bảng 3.4) cho thấy mô hình hoàn toàn có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99,99%. Chuẩn F cho sự không tương thích của mô hình là 5,01 chứng tỏ sự không tương thích của mô hình là không có ý nghĩa, chỉ có 5,08% (P = 0,0508) cơ hội xuất hiện lỗi do độ nhiễu gây nên. Bảng 3.4. Kết quả phân tích hồi quy hoạt độ chitinase Tổng Trung bình Thông số Bậc tự Chuẩn phương phương sai Giá trị P do Fisher sai khác Mô hình 80,22 9 8,91 136,95
15 Như vậy, sau khi tối ưu điều kiện lên men chủng E. coli tái tổ hợp bằng phương pháp bề mặt đáp ứng đã làm tăng hoạt tính enzym tái tổ hợp lên 1,32 lần (hoạt tính trước khi tối ưu đạt 5,71 U/ml). 3.4.4. Tinh sach và xác đ ̣ ịnh hoạt tính của chitinase tai tô h ́ ̉ ợp Kết quả điện di (Hình 3.9A) cho thấy, rChiA sau tinh sạch cho một băng đậm kích thước khoảng 70 kDa (Băng 1) tương ứng với trọng lượng chitinase tái tổ hợp. Hình 3.9B cho thấy, kết quả điện di không biến tính (phương pháp zymogram) thu được vệt sáng ở khoảng kích thước 70 kDa, tương ứng với kích thước của rChiA trước và sau tinh sạch. Do trong sản phẩm rChiA còn một số băng kích thước nhỏ, chúng tôi tiến hành kiểm tra Western blot đối với mẫu protein tái tổ hợp trước và sau tinh sạch. Kết quả hình 3.9C cho thấy, trên phổ Western blot đối với cả mẫu rChiA trước và sau tinh sạch chỉ xuất hiện một băng đậm kích thước khoảng 70 kDa. Kết quả này chứng tỏ protein chitinase đã được tinh sạch thành công. Protein tinh sạch có hoạt độ riêng 72,11 U/mg protein, tăng 4,65 lần so với ban đầu. Hiệu suất thu hồi enzym cao đạt 40,32%. B C Hình 3.9. Điện di SDSPAGE chitinase tinh sạch (A); kiểm tra hoạt tính chitinase bằng zymogram (B) và phân tích Western blot (C). Hình A: M. Thang protein chuẩn, 1. Protein sau tinh sạch, 2. Protein trước tinh sạch. Hình B: 1. Dịch chiết protein không cảm ứng, 2. Dịch chiết protein từ chủng E. coli BL21(DE3)pET28b/chiA trong đệm phosphate pH6, 35. Dịch chiết protein từ chủng E. coli BL21(DE3)pET28b/chiA trong đệm sodium acetate pH6 với hàm lượng protein tương ứng là 1, 5 và 20 µg. Hình C: M. Thang protein chuẩn, 1. Protein sau tinh sạch, 2. Protein trước tinh sạch. 3.5. Nghiên cứu tính chất của chitinase tái tổ hợp 3.5.1. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của rChiA là 40oC (hoạt tính đạt cực đại 72,12 U/mg), rChiA bền ở dải nhiệt độ dưới 35 oC (ở 30oC và 35oC, hoạt tính rChiA giảm không đáng kể, vẫn còn duy trì 94,6 và 91,3% sau khi ủ 24 giờ). 3.5.2. pH tối ưu và độ bền pH
16 pH tối ưu cho hoạt động của rChiA là 7 và hoạt tính rChiA bền nhất khi ở pH7, sau 24 giờ ủ vẫn còn 70,1% hoạt tính 3.5.3. Ảnh hưởng của ion kim loại và EDTA lên hoạt tính chitinase Một số ion kim loại hóa trị 2: Mn2+, Mg2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+ với nồng độ 10 mM đã làm giảm hoạt tính enzyme từ 13,3 – 32,2%. Ngoại trừ ion Hg 2+ ở nồng độ 10 mM làm cho rChiA mất hoàn toàn hoạt tính enzyme. Đặc biệt, ion Ca2+ ở nồng độ 10 mM làm hoạt tính enzyme tăng 17,61%. Hoạt tính enzyme của rChiA tăng từ 1 4% khi bổ sung các ion K+ và Na+ ở nồng độ 110 mM. Ion Ag+ ở nồng độ 10 mM làm hoạt tính enzyme giảm 58%. EDTA nồng độ 110 mM làm giảm hoạt tính enzyme 17,6 – 47,2%. 3.5.4. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa Trong số các chất tẩy rửa thì Trixton X100 với nồng độ 2% đã làm hoạt tính enzyme của rChiA tăng 14,6%. Đặc biệt, SDS với nồng độ 2% thì hoạt tính enzyme của rChiA chỉ còn 66,8%. 3.5.5. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ Hoạt tính enzym của rChiA bị ảnh hưởng bởi dung môi hữu cơ ở các nồng độ khác nhau. Khi bổ sung ethanol, acetone, methanol và nbutanol với nồng độ 10% đã làm hoạt tính giảm đi 1,3; 5,4; 6,3 và 8,4%. Đặc biệt, khi xử lý enzym với các dung môi hữu cơ ở nồng độ 30% thì hoạt tính enzym của rChiA giảm khá nhiều từ 16,3% đến 40,2%. 3.5.6. Động học của phản ứng enzyme Các thông số động học Km và Vmax của rChiA với cơ chất chitin và cơ chất 4MU (GlcNAc)3 được xác định dựa trên phương trình LineweverBurk (Bảng 3.5). Bảng 3.5. Các thông số động học của rChiA với các cơ chất khác nhau Cơ chất Phương trình Vmax Km LineweverBurk (mg/ml) Chitin y=14,199x + 1.596 0,63 µM/ phút ± 0,09 8,90 ± 0,34 4MU(GlcNAc)3 y= 0,7693x + 1,8731 0,53 nM/phút ± 0,087 0,41 ± 0,06 3.5.7. Sản phẩm của sự thủy phân cơ chất bởi chitinase Sử dụng rChiA tinh sạch và colloidal chitin như nguồn cơ chất, các oligosaccharit với mức trùng hợp 2 (GlcNAc2), 3 (GlcNAc3) và 4 (GlcNAc4) đã được phát hiện. Ngoài ra, còn thấy một lượng không nhỏ NacetylD–glucosamine (GlcNAc) (Hình 3.10). GlcNAc (GlcNAc)2 Hình 3.10. Phân tích bản mỏng (TLC) các sản phẩm (GlcNAc)3 thủy phân chitin bởi chitinase (GlcNAc) 4 1. Sản phẩm thủy phân chitin huyền phù sau 24 giờ, 2. Chất chuẩn (Nacetyl D glucosamine và các oligomer (Sigma), 3. rChiA tinh sạch, 4. Chitin huyền phù 0,5% 1 2 3 4