Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Ứng dụng công nghệ sinh học xử lý rác hữu cơ phục vụ sản xuất nông nghiệp, tỉnh Sóc Trăn

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

59
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm phân lập và chọn lọc các dòng vi khuẩn bản địa để xử lý rác hữu cơ và ứng dụng phân hữu cơ vi sinh trong sản xuất nông nghiệp tỉnh Sóc Trăng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Ứng dụng công nghệ sinh học xử lý rác hữu cơ phục vụ sản xuất nông nghiệp, tỉnh Sóc Trăn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã ngành: 62 42 01 07 MAI THI ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC XỬ LÝ RÁC HỮU CƠ PHỤC VỤ SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP TỈNH SÓC TRĂNG Cần Thơ, 2018
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: ……………………………………, Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc …. giờ …. ngày …. tháng …. năm …. Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3:
DANH MỤC LIỆT KÊ CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ 1. Mai Thi, Nguyễn Hữu Hiệp, (2013). "Phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose từ con sùng (Holotrichia paralella)". Kỷ yếu Khoa học Hội thảo Công nghệ Sinh học vùng Đồng bằng sông Cửu Long, Đại Học Cần Thơ, 2013. 2. Mai Thi va Nguyen Huu Hiep, (2015). "Isolation and characterization of cellulose bacteria in organic waste in Soc Trang province, Vietnam". The 6th International Conference on Fermentation Technology for Value Added Agricultural Products (The 6th FerVAAP Conference), Khon Kaen, Thailand". 3. Mai Thi, Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Diệp Minh Tân, (2016). "Phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải cellulose trong rác hữu cơ ở tỉnh Sóc Trăng". Tạp chí Tài Nguyên và Môi trường (ISSN 1859-1477), số 21. Trang 129-131. 4. Mai Thi, Nguyễn Hữu Hiệp, Diệp Tuấn Anh, Lê Minh Hiếu và Huỳnh Tấn Thanh. (2016). "Ứng dụng chế phẩm sinh học STBacilli trong xử lý rác hữu cơ". Tạp chí Tài Nguyên và Môi trường (ISSN 1859-1477), số 21. Trang 125-128. 5. Mai Thi, Nguyễn Hữu Hiệp. (2017). "Phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải protein từ sùng và trùn đất" Tạp chí Tài Nguyên và Môi trường ISSN 1859-1477 số 16. Trang 40-42. 6. Mai Thi, Nguyễn Hữu Hiệp và Dương Ngọc Thúy. (2017). "Phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose từ con sùng (Holotrichia paralella) và Trùn đất (Lubricus terrestris)". Tạp chí Đại Học Cần Thơ ISSN 1859-2333; Tập 50, phần B. Trang 81-90.
Chương I. GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của luận án Cùng với sự gia tăng số lượng và quy mô các ngành nghề sản xuất, sự hình thành các khu dân cư tập trung, nhu cầu tiêu dùng hàng hoá, nguyên vật liệu và năng lượng ngày càng tăng. Những sự gia tăng đó đã tạo điều kiện kích thích các ngành sản xuất, kinh doanh và dịch vụ mở rộng và phát triển nhanh chóng, đóng góp tích cực cho sự phát triển kinh tế - xã hội của đất nước. Tuy nhiên, song song với sự phát triển mạnh mẽ là sự phóng thích một lượng lớn chất thải vào môi trường, đặc biệt là chất thải rắn như chất thải sinh hoạt, chất thải công nghiệp, chất thải y tế, chất thải nông nghiệp, chất thải xây dựng, chất thải nguy hại… Hiện nay, ô nhiễm môi trường đang là vấn đề cấp bách trên mỗi quốc gia và có rất nhiều phương án để khắc phục, giảm thiểu hậu quả của ô nhiễm môi trường. Rác thải sinh hoạt tại Việt Nam, nhất là tại các thành phố lớn chủ yếu được xử lý thô sơ bằng cách vùi tại các bãi chôn lấp, có nguy cơ gây ô nhiễm không khí và nguồn nước ngầm. Tỉnh Sóc Trăng hàng ngày có hơn 248,2 tấn rác thải; hiện nay tỉnh chưa có quy trình công nghệ xử lý rác đạt yêu cầu mà chủ yếu chỉ đổ vào bãi rác hở chờ phân hủy tự nhiên, vừa chiếm diện tích lớn vừa mất vệ sinh tạo nên những điểm nóng ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Chính điều này tác động lớn đến môi trường xung quanh, là nguy cơ tiềm ẩn những dịch bệnh cho con người và làm cho môi trường ngày càng ô nhiễm. Từ những lý do trên, đề tài nghiên cứu “Ứng dụng công nghệ sinh học xử lý rác hữu cơ phục vụ sản xuất nông nghiệp, tỉnh Sóc Trăng” góp phần bảo vệ môi trường hướng đến phát triển bền vững kinh tế - xã hội đi đôi với bảo vệ môi trường đã được thực hiện. 1.2 Mục tiêu của đề tài Phân lập và chọn lọc các dòng vi khuẩn bản địa để xử lý rác hữu cơ và ứng dụng phân hữu cơ vi sinh trong sản xuất nông nghiệp tỉnh Sóc Trăng. 1
Chương II. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Luận án được thực hiện từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2016 tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học và phòng thí nghiệm chuyên sâu của trường Đại học Cần Thơ; phòng thí nghiệm Hóa Sinh thuộc Trung tâm Quan trắc Tài nguyên và Môi trường tỉnh Sóc Trăng; các bãi rác trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng như bãi rác thị trấn Đại Ngãi (huyện Long Phú), bãi rác thị trấn Trần Đề (huyện Trần Đề), bãi rác thị trấn Kế Sách (huyện Kế Sách) và bãi rác xã Tân Long (huyện Ngã Năm) và trang trại của Ông Phạm Hữu Lai (ấp Thạnh An 3, xã Thạnh Thới Thuận, huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng). 2.2. Phương tiện nghiên cứu 2.2.1 Vật liệu Ba mẫu rác hữu cơ và ba mẫu nước rỉ rác được thu từ mỗi bãi rác ở các huyện Trần Đề, Kế Sách và Ngã Năm thuộc tỉnh Sóc Trăng. Mẫu được lưu trữ trong chai thủy tinh vô trùng, trữ ở 4ºC đến khi sử dụng. Các mẫu sùng gồm 12 con có trọng lượng từ 2,5 g đến 15 g và các mẫu trùn đất gồm 12 con có trọng lượng từ 3 g đến 11 g được thu thập từ những đóng rơm đang hoai mục ở huyện Ngã Năm, tỉnh Sóc Trăng. Những mẫu sùng đất và trùn đất được trữ trong thùng có chứa đất mùn hơi ẩm và rơm hoai mục làm thức ăn cho đến khi sử dụng. 2.2.2 Thiết bị và dụng cụ Luận án sử dụng các thiết bị và dụng cụ hiện có tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học và phòng thí nghiệm Chuyên sâu thuộc trường Đại học Cần Thơ và Trung tâm Quan trắc Tài nguyên và Môi trường tỉnh Sóc Trăng. 2
2.2.3 Hóa chất và môi trường Hóa chất khử trùng bề mặt mẫu sùng đất và trùn đất; chất kháng nấm cycloheximide; thuốc thử lugol; thuốc thử Methyl red; hóa chất nhuộm Gram, hóa chất nhuộm bào tử; ... Môi trường sử dụng trong luận án gồm có môi trường phân lập các dòng vi khuẩn phân hủy cellulose, tinh bột và protein; môi trường LB (Luria Broth); môi trường xác định hoạt tính enzyme cellulase, ... 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phân lập vi khuẩn Mẫu rác và nước rỉ rác được pha loãng mẫu với các độ pha loãng 10 , 10-2, 10-3, 10-4 và 10-5. Sau đó trải đều 0,1 mL mẫu ở các nồng độ -1 lên môi trường phân lập vi khuẩn bằng que trải thủy tinh. Sau đó đậy nắp, úp ngược và ủ hiếu khí ở 30oC trong 72 giờ. Đối với sùng và trùn đất, mẫu được rửa sạch bằng nước cất, khử trùng bề mặt bằng cồn 70o trong 5 phút sau đó bằng H2O2 3% trong 5 phút, mổ lấy ít ruột (khoảng một vòng que cấy) trải đều lên môi trường phân lập bằng que trải thủy tinh, ủ ở 30ºC trong 72 giờ ở điều kiện hiếu khí (Shengwei et al., 2012; Kumar et al., 2012). Khi khuẩn lạc phát triển, chọn những khuẩn lạc rời rạc để tách ròng bằng phương pháp cấy ria trên môi trường phân lập. 2.3.2 Quan sát đặc điểm hình thái và sinh hóa của vi khuẩn Các đặc điểm của khuẩn lạc vi khuẩn (hình dạng, độ nổi, dạng bìa, màu sắc và kích thước) được ghi nhận trong suốt quá trình phân lập. Phương pháp nhuộm Gram và đo kích thước tế bào vi khuẩn dựa theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002). Phương pháp xác định khả năng di động và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn dựa theo Nguyễn Lân Dũng (2006). Phương pháp xác định khả năng sinh acid của vi khuẩn trong môi trường có sự hiện diện của glucose và khả năng sinh catalase của vi khuẩn dựa theo Nguyễn Lân Dũng (2006). 3
2.3.3 Khảo sát khả năng phân hủy cellulose, tinh bột và protein Phương pháp giếng thạch được dùng để chọn ra những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose, tinh bột và protein dựa vào đường kính vòng sáng phân hủy cơ chất xung quanh khuẩn lạc trên môi trường phân lập (môi trường CMC, tinh bột và skim milk). Khả năng phân hủy cơ chất (E) được đánh giá qua hiệu số giữa đường kính vòng sáng phân hủy (D) và đường kính khuẩn lạc (d) phát triển từ giếng (E=D-d). Giá trị E càng lớn thì vi khuẩn phân hủy cơ chất càng mạnh (Saini et al., 2012; Alariya et al., 2013 and Kazanas, 1968). 2.3.4 Xác định hoạt tính cellulase Cellulase phân hủy CMC (hoặc cellulose) giải phóng đường khử. Hoạt tính của enzyme cellulase là lượng đường khử sinh ra (µmol) trong 1 phút dưới hoạt động xúc tác của 1 mL enzyme này ở pH 5 và nhiệt độ phòng (Nelson, 1944). Hoạt tính endoglucanase được xác định khi cho enzyme phản ứng với cơ chất CMC trong khi hoạt tính exoglucanase được xác định khi cho enzyme phản ứng với cơ chất bột cellulose (Li- Jung et al., 2010). 2.3.5. Xác định hoạt tính amylase Amylase phân hủy tinh bột tạo đường khử. Hoạt tính enzyme amylase được xác định dựa vào nồng độ đường khử sinh ra thông qua phản ứng trung gian với thuốc thử đồng và asenomolybdate. Một đơn vị hoạt tính amylase là ượng đường khử (µmol) tạo ra trong 1 phút dưới sự xúc tác của 1 mL enzyme amylase ở pH 5,0 và nhiệt độ phòng (Nelson, 1944). 2.3.6 Xác định hoạt tính protease Sản phẩm của quá trình phân hủy protein bởi protease của vi khuẩn có phản ứng màu với thuốc thử Folin. Hàm lượng của sản phẩm phân hủy được định lượng dựa vào đồ thị đường chuẩn tyrosine; từ đó xác định được hoạt tính của enzyme protease. Một đơn vị hoạt tính protease là lượng sản phẩm hòa tan tạo thành (µmol) trong một phút với 4
sự xúc tác của 1 mL enzyme protease ở pH 7,5 và nhiệt độ 37ºC (Cupp- Enyard, 2008). 2.3.7 Khuếch đại đoạn gene 16S rRNA Chọn những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose, tinh bột và protein triển vọng để khuếch đại đoạn gen 16Sr RNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi 27F-1492R (Lane, 1991): 27F- 5’-AGAGTTTAGTCCTTGGCTCAG- 3’ 1492R- 5’-GGCTACCTTGTTACGACTT- 3’ Sản phẩm PCR được diện di trên gel agarose 2%. 2.3.8 Giải trình tự đoạn gen 16S rRNA Sản phẩm PCR được tinh sạch và kiểm tra nồng độ DNA sau khi tinh sạch. Sau đó thực hiện phản ứng PCR gắn huỳnh quang với thuốc nhuộm Big.Dye Terminater v3.1. Đoạn gen 16S rRNA được giải trình tự bằng máy giải trình tự ABI PRISM 3130. 2.3.9 Ứng dụng vi khuẩn xử lý rác hữu cơ Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là một mẻ ủ với khối lượng 100 kg rác hữu cơ đã được phân bố vào một chậu gốm. Thí nghiệm gồm có 5 nghiệm thức được ký hiệu là NT1, NT2, NT3, NT4 và NT5. Trong đó, NT1 không được bổ sung vi khuẩn; NT2 sử dụng chế phẩm sinh học SEM 09; NT3 sử dụng chế phẩm EM; NT4 sử dụng chế phẩm EcoClean và NT5 sử dụng những dòng vi khuẩn đã được định danh của luận án. 2.3.10 Phương pháp xác định mật số vi khuẩn hiếu khí Mật số vi khuẩn hiếu khí được xác định theo phương pháp của Jackson (2000). Mật số tổng vi khuẩn hiếu khí trong 1 mL hoặc 1g mẫu (CFU/mL hoặc CFU/g) bằng tổng số khuẩn lạc đếm được ở đĩa chia cho thể tích cấy trên mỗi đĩa (mL) và độ pha loãng (Jackson, 2000). 5
2.3.11 Phương pháp xác định C, N, P, K trong phân hữu cơ Đo hàm lượng C, N, P, K vào ngày 0, 1, 7, 14, 21, 28, 35 sau khi ủ để đánh giá chất lượng phân hữu cơ vi sinh ủ từ rác. 2.3.12 Ứng dụng phân hữu cơ trồng dưa leo Thí nghiệm được bố theo thể thức khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức và 4 lần lặp lại. Bốn nghiệm thức của thí nghiệm gồm nghiệm thức đối chứng không sử dụng phân bón (NT1); nghiệm thức sử dụng 100% phân bón hóa học tại địa phương (NT2); nghiệm thức sử dụng 100% phân bón hữu cơ vi sinh từ luận án (NT3) và nghiệm thức sử dụng 50% phân bón hóa học và 50% phân hữu cơ vi sinh từ luận án (NT4). Các chi tiêu như chiều dài trái, đường kính trái, trọng lượng trái, số lượng trái/cây, ngày nở hoa và ngày thu hoạch được theo dõi trong suốt quá trình thí nghiệm. 2.3.13 Xử lý kết quả thí nghiệm Kết quả thí nghiệm được biên tập bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và phân tích thống kê bằng phần mềm Minitab 17. Phân tích thống kê bao gồm phân tích phương sai và so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức được bằng kiểm định Fisher (LSD) với độ tin cậy 95%. 6
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Vi khuẩn phân hủy cellulose từ rác và nước rỉ rác 3.1.1 Kết quả phân lập Hai mươi sáu dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose đã được phân lập từ 3 mẫu rác và 3 mẫu nước rỉ rác (được thu ở các huyện Trần Đề, huyện Kế Sách và thị xã Ngã Năm, tỉnh Sóc Trăng) và được ký hiệu là RC1, RC2, ...RC26. 3.1.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa Khuẩn lạc của vi khuẩn phân hủy cellulose từ rác và nước rỉ rác khác nhau ở một hoặc nhiều các đặc điểm bao gồm màu sắc, hình dạng, dạng bìa, đường kính và độ nổi. Hình dạng tế bào vi khuẩn gồm que dài (15,40%), que ngắn (61,50%) và cầu (23,10%). Chiều dài của tế bào vi khuẩn dao động trong khoảng 0,52-4,09 µm và chiều rộng dao động trong khoảng 0,52-1,5 µm. Tất cả 26 dòng vi khuẩn đều có khả năng di động. Số tế bào vi khuẩn có Gram dương là 19 dòng và số tế bào Gram âm là 7 dòng. Có 17 dòng có khả năng tạo nội bào tử và những dòng này đều có tế bào dạng que và Gram dương. Khả năng sinh catalase được ghi nhận ở cả 26 dòng vi khuẩn cho thấy chúng đều có khả năng khử độc H2O2 và sử dụng khí O2 trong quá trình sinh trưởng (Acharya, 2013). Kết quả kiểm tra Methylred cho thấy có 5 dòng sinh acid mạnh khi đổi màu Methyl red sang đỏ, 8 dòng sinh acid trung bình khi đổi màu Methyl red sang màu cam và 13 dòng không sinh acid. 3.1.3 Khả năng phân hủy CMC của các dòng vi khuẩn Hai mươi hai dòng vi khuẩn có năng phân hủy CMC và giá trị E dao động từ 1 đến 22 mm. Dòng RC22 và RC20 phân hủy CMC mạnh nhất với giá trị E tương ứng là 22 và 19 mm (Hình 3.1). Giá trị E của dòng RC22 cao hơn giá trị E của dòng RC20 trong khi hoạt tính enzyme 7
endoglucanase của dòng RC20 (0,173 UI/mL) cao hơn hoạt tính endoglucanase của dòng RC22 (0,059 UI/mL). Sự khác biệt đó có thể do thành phần dinh dưỡng của môi trường xác định khả năng phân hủy cơ chất và môi trường xác định hoạt tính enzyme khác nhau. Hình 3.1: Vòng sáng phân hủy CMC Vòng sáng thể hiện khả năng phân hủy CMC của dòng vi khuẩn RC20 (b) và dòng RC22 (c). Dòng RC18 (a) không có khả năng phân hủy CMC. 3.1.4 Kết quả định danh Dòng RC20 tương đồng với vi khuẩn Bacillus cereus strain BDU9 16S với mức độ đồng hình là 96%. Kết quả này phù hợp với các đặc điểm hình thái và sinh hóa của dòng RC20 như Gram dương, hiếu khí, que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Khả năng phân hủy cellulose của loài vi khuẩn Bacillus cereus đã được tìm thấy ở nhiều nghiên cứu chẳng hạn như nghiên cứu của Kumar et al. (2012) Afzal et al. (2012) và Saleem et al. (2014). Dòng RC22 tương đồng với vi khuẩn Bacillus subtilis strain HCST9 với mức độ đồng hình là 93%. Kết quả này phù hợp với các đặc điểm hình thái và sinh hóa của dòng RC22 như Gram dương, hiếu khí, que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Nhiều nghiên cứu cho thấy loài vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng phân hủy cơ chất celluose như nghiên cứu của Kim et al. (2012), Joseph et al. (2016) và Ajay et al. (2016). 8
3.2 Vi khuẩn phân hủy cellulose từ ruột sùng đất và trùn đất 3.2.1 Kết quả phân lập Hai mươi chín dòng vi khuẩn được phân lập từ ruột sùng đất (Holotrichia parallela) với ký hiệu tương ứng là SC1, SC2, ...SC29 và hai mươi mốt dòng vi khuẩn được phân lập từ ruột trùn đất (Lubricus terrestris ) với ký hiệu tương ứng là TC30, TC31,...TC50. 3.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân hủy cellulose từ ruột sùng đất và trùn đất khác nhau về màu sắc, hình dạng, dạng bìa, đường kính hoặc độ nổi. Tế bào vi khuẩn có dạng que ngắn (72%), dạng cầu (26%) và que dài (2%). Chiều dài tế bào vi khuẩn dao động trong khoảng 0,52 - 3,22 µm và chiều dài ngang dao động trong khoảng 0,52 - 1,74 µm. Tất cả 26 dòng vi khuẩn đều có khả năng di động. Số tế bào Gram dương và Gram âm tương ứng là 30 và 20 dòng. Có 24 dòng có khả năng tạo nội bào tử và những dòng này đều có tế bào dạng que, Gram dương. Tất cả 50 dòng vi khuẩn đều có khả năng sinh catalase tức đều có thể sống trong điều kiện có khí oxy. Mười chín dòng sinh acid mạnh khi đổi màu Methyl red sang đỏ, 14 dòng sinh acid trung bình khi đổi màu Methyl red sang cam và 17 dòng không sinh acid. 3.2.3 Khả năng phân hủy CMC của các dòng vi khuẩn Hai mươi lăm dòng có khả năng phân hủy CMC với giá trị E dao động từ 3 đến 23,8 mm. Bốn dòng triển vọng là SC12 (23,8 mm), SC5 (22,6 mm), TC42 (18,7 mm) và TC36 (17,9 mm) (Hình 3.2). Khi thay cơ chất CMC bằng cơ chất bột giấy, bốn dòng SC12, SC5, TC42 và TC36 vẫn thể hiện khả năng phân hủy cao nhất với giá trị E tương ứng là 24,3; 23,0; 18,3 và 15,3 mm. 9
Hình 3.2: Vòng sáng phân hủy CMC Vòng sáng thể hiện khả năng phân hủy CMC (E) của các dòng vi khuẩn SC5 (a); SC12 (b), TC42 (a1), TC36 (b1). Hai dòng SC3 (c) và TC33 (c1) không có khả năng phân hủy CMC. Bốn dòng SC12, SC5, TC42 và TC36 có hoạt tính exoglucanase va endolucanase đứng đầu. Cụ thể, hoạt tính endoglucanase của SC12, SC5, TC42 và TC36 lần lượt là 0,043 UI/mL, 0,037 UI/mL, 0,029 UI/mL và 0,023 UI/mL và hoạt tính enzyme exoglucanase tương ứng là 0,041 UI/mL, 0,036 UI/mL, 0,028 UI/mL và 0,025 UI/mL. Bốn dòng này được chọn để giải trình tự đoạn gen 16S rRNA. 3.2.4 Kết quả định danh Dòng SC12 tương đồng với Bacillus subtilis strain GX S-15 16S với độ đồng hình là 97% và dòng SC5 tương đồng với Bacillus subtilis strain CMST 03/13COR5 với độ đồng hình là 98%. Kết quả này phù hợp với các đặc điểm hình thái và sinh hóa của chi Bacillus như Gram dương, hiếu khí, que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Loài vi khuẩn B. subtilis có khả năng phân hủy cellulose như đã thảo luận ở mục 3.1.4. Dòng TC42 tương đồng với vi khuẩn Bacillus megaterium strain F3-1-10-16s với độ đồng hình là 96% và TC36 tương đồng với vi khuẩn Bacillus megaterim strain AU03-16s với độ đồng hình là 98%. Kết quả này phù hợp với các đặc điểm hình thái và sinh hóa của chi Bacillus như Gram dương, hiếu khí, que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Một số nghiên cứu trên thế giới gần đây như nghiên cứu của 10
Aftab (2013), Ferbiyanto et al. (2015) và Ribeiro et al., (2016) chứng minh B. megaterium có khả năng phân hủy cellulose. 3.3 Vi khuẩn phân hủy tinh bột từ rác và nước rỉ rác 3.3.1 Kết quả phân lập Từ 3 mẫu rác và 3 mẫu nước rỉ rác, 30 dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột đã được phân lập và được ký hiệu là RB1, RB2, ...RB30. 3.3.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột từ rác và nước rỉ rác khác nhau về hình dạng, độ nổi, dạng bìa, màu sắc hoặc đường kính khuẩn lạc. Tế bào vi khuẩn có dạng que ngắn (86,70%) và dạng que dài (13,30%). Tất cả 30 dòng vi khuẩn đều có khả năng di động. Chiều dài của tế bào vi khuẩn dao động trong khoảng 0,87 - 3,74 µm và chiều rộng dao động trong khoảng 0,52 - 1,39 µm. Số tế bào vi khuẩn có Gram dương là 21 dòng và số tế bào Gram âm là 20. Có 21 dòng có khả năng tạo nội bào tử và những dòng này đều có tế bào dạng que, Gram dương. Tất cả 30 dòng vi khuẩn đều có khả năng sinh catalase cho thấy chúng đều có khả năng sử dụng khí oxy. Mười hai dòng sinh acid mạnh khi đổi màu Methyl red sang đỏ, 10 dòng sinh acid trung bình khi đổi màu Methyl red sang cam và 8 dòng không sinh acid. 3.3.3 Khả năng phân hủy tinh bột của các dòng vi khuẩn Tất cả 30 dòng vi khuẩn đều có khả năng phân hủy tinh bột và giá trị E dao động trong khoảng 1,57 đến 23,5 mm. Dòng RB8 phân hủy tinh bột mạnh nhất với giá trị E 23,5 mm; kế đến là dòng RB17 (E = 21,47 mm). Hoạt tính enzyme amylase của RB8 và RB17 tương ứng là 22,2 và 15,6 UI/mL. Dựa theo khả năng phân hủy tinh bột, hai dòng này đã được chọn để giải trình tự đoạn gene 16S rRNA. 11
3.3.4 Kết quả định danh Dòng RB8 có độ tương đồng 96% với vi khuẩn Bacillus flexus gene 16S rRNA khi so sánh trình tự gen 16S rRNA của dòng này với trình tự gene 16S rRNA trên ngân hàng dữ liệu NCBI. Theo (Zhao et al., 2008) và Pal et al. (2014) thì Bacillus flexus là một loài vi khuẩn Gram (+), hình que, di động, sử dụng được O2 và có khả năng tạo nội bào tử và đều phù hợp với đặc điểm hình thái, sinh hóa của dòng RB8. Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy Bacillus flexus là vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột và có tiềm năng ứng dụng như nghiên cứu của Zhao et al. (2008) và Chen et al. (2013). Dòng RB17 có độ tương đồng 99% với vi khuẩn Bacillus subtilis strain NG3-5 16S. Kết quả này phù hợp với các đặc điểm hình thái và sinh hóa của dòng RB17 như Gram dương, hiếu khí, que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Khả năng phân hủy tinh bột của loài vi khuẩn Bacillus subtilis đã được tìm thấy ở nghiên cứu của Panneerselvam và Elavarasi (2015) và Vijayalakshmi et al. (2012). 3.4 Vi khuẩn phân hủy tinh bột từ ruột sùng và trùn đất 3.4.1 Kết quả phân lập Từ ruột 3 mẫu con sùng và 3 mẫu con trùn, 28 dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột đã được phân lập; trong đó 14 dòng vi phân lập từ ruột con sùng đất được ký hiệu là SB15, SB16, …SB28 và 14 dòng vi khuẩn phân lập từ ruột con trùn đất được ký hiệu là TB1, TB2,…TB14. 3.4.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột từ ruột sùng và trùn đất khác nhau ở màu sắc, hình dạng, dạng bìa, đường kính hoặc độ nổi. Tất cả 28 dòng vi khuẩn đều có khả năng di động và tế bào dạng que; trong đó que ngắn là 26 dòng và que dài là 2 dòng. Số dòng vi khuẩn Gram dương là 15 trong khi số vi khuẩn Gram âm là 13 dòng. Tất cả những dòng vi khuẩn Gram dương đều có khả năng tạo nội bào 12
tử. Chiều dài của tế bào dao động từ 1,2 đến 3 µm và chiều rộng dao động từ 0,8 đến 1,5 µm. Tất cả 28 dòng vi khuẩn đều sinh catalase chứng tỏ chúng đều có khả năng sử dụng khí oxy trong quá trình sinh trưởng. Bảy dòng sinh acid mạnh khi đổi màu Methyl red sang đỏ, 12 dòng sinh acid trung bình khi đổi màu Methyl red sang màu cam và 9 dòng không sinh acid. 3.4.3 Khả năng phân hủy tinh bột của các dòng vi khuẩn Hai mươi bảy dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột với giá trị E dao động từ 5,7 mm đến 23,4 mm. Ba dòng SB25, TB6 và SB16 có vòng sáng phân hủy tinh bột lớn nhất với giá trị E tương ứng là 23,4 mm, 21,7 mm và 21,57 mm (Hình 3.3). Mặc dù dòng SB25 có vòng sáng phân hủy tinh bột lớn nhất nhưng hoạt tính enzyme amylase lại thấp nhất với 13,64 UI/mL, trong khi hoạt tính amylase cao nhất được ghi nhận ở dòng TB6 (33,71 UI/mL). Sự khác biệt đó có thể do thành phần dinh dưỡng của môi trường xác định khả năng phân hủy cơ chất và môi trường xác định hoạt tính enzyme khác nhau. Hình 3.3: Vòng sáng phân hủy tinh bột Vòng sáng phân hủy tinh bột dòng vi khuẩn SB16 (a) và TB6 (b) 3.4.4 Kết quả định danh Dòng TB6 tương đồng với Bacillus megaterium (gene for 16S rRNA) với độ đồng hình là 97%. Kết quả này phù hợp với các đặc điểm hình thái và sinh hóa của dòng TB6 như Gram dương, hiếu khí, que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Nhiều nghiên cứu cho 13
thấy Bacillus megaterium là một loài vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột và có tiềm năng ứng dụng trong đời sống (David et al., 1987; Brumm et al., 1991 và Mary et al., 1980). Dòng SB16 tương đồng với Bacillus cereus strain FORC 024 với độ đồng hình là 95%. Kết quả này phù hợp với các đặc điểm hình thái và sinh hóa của dòng SB16 như Gram dương, hiếu khí, que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Bacillus cereus là loài vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột (Sanjoy et al., 2009) và còn được dùng để sản xuất amylase sử dụng trong công nghiệp (Sivakumar et al., 2012). Dòng SB25 có độ tương đồng 96% với vi khuẩn Bacillus flexus gene 16S rRNA. Theo (Zhao et al., 2008) và Pal et al. (2014) thì Bacillus flexus là một loài vi khuẩn Gram (+), hình que, di động, sử dụng được O2 và có khả năng tạo nội bào tử. Quá trình khảo sát của luận án cũng cho thấy dòng SB25 là vi khuẩn Gram (+), hình que (dài), di động và có thể sống trong môi trường hiếu khí. Khả năng phân hủy tinh bột của loài Bacillus flexus đã được thảo luận ở mục 3.3.4. 3.5 Vi khuẩn phân hủy protein từ rác và nước rỉ rác 3.5.1 Kết quả phân lập Từ 3 mẫu rác và nước rỉ rác, 29 dòng vi khuẩn phân hủy protein đã được phân lập và được ký hiệu tương ứng là RPp, RPs và RPg. 3.5.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn khác nhau ở một hoặc nhiều các đặc điểm bao gồm màu sắc, hình dạng, dạng bìa, đường kính và độ nổi. Tất cả 29 dòng vi khuẩn đều có khả năng di động và tế bào đều dạng que; trong đó que ngắn là 20 dòng (69%) và que dài là 9 dòng (31%). Số dòng vi khuẩn Gram dương là 20 dòng và số vi khuẩn Gram âm là 9 dòng. Tất cả những dòng vi khuẩn Gram dương đều có khả năng tạo nội bào tử. Chiều dài của tế bào dao động từ 0,87 đến 4,22 µm và chiều rộng dao động từ 0,52 đến 2,33 µm. 14
Tất cả 30 dòng vi khuẩn đều có khả năng sinh catalase chứng tỏ chúng đều có khả năng sử dụng khí oxy. Mười hai dòng sinh acid mạnh khi đổi màu Methyl red sang đỏ, 11 dòng sinh acid trung bình khi đổi màu Methyl red sang màu cam và 6 dòng không sinh acid. 3.5.3 Khả năng phân hủy protein của các dòng vi khuẩn Tất cả 29 dòng vi khuẩn đều có khả năng phân hủy protein và giá trị E dao động từ 5,67 đến 28,77 mm. Ba dòng có vòng sáng phân hủy lớn nhất là RPs19 (28,77 mm), RPp9 (28,57 mm) và RPg15 (27,57 mm) (Hình 3.4) có hoạt tính enzyme protease tương ứng là 50, 65 và 45 UI/mL. Mặc dù dòng RPs19 có vòng sáng phân hủy skim milk lớn nhất nhưng hoạt tính enzyme cao nhất lại được ghi nhận ở dòng RPp9. Sự khác biệt đó có thể do thành phần dinh dưỡng của môi trường xác định khả năng phân hủy cơ chất và môi trường xác định hoạt tính enzyme khác nhau. Hình 3.4: Vòng sáng phân hủy skim milk Vòng sáng phân hủy skim milk của dòng RPs19 (a) và RPp9 (b) 3.5.4 Kết quả định danh Dòng RPp9 tương đồng với vi khuẩn Bacillus aquimaris strain HNS62 16S với mức độ đồng hình là 99%. Kết quả này phù hợp với các đặc điểm hình thái và sinh hóa của dòng RPp9 như Gram dương, hiếu khí, que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Nhiều nghiên cứu đã chứng minh Bacillus aquimaris có khả năng phân hủy protein (Abhijit et al., 2012; Amutha and Priva, 2011; Chandrashekhar, 2012; Shivanand and Jayaraman, 2009). 15
Dòng RPs19 tương đồng với Bacillus aryabhattai strain rif 200898 16S với độ đồng hình là 96%. Kết quả này phù hợp với các đặc điểm hình thái và sinh hóa của dòng RPs19 như Gram dương, hiếu khí, que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Sự phân hủy protein của loài Bacillus aryabhattai đã được ghi nhận trong nghiên cứu của Sharma et al. (2014) rằng dòng Bacillus aryabhattai K3 tạo vòng sáng phân hủy lớn trên môi trường skim milk và hoạt tính protease của dòng này lên đến 952 UI/mL. Dòng RPg15 được xác định thuộc chi Bacillus và tương đồng với dòng Bacillus sp. S42 16s với độ đồng hình 84%. Những đặc điểm hình thái và sinh hóa của dòng RPg15 như Gram dương, hiếu khí, que dài, di động và tạo nội bào tử cho thấy dòng RPg15 thuộc chi Bacillus là hợp lý (Bergey et al., 1957). Tuy nhiên, vì chưa định danh được đến loài nên khả năng phân hủy protein của vi khuẩn RPg15 chỉ được ghi nhận trong phạm vi của luận án này. 3.6 Vi khuẩn phân hủy protein từ ruột sùng và trùn đất 3.6.1 Kết quả phân lập Từ ruột sùng và trùn đất, 50 dòng vi khuẩn phân hủy protein đã được phân lập; trong đó có 17 dòng phân lập từ ruột sùng với ký hiệu là SPp, SPs hoặc SPc và 33 dòng phân lập từ ruột trùn đất với ký hiệu là TPp, TPc, TPs hoặc TPt. 3.6.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân hủy protein từ ruột sùng và trùn đất khác nhau về một hoặc nhiều các đặc điểm gồm hình dạng, dạng bìa, độ nổi, màu sắc và đường kính. Những dòng vi khuẩn này đều có khả năng di động và có tế bào dạng que ngắn (70%), dạng que dài (8%) hoặc dạng hình cầu (22%). Số dòng vi khuẩn Gram dương và Gram âm tương ứng là 31 và 19 dòng. Chiều dài của tế bào biến động từ 0,52 - 4,29 µm trong khi chiều rộng nằm trong khoảng 0,52 - 5,17 mm. Những dòng vi khuẩn Gram dương đều có khả năng tạo nội bào tử. 16
Tất cả 50 dòng vi khuẩn từ ruột sùng và trùn đất đều có khả năng sử dụng O2 vì đều sinh catalase. Hai mươi dòng vi khuẩn có khả năng sinh acid mạnh khi đổi màu Methyl red sang đỏ, 21 dòng có khả năng sinh acid trung bình khi đổi màu Methyl red sang cam và 9 dòng không sinh acid. 3.6.3 Khả năng phân hủy protein của các dòng vi khuẩn Tất cả 50 dòng vi khuẩn đều có khả năng phân hủy protein với E dao động từ 6,57 đến 33,80 mm. Ba dòng tạo vòng sáng lớn nhất là SPp5 (33,80 mm), TPt35 (31,93 mm) và TPs45 (31,50 mm) (Hình 3.5) với hoạt tính protease tương ứng bằng 80, 80 và 100 UI/mL. Mặc dù dòng SPp5 có vòng sáng phân hủy skim milk lớn nhất nhưng hoạt tính enzyme cao nhất lại được ghi nhận ở dòng TPs45. Sự khác biệt đó có thể do thành phần dinh dưỡng của môi trường xác định khả năng phân hủy cơ chất và môi trường xác định hoạt tính enzyme khác nhau. Hình 3.5: Vòng sáng phân hủy skim milk Vòng sáng phân hủy skim milk của các dòng SPp5 (a) và TPc18 (b) 3.6.4 Kết quả định danh Dòng TPs45 tương đồng với Bacillus megaterium strain rif200898 16S với độ đồng hình 99% và dòng TPc18 tương đồng với Bacillus megaterium strain YKA3 16S với độ đồng hình 92%. Hai dòng TPs45 và TPc18 đều là vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, có tế bào dạng que và có khả năng tạo bào tử. Đó cũng là những đặc điểm của loài B. megaterium theo mô tả của Bergey et al. (1957). Khả năng phân hủy 17