Tóm tắt Luận án tiến sĩ: Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:30

Thêm vào BST

Báo xấu

65
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm phân lập được ít nhất 01 chủng Bacillus subtilis tại một số tỉnh ĐBSCL có các đặc tính probiotic như: khả năng sinh enzyme tiêu hóa (amylase, protease, lipase); chịu được tác động của dịch tiêu hóa (dịch vị, muối mật), có khả năng bám dính vào niêm mạc ruột và đối kháng với một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột (Salmonella, E. coli).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ: Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Bệnh lý học & Chữa bệnh vật nuôi Mã ngành: 62 64 01 02 LÊ THỊ HẢI YẾN TUYỂN CHỌN CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH ĐƢỜNG TIÊU HÓA TRÊN GÀ Cần Thơ - 2018
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC HIỀN Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại:…………………………………., Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc …. giờ …. ngày …… tháng …..năm ………. Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 1. Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. 2. Thư viện Quốc gia Việt Nam.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Lê Thị Hải Yến và Nguyễn Đức Hiền, 2015. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis ứng dụng làm probiotic từ đất và phân gà tại TP. Cần Thơ. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, số 6, trang 55-62 2. Lê Thị Hải Yến và Nguyễn Đức Hiền, 2015. Khảo sát đặc tính prbiotic của một số chủng Bacillus phân lập tại một số trại gà thành phố Cần Thơ. Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc Chăn nuôi – Thú y 2015. ISBN 978-604-60-2019-6. Nhà xuất bản Nông nghiệp, trang 485-491 3. Le Thi Hai Yen and Nguyen Duc Hien, 2016. Isolation and identification of Bacillus subtilis isolated from soil and feces on chicken farms in the Mekong delta, Vietnam. Proceedings of The 19th Federation of Asian Veterinary Associations Congress, Ho Chi Minh city, September 6-9th, 2016. Vietnam National University-Ho Chi Minh city Press, page 143- 147 4. Lê Thị Hải Yến và Nguyễn Đức Hiền, 2016. Khảo sát đặc tính probiotic các chủng vi khuẩn phân lập tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. ISSN 1859-2333. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ số 2, trang 26- 32 5. Lê Thị Hải Yến và Nguyễn Đức Hiền, 2017. Khảo sát khả năng chịu acid dạ dày - muối mật và khả năng bám dính của hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis AG27 và VL28. Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc Chăn nuôi – Thú y 2017. ISBN 978-604-60-2492-7. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, trang 341-346 6. Le Thi Hai Yen and Nguyen Duc Hien, 2017. Isolation and characterization of probiotic Bacillus subtilis VL28 on chicken farms in Vietnam. Proceedings of 33rd World Veterinary Congress, Incheon – Korea, August 27-31, 2016. 7. Le,T.H.Y. and Nguyen,D.H., 2017. Bacillus subtilis strain VL28 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. GenBank: KY346980.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KY346980
CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 . Tính cấp thiết của đề tài Sự phát triển mạnh mẽ của ngành chăn nuôi gà công nghiệp trong những thập niên gần đây đã mang lại nhiều lợi ích kinh tế - xã hội to lớn, nhưng cũng làm nảy sinh nhiều vấn đề cần được quan tâm xem xét. Một trong những vấn đề cần quan tâm giải quyết là việc sử dụng rộng rãi các chất kháng sinh để phòng bệnh và kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi. Việc này đã làm gia tăng các dòng vi khuẩn kháng thuốc trong tự nhiên, có ảnh hưởng rất lớn tới hiệu quả sử dụng kháng sinh trong điều trị các bệnh viêm nhiễm trên người. Do vậy, nhiều nước tiên tiến đã quyết định hạn chế việc sử dụng các chất kháng sinh trong chăn nuôi. Để thay thế kháng sinh trong chăn nuôi, các nhà khoa học đã đưa ra nhiều giải pháp khác nhau trong đó có biện pháp sử dụng probiotic - những vi sinh vật sống hữu ích cho hoạt động tiêu hóa và có tác dụng tăng cường sức khỏe nói chung cho người và động vật. Bacillus subtilis là một vi khuẩn rất phổ biến trong tự nhiên, hầu như không có độc tính trên người cũng như nhiều loài động vật và có sức đề kháng cao với nhiều tác nhân vật lý và hóa học. Do vậy, từ lâu vi khuẩn này được chọn nghiên cứu để làm probiotic cho người và vật nuôi theo mô hình công nghiệp. Tuy nhiên, B. subtilis rất đa dạng về các đặc tính sinh học nên không phải tất cả các chủng đều có thể sử dụng làm probiotic và mỗi chủng probiotic chỉ phù hợp và có hiệu quả khi sử dụng cho một đối tượng nhất định. Đề tài “Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà” được thực hiện nhằm nghiên cứu tìm giải pháp mới thay thế sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, nâng cao năng suất, hiệu quả trong chăn nuôi gà công nghiệp và giảm bớt nguy cơ lan rộng các dòng vi khuẩn đề kháng kháng sinh trong tự nhiên. 1.2. Mục tiêu: 1. Phân lập được ít nhất 01 chủng Bacillus subtilis tại một số tỉnh ĐBSCL có các đặc tính probiotic như: khả năng sinh enzyme tiêu hóa (amylase, protease, lipase); chịu được tác động của dịch tiêu hóa (dịch vị, muối mật), có khả năng bám dính vào niêm mạc ruột và đối kháng với một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột (Salmonella, E. coli). - Xác định được liều dùng hiệu quả của chủng probiotic phân lập được trong phòng bệnh đường ruột ở gà do E. coli và S. enterica gây ra. 1
1.3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis. - Phạm vi nghiên cứu: Các chủng Bacillus subtilis được phân lập từ đất và phân gà ở 7 tỉnh thành thuộc Đồng bằng sông Cửu Long, bao gồm: Cần Thơ, Hậu Giang, An Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Kiên Giang. 1.4. Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên chọn lọc được chủng B. subtilis bản địa có hiệu quả trong phòng bệnh đường tiêu hóa trên gà tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long, đặc biệt là bệnh do S. enterica và E. coli gây ra. - Đã phân lập và giám định chính xác 21 chủng B. subtilis bản địa từ phân và đất chuồng gà ở khu vực ĐBSCL và tuyển chọn được chủng B. subtilis VL28 có thể sử dụng làm probiotic trên gà. - Đã chứng minh bằng thực nghiệm việc bổ sung chủng B. subtilis VL28 10 CFU/g với liều 5g/kg thức ăn có khả năng thay thế kháng sinh ngăn ngừa 7 quá trình nhiễm trùng đường ruột ở đàn gà được gây nhiễm thực nghiệm với S. enterica và E. coli, đồng thời làm tăng mức tăng trưởng cũng như giảm hệ số chuyển hóa thức ăn so với gà đối chứng. - Đã được ngân hàng gen NCBI công nhận trình tự gen 16S rRNA của B. subtilis VL 28 với mã số truy cập KY346980. (có thể truy cập trên trang web https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ky346980) - Là công trình nghiên cứu, phân lập, tuyển chọn vi khuẩn probiotic một cách hệ thống theo tiêu chuẩn Quốc tế. 1.5. Ý nghĩa thực tiễn của luận án Chọn lọc được chủng B. subtilis bản địa có tiềm năng dùng làm probiotic phù hợp với điều kiện chăn nuôi tại Đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả nghiên cứu của đề tài dùng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm probiotic, phòng chống bệnh đường ruột gia cầm, làm tăng năng suất chăn nuôi đem lại lợi nhuận cao cho người chăn nuôi. Tạo cơ sở khoa học để đề xuất hạn chế sử dụng kháng sinh làm chất kích thích tăng trưởng và phòng bệnh trong chăn nuôi. Góp phần tạo được nguồn thịt gia cầm sạch, không tồn dư kháng sinh, bảo vệ sức khỏe cộng đồng. 2
Chƣơng III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đề tài được thực hiện với 3 nội dung: 3.1. Nội dung 1: Phân lập các chủng B. subtilis - Phân lập B. subtilis bằng phương pháp truyền thống: dựa vào đặc điểm khuẩn lạc và quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi, nhuộm Gram và thử phản ứng sinh hóa. - Định danh chính xác đến loài bằng kit API 50 CHB. - Giám định chính xác giống và loài các chủng Bacillus tuyển chọn bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA. Phƣơng pháp lấy mẫu Mẫu đất: Đất được lấy ở tầng mặt, độ sâu từ 4-5 cm. Mẫu gộp được lấy từ 5 vị trí khác nhau của 1 trại gà. Mẫu phân: Lấy phân tươi trên nền chuồng. Mẫu gộp được lấy từ 5 vị trí khác nhau trong chuồng gà (4 mẫu ở 4 góc và 1 mẫu ở trung tâm). Lượng đất và phân lấy mỗi lần từ 30-50 g. Mẫu được đựng trong túi nilon (polypropylen) đã được khử trùng. Sau khi lấy mẫu, tiến hành ghi nhãn địa điểm và thời gian lấy, sau đó tất cả các mẫu được bảo quản bằng thùng trữ lạnh và đưa về phòng thí nghiệm. Số lƣợng mẫu Chọn mẫu theo phương pháp định ngạch (phi ngẫu nhiên), mỗi địa phương 20 mẫu (10 mẫu đất + 10 mẫu phân). Tổng cộng: 140 mẫu/ 7 tỉnh, thành phố ĐBSCL Chuẩn bị mẫu Cân 10 g mẫu + 90 mL nước muối sinh lý vô trùng cho vào bình tam giác, lắc đều. Gia nhiệt ở 80ºC trong 20-25 phút để chọn những vi khuẩn có khả năng là Bacillus spp. (Eman, 2013). Phân lập vi khuẩn Sau khi gia nhiệt, mẫu được tiến hành pha loãng và trải đĩa trên môi trường TSA, ủ ở 30ºC trong 24 giờ. Kết thúc thời gian ủ, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ, khác biệt nhau và tiến hành cấy phân lập, kết hợp với quan sát, ghi nhận hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi để thu được chủng vi khuẩn thuần. 3
Tiến hành giám định các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn B. subtilis theo phương pháp của Cowan and Steel (2004) với một số cải tiến. Các phản ứng sinh hóa bao gồm: lecithinase (-), catalase (+), VP (+), amylase (+), khả năng phát triển ở 50oC và celluslase (+) được thực hiện lần lượt theo trình tự để sàng lọc sơ bộ được nhóm vi khuẩn thuộc loài B. subtilis. Các chủng đạt yêu cầu, sau đó sẽ được định danh bằng bộ kit API 50 CHB, chủng nào có kết quả là B. subtilis sẽ được giải trình tự gen 16S RNA để khẳng định lại. Sau khi ly trích DNA của các chủng vi khuẩn, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi phổ biến mã hóa cho đoạn gen 16S rRNA (Saminathan and Narayanan, 2015) có trình tự như sau: 27F: (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') 1492R: (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'27F) Qui trình phân lập và giám định vi khuẩn B. subtilis được trình bày tóm tắt theo sơ đồ sau: Chủng vi khuẩn thuần ↓ Test Lecithinase: (-) ↓ Test Catalase: (+) ↓ Test VP: (+) ↓ Test Amylase: (+) ↓ Khả năng phát triển ở 50ºC ↓ Test Cellulase: (+) ↓ API CH50B ↓ Giải trình tự gen 16S rRNA Hình 3.1. Sơ đồ sàng lọc, định danh vi khuẩn B. subtilis 3.2. Nội dung 2: Tuyển chọn các chủng B. subtilis có đặc tính probiotic Gồm 7 chỉ tiêu như sau: 3.2.1. Tính chịu nhiệt. Tính chịu nhiệt của vi khuẩn được khảo sát theo phương pháp của Barbosa et al. (2000) có cải tiến. Cấy chủng vi khuẩn cần 4
kiểm tra trên đĩa thạch TSA và ủ ở 50oC, 55oC và 60oC trong 24 giờ. Kết thúc thời gian ủ, kiểm tra khả năng sống của vi khuẩn. 3.2.2. Khả năng nhạy kháng sinh (9 loại kháng sinh đang được dùng phổ biến trên gia cầm: erythromycin, gentamycin, neomycin, oxytetracyclin, doxycyclin, colistin, sulfadimidin - trimethoprim, norfloxacin, enrofloxacin). Tính nhạy cảm kháng sinh của các vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đĩa khuếch tán kháng sinh theo hướng dẫn của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và xét nghiệm (Clinical and Laboratoty Standards Institude - CLSI, 2015) (Wayne, 2015). 3.2.3. Khả năng sinh enzyme tiêu hóa (amylase, protease, lipase): Thực hiện định tính và định lượng các chủng vi khuẩn khảo sát, sau đó chọn những chủng có khả năng sinh cả 3 loại enzyme. 3.2.4. Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh Thử nghiệm khả năng đối kháng theo phương pháp vạch thẳng vuông góc: Khảo sát trên môi trường Starch agar (SA). Các bước tiến hành theo phương pháp của Sertaç et al. (2014): cấy vi khuẩn B. subtilis dọc theo một đường thẳng trên đĩa thạch SA, ủ ở 37oC trong 24 giờ, tiến hành cấy vi khuẩn gây bệnh (S. enterica, E.coli) theo các vạch ngang vuông góc với vạch vi khuẩn đã mọc, tiếp tục ủ ở 37oC trong 24 giờ. Khả năng kháng khuẩn được xác định bằng cách đo khoảng cách vùng kháng khuẩn theo đơn vị mm dựa theo Hutt et al. (2006). Thử nghiệm khả năng đối kháng theo phương pháp đối kháng trực tiếp: Thực hiện theo phương pháp của Moore et al. (2013): Vi khuẩn gây bệnh và B. subtilis được hoạt hóa trong môi trường TSB và ủ ở nhiệt độ thích hợp trong 24 giờ. Huyền phù vi khuẩn B. subtilis được điều chỉnh sao cho mật số đạt 105, 106 và 107 CFU/mL tương ứng với nồng độ vi khuẩn gây bệnh để tiến hành thử khả năng đối kháng. Bơm 100 µL huyền phù vi khuẩn gây bệnh lên các đĩa thạch và dùng que tran trải đều; sau đó, bơm 10 µL dịch vi khuẩn B. subtilis tương ứng với các nồng độ khảo sát lên những vị trí xác định trên bề mặt thạch, và đem ủ ở 37oC trong 24 giờ. Khả năng đối kháng được đo bằng đường kính vòng ức chế vi khuẩn gây bệnh theo đơn vị mm. Đánh giá khả năng đối kháng theo Sumathi and Reetha (2012). 5
3.2.5. Khả năng chịu acid và muối mật. Thực hiện theo phương pháp của Corcoran et al. (2005) và Dunne (2001). Vi khuẩn B. subtilis được cấy ria trên môi trường DSM, ủ từ 24 - 48 giờ ở 30ºC. Sau đó, tạo huyền phù sinh khối vi khuẩn trong dung dịch đệm PBS pH 7,2, pha loãng để đạt mật số vi khuẩn trong dịch huyền phù là 107 CFU/mL. Sau đó chủng 1 mL dịch huyền phù vào 9 mL dung dịch dạ dày mô phỏng gồm Glucose (3,5 g/L), NaCl (2,05 g/L), KH2PO4 (0,6 g/L), CaCl2 (0,11 g/L), và KCl (0,37 g/L) được chuẩn độ về các pH 2, 3, 4, 5 bằng dung dịch HCl 1M và lọc bằng màng lọc 0,2 μm. Sau đó Pepsin (13,3 mg/L) và dịch mật (0,05 g/L) được cho vào dịch gốc trước khi tiến hành thí nghiệm. Trộn đều và ủ dịch hỗn hợp ở 37ºC trong máy lắc 90 phút, đồng thời tiến hành kiểm tra mật số vi khuẩn ở các thời điểm 0; 10; 30; 60, 90 phút. Tính tỉ lệ phần trăm sống sót của vi khuẩn B. subtilis. 3.2.6. Khả năng bám dính - Khả năng bám dính cùng một chủng (tự bám dính): xác định theo phương pháp của Del Re et al. (2003) và Kos et al. (2003). Hoạt hóa chủng vi khuẩn cần kiểm tra trên môi trường TSA, ủ ở 37oC trong 24 giờ, sa+u đó cấy vi khuẩn vào 100 mL TSB, nuôi ở 37oC trong 18 giờ. Sinh khối tế bào thu được sau khi nuôi cấy được rửa 2 lần và tái huyền phù trong đệm Phosphate buffered saline (PBS) sao cho nồng độ vi khuẩn đạt khoảng 108 CFU/mL (so độ đục Mc Farlan 0,5%). Sau đó 4 mL dịch huyền phù tế bào được trộn đều trong 10 giây. Khả năng bám dính của các tế bào trong cùng một chủng được xác định trong 5 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau mỗi giờ, lấy 0,1 mL dịch nổi phía trên cho vào 1 ống nghiệm khác chứa 3,9 mL PBS và xác định mật độ quang của dung dịch ở bước sóng 600 nm (OD600). Kết quả được tính theo công thức sau: Khả năng tự bám dính (%) = (Ao - At)/Ao × 100 Trong đó:Ao: OD600 của dung dịch tế bào ở thời điểm t = 0 giờ At: OD600 dung dịch tế bào ở các thời điểm t = 1, 2, 3, 4 và 5 giờ - Khả năng bám dính giữa các chủng vi sinh vật khác nhau: xác định theo mô tả của Kos et al. (2003) và Anwar et al. (2014). Phương pháp chuẩn bị mẫu tương tự như phương pháp thử nghiệm khả năng tự bám dính, tuy nhiên sử dụng vi khuẩn phân lập được lần lượt với hai chủng vi khuẩn thử nghiệm là E. coli và S. enterica. Khả năng bám dính giữa các chủng vi sinh vật khác nhau được tính toán theo công thức: 6
Khả năng bám dính giữa các chủng khác nhau (%) = [(Ax + Ay)/2 - A(x+y)]/[(Ax+Ay)/2]×100 Trong đó: Ax là OD600 của chủng vi khuẩn x ở ống đối chứng Ay là OD600 của chủng vi khuẩn y ở ống đối chứng A(x+y) là OD600 của hỗn hợp 2 chủng vi khuẩn x và y - Khả năng bám dính với biểu mô ruột. Tiến hành theo phương pháp của Piatek et al. (2012): Chủng vi khuẩn B. subtilis được tăng sinh bậc 2 trong 20 mL dung dịch NB, ủ ở 37oC trong 24 giờ, và được điều chỉnh với mật số 108 CFU/mL. Mẫu biểu mô ruột gà được cắt thành những đoạn ngắn khoảng 1cm, và nhúng vào dung dịch đệm PBS trong 30 phút ở 4oC. Sau đó, mẫu được ngâm trong dung dịch vi khuẩn cần kiểm tra, tiếp tục ủ ở 37 oC, trong 30 phút. Dung dịch vi khuẩn được loại bỏ, mẫu được cố định trong formalin, và tiến hành làm tiêu bản mô. 3.2.7. Khả năng sống của vi khuẩn trong đƣờng ruột gà Thực hiện theo phương pháp của Cartman et al. (2008): gà con 1 ngày tuổi được cho uống bào tử B. subtilis liều 0,1 mL canh khuẩn chứa 1x109 CFU/mL. Sau đó, vào các mốc thời gian 24, 48, 72, 96 và 120 giờ, chọn 3 gà ngẫu nhiên, mổ và thu mẫu ở hồi tràng, manh tràng và ruột già. Tiến hành rửa mẫu, xử lý nhiệt ở 80oC, trong 20 phút để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng và các vi khuẩn khác. Sau đó, tiến hành trải mẫu kiểm tra mật số vi khuẩn B. subtilis ở các mốc thời gian như trên. Giá trị trung bình được tính theo số lượng bào tử/g ruột non, manh tràng và ruột già. 3.3. Nội dung 3: Thử nghiệm, đánh giá tác dụng của chế phẩm probiotic chứa B. subtilis trên gà 3.3.1. Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu trong 3 thí nghiệm là chủng B. subtilis được phân lập và tuyển chọn trong đề tài. Gà thí nghiệm: là gà 1 ngày tuổi, thuộc giống gà ta Greenfeed GF168 nuôi tại công ty chăn nuôi Vemedim. Thức ăn và các qui trình tiêm chủng vaccine thực hiện theo qui trình của công ty chăn nuôi. 7
3.3.2. Chuồng trại thí nghiệm Gà được nuôi trên chuồng lồng, đáy lồng và vách được làm bằng khung kẽm kích thước 0,6 x 1 x 2 m. Diện tích mỗi ô chuồng là 2m2 ngăn làm 2 ngăn, mỗi ngăn là 15 con. Máng ăn và máng uống được bố trí riêng cho mỗi ngăn chuồng 3.3.3. Thí nghiệm 1: Xác định liều sử dụng B. subtilis hiệu quả Mục đích: đánh giá tính an toàn và xác định liều hiệu quả của sản phẩm đối với gà. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức, trong đó có 3 nghiệm thức tương ứng với 3 liều bổ sung B. subtilis và 1 nghiệm thức đối chứng không bổ sung B. subtilis. Mỗi nghiệm thức gồm 30 gà và lặp lại 3 lần. Bảng 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 Chỉ tiêu theo dõi Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 ĐC Tuổi gà thí nghiệm, ngày 1 1 1 1 B. subtilis bổ sung, CFU/g (*) 107 106 5x105 - Lượng bổ sung, g/kg thức ăn 5 5 5 - Số ngày chuẩn bị thí nghiệm 7 7 7 7 Số ngày thí nghiệm 60 60 60 60 Ghi chú: (*): Liều tham khảo từ thí nghiệm của Knap et al. (2011) và Teo et al. (2006) Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm Lượng thức ăn đưa vào: xác định bằng cách cân tổng lượng thức ăn cho ăn và thức ăn thừa hàng ngày của từng lô trong thời gian thí nghiệm. Số gà chết: ghi nhận số gà chết hàng ngày và tổng kết mỗi 2 tuần. Tăng trọng: gà được cân khối lượng khi bắt đầu thí nghiệm, sau đó mỗi 2 tuần cân một lần đến khi kết thúc thí nghiệm, tính khối lượng chung cho cả lô. Tăng khối lượng toàn kỳ (g) = Khối lượng cuối kỳ (g) - Khối lượng đầu kỳ (g). Tăng khối lượng toàn kỳ Tăng khối lượng bình quân (g/ngày) = Số ngày thí nghiệm Tổng lượng thức ăn đưa vào (g) Hệ số chuyển hóa thức ăn = Tổng tăng trọng của gà (g) 8
3.3.4.2. Thí nghiệm 2 Mục đích: Đánh giá khả năng bảo vệ của probiotic so với kháng sinh ở gà khi gây nhiễm với S. enterica. Bố trí thí nghiệm: gồm 5 nghiệm thức bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên theo phương pháp của Knap et al. (2011): 2 nghiệm thức đối chứng (ĐC âm, ĐC dương) cho ăn khẩu phần ăn bình thường của trại trong suốt quá trình nuôi. Các nghiệm thức thí nghiệm (bổ sung probiotic hoặc kháng sinh) được bố trí như sau: NT1: Bổ sung B. subtilis 5g/kg thức ăn, cho ăn liên tục trong suốt thời gian thí nghiệm. NT2: Bổ sung oxytetracycline 50 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu từ ngày gây nhiễm. NT3: Bổ sung enrofloxacine 15 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu từ ngày gây nhiễm. Gây nhiễm S. enterica cho các nghiệm thức NT1, NT2, NT3, và ĐC (+) vào ngày thứ 18, mỗi nghiệm thức gồm 30 gà và lặp lại 3 lần. Bảng 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 Chỉ tiêu theo dõi Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 ĐC (+) ĐC (-) Tuổi gà thí nghiệm, ngày 1 1 1 1 1 Tuổi gây nhiễm, ngày 18 18 18 18 - S. enterica gây nhiễm(1), CFU/mL 7,5x104 7,5x104 7,5x104 7,5x104 - B. subtilis bổ sung(2), g/kg thức ăn 5 - - - - Oxtetracycline, mg/kg thức ăn (3) - 50 - - - Enrofloxacine, mg/kg thức ăn (4) - - 15 - - Số ngày thí nghiệm 60 60 60 60 60 (1) S. enterica phân lập từ gà bệnh, gây nhiễm qua đường uống 0,5ml/con (Knap et al., 2011). (2) Liều B. subtilis hữu dụng được chọn ở thí nghiệm 1 (10 7CFU/g) (3), (4) Liều oxtetracycline và enrofloxacine thí nghiệm tham khảo từ Pattison, 2008 Chỉ tiêu khảo sát: - Mổ khảo sát gà (5 gà/nghiệm thức) ở 21 và 42 ngày tuổi, ghi nhận bệnh tích, thu mẫu bệnh phẩm ở gan và lách, trữ lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm kiểm tra vi khuẩn gây bệnh. - Ghi nhận các biểu hiện bệnh lý của gà, tỉ lệ chết ở các nghiệm thức. - Các chỉ tiêu lượng thức ăn đưa vào, tăng trọng, tăng khối lượng toàn kỳ, hệ số chuyển hóa thức ăn ghi nhận giống thí nghiệm 1. 9
3.3.4.3. Thí nghiệm 3: Mục đích: Đánh giá khả năng bảo vệ của probiotic so với kháng sinh ở gà gây nhiễm với E. coli. Bố trí thí nghiệm: gồm 5 nghiệm thức bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên theo phương pháp của Teo and Tan (2006): 2 nghiệm thức đối chứng (ĐC âm, ĐC dương) cho ăn khẩu phần ăn bình thường của trại trong suốt quá trình nuôi. Các nghiệm thức thí nghiệm (bổ sung probiotic hoặc kháng sinh) được bố trí như sau: NT1: Bổ sung B. subtilis 5g/kg thức ăn, cho ăn liên tục trong suốt thời gian thí nghiệm. NT2: Bổ sung oxytetracycline 50 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu từ ngày gây nhiễm. NT3: Bổ sung enrofloxacine 15 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu từ ngày gây nhiễm. Gây nhiễm E. coli cho các nghiệm thức NT1, NT2, NT3, và ĐC (+) vào ngày thứ 18, mỗi nghiệm thức gồm 30 gà và lặp lại 3 lần. Bảng 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 Chỉ tiêu theo dõi Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 ĐC (+) ĐC (-) Tuổi gà thí nghiệm, ngày 1 1 1 1 1 Tuổi gây nhiễm, ngày 18 18 18 18 - E. coli gây nhiễm(1), CFU/mL 5x106 5x106 5x106 5x106 - B. subtilis bổ sung(2), g/kg thức ăn 5 Oxtetracyclin, mg/kg thức ăn (3) - 50 - - - Enrofloxacin, mg/kg thức ăn (4) - - 15 - - Số ngày bổ sung 60 5 5 - - Số ngày thí nghiệm 60 60 60 60 60 (1) E. coli phân lập từ gà bệnh, gây nhiễm qua đường uống 0,5ml/con (Teo and Tan,2006). (2) Liều B. subtilis hữu dụng được chọn ở thí nghiệm 1 (10 7CFU/g) (3), (4) Liều oxtetracycline và enrofloxacine thí nghiệm tham khảo từ Pattison (2008). Chỉ tiêu khảo sát: - Mổ khảo sát gà (5 gà/nghiệm thức) ở 21 và 42 ngày tuổi, ghi nhận bệnh tích, thu mẫu bệnh phẩm ở gan và lách, trữ lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm kiểm tra vi khuẩn gây bệnh. - Ghi nhận các biểu hiện bệnh lý của gà, tỉ lệ chết ở các nghiệm thức. - Các chỉ tiêu lượng thức ăn đưa vào, tăng trọng, tăng khối lượng toàn kỳ, hệ số chuyển hóa thức ăn ghi nhận giống thí nghiệm 1. 10
3.4. Xử lý số liệu: Số liệu thí nghiệm được xử lý sơ bộ trên bảng tính Microsoft Excel 2010, sau đó phân tích phương sai (ANOVA) theo mô hình tuyến tính tổng quát (General Linear Model) trên phần mềm Minitab 16.1. Chƣơng IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập và định danh vi khuẩn B. subtilis 4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus spp. Từ 70 mẫu đất và 70 mẫu phân tại các trại gà ở 7 tỉnh thành, mẫu được xử lí nhiệt, pha loãng, cấy tran và ủ ở 30ºC trong 24 giờ, kết thúc thời gian ủ, dựa vào hình dạng khuẩn lạc, tiến hành chọn riêng từng dòng vi khuẩn và cấy chuyển nhiều lần cho đến khi thuần. Kết quả thu được tổng cộng 296 chủng vi khuẩn có hình que, gram dương và có khả năng sinh bào tử khi quan sát sau 48 giờ. Các khuẩn lạc của 296 chủng được tách ròng bằng phương pháp cấy ria và trữ trong dung dịch NB (nutrient broth) có chứa 16% glycerol, bảo quản trong tủ âm sâu 86oC. 4.1.2. Kết quả định danh Bacillus spp. 4.1.2.1. Định danh bằng các phản ứng sinh hóa Từ 296 chủng, tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa theo trình tự: âm tính với lecithinase, dương tính với catalase, VP, amylase, cellulase và có khả năng phát triển ở 50oC (Cowan and Steel, 2003). Các phân lập vi khuẩn không đạt yêu cầu sẽ được loại bỏ dần, cuối cùng, các chủng vi khuẩn tương đồng với 6 đặc điểm sinh hóa của B. subtilis sẽ được định danh bằng bộ kit API CH50B. Kết quả kiểm tra sinh hóa được trình bày ở Bảng 4.2. Bảng 4.2: Kết quả sàng lọc vi khuẩn bằng các test sinh hóa Chỉ tiêu Số lượng chủng Kết quả Dương tính Âm tính Lecithinase 296 66 230 Catalase 230 230 0 VP 230 169 61 Amylase 169 91 78 Phát triển ở 50ºC 91 49 42 Cellulase 49 29 20 Theo qui trình chọn lọc, phản ứng sinh hóa đầu tiên được thực hiện là lecithinase, đây là chỉ tiêu quan trọng giúp loại bỏ các loài Bacillus có độc tính. Kết quả kiểm tra cho thấy 66/296 chủng dương tính với lecithinase, 66 chủng này sẽ loại bỏ, không kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa tiếp theo. Tiếp tục thực 11
hiện phản ứng sinh hóa thứ 2 (catalase) với 230 chủng còn lại, tất cả đều cho kết quả dương tính nghĩa là các chủng này có thể phát triển trong điều kiện hiếu khí. Tiếp theo là phản ứng VP, vì B. subtilis dương tính với phản ứng này nên thực hiện phản ứng VP sẽ giúp loại bớt các chủng không phải B. subtilis, kết quả có 169/230 chủng dương tính, 61 chủng âm tính sẽ loại bỏ. Phản ứng sinh hóa thứ 4 là amylase. Kết quả có 78 chủng âm tính, và 91 chủng dương tính. Kết quả khảo sát cho thấy có 49/91 chủng có khả năng phát triển ở 50oC. Cuối cùng, phản ứng cellulase được tiến hành nhằm xác định khả năng thủy phân cellulose của vi khuẩn. Trong 49 chủng khảo sát, có 29 chủng dương tính với cellulase, 29 chủng vi khuẩn này sẽ được tiếp tục định danh bằng bộ kit API CH50B để xác định loài. 4.1.2.2. Định danh bằng bộ kit API CH50B Sau khi tiến hành kiểm tra các đặc tính sinh hóa, có 29 chủng đã thỏa đặc tính của B. subtilis. Trong 29 chủng định danh bằng kit API, có 23 chủng được xác định là B. subtilis/B. amyloliquefaciens với phần trăm chính xác từ 90,7% - 99,9%; 6 chủng còn lại thuộc loài B. licheniformis. 23 chủng này sẽ tiến hành giải trình tự gen để xác định chính xác đến loài B. subtilis. 4.1.2.3. Định danh bằng PCR và giải trình tự gen 16S rRNA Kết quả điện di sản phẩm PCR của 23 chủng vi khuẩn cho thấy đã khuếch đại thành công đoạn gen với kích thước 1500bp (Hình 4.4). M ST10 DT11 DT26 DT29 DT30 KG12 KG22 KG29 KG36 C M CT11 AG07 AG17 AG19 AG60 VL16 ST06 ST08 C 1500 bp 1500 bp M VL05 VL28 VL41 KG09 AG27 AG49 C Hình 4.4. Sản phẩm PCR của các chủng vi 1500 bp khuẩn B. subtilis trong nghiên cứu (M: thang chuẩn 100bp; ST10, DT11,…: sản phẩm PCR của 23 chủng VK khảo sát; C: đối chứng âm) Giải trình tự gen 16S rRNA Sau khi giải trình tự và xử lý bằng phần mềm BLAST so sánh kết quả trên NCBI, kết quả cho thấy có 21 trong 23 chủng được xác định là B. subtilis với mức độ tương đồng cao (99%-100%), 2 chủng còn lại là B. amyloliquefaciens. 12
Tóm lại, từ 296 chủng vi khuẩn phân lập, sau khi tiến hành các bước chọn lọc kiểm tra các phản ứng sinh hóa, và định danh bằng bộ kit API, cuối cùng ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA, có 21 chủng vi khuẩn được xác định là B. subtilis. 21 chủng B. subtilis này sẽ thực hiện các bước tuyển chọn probiotic để chọn ra chủng tối ưu có khả năng phòng bệnh đường tiêu hóa trên gà. 4.2. Kết quả khảo sát các đặc tính probiotic 4.2.1. Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt độ cao Theo Sottnik (2002) gia cầm có thân nhiệt khoảng 41,5oC, cao hơn các loài động vật hữu nhũ, do đó, ứng viên probiotic sử dụng trong chăn nuôi gia cầm phải có khả năng phát triển cao hơn nhiệt độ bình thường (30-37oC). Bảng 4.6. Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt của các chủng B. subtilis Số lƣợng Nhiệt độ khảo sát Chủng VK chủng 50oC 55oC 60oC KG36, AG19, VL05 3 + + + AG07, AG27, AG49, AG60, VL16, VL28, VL41, ST08, 12 + + - DT30, KG09, KG12, KG22 CT 11, AG17, ST06, ST10, 6 + - - DT29, KG29 Tổng cộng 21 21 15 3 Ghi chú : + có khả năng sống được trong môi trường ở nhiệt độ khảo sát - không có khả năng sống được trong môi trường ở nhiệt độ khảo sát Kết quả trình bày ở Bảng 4.6 cho thấy tất cả 21 chủng vi khuẩn đều có thể phát triển ở mốc nhiệt độ 50oC. Vậy 21 chủng B. subtilis phân lập đều có khả năng chịu nhiệt, hoàn toàn có thể đáp ứng khi được dung nạp vào cơ thể gia cầm. Như vậy ở chỉ tiêu chịu nhiệt thì 21 chủng B. subtilis khảo sát đều có thể chọn làm probiotic. 4.2.2. Khả năng nhạy/ kháng kháng sinh Khả năng nhạy kháng sinh của vi khuẩn probiotic được xem là một trong những tiêu chí quan trọng trong tiêu chuẩn chọn lọc vi khuẩn probiotic (Hummel et al., 2007), theo Gueimonde et al. (2013), nếu vi khuẩn probiotic còn nhạy với kháng sinh thì sẽ an toàn về mặt sinh học, vì không chứa plasmid hoặc các gen kháng kháng sinh. 13
Hình 4.6. Mức độ mẫn cảm kháng sinh của 21 chủng vi khuẩn B. subtilis Một điều đáng ghi nhận là có đến 95% chủng B. subtilis trong khảo sát này kháng với kháng sinh colistin, điều này có thể là do colistin là kháng sinh được sử dụng rất phổ biến trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa. Hình 4.7. Kết quả kháng sinh đồ của chủng B. subtilis AG27 và VL28 Qua khảo sát 21 chủng B. subtilis phân lập được chúng tôi nhận thấy trên 50% các chủng còn nhạy với nhiều kháng sinh và cả 21 chủng đều nhạy với nhiều kháng sinh hơn so với 2 chủng đối chứng. Kết quả này cho thấy về chỉ tiêu nhạy với kháng sinh thì cả 21 chủng B. subtilis khảo sát đều có khả năng chọn làm probiotic. 4.2.3. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào 4.2.3.1. Khả năng sinh enzyme amylase, protease và lipase Kết quả khảo sát khả năng sinh 3 loại enzyme được trình bày ở Bảng 4.7. Bảng 4.7: Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 21 chủng B. subtilis Vi khuẩn Amylase Protease Lipase ĐC1 + + - ĐC2 + + - AG27, AG60, VL05, VL28, VL41, + + + DT29, KG09, KG12, KG22, KG36 CT11, AG07, AG17, AG19, AG49, VL16, ST06, ST08, ST10, DT30, + + - KG29 Ghi chú (+) : Có khả năng sinh enzyme, (-): không có khả năng sinh enzyme 14
Theo Parsons (2004) các enzyme ngoại bào như amylase, protease, và lipase đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa thức ăn, giúp thức ăn được hấp thu dễ dàng. Do đó, để trở thành một probiotic thì chủng B. subtilis phải có khả năng sinh được nhiều loại enzyme. Kết quả cho thấy trong 21 chủng B. subtilis khảo sát chỉ có 10 chủng (AG27, AG60, VL05, VL28, VL41, DT29, KG09, KG12, KG22, KG36) có khả năng sinh cả 3 loại enzyme, 10 chủng này sẽ tiến hành kiểm tra khả năng đối kháng với các chủng vi khuẩn gây bệnh. 4.2.4. Khả năng đối kháng với các chủng vi sinh vật gây bệnh 4.2.4.1. Khả năng đối kháng của B. subtilis với 4 loài vi khuẩn gây bệnh theo phƣơng pháp kẻ vạch vuông góc Kết quả ở Bảng 4.9 cho thấy 10 chủng B. subtilis thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở những mức độ khác nhau. Bảng 4.9: Khoảng cách kháng khuẩn của các chủng B. subtilis bằng phương pháp kẻ vạch vuông góc Vi khuẩn Khoảng cách kháng khuẩn (mm) E. coli S. enterica Staphylococcus Streptococcus ĐC1 5,47c 6,27c 7,00bc - ĐC2 6,10c - 7,00bc 6,23c AG27 8,00b 12,00a 10,00a 10,00b AG60 6,00c 6,00 c 7,00 bc 4,00d VL05 6,00c 10,00 b 8,00 b 6,00c VL28 10,00a 13,00 a 10,00 a 12,00a VL41 6,00c 10,00 b 10,00 a - KG12 - 9,00b 10,00a 4,00d KG22 4,00d 6,00c 6,00c - KG09 6,00c 10,00 b - - KG36 - 9,00b 6,00c - DT29 - - 8,00b - SEM 0,184 0,275 0,281 0,167 P 0,00 0,00 0,00 0,00 a,b,c,d các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 cột thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) Từ kết quả đối kháng theo phương pháp kẻ vạch vuông góc, 4 chủng vi khuẩn B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 thể hiện được hoạt tính đối kháng với cả 4 vi khuẩn bệnh, là các chủng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh sẽ tiếp tục khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp đối kháng trực tiếp để kiểm tra và so sánh hoạt tính đối kháng ở các nồng độ vi khuẩn khác nhau. 4.2.4.2. Khả năng đối kháng của B. subtilis với E. coli và S.enterica theo phƣơng pháp đối kháng trực tiếp 15