Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Y học: Xác định đột biến gen GLA, GAA và đặc điểm di truyền của bệnh Fabry và Pompe

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

11
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Y học "Xác định đột biến gen GLA, GAA và đặc điểm di truyền của bệnh Fabry và Pompe" được nghiên cứu với mục tiêu là: Xác định đột biến gen GLA, GAA trên người bệnh Fabry và Pompe; Phát hiện người lành mang gen bệnh trên các thành viên gia đình người bệnh. 3. Mô tả biểu hiện lâm sàng và cận lâm sàng của người bệnh mắc bệnh Fabry và Pompe.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Y học: Xác định đột biến gen GLA, GAA và đặc điểm di truyền của bệnh Fabry và Pompe

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN GLA, GAA VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH FABRY VÀ POMPE Chuyên ngành: Hóa sinh Y học Mã số: 9720101 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2023
Công trình được hoàn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Tạ Thành Văn PGS.TS. Hoàng Thị Ngọc Lan Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường Họp tại: Trường Đại học Y Hà Nội Vào hồi: giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại các thư viện: - Thư viên Quốc Gia - Thư viện Trường Đại học Y Hà Nội
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Phương Mai, Dau Ming Niu, Nguyễn Văn Hùng, Hoàng Thị Ngọc Lan, Tạ Thành Văn (2019), Phát hiện đột biến gen GLA ở một gia đình mắc bệnh Fabry ở Việt Nam, Tạp chí Y học Việt Nam, Tháng 11/2019 - Số đặc biệt (Tập 484), 645 - 650. 2. Nguyễn Thị Phương Thảo, Dau Ming Niu, Nguyễn Quỳnh Thơ, Hoàng Thị Ngọc Lan, Tạ Thành Văn (2020), Chẩn đoán trước sinh cho 2 thai phụ có đột biến gen GAA gây bệnh Pompe, Tạp chí Y học Việt Nam, Số chuyên đề (Tập 496), 205 - 210. 3. Nguyễn Thị Phương Thảo, Vũ Chí Dũng, Nguyễn Ngọc Khánh, Lê Thị Phương, Trần Vân Khánh, Hoàng Thị Ngọc Lan, Tạ Thành Văn (2023), Phát hiện đột biến gen GAA và đặc điểm di truyền của bệnh Pompe, Tạp chí Nghiên cứu Y học Trường Đại học Y Hà Nội, Số 3 (Tập 164), 18 - 24.
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Fabry và Pompe là 2 bệnh di truyền hiếm gặp thuộc nhóm các bệnh rối loạn dự trữ trong tiêu thể - LSDs. Nguyên nhân của bệnh được xác định là do đột biến gen GLA, GAA, dẫn đến thiếu hụt enzyme alpha- galactosidase A, alpha-glucosidase trong tiêu thể tế bào, hậu quả là sự tích tụ sphingolipid, glycogen trong tiêu thể tế bào, gây tổn thương tế bào. Tỷ lệ mắc bệnh tuy thấp nhưng trẻ mắc bệnh thường tử vong sớm do suy tim, suy hô hấp. Các nghiên cứu gần đây báo cáo một tỷ lệ không nhỏ các trường hợp mắc Fabry không điển hình. Việc phát hiện các đột biến gen gây bệnh và phát hiện người lành mang gen bệnh có ý nghĩa lớn trong việc chẩn đoán, điều trị sớm, tư vấn di truyền hợp lý để hạn chế sinh ra trẻ bệnh. Tuy nhiên, ở Việt Nam có rất ít nghiên cứu về vấn đề này, dẫn đến việc chẩn đoán muộn và hiệu quả điều trị không cao. Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu Xác định đột biến gen GLA, GAA và đặc điểm di truyền của bệnh Fabry và Pompe” được tiến hành với ba mục tiêu sau: 1. Xác định đột biến gen GLA, GAA trên người bệnh Fabry và Pompe. 2. Phát hiện người lành mang gen bệnh trên các thành viên gia đình người bệnh. 3. Mô tả biểu hiện lâm sàng và cận lâm sàng của người bệnh mắc bệnh Fabry và Pompe. 1. Tính cấp thiết Fabry và Pompe là 2 bệnh di truyền hiếm gặp thuộc nhóm các bệnh rối loạn dự trữ trong tiêu thể - LSDs. Tỷ lệ mắc bệnh tuy thấp nhưng trẻ mắc bệnh thường tử vong sớm do suy tim, suy hô hấp. Các nghiên cứu gần đây báo cáo một tỷ lệ không nhỏ các trường hợp mắc Fabry không điển hình. Việc phát hiện các đột biến gen gây bệnh và phát hiện người lành mang gen bệnh có ý nghĩa lớn trong việc chẩn đoán, điều trị sớm, tư vấn di truyền hợp lý để hạn chế sinh ra trẻ bệnh. Đây là những lý do đề tài của chúng tôi được tiến hành nghiên cứu.
2 2. Những đóng góp mới của luận án - Xác định được các đột biến gen GLA, GAA gây bệnh Fabry và Pompe tại Việt Nam, trong đó phát hiện được 01 đột biến gen GLA và 02 đột biến gen GAA chưa từng được công bố. - Phát hiện được các người lành mang gen bệnh trên các thành viên trong gia đình có người mắc bệnh Fabry, Pompe, từ đó đưa ra tư vấn di truyền phù hợp cho từng đối tượng. - Cung cấp các số liệu về đặc điểm lâm sàng (các triệu chứng thường gặp), các biến đổi cận lâm sàng (hóa sinh, chẩn đoán hình ảnh) của các bệnh nhân Fabry và Pompe. 3. Bố cục của luận án - Luận án được trình bày 128 trang bao gồm: đặt vấn đề 2 trang, tổng quan 37 trang, đối tượng và phương pháp nghiên cứu 20 trang, kết quả nghiên cứu 36 trang, bàn luận 31 trang, kết luận 1 trang, khuyến nghị 1 trang. - Luận án có 18 bảng, 03 biểu đồ, 20 hình, gồm 155 tài liệu tham khảo được xếp theo thứ tự xuất hiện trong luận án. CHƯƠNG 1 ̉ TÔNG QUAN TÀ I LIỆU 1.1. Bệnh Fabry Fabry là bệnh di truyền hiếm gặp, liên kết NST giới tính X gây ra bởi sự ứ đọng quá mức sphingolipid trong tiêu thể, dẫn đến các triệu chứng ở các cơ quan khác nhau, là hậu quả của sự thiếu hụt enzyme alpha galactosidase A (GLA) do đột biến gen GLA-gen mã hóa sản xuất enzyme GLA. Gen GLA nằm trên nhánh dài NST X, ở vị trí Xq22.1. Gen có 7 exon, gồm khoảng 10.222 bp. Vùng mã hóa gồm 1290 bp, mã hóa một protein gồm 429 acid amin. Cho đến nay đã có hơn 900 đột biến gen GLA gây bệnh Fabry đã được báo cáo. Fabry là bệnh hiếm gặp, tỷ lệ mắc dao động trong khoảng 1/40.000- 1/60.000 người. Triệu chứng lâm sàng của Fabry rất đa dạng với các biểu hiện là đau, tổn thương giác mạc hoặc tổn thương da, hậu quả cuối cùng là suy các cơ quan, thường gặp với các trẻ từ 3-10 tuổi, ở trẻ gái thường muộn hơn ở trẻ
3 trai. Cơ chế tổn thương các mô được cho là do sự giảm tưới máu do sự tích đọng các chất trong tế bào biểu mô mạch máu đơn độc đặc biệt ở thận, tim, hệ thần kinh trung ương và da, hoặc phối hợp với sự tích đọng trong các mô khác. Người nữ dị hợp tử có thể có biểu hiện triệu chứng hoặc không, là do sự bất hoạt ngẫu nhiên NST X trong tất cả các tế bào của phôi thai nữ. Bệnh có thể được chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm đo hoạt độ enzyme GLA hoặc xét nghiệm phân tích gen tìm đột biến. Hiện nay, liệu pháp thay thế enzyme (ERT) được coi là phương pháp điều trị đặc hiệu duy nhất cho bệnh Fabry. Tác dụng có lợi của ERT đối với các cơ quan/hệ thống khác nhau đã được đánh giá rộng rãi. Chất lượng cuộc sống của bệnh nhân nhận ERT được cải thiện. 1.2. Bệnh Pompe Bệnh Pompe (Pompe disease – PD) là bệnh di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường, là kết quả của sự thiếu hụt acid alpha – glucosidase (acid maltase, GAA) do gen đột biến gen GAA, dẫn đến sự tích tụ glycogen quá mức trong tiêu thể. Sự tích tụ này ảnh hưởng đến chức năng bình thường của các bào quan khác trong tế bào và dẫn đến tổn thương tế bào. Từ đó lan rộng và làm rối loạn chức năng của toàn bộ các cơ quan liên quan (ví dụ: bệnh cơ tim). Gen GAA nằm trên NST 17 vị trí 17q25, gồm 20 exon trong đó exon 1 không tham gia mã hóa. Cho đến nay đã có gần 700 đột biến gen GAA gây bệnh Pompe đã được báo cáo. Tỉ lệ mắc bệnh: tỉ lệ mắc bệnh khác nhau ở các quần thể nghiên cứu, dao động từ 1/14.000-50.000 người. Biểu hiện lâm sàng trong Pompe rất khác nhau phụ thuộc vào tuổi khởi phát bệnh. Bệnh có thể được chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm đo hoạt độ enzyme GAA hoặc xét nghiệm phân tích gen tìm đột biến. Tương tự như FD, ERT cũng mang lại hiệu quả điều trị cao với người bệnh PD, giúp nâng cao chất lượng cuộc sống và kéo dài tuổi thọ cho bệnh nhân.
4 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng nghiên cứu Tiêu chuẩn lựa chọn người bệnh: - Fabry: các đối tượng có triệu chứng lâm sàng gợi ý (phì đại cơ tim chưa rõ nguyên nhân phát hiện qua siêu âm tim hoặc điện tâm đồ), có hoạt độ enzyme thấp phát hiện qua sàng lọc sơ sinh hoặc các thành viên trong gia đình có người mắc bệnh Fabry. - Pompe: các đối tượng có triệu chứng lâm sàng gợi ý (yếu cơ), có hoạt độ enzyme thấp phát hiện qua sàng lọc sơ sinh hoặc các thành viên trong gia đình có người mắc bệnh Pompe. - Tiêu chuẩn lựa chọn các thành viên trong gia đình: nếu phát hiện đột biến gen GLA, GAA trên các người bệnh tham gia nghiên cứu, sẽ tiến hành lập phả hệ và lấy mẫu của các thành viên cùng huyết thống trong phạm vi 3 thế hệ, để tiến hành phân tích gen GLA, GAA tại vị trí đột biến tìm được ở người bệnh. - Tiêu chuẩn loại trừ: người bệnh hoặc người nhà không đồng ý tham gia nghiên cứu. 2.2. Thiết kế nghiên cứu - Mô tả ca bệnh, với cách lấy mẫu thuận tiện, chúng tôi thu thập được cỡ mẫu như sau: + Bệnh Fabry: 433 người bệnh đáp ứng các tiêu chuẩn lựa chọn của bệnh Fabry thể không điển hình; 01 trẻ có hoạt độ enzyme thấp phát hiện qua sàng lọc sơ sinh và 08 thành viên trong 01 gia đình người bệnh mắc bệnh Fabry. + Bệnh Pompe: 14 người bệnh đáp ứng tiêu chuẩn của bệnh Pompe; 70 thành viên từ 08 gia đình có đột biến GAA tham gia nghiên cứu. 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian: từ tháng 6/2014 đến tháng 6/2022 - Địa điểm nghiên cứu: mẫu được lấy tại Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng, Bệnh viện Nhi Trung ương, Viện Tim Hà Nội, Bệnh viện Xanh pon. Địa
5 điểm phân tích mẫu: xét nghiệm đo hoạt độ enzyme được thực hiện tại Bệnh viện đa khoa Cựu chiến binh Đài Bắc, kỹ thuật phân tích gen được thực hiện ở 2 nơi là Bệnh viện đa khoa Cựu chiến binh Đài Bắc và Trung tâm Gen – protein – Trường Đại học Y Hà Nội, đều sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại gen, giải trình tự theo phương pháp Sanger, với cùng mồi thiết kế, thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của phản ứng. 10% số mẫu được phân tích ở cả 2 nơi để đảm bảo tính chính xác của kết quả. 2.4. Các nội dung và biến số nghiên cứu Thu thập dữ liệu về triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng (kết quả siêu âm tim, Xquang tim phổi, xét nghiệm ALT, CK) dựa trên Bệnh án nghiên cứu. Đo hoạt độ enzyme GLA, GAA, giải trình tự gen cho những người có hoạt độ enzyme thấp. So sánh với trình tự trên GeneBank để tìm đột biến, các đột biến mới được dự đoán khả năng gây bệnh bằng các phần mềm tin-sinh học. Với các đối tượng có đột biến gen: lấy mẫu các thành viên trong gia đình, phân tích gen tại vị trí đã phát hiện đột biến trên người bệnh. 2.5. Phương tiện, hóa chất Sử dụng trang thiết bị, máy móc và hóa chất của các hãng uy tín như Qiagen (Đức), Thermo Fisher (Mỹ), Genzyme – Sanofi (Mỹ). 2.6. Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu - Đo hoạt độ enzyme (GLA và GAA) từ giọt máu khô trên giấy thấm (DBS) bằng phương pháp đo khối phổ song song. - Tách chiết DNA từ máu toàn phần: dùng kit QIAamp DNA của Qiagen (theo hướng dẫn của nhà sản xuất). - Tiến hành phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mong muốn với thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt khác nhau cho mỗi exon - PCR giải trình tự gen: Sử dụng phương pháp Sanger trên hệ thống máy ABI 3730 XL (Thermo Fisher) chạy với hóa chất BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. 2.7. Xử lý số liệu - Các biến số về lâm sàng và xét nghiệm thông thường được tính toán dựa vào phần mềm thông kê y học SPSS16.0. Hoạt độ enzyme được tính toán
6 bằng phần mềm chuyên dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Kết quả giải trình tự gen được xử lý bằng phần mềm BioEdit 7.2.6, và phần mềm CLC Workbenches 8.0, sau đó trình tự được so sánh trên GeneBank để phát hiện đột biến. Tìm kiếm đột biến, dạng đột biến, loại protein bị thay đổi…, dựa vào ngân hàng gen trực tuyến http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php. - Áp dụng phương pháp lập phả hệ và sử dụng các ký hiệu lập phả hệ theo đúng quy định. 2.8. Đạo đức trong nghiên cứu - Nghiên cứ u đươ ̣c tiế n hà nh khi có sự đồ ng ý củ a hội đồng y đức BVTEHP, Bệnh viện Nhi Trung ương, Hội đồng khoa học trường Đại học Y Hải Phòng, người bệnh và gia đình người bê ̣nh. CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Đặc điểm chung của các đối tượng tham gia nghiên cứu 3.1.1. Bệnh Fabry 3.1.1.1. Đặc điểm phân bố theo tuổi Biểu đồ 3.1: Phân bố theo nhóm tuổi của nhóm người bệnh phì đại cơ tim nghi ngờ Fabry Biểu đồ 3.1 cho thấy người bệnh phì đại cơ tim chủ yếu thuộc nhóm từ 40-80 tuổi, giá trị mean ± SD về nhóm tuổi là 57 ± 12 tuổi. 3.1.1.2. Đặc điểm phân bố theo giới
7 Trong 433 người bệnh phì đại cơ tim tham gia nghiên cứu, có 417 người bệnh là nam, chiếm 97%, chỉ có 3% người bệnh là nữ. 3.1.2. Bệnh Pompe Phần lớn các người bệnh khởi phát sớm (dưới 6 tháng tuổi), tuổi khởi phát trung bình là 5 ± 4,2 tháng. Trường hợp biểu hiện sớm nhất là 6 ngày tuổi và trường hợp muộn nhất là 17 tháng tuổi. 3.2.2.2. Giới Trong số 14 bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng gợi ý đến bệnh Pompe trong nghiên cứu này có 7 nam và 7 nữ. Tỷ lệ bệnh ở cả 2 giới là tương đương nhau. 3.2. Kết quả đo hoạt độ enzyme 3.2.1. Hoạt độ enzyme GLA của các người bệnh nghi ngờ Fabry Hoạt độ enzyme GLA trong các mẫu nghiên cứu nằm trong khoảng 0,17-9,18 μmol/h/L (1,87±0,94 μmol/h/L), chủ yếu dao động trong khoảng 0,92-2,97 μmol/h/l. Hơn 60% người bệnh có hoạt độ enzyme thấp hơn giá trị tham chiếu của người Đài Loan là 2,05-7,46 μmol/h/L, trong đó có 26 người bệnh có hoạt độ enzyme còn lại dưới 10% giá trị tham chiếu, chiếm 6%. 3.2.2. Kết quả hoạt độ enzyme GAA của các người bệnh nghi ngờ Pompe Kết quả đo hoạt độ enzyme GAA trên 14 người bệnh nghi ngờ Pompe trong nghiên cứu này nằm trong khoảng từ 0,01-6,8 μmol/h/L (0,91±1,26 μmol/h/L). 100% người bệnh tham gia nghiên cứu có hoạt độ enzyme giảm so với giá trị tham chiếu, trong đó 35,7% người bệnh có hoạt độ enzyme còn lại nhỏ hơn 10% giá trị tham chiếu (
8 Bảng 3.1: Tần suất xuất hiện của các biến thể gen GLA Thay đổi Thay đổi acid Vị trí Loại đột Tần nucleotid amin biến suất c.178C.T p.Pro60Ser Exon 1 Sai nghĩa 2 IVS1+17 A>G - Intron 1 - 1 5'UTR -12 G>A - Exon 1 SNP 1 5'UTR -10 C>T - Exon 1 SNP 4 IVS4-16 A>G - Intron 14 - 12 IVS6-22 C>T - Intron 16 - 13 Tần suất xuất hiện biến thể IVS6-22 C>T là cao nhất (48,1%), 44.4% mang biến thể IVS4-16A>G, 37% mang biến thể 5’UTR-10 C>T và 18,5% mang cả 3 biến thể trên, trong đó có 2 trường hợp là nữ, đều mang các biến thể này ở thể đồng hợp tử. Ngoài ra còn phát hiện 2 biến thể là IVS1+17 A>G và 5’UTR -12G>A. Người bệnh mã số FB64 và VN.06 đều có đột biến ở vùng mã hóa (exon 1) ở vị trí 178, thay thế nucleotide C bằng nucleotide T, dẫn đến thay đổi acid amin ở vị trí 60 là Prolin thành Serin. Đây là đột biến mới chưa từng được công bố trước đây trong các nghiên cứu về bệnh Fabry. Hình 3.1. Hình ảnh đột biến c.178C>T, p.Pro60Ser Sử dụng các phần mềm tin sinh học SIFT, PolyPhen-2 và MutationTaster để dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến này đều cho kết quả là có khả năng gây bệnh ở mức độ cao. Khi phân tích kết quả hoạt độ enzyme theo kết quả giải trình tự gen, chúng tôi nhận thấy nhóm có đột biến ở vùng mã hóa có kết quả hoạt độ enzyme thấp nhất, tuy nhiên khi so sánh với 2 nhóm còn lại là có đột biến
9 ở vùng không mã hóa và nhóm ko có đột biến chúng tôi nhận thấy sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê. 3.3.2. Kết quả giải trình tự gen các người bệnh nghi ngờ Pompe Tất cả các trường hợp đều phát hiện đột biến với tần suất như sau: Bảng 3.2. Tần suất xuất hiện các đột biến trong nghiên cứu Thay đổi Thay đổi acid Vị trí Loại đột biến Tần suất nucleotid amin c.625T>C p.Tyr209His* E3 Sai nghĩa 4 c736delT p.Leu246fs E4 Dịch khung 1 c. 1411_1414del p.Glu471Profs E9 Dịch khung 1 c.2040+1G>T Intron 14 Chỗ nối 1 c.1933G>C p.Asp645His E14 Sai nghĩa 7 c.1933G>A p.Asp645His E14 Sai nghĩa 1 c.1735G>A p.Glu579Lys E14 Sai nghĩa 1 c.2173C>T p.Arg725Asn E15 Sai nghĩa 1 c.2818- p.Ser940fs* E20 Dịch khung 3 2819delTinsCAG (*): các đột biến chưa từng được báo cáo trong y văn Phần lớn là các đột biến phát hiện trong nghiên cứu này là đột biến sai nghĩa, ngoài ra còn gặp các đột biến dịch khung và đột biến ở vị trí nối. Ngoài những đột biến đã được báo cáo trong y văn, chúng tôi nhận thấy sự xuất hiện của các đột biến mới với tần suất khá cao như: c.625T>C(p.Tyr209His) gặp ở 4/14 người bệnh, đột biến c.2818- 2819delTCinsCAG(p.Ser940fs) gặp ở 2/14 người bệnh. 7/14 người bệnh mang đồng thời 2 đột biến ở thể dị hợp tử (dị hợp tử kép). c.625T c.625T>C Hình 3.2. Hình ảnh đột biến c.625T>C
10 Kết quả dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến điểm c.625T>C bằng phần mềm PolyPhen-2 và MutationTaster đều cho rằng đây là đột biến có khả năng gây bệnh, tuy nhiên, phần mềm SIFT lại cho rằng đây là đột biến lành tính với số điểm là 0,14. 3.4. Phát hiện người lành mang gen trên các thành viên gia đình người bệnh 3.4.1. Phát hiện người lành mang gen trên các thành viên gia đình người bệnh Fabry. Kết quả giải trình tự gen cho 08 thành viên trong gia đình của người bệnh mã số VN.06, cho thấy 6/8 thành viên mang đột biến gen c.178C>T. Khi đối chiếu hoạt độ enzyme với kết quả phân tích gen của các thành viên trong gia đình chúng tôi nhận thấy cụ ngoại và mẹ của người bệnh có đột biến gen nhưng có hoạt độ enzyme trong giới hạn bình thường, trong khi dì của người bệnh cũng mang đột biến thì lại có hoạt độ enzyme thấp. Các thành viên nam có đột biến đều có hoạt độ enzyme thấp hơn so với giá trị bình thường. Hình 3.3: mô tả phả hệ gia đình người bệnh mã số VN.06 3.4.2. Phát hiện người lành mang gen trên thành viên gia đình người bệnh Pompe - Gia đình người bệnh mã số Pom16 10 thành viên mang đột biến (c.1933G>C (p.Asp645His), dị hợp tử, gồm: ông nội (I-1), ông ngoại (I-3), 2 bác ruột (II-1 và II-3), bố đẻ (II-4), mẹ đẻ (II-5), dì (II-7), cậu (II-6), 2 chị họ (III-1, III-2), em họ (III-5).
11 - Gia đình người bệnh mã số Pom17 6 thành viên trong gia đình mang đột biến (c.1933G>C (p.Asp645His) dị hợp tử, gồm: ông nội (I-2), ông ngoại (I-3), bác ruột (II- 2), bố đẻ (II-3), mẹ đẻ (II-4) và dì (II-6). Hình 3.4: Phả hệ gia đình mã số Pom 16 và Pom17 - Gia đình người bệnh mã số Pom18 5 thành viên mang đột biến, gồm bà nội (I-1) và bố (II-1) của người bệnh mang đột biến c.2173C>T (p.Arg725Trp), dị hợp tử; ông nội (I-2), ông ngoại (I-3) và mẹ (II-2) của người bệnh cùng mang đột biến c.1933G>C (p.Asp645His) dị hợp tử. 3.4.2.4. Gia đình người bệnh mã số Pom19 5 thành viên mang đột biến, gồm: ông nội (I-2) và bố đẻ (II-3) cùng mang đột biến c.2040+1G>T, dị hợp tử, ông ngoại (I-3) mẹ đẻ (II-4) và anh trai ruột (III-5) cùng mang đột biến c.1735G>A (p.Glu579Lys), dị hợp tử. Hình 3.8: Phả hệ gia đình mã số Pom18 và Pom19
12 - Gia đình người bệnh mã số Pom20 5 thành viên mang đột biến, gồm: bà nội (I-1) và bố đẻ (II-2) cùng mang đột biến c.1411-1414del (p.Glu471Profs), dị hợp tử, bà ngoại (I-3), mẹ đẻ (II-2) và cậu (III-3) cùng mang đột biến c.1735G>A (p.Glu579Lys), dị hợp tử. - Gia đình người bệnh mã số Pom21 7 thành viên mang đột biến, gồm: ông nội (I-2), ông ngoại (I-3), bác – chị gái bố (II-2), cô (II-4), bố đẻ (II-5), mẹ đẻ (II-4) và anh trai họ (III-1) cùng mang đột biến c.625T>C dị hợp tử. - Gia đình người bệnh mã số Pom22 6/8 thành viên mang đột biến, gồm: ông nội (I-2), ông ngoại (I-3), bác gái (II-1), bố đẻ (II-2), mẹ đẻ (II-3) và cậu (II-4) cùng mang đột biến c.1933G>C (p.Asp645His), dị hợp tử. - Gia đình mã số VN.0055 5/8 thành viên mang đột biến, gồm 2 vợ chồng, bố chồng, bố đẻ, và con gái.
13 Hình 3.12: Phả hệ gia đình mã số Pom22 và VN.0055 Tỷ lệ các thành viên trong gia đình mang đột biến: Khi tổng hợp các thành viên trong gia đình có mang đột biến, chúng tôi tính được tỷ lệ các thành viên có cùng huyết thống mang đột biến gen GAA. Tỷ lệ này tương đối cao, dao động từ 70 -100%, ở họ hàng bậc 1 là trên 50% ở tất cả các gia đình tham gia nghiên cứu, ở họ hàng bậc 2 dao động từ 50 – 100% (5/9 gia đình có tất cả các thành viên họ hàng bậc 2 mang gen bệnh), ở họ hàng bậc 3 trong dao động từ 0- 100%. 3.5 Đặc điểm lâm sàng của người bệnh Fabry và Pompe 3.5.1. Đặc điểm lâm sàng của người bệnh Fabry Người bệnh mã số FB 64 mang đột biến gen GLA ở vùng mã hóa là nam, 56 tuổi. Kết quả siêu âm cho thấy các chỉ số khối cơ thất trái (LVMI) là 205 g/m2, bề dày thành sau thất trái thì tâm trương (LVPWd) là 22.6 mm đều rất cao. Người bệnh này chỉ biểu hiện các đặc điểm của bệnh Fabry thể không điển hình như phì đại cơ tim với các triệu chứng khó thở, đau thắt ngực, tim đập nhanh đặc biệt là khi lao động hoặc vận động mạnh, ngoài ra không mang các đặc điểm khác của bệnh Fabry thể điển hình. Người bệnh mã số VN06 có hoạt độ enzyme giảm nhưng chưa có biểu hiện lâm sàng. Các thành viên nam trong gia đình bên ngoại của người bệnh đều mang đột biến gen, có hoạt độ enzyme giảm nhưng chưa có biểu hiện lâm sàng, các chỉ số LVMI và LVPWd đều trong giới hạn bình thường.
14 3.5.2. Đặc điểm lâm sàng của người bệnh Pompe - Triệu chứng lâm sàng khởi phát 10/14 người bệnh tham gia nghiên cứu có biểu hiện yếu cơ, 2/10 người bệnh có biểu hiện bú kém. - Biến đổi chỉ số tim ngực và LVMI trên Xquang tim phổi và siêu âm tim Trong 11 người bệnh có kết quả LVMI thì có đến 10 người bệnh có chỉ số này cao hơn giá trị tham chiếu. LVMI trung bình của các người bệnh rất cao, nằm trong khoảng 236±127g/m2. Có 6/12 người bệnh có chỉ số tim ngực tăng (>60%), chỉ số tim ngực trung bình là 62,5±7,7%. - Kết quả đo hoạt độ enzyme ALT, CK Hoạt độ CK và ALT đều tăng rất cao (trên 5 lần) so với giá trị tham chiếu (Mean ± SD lần lượt là 909,5 ±707,8 và 287,7 ±187,1). CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 4.1. Đặc điểm chung của các đối tượng nghiên cứu 4.1.1. Đặc điểm chung về tuổi và giới của bệnh Fabry Nghiên cứu cho thấy người bệnh mắc phì đại cơ tim chủ yếu có nhóm tuổi từ 40 đến 80 tuổi đặc biệt là từ 50 - 59 tuổi (33%). Kết quả này tương đối phù hợp với một số nghiên cứu trước đó về sàng lọc bệnh Fabry ở người bệnh phì đại cơ tim trên thế giới như nghiên cứu của Nakao và cộng sự (1995), hay nghiên cứu của Ole Havndrup và cộng sự (2010), nghiên cứu của của Albert A Hagege (2010) tại Pháp và nghiên cứu của David Zemánek và cộng sự (2022). Về giới tính của các đối tượng tham gia nghiên cứu: 97% đối tượng tham gia nghiên cứu là nam, trong số 26 người bệnh có hoạt độ enzyme thấp nhất được giải trình tự, tỷ lệ nam cũng chiếm đa số. Điều này phù hợp với quy luật di truyền liên kết NST X của Fabry. 4.1.2. Đặc điểm chung về tuổi và giới của bệnh Pompe Tuổi khởi phát trung bình của các người bệnh trong nghiên cứu là 5±4,2 tháng, phần lớn là khởi phát dưới 1 tuổi, kết quả này phù hợp với
15 các công bố trước đây về IOPD là tuổi khởi phát thường khoảng 4 tháng, tuổi chẩn đoán thường là 6 tháng. Đặc điểm về giới: tỷ lệ nam: nữ trong nghiên cứu của chúng tôi là 1:1. Điều này hoàn toàn phù hợp vì Pompe là bệnh di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường nên không có sự khác nhau về giới tính. 4.2. Biến đổi hoạt độ enzyme GLA, GAA của các người bệnh tham gia nghiên cứu 4.2.1. Hoạt độ enzyme GLA của người bệnh phì đại cơ tim chưa rõ nguyên nhân Hoạt độ GLA của các người bệnh trong nghiên cứu của chúng tôi là thấp hơn rất nhiều so dải tham chiếu của Đài Loan thể là do đối tượng tham gia nghiên cứu là những người bệnh có phì đại cơ tim chưa rõ nguyên nhân nên không có tính đại diện. Kết quả của chúng tôi cũng thấp hơn so với kết quả của Nakao và cộng sự (1995) hay kết quả của B. Sachdev và cộng sự (2002) trên cùng đối tượng người bệnh có phì đại cơ tim, có thể do sử dụng các phương pháp xác định hoạt độ enzyme GLA khác nhau đo khối phổ song song và phương pháp đo huỳnh quang chuẩn với cơ chất là 4-methylumbelliferyla-D-galactopyranoside). Trong nghiên cứu này có 02 đối tượng có cùng độ tuổi, mang cùng 1 đột biến nhưng hoạt độ enzyme lại rất khác nhau, kết quả này cũng tương tự như kết quả của D. Zemáneket (2022) trên có 4 người bệnh nam cùng mang đột biến và có độ tuổi tương đương nhau nhưng có sự khác nhau về hoạt độ enzyme. 4.2.2. Hoạt độ enzyme GAA của người bệnh có triệu chứng lâm sàng nghi ngờ mắc Pompe Tất cả các bệnh nhi có triệu chứng lâm sàng gợi ý bệnh Pompe đều có hoạt độ GAA nhỏ hơn giá trị tham chiếu, trong đó có 9 người bệnh có hoạt độ enzyme thấp hơn 3% so với giá trị tham chiếu. Các người bệnh này đều xuất hiện các triệu chứng đầu tiên trước 6 tháng tuổi. Điều này hoàn toàn phù hợp với mô tả trong các nghiên cứu trước đây; với IOPD, hoạt độ GAA
16 bệnh trong nghiên cứu của chúng tôi cao hơn so với nghiên cứu của Lukana và cộng sự tại Thái Lan, có thể là do trong nghiên cứu của Lukana hoàn toàn là các người bệnh IOPD, còn trong nghiên cứu này có cả các người bệnh IOPD và LOPD, do đó làm cho hoạt độ enzyme trung bình cao hơn. Mặt khác, các đột biến gen GAA khác nhau cũng sẽ làm thay đổi hoạt độ enzyme với các mức độ khác nhau. Các người bệnh có hoạt độ enzyme thấp đều có thời gian khởi phát sớm. Điều này có thể giải thích là do hoạt độ enzyme thấp sẽ dẫn đến sự tích tụ quá mức glycogen trong tiêu thể tế bào cơ xương và cả cơ tim. Tuy nhiên, khi so sánh hoạt độ enzyme theo thời gian khởi phát (1 tuổi), theo loại đột biến, chúng tôi không nhận thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Điều này có thể giải thích là do cỡ mẫu quá nhỏ, cần có các nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn. 4.3. Đột biến gen GLA, GAA ở người bệnh Fabry và Pompe 4.3.1. Các đột biến gen GLA Trong nghiên cứu này chúng tôi phát hiện được duy nhất một đột biến ở vùng mã hoá acid amin thuộc exon 1. Đó là đột biến c.178C>T p.Pro60Seu, chưa từng công bố trong y văn. Sự thay thế Proline - acid amin phân cực bằng Serin - acid amin không phân cực có thể ảnh hưởng đến sự gấp nếp và cấu trúc của phân tử GLA, từ đó giảm sự trưởng thành cũng như hoạt động của GLA gây ra các biểu hiện của Fabry. Người bệnh mã só FB64 có đột biến c.178 C>T, p.Pro60Serin, chỉ có biểu hiện lâm sàng nhẹ, các đối tượng nghiên cứu khác có đột biến này đều chưa có biểu hiện lâm sàng tại thời điểm nghiên cứu, nên có thể dự đoán đột biến này có thể liên quan đến Fabry thể không điển hình. Khi sử dụng các công cụ SIFT, PolyPhen-2 và MutationTaster đều dự đoán đột biến này khả năng gây bệnh. Tuy nhiên vẫn cần có các nghiên cứu in vitro để khẳng định ảnh hưởng của đột biến này đến hoạt độ enzyme GLA. Tỉ lệ đột biến gen GLA khi sàng lọc các người bệnh phì đại cơ tim trong các nghiên cứu là rất khác nhau. Điều này có thể do tần suất mang gen đột biến khác nhau giữa các dân tộc, các quốc gia, hoặc cũng có thể do khác biệt về tiêu chuẩn thu thập mẫu giữa các nghiên cứu hay số lượng mẫu. Ngoài ra, chúng tôi còn nhận thấy có 5 biến thể ở vị trí IVS và
17 5’UTR xuất hiện với tần số khá cao, trong đó 2 sự thay đổi trình tự là 5’UTR-10C>T và 5’UTR-12G>A đã được ghi nhận là các SNP của gen GLA. Tuy nhiên, hoạt độ enzyme ở những người bệnh có các biến thể này không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với các người bệnh không mang đột biến hoặc mang đột biến ở vùng mã hóa. Có thể là do các đột biến này xảy ra ở vùng intron hoặc vùng 5'UTR là vùng DNA không tham gia vào quá trình giải mã ra protein, cụ thể là enzyme GLA. Tuy nhiên khoa học ngày càng phát triển và vai trò của nhiều trình tự DNA vẫn còn là bí ẩn với sự hiểu biết của con người, do đó các đột biến này có ảnh hưởng gì đến kiểu hình của các cá thể hay không cần có sự nghiên cứu thêm. 4.3.2. Các đột biến gen GAA Kanako Sugawara (2009) cho rằng sự thay thế acid amin gây ra bất thường quá trình trưởng thành hoặc vận chuyển enzyme GAA gây ra bệnh Pompe có thể được tìm thấy trên tất cả năm miền của enzyme GAA. Trong nghiên cứu này chúng tôi phát hiện 10 đột biến (gồm 6 đột biến sai nghĩa, 3 đột biến dịch khung, 1 đột biến chỗ nối) và 1 SNP. Đột biến sai nghĩa c.1933G>C (p.Asp645His) Đột biến này là đột biến có tần suất xuất hiện cao nhất trong nghiên cứu của chúng tôi (7/14 trường hợp, chiếm 50%). Đột biến này xảy ra tại exon 14, thuộc vùng bảo tồn cao của gen GAA, đã được báo cáo là đột biến gây bệnh trong những nghiên cứu trước đây trên cả người bệnh IOPD và LOPD, ở thể đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép, kết hợp với các đột biến thể dị hợp tử khác nhau như đột biến c.1933G>C hay đột biến c.1411-1414del trong nghiên cứu của Lukana (2019). Trong nghiên cứu này, đột biến c.1933 G>C (p.Asp645His) thể đồng hợp tử được tìm thấy trên 03 người bệnh IOPD khác nhau, đều có hoạt độ enzyme rất thấp. Thể dị hợp tử kép kết hợp với đột biến c.1933G>A (p.Asp645Asn), đột biến (p.Leu246fs*22) hay đột biến c.2173C>T (p.Arg725Trp), đều là các đột biến gây bệnh đã được báo cáo trong nhiều