Tóm tắt Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu chất ức chế hoạt tính protease HIV-1 từ dịch chiết của lá cây Thạch châu (Pyrenaria Jonqueriana), Ổi (Psidium Guajava) và Ma hoàng (Ephedra distachya)

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:26

Thêm vào BST

Báo xấu

62
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu chất ức chế hoạt tính protease HIV-1 từ dịch chiết của lá cây Thạch châu (Pyrenaria Jonqueriana), Ổi (Psidium Guajava) và Ma hoàng (Ephedra distachya) có kết cấu gồm 3 chương: Chương 1 Tổng quan tài liệu, chương 2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu, chương 3 Kết quả và thảo luận.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu chất ức chế hoạt tính protease HIV-1 từ dịch chiết của lá cây Thạch châu (Pyrenaria Jonqueriana), Ổi (Psidium Guajava) và Ma hoàng (Ephedra distachya)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Hồng Anh NGHIÊN CỨU CHẤT ỨC CHẾ HOẠT TÍNH PROTEASE HIV-1 TỪ DỊCH CHIẾT CỦA LÁ CÂY THẠCH CHÂU (PYRENARIA JONQUERIANA), ỔI (PSIDIUM GUAJAVA) VÀ MA HOÀNG (EPHEDRA DISTACHYA) TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015
MỞ ĐẦU Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) gây ra bởi virus gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV). Đây là virus thuộc họ Retroviridae và có hai type chính là HIV-1 và HIV-2, trong đó type 1 xuất hiện phổ biến và là nguyên nhân chính gây ra AIDS ở người. Cho đến nay, dù đã có những chương trình hành động toàn cầu cùng với sự phát triển của các phương pháp điều trị, AIDS vẫn là đại dịch của toàn nhân loại và cần thiết phải tăng cường các biện pháp phòng ngừa, điều trị bệnh hiệu quả. Trong phòng chống nhiễm HIV-1, phát triển vaccine gặp rất nhiều khó khăn và thường thất bại do thời gian ủ bệnh của HIV-1 dài, thường xuyên xảy ra đột biến ở vùng gen mã hóa cho kháng nguyên. Vì vậy, cho đến hiện nay, người nhiễm HIV-1 muốn kéo dài cuộc sống chỉ có con đường duy nhất là sử dụng liệu pháp dùng thuốc kháng retrovirus (ART). Trong chu trình tái bản của HIV-1, protease là enzyme có tác dụng phân cắt các polyprotein tiền thân gag và gag-pol thành những protein cấu trúc và chức năng trong quá trình trưởng thành của virus. Khi ức chế hoạt tính của protease hoặc gây đột biến trên gen mã hóa cho protease, các hạt virus vẫn hình thành nhưng không được đóng gói phù hợp để tạo thành virus hoàn chỉnh nên chúng không có khả năng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ. Vì vậy, một số chất ức chế protease HIV-1 (PI) đã được phát triển thành thuốc điều trị bệnh nhân HIV/AIDS. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc trong thời gian dài với nồng độ cao cùng với tốc độ đột biến lớn của HIV-1 dẫn đến sự xuất hiện các chủng virus kháng thuốc là một trong những nguyên nhân chính gây thất bại điều trị với ART nói chung và PI nói riêng. Hơn nữa, việc thiết kế các chất PI mới không phải dễ dàng, không định hướng, phải sàng lọc trên số lượng khá lớn các hợp chất thiết kế tương tự nhau trên cơ sở hiểu biết về cấu trúc và chức năng của protease HIV-1. Chính vì vậy, bên cạnh các thuốc tổng hợp hóa học, 1
các nhà khoa học trên thế giới cũng không ngừng tìm kiếm và chọn lọc các chất tự nhiên từ dịch chiết thực vật có tác dụng ức chế protease của HIV-1 (protease HIV-1). Việt Nam với nguồn thực vật phong phú và nhiều cây thuốc có giá trị lớn với sức khỏe con người. Theo thống kê, Việt Nam có hơn 12.000 loài thực vật, trong đó có gần 4.000 loài được dùng làm thuốc trong y học dân gian và y học cổ truyền. Như vậy, thực vật Việt Nam cũng s là nguồn nguyên liệu phong phú để sàng lọc và xác định các hoạt chất ức chế protease HIV-1, làm cở sở cho việc phát triển thuốc điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS. Tuy nhiên, cho đến nay chúng ta chưa khai thác nguồn tài nguyên phong phú của đất nước theo hướng này. Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chất ức chế hoạt tính protease HIV-1 từ dịch chiết của lá cây Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana), Ổi (Psidium guajava) và Ma hoàng (Ephedra distachya)” nhằm thu nhận được chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc từ dược liệu Việt Nam. 2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV VÀ PROTEASE CỦA HIV-1 1.1.1. Giới thiệu chung về HIV Đại dịch HIV/AIDS đã và đang là một thách thức to lớn đối với tiến trình phát triển xã hội. Sau 3 thập kỷ phát hiện mà đầu tiên là ở các nước phát triển, HIV/AIDS đã lan rộng trên toàn thế giới, đặc biệt ở khu vực châu Phi và các nước châu Á. Đến nay vẫn chưa có vaccine phòng ngừa HIV hay thuốc chữa trị AIDS đặc hiệu. Theo chương trình HIV/AIDS của Liên hiệp quốc (UNAIDS, 2015), tính đến cuối năm 2014, thế giới có khoảng 36,9 triệu người (dao động trong khoảng từ 34,3 triệu đến 41,4 triệu) đang mang căn bệnh AIDS, trong đó số đối tượng nhiễm mới là 2 triệu người và có khoảng 1,2 triệu bệnh nhân đã chết vì AIDS trong năm 2014. Trong phòng chống nhiễm HIV/AIDS, phương thức điều trị phổ biến nhất hiện nay vẫn là liệu pháp dùng thuốc chống virus (ART-antiretroviral drug therapy) bao gồm thuốc ức chế reverse transcriptase, thuốc ức chế integrase và thuốc ức chế protease (PI). Trong đó, protease được mã hóa bởi gen pol của virus có chức năng cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) tại những vị trí nhất định để tạo thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh. Nếu protease bị mất hoạt tính, HIV-1 không được đóng gói phù hợp để tạo virus hoàn chỉnh. Vì vậy, protease của HIV-1 (protease HIV-1) là một trong những đích quan trọng để phát triển thuốc điều trị AIDS. 1.1.2. Cấu trúc và chức năng của protease HIV-1 Về cấu trúc, protease HIV-1 là một protease aspartyl, họ retropepsin A2. Enzyme này có cấu trúc dạng homodimer, mỗi monomer gồm 99 acid amin và được sắp xếp gần như theo kiểu đối xứng. 3
Cấu tạo của protease HIV-1 có thể chia thành ba vùng chính: vùng dimer hóa, vùng lõi và vùng mũ. Trong đó, vùng dimer hóa được hình thành nhờ tương tác giữa 8 gốc acid amin 1 – 4 (vùng N đầu cùng) và 96 – 99 (vùng C tận cùng) từ mỗi monomer và các acid amin trong trung tâm hoạt động 24 – 29. Khi enzyme gắn thêm chất ức chế hoặc cơ chất, sự ổn định của cấu trúc dimer được tăng cường. Vùng lõi gồm 4 đầu N sợi β có vai trò quan trọng đối với sự ổn định cấu trúc dimer và hoạt tính xúc tác của enzyme. Trung tâm hoạt động của enzyme nằm trong vùng lõi và bao gồm ba gốc acid amin từ mỗi monomer. Vùng mũ nằm ở phần rộng nhất của enzyme bao gồm các acid amin từ 33 – 43 và 44 – 63 bao quanh trung tâm hoạt động. Trung tâm hoạt động của protease chứa bộ ba Asp – Thr – Gly nằm tại mặt phân giới của dimer. Tại một monomer nhóm bộ ba xúc tác được đặt ở vị trí 25 – 26 – 27 và do tính đối xứng ở monomer còn lại là 25’ – 26’ – 27’. Phân tử Asp25 và 25’ là cần thiết cho cả cấu trúc và hoạt tính xúc tác của protease. Về chức năng, sau khi được giải phóng khỏi màng tế bào vật chủ, HIV-1 tồn tại như một hạt virus không có khả năng lây nhiễm được gọi là virion. Để trở thành một hạt virus hoàn chỉnh, virion phải trải qua quá trình sắp xếp lại cấu trúc nhờ khả năng phân cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) của protease để tạo thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho sự trưởng thành của virus. Ngoài vai trò phân cắt các tiền chất của virus, protease HIV-1 cũng cắt các protein của tế bào chủ. Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy sự phân giải và suy giảm các protein của tế bào dẫn tới cả quá trình chết hoại tử và chết tự hủy ở các tế bào CD4+ T. Sự suy giảm các tế bào CD4+ T là một dấu hiệu của HIV/AIDS. Như vậy, có thể dễ dàng nhận thấy vai trò quan trọng của protease HIV-1 trong việc phân cắt các protein tiền thân của virus, lắp ráp của các virion trưởng thành và góp phần gây độc cho tế bào vật chủ trong quá trình xâm nhiễm. 4
1.1.3. Phân tích hoạt độ của protease HIV-1 Protease HIV-1 có chức năng phân cắt các polyprotein tiền thân gag và gag-pol của virus. Trung tâm hoạt động của protease bao gồm bộ ba Asp25, Thr26 và Gly27; nếu đột biến xảy ra tại Asp25 s dẫn đến mất hoạt tính của protease HIV-1. Protease HIV-1 cũng có hoạt tính tự cắt xảy ra sau khi protein gag-pol hình thành dimer hóa, qua đó cho phép giải phóng chính nó ra khỏi polyprotein tiền thân. Hoạt tính của enzyme này là tuyệt đối cần thiết cho quá trình hình thành virus hoàn chỉnh dẫn đến vai trò quan trọng của protease trong liệu pháp dùng thuốc chống HIV-1. Phát triển thuốc ức chế protease HIV-1 cần thiết phải có các phương pháp xác định hoạt độ của protease phù hợp. Do protease HIV-1 chỉ thủy phân peptide hay protein chứa những trình tự đặc hiệu, không thủy phân các protein thông thường nên việc xác định hoạt độ của protease chỉ có thể được thực hiện khi sử dụng các cơ chất được thiết kế dựa trên các trình tự phân cắt của protease HIV-1. Vì vậy, phần lớn cơ chất là các chuỗi peptide có trình tự giống với một trong các vị trí cắt đặc hiệu của protease HIV-1 trên các chuỗi polyprotein gag và gag-pol của HIV-1. Dưới đây là một số phương pháp xác định hoạt độ của protease HIV-1 được sử dụng phổ biến. Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp pha đảo (Reversed Phase HPLC) định lƣợng sản phẩm phân cắt từ cơ chất tổng hợp: Phương pháp có độ nhạy cao nhưng nhược điểm là: tiêu tốn nhiều thời gian, không thích hợp làm nhiều mẫu và thiếu tính liên tục. Những hạn chế này của HPLC đã dần được khắc phụ bằng cách sử dụng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC (Ultra performance liquid chromatography) để tăng độ phân giải, độ nhạy và số lượng. So với HPLC, UPLC có quá trình chuẩn bị mẫu đơn giản, thời gian phân tích ngắn và có tính chọn lọc cao cho phép đánh giá đồng thời nhiều chất ức chế. 5
Phƣơng pháp quang phổ kế với cơ chất peptide có liên kết đặc hiệu của protease HIV-1: cơ chất peptide được thiết kế có chứa vị trí phân cắt của protease HIV-1 có khả năng hấp thụ cực đại tại bước sóng nhất định trong vùng tử ngoại. Dưới tác dụng của protease, liên kết bị phân cắt, độ hấp thụ ánh sáng giảm dần theo thời gian tác dụng của enzyme. Phương pháp được thực hiện nhanh, không tốn nhiều thời gian, liên tục và cho số liệu chính xác. Phƣơng pháp quang phổ huỳnh quang: Dựa trên trình tự cắt của protease HIV-1, Taylor và tập thể (1992) đã tổng hợp một cơ chất huỳnh quang DABCYL-SerGlnAsnTyrProIleValGln-EDANS để đo hoạt độ của enzyme. Cơ chất được đặc trưng bởi chất phát quang là EDANS và chất thu tín DABCYL. Khi protease HIV-1 thủy phân liên kết Tyr-Pro, DABCYL tách ra khỏi phần gắn EDANS, nhờ đó EDANS phát ra huỳnh quang có thể đo được dưới tác dụng của ánh sáng kích thích. Phương pháp này ít tốn thời gian, có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hơn quang phổ thông thường và được xem là phương pháp hiện đại nhất hiện nay để xác định hoạt độ protease HIV-1. 1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ PROTEASE HIV-1 VÀ ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ AIDS 1.2.1. Chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc hoá học Protease HIV-1 là một trong các đích quan trọng để phát triển thuốc điều trị HIV/AIDS. Nhìn chung, các chất ức chế protease có thể chia thành hai nhóm lớn: i) các chất ức chế có bản chất peptide và ii) các chất ức chế không phải peptide. Ở nhóm thứ nhất, chất ức chế giống với cơ chất tự nhiên mang liên kết đặc hiệu của protease HIV-1. Chúng được thiết kế giống với dạng trung gian chuyển tiếp tứ diện hình thành trong quá trình protease xúc tác. Trong khi đó, nhóm chất ức chế không phải peptide lại gắn với phân tử H2O trong trung tâm hoạt động của protease làm cho protease không gắn được với các polyprotein tiền thân của HIV-1 để thực hiện chức năng của mình. 6
Đến nay, đã có 8 thuốc PI được FDA cấp phép để điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV, bao gồm: Atazanavir, Darunavir, Fosamprenavir, Indinavir, Nelfinavir, Saquinavir, Tipranavir và Ritonavir. Để đánh giá mức độ mạnh yếu của các chất ức chế các nghiên cứu trước thường sử dụng giá trị IC50 và IC90 (nồng độ của chất ức chế mà tại đó 50% và 90% hoạt tính của enzyme bị ức chế). Saquinavir là chất ức chế đầu tiên được FDA phê duyệt. Cơ sở của thiết kế dựa trên khả năng phân cắt các liên kết bất thường giữa Tyr-Pro hoặc Phe- Pro trên chuỗi polypeptide pol tiền thân của protease. Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cho thấy, Saquinavir có hoạt tính ức chế cao với giá trị IC90 là 6 nM. Tuy nhiên, Saquinavir lại có hoạt tính sinh học thấp theo đường uống và nhanh chóng bị phân hủy trong cơ thể. Indinavir, Nelfinavir và Ritonavir đều được thiết kế dựa trên chức năng nhận biết trình tự acid amin tương tự như Saquinavir. Trong điều kiện in vitro, Ritonavir đã được chứng minh có khả năng ức chế các chủng HIV-1 phân lập với IC90 vào khoảng 70 – 200 nM. Tác dụng phụ của thuốc là tương tác thuốc cao nên nhiều thuốc bị chống chỉ định khi dùng Ritonavir, xảy ra nhiều rối loạn chuyển hóa, giảm chức năng gan. Indinavir là một chất ức chế mạnh và chọn lọc của protease ở nồng độ 0,6 nM. Indinavir được tăng cường độ hòa tan, hoạt tính sinh học theo đường uống rất tốt và ức chế virus với nồng độ từ 50 – 100 nM. Mặc dù vậy, có một số vấn đề liên quan đến Indinavir đó là thuốc gây sỏi thận ở khoảng 5 – 25% số bệnh nhân, có tác dụng phụ trên da, niêm mạc và gây tăng bilirubin không triệu chứng. Do đó, hiện nay Indinavir vẫn có vai trò thứ yếu trong điều trị HIV. Nelfinavir cũng là một trong các chất ức chế protease được sử dụng nhiều nhất. Ở điều kiện in vitro, Nelfinavir ức chế protease HIV-1 mạnh với Ki là 2,0 nM. Thuốc này đã được chứng minh có khả năng kháng một số chủng HIV-1 và 7
HIV-2 với IC50 là 9 – 60 nM. Tác dụng của Nelfinavir được tăng cường khi sử dụng cùng các thuốc kháng retrovirus khác. Bên cạnh các tác dụng phụ, khi sử dụng các thuốc tổng hợp hóa học để điều trị cho các bệnh nhân nhiễm HIV phải xem xét tới vấn đề đột biến kháng thuốc của HIV-1. Trong các đột biến kháng thuốc thì phổ các đột biến PI rất rộng, có thể do sự đa hình xảy ra ở 49 gốc acid amin trong tổng số 99 gốc acid amin của protease. Khi điều trị bằng các thuốc ức chế protease không tăng cường, các đột biến chính làm giảm rõ rệt hoạt tính của các thuốc. Đối với các chất ức chế protease tăng cường phải cần sự xuất hiện của nhiều đột biến đồng thời mới xảy ra tình trạng kháng thuốc. 1.2.2. Chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc tự nhiên Mặc dù PI tổng hợp hoá học có tính đặc hiệu cao nhưng nhược điểm là gây ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn khi sử dụng trong thời gian dài và khả năng kháng thuốc cao. Do đó, sự ra đời của các loại thuốc PI mới chống HIV/AIDS là hết sức cần thiết. Tuy nhiên, việc thiết kế các chất mới thường khá phức tạp, phải trải qua nhiều bước thử nghiệm và không thân thiện với con người. Chính vì vậy, ngoài các thuốc tổng hợp hóa học, các nhà khoa học cũng không ngừng tìm kiếm và chọn lọc các chất tự nhiên có tác dụng ức chế protease HIV-1. Nhiều dịch chiết từ thực vật và vi sinh vật đã được sử dụng để chống nhiễm trùng, chống lại sự phát triển của các khối u cũng như có hoạt tính kháng HIV-1 và protease HIV-1. Otake và tập thể đã nghiên cứu tác dụng của 30 dịch chiết thực vật lên hoạt động của HIV-1 và nhận thấy khả năng ức chế nhiều nhất là dịch chiết methanol của cây xà cừ Tây Ấn. Các loài thực vật khác cũng có khả năng ức chế 40 – 50% hoạt tính của protease HIV-1 tại nồng độ 100 µg/ml như dịch chiết methanol thân rễ của cây Riềng nếp (Alpinia galangal) ức chế 48,70% và cây Nhọ nồi (Eclipta prostrate) ức chế 42,53%. 8
Protease HIV-1 thuộc họ protease aspartyl, có dạng dimer và mang những đặc điểm tương đồng với pepsin về cấu trúc cũng như cơ chế xúc tác. Do protease HIV-1 có tính đặc hiệu cơ chất cao nên gần như không thể sử dụng nó trong các khâu sàng lọc, vì các chất có mặt s ảnh hưởng đến phép phân tích. Chính vì vậy, trong nhiều nghiên cứu, pepsin thường được dùng thay thế cho protease HIV-1 trong quá trình sàng lọc. Chẳng hạn như, Rege và tập thể đã sử dụng pepsin thay thế cho protease HIV-1 để đánh giá hoạt tính ức chế của các dịch chiết từ thực vật. Kết quả cho thấy, dịch chiết ethanol của Hương nhu tía (Ocimum sanctum) và Thần thông (Tinospora cordifolia) có hoạt tính ức chế với IC50 tương ứng là 123,73 và 11,20 µg/ml. Từ các dịch chiết thực vật và vi sinh vật ban đầu, một loạt các hợp chất thứ cấp có khả năng ức chế protease HIV-1 đã được phân tách và tinh sạch bao gồm: Các flavonoid: Đây là nhóm chất lớn nhất (các hợp chất polyphenol) được tổng hợp trong các tế bào thực vật. Chúng được biết đến với nhiều tác dụng sinh học quan trọng và đặc biệt là hoạt tính chống oxy hóa. Hoạt tính kháng HIV-1 của các flavonoid khác nhau đã được chứng minh. Một số chalcone trong nhóm flavonoid như: hydroxypanduratin A và panduratin A từ dịch chiết metanol của thân, rễ cây Gừng (Boesenbergia pandurata Holtt) thể hiện khả năng ức chế hoạt độ protease HIV-1 với IC50 tương ứng là 5,6 µM và 18,7 µM. Các lignin: Lignin là các hợp chất cao phân tử, có mặt chủ yếu ở thực vật có mạch. Longipedunin A được phân lập từ cây Na rừng (Kadsura longipedunculata Finet et Gagnet) ức chế protease HIV-1 với giá trị IC50 là 50 µM. Nhóm nghiên cứu của Gao đã phân lập và xác định được 26 lignin (và hai triterpenoid) từ cây Oải hương (K.angustifolia (Bertol.) O. Kuntze). Trong số này, binankadsurin A đã thể hiện hoạt tính kháng HIV với IC50 là 3,86 µM. Các triterpen và dẫn xuất của chúng: Triterpen là những terpene chứa 6 đơn vị isoprene, có công thức C30H48, một số kết hợp với đường gọi là 9
saponin triterpen. Trong đó, nhiều hợp chất có hoạt tính ức chế protease HIV- 1 đã được biết đến như: acid maslinic, acid ursolic, acid oleanolic... Cụ thể, acid ursolic và các dẫn xuất malonate mono-este có hoạt tính ức chế protease HIV-1 với IC50 tương ứng 8 và 6 µM. Acid ursolic, acid maslinic và một số triterpen khác cũng đã được phân lập từ một thực vật của Trung Quốc Geum japonicum, trong đó acid maslinic thể hiện hoạt tính ức chế protease HIV-1 mạnh nhất. Bên cạnh tác dụng ức chế protease HIV-1, các triterpen cũng được công bố làm ngăn chặn quá trình xâm nhập của HIV, ức chế enzyme phiên mã ngược và ức chế quá trình trưởng thành của HIV. Không chỉ có ở thực vật, nhiều triterpen phân lập từ nấm cũng cho thấy hoạt tính ức chế protease HIV-1 với giá trị IC50 dao động từ 20 đến hơn 200 µM chẳng hạn như các triterpen từ C. songaricum thể hiện hoạt tính ức chế mạnh protease HIV-1 với giá trị IC50 từ 4 – 14 µM. Họ nấm Ganodermataceae gồm hơn 200 loài chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Phân lập dịch chiết chloroform của Ganoderma colossum (FR.) thu được 8 lactone lanostane triterpen gọi tên là colossolactone I-VIII và các hợp chất đã biết như ergosterol, schisanlactone, và colossolactone B, C, D, E và G. Trong đó, colossolactone I và II ức chế mạnh nhất với IC 50 tương ứng là 4,1 µM và 4,4 µM, các hợp chất còn lại ức chế yếu hơn với IC 50 từ 10,8– 29,1 µM. Qua đây, có thể thấy rằng nhiều hợp chất triterpen có hoạt tính ức chế protease HIV-1. Các hợp chất phenol: Tannin – một nhóm hợp chất phenol và các hợp chất phenol liên quan khác có khả năng kháng virus hiệu quả. Một số tannin có thể thủy phân như acid gallic và các galloyl glucose phân lập từ cây Chiêu Liêu (Terminalia chebula) và camellia-tannin H phân lập từ cây Trà My (Camellia japonica) lần lượt thể hiện hoạt tính ức chế intergrase và protease HIV-1 mạnh. Các curcumin phân lập từ dịch chiết ethyl acetate của thân rễ cây Nghệ (Curcuma longa) cũng cho thấy hoạt tính kháng protease HIV-1 và 10
HIV-2. Từ dịch chiết chloroform quả thể của nấm G. colossum ở Việt Nam đã phân lập được hai hợp chất hydroquinone farnesyl là ganomycin B đã biết và hợp chất mới ganomycin I. Cả hai ganomycin I và ganomycin B ức chế protease HIV-1 với giá trị IC50 lần lượt tương ứng 21,9 µM và 2,9 µM. Ở trong nước, nghiên cứu của Đỗ Thế Lộc và Phạm Viết Dự đã cho thấy tác dụng hỗ trợ điều trị HIV/AIDS trên lâm sàng của bài thuốc y học cổ truyền MD 07. Ngoài ra, một số các nghiên cứu cũng được tiến hành để đánh giá tác dụng của viên nang Brishamin hay thuốc BSP1 trong hỗ trợ điều trị bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS. Nghiên cứu của Lã Đình M i và Đái Duy Ban điều tra được 40 loài thảo mộc có tác dụng kháng virus, kháng HIV và tăng cường miễn dịch có triển vọng ở Việt Nam. Khả năng ức chế protease HIV-1 của 8- hydroxyquinoline, menadione và acid asiatic cũng được phát hiện bởi Nguyễn Thị Hồng Loan và Phan Tuấn Nghĩa. Mặc dù, cho tới nay chưa có loại thuốc nào có nguồn gốc tự nhiên được đưa vào điều trị lâm sàng cho bệnh AIDS nhưng hoạt động đầy hứa hẹn của các sản phẩm tự nhiên này đã được chứng minh. Bên cạnh tác dụng ức chế trực tiếp protease HIV-1, việc tìm ra các hoạt chất này cũng s là cơ sở để thiết kế các chất hóa học có cấu trúc tương tự nhưng được cải biến phù hợp nhằm tăng hiệu quả ức chế protease HIV-1. Theo thống kê của Viện Dược liệu, Việt Nam có hơn 12.000 loài thực vật, trong đó có gần 4.000 loài được dùng làm thuốc trong y học dân gian và y học cổ truyền. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các cây thuốc Việt Nam có chứa nhiều hoạt chất có tác dụng sinh học đáng chú ý. Nguồn thực vật phong phú và nhiều cây thuốc, vị thuốc của Việt Nam s là nguồn nguyên liệu phong phú cho việc sàng lọc và phát hiện ra các hoạt chất ức chế protease HIV-1, làm cở sở cho việc phát triển thuốc điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS. 11
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Mẫu dƣợc liệu Các mẫu thực vật, bao gồm: lá cây Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana Pierre.), lá Ổi (Psidium guajava L.), cây Ma hoàng (Ephedra distachya L.) được thu hái và kiểm tra tính chính xác về loài thông qua đặc điểm hình thái bởi TS. Đỗ Thị Xuyến, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Mẫu nghiên cứu hiện được lưu giữ tại Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu. 2.1.2. Các hoá chất, nguyên liệu khác Các hóa chất chính sử dụng cho nghiên cứu gồm: protease HIV-1 là sản phẩm của đề tài mã số: ĐT-PTNTĐ.2012-G/02; pepsin, hemoglobin, pepstatin A, dimethyl sulphoxide (DMSO), Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB), cơ chất peptide L6525(Lys-Ala-Arg-Val-Nle-p-nitro-Phe-Glu-Ala-amide) cho protease HIV-1 của Sigma-Aldrich (Mỹ), kit xác định hoạt tính protease HIV-1 sử dụng cơ chất huỳnh quang Kit SensoLyte® 520 HIV-1 Protease Assay (Anaspec, Mỹ). Các hóa chất khác như trichloroacetic acid (TCA), agar, urea, β- mercaptoethanol… đều đạt độ tinh sạch dành cho phân tích. 2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ Các máy móc, trang thiết bị chính sử dụng cho nghiên cứu bao gồm: tủ ấm 37ºC (Memmert, Anh); tủ an toàn sinh học cấp 2 (Nuaire, Mỹ); máy li tâm lạnh 5417R (Eppendorf, Đức); máy li tâm Sigma 3K (Sartorius, Đức); máy gia nhiệt khô Multi Blok® Heater (Lab-Line Instruments, Hoa Kỳ); máy quang phổ (Thermo Scientific, Hoa Kỳ); máy quang phổ kiến DU 800 (Beckman coulter, Hoa Kỳ); máy NanoDrop huỳnh quang 3300 (Thermo Scientific, Hoa Kỳ). Các dụng cụ, trang thiết bị cơ bản khác của phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein. 12
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phân tách các hợp chất từ dịch chiết thực vật - Lá dược liệu (1,5 kg) độ ẩm 8,5% được cắt nhỏ, chiết hồi lưu với ethanol 96% ở nhiệt độ sôi (chiết 3 lần, mỗi lần 4 giờ). - Dịch chiết được gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết ethanol đã cô khô. - Cao chiết được hòa tan vào nước cất (0,5 lít) thành nhũ dịch và tiếp tục chiết phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần theo thứ tự n-hexan (Hx) (0,5 lít × 3 lần), ethyl acetate (EtOAc) (0,5 lít × 3 lần), n-butanol (BuOH) (0,5 lít × 3 lần). - Các dịch chiết Hx, EtOAc và BuOH được tách riêng, cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các phần cao tương ứng. - Cao phân đoạn có hoạt tính ức chế tốt tiếp tục được chạy qua cột sắc ký silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi dicloromethan/methanol với tỷ lệ methanol tăng dần từ 0 đến 100%. - Thành phần dịch rửa giải được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Sự có mặt của các hợp chất quan tâm được quan sát bản sắc ký dưới đèn tử ngoại ở bước sóng UV – 254 nm, 365 nm và ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử H2SO4 10%/ethanol và sấy ở 110oC trong 5 phút. - Phân đoạn lựa chọn được chạy qua cột silica gel rửa giải với hệ dung môi gradient n-hexan/ethyl acetat (4/1; 2/1; 1/1) thu được hợp chất quan tâm. 2.3.2. Xác định cấu trúc của chất đƣợc phân tách Công thức cấu tạo của chất phân tách được xác định thông qua các tính chất lý hóa (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy) và các phổ tử ngoại (UV), hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, sử dụng chất nội chuẩn là TMS - tetramethyl silan) và so sánh với các dữ liệu đã công bố. 13
2.3.3. Xác định hoạt tính ức chế pepsin bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch có chứa cơ chất hemoglobin Trong giai đoạn sàng lọc, hoạt tính ức chế protease HIV-1 của các dịch chiết thực vật được đánh giá gián tiếp thông qua khả năng ức chế pepsin phân giải cơ chất hemoglobin. Quá trình chuẩn bị đĩa thạch gồm các bước như sau: 1. Các đĩa agar (2,5%) được chuẩn bị trong đệm acetate 50 mM pH 3,5, chứa hemoglobin (0,3%) và được đục các lỗ (đường kính 4 mm) để cho mẫu. 2. 10 µl dịch chiết thực vật hoặc các phân đoạn tinh sạch pha trong DMSO được cho vào giếng, ủ 37ºC trong 15 phút cho đến khi dịch chiết khuếch tán một phần vào đĩa thạch. 3. 10 µl pepsin (1 mg/ml) pha trong HCl 0,01 N được bổ sung và tiếp tục ủ ở 37ºC trong 2 giờ. Mẫu kiểm tra âm là mẫu thay đồng thời dịch chiết bằng DMSO, thay pepsin bằng dung dịch pha pepsin (HCl 0,01 N), mẫu kiểm tra dương là mẫu thay dịch chiết (chứa chất ức chế) bằng DMSO. 4. Sau khi ủ 120 phút, đĩa thạch được nhuộm bằng dung dịch CBB 0,25% và được tẩy nhiều lần cho tới khi nhìn rõ vòng phân giải của pepsin. Hoạt tính ức chế pepsin được đánh giá trên cơ sở đo vòng phân giải cơ chất, so sánh giữa mẫu thí nghiệm và các mẫu kiểm tra. Cụ thể, khả năng ức chế của các hợp chất thực vật được thống kê trên cơ sở đo vòng phân giải (Bảng 1). Bảng 1. Mức độ ức chế pepsin của các hợp chất thực vật theo đƣờng kính vòng phân giải Đƣờng kính vòng phân giải Mức độ ức chế (ĐKVPG) (cm) 0 < ĐKVPG ≤ 0,6 cm +++ 0,6 < ĐKVPG ≤ 0,9 ++ 0,9 < ĐKVPG < 1,1 + 1,1 ≤ ĐKVPG - (Không ức chế) 14
2.3.4. Xác định hoạt tính ức chế pepsin theo phƣơng pháp Anson cải tiến Bên cạnh phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, hoạt tính ức chế pepsin của các dịch chiết thực vật cũng được đánh giá bằng phương pháp Anson cải tiến với cơ chất hemoglobin theo quy trình mô tả của hãng Sigma Aldrich. Nguyên tắc: Hemoglobin bị phân cắt bởi pepsin thành các peptide và acid amin hòa tan. Sự có mặt của các acid amin thơm trong sản phẩm thủy phân được xác định thông qua độ hấp thụ của chúng ở bước sóng 280 nm (A280) và là cơ sở để đánh giá hoạt độ của pepsin. Cách tiến hành: Pepsin được ủ với dịch chiết ở 37ºC, 5 phút. Sau đó bổ sung hemoglobin 2% trong HCl 60 mM và tiếp tục ủ ở 37ºC trong 15 phút. Phản ứng được làm ngừng bằng TCA 5%, sản phẩm phân giải trong dịch nổi thu được sau khi ly tâm được xác định bằng cách đo A280. Mẫu kiểm tra là pepsin bị bất hoạt bằng TCA 5% trước khi bổ sung cơ chất. Hoạt độ pepsin được đánh giá trên cơ sở hiệu số số đọc A280 của mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng. Công thức tính % ức chế: AĐC - ATN × 100% % ức chế = AĐC Trong đó: AĐC và ATN lần lượt là độ hấp thụ tại bước sóng 280 nm của mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm. 2.3.5. Xác định hoạt tính protease HIV-1 sử dụng cơ chất peptide đặc hiệu Hoạt tính ức chế protease HIV-1 của các hợp chất được xác định bằng cách sử dụng cơ chất tổng hợp có liên kết đặc hiệu dựa theo phương pháp được mô tả bởi Richards và tập thể. Nguyên tắc: Cơ chất peptide với trình tự Lys-Ala-Arg-Val-Leu*Nph-Glu- Ala-Met (Sigma-Aldrich) chứa vị trí phân cắt của protease HIV-1 dưới dạng cải biến Nle (nonleucine) và 4-NO2- phenylalanine (Nph) có khả năng hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 300 nm (A300). Dưới tác dụng thủy phân của protease 15
HIV-1 liên kết bị phân giải, đo độ giảm A300 theo thời gian trên máy quang phổ kế UV-VIS. Cách tiến hành:  Enzyme và chất ức chế được ủ trước với nhau trong môi trường đệm thử hoạt tính (Bảng 2.) trong 5 phút.  20 µL cơ chất được bổ sung.  Hỗn hợp được trộn đều và tiến hành đo mức độ giảm A300 trên hệ thống máy quang phổ trong 10 phút ở 37oC.  Mẫu kiểm tra hay đối chứng là mẫu thay dung dịch chứa chất ức chế bằng đệm chiết hay dung môi hòa tan chất ức chế. Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng đo hoạt độ protease HIV-1 sử dụng cơ chất peptide đặc hiệu L6525 Thể tích Thành phần (μL) H2O khử ion, khử trùng 127 Đệm 2x (Na-acetate 200 mM, pH 4.5, EDTA 8 mM, 150 -mecaptoethanol 10 mM, NaCl 1.8 M, CaCl2 10 mM) Cơ chất 1mg/ml 20 Chất ức chế (ở các nồng độ khác nhau) 1 Protease HIV-1 150 ng/l 2 Tổng thể tích 300 16
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐÁNH GIÁ KHẢ N NG ỨC CHẾ PROTEASE HIV-1 CỦA THẠCH CHÂU (PYRENARIA JONQUERIANA PIERRE.), ỔI (PSIDIUM GUAJAVA L.) VÀ MA HOÀNG (EPHEDRA DISTACHYA L.) Nguyễn Văn Dũng và tập thể đã tiến hành sàng lọc hoạt tính ức chế pepsin/protease HIV-1 của các cao chiết cồn từ 136 loài thực vật; kết quả cho thấy có 5 cao chiết gồm: hạt Bơ (Persea americana Mill.), lá Gối hạc (Leea rubra L.), cây Ma hoàng (Ephedra sinica L.), lá Ổi (Psidium guajava L.) và lá Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana Pierre.) ức chế mạnh enzyme. Từ dịch chiết ethanol lá cây Gối hạc (Leea rubra L.), hợp chất acid maslinic (2α,3β- dihydroxy-olean-12-en-28-oic acid; công thức phân tử C30H48O4) được phân lập. Hợp chất này có tác dụng ức chế mạnh pepsin và protease HIV-1 với giá trị IC50 tương ứng là 3,2 mM và 4,5 µM. Trên cơ sở đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn Thạch châu Pyrenaria jonqueriana Pierre. (Theaceae), lá cây Ổi Psidium guajava L. (Myrtaceae) và cây Ma hoàng Ephedra distachya L. (Ephedraceae) để tiếp tục phân lập, tinh sạch chất ức chế tiềm năng protease HIV-1 và nghiên cứu tính chất của các hoạt chất thu được. 3.1.1. Khả năng ức chế pepsin của của các dịch chiết và phân đoạn từ lá cây Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana Pierre.) Cây Thạch châu Pyrenaria jonqueriana Pierre. thuộc họ Chè (Theaceae) là một loài cây mới được phát hiện ở một số tỉnh nước ta (Lâm Đồng, Quảng Trị, Lào Cai). Người dân những vùng này từ lâu đã thu hái và sử dụng Thạch châu để pha nước uống giải nhiệt thay cho chè. Ngoài ra, Thạch Châu còn được sử dụng trong các bài thuốc để thanh nhiệt, lợi tiểu, tăng sức đề kháng... Theo các nghiên cứu, nhiều thực vật trong họ Chè (Theaceae) thường chứa nhiều hợp chất thứ cấp quan trọng như tanin, flavonoid, polyphenol, triterpen và 17
glycoside… Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam và trên thế giới có rất ít tài liệu nghiên cứu về cây Thạch châu, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào đặc điểm hình thái và phân loại. Do đó, nghiên cứu của chúng tôi s góp phần cung cấp thêm các thông tin về thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của các hợp chất phân lập từ cây Thạch châu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành chiết cao ethanol tổng số của lá cây Thạch châu trong các dung môi hexane (Hx), ethyl acetate (EtOAc) và butanol (BuOH) có độ phân cực tăng dần để thu riêng các phân đoạn và cao nước. Các dịch chiết này sau đó được kiểm tra khả năng ức chế pepsin bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch với cơ chất hemoglobin. Kết quả cho thấy, tại các giếng đối chứng chỉ có dung dịch pha pepsin HCl là 0,01 N và dung môi pha chất nghiên cứu là DMSO 100% đều không có vòng phân giải; với giếng chỉ có pepsin hoặc pepsin và DMSO, đường kính vòng phân giải cơ chất là lớn nhất 1,2 cm. Qua đó chứng tỏ, vòng phần giải do hoạt tính của pepsin tạo ra. Trong khi đó, một số giếng chứa dịch chiết cũng như pepstatin A có đường kính vòng phân giải bị giảm đi. Dựa vào đường kính vòng phân giải có thể kết luận, phân đoạn BuOH ức chế hoạt tính pepsin tốt nhất. 3.1.2. Khả năng ức chế pepsin của của các dịch chiết và phân đoạn từ lá cây Ổi (Psidium guajava L.) Cây Ổi có tên khoa học là Psidium guajava L., thuộc họ Sim (Myrtaceae). Các phần khác nhau của cây Ổi được dùng làm thuốc điều trị một loạt các bệnh ở người: điều trị đi ngoài, bệnh tả, bỏng, liền da, hạ sốt, ho, viêm họng… Trong cây Ổi có nhiều hợp chất hữu cơ thứ cấp, gồm saponin, alkaloid, tannin, flavonoid, steroid, tinh dầu và rất giàu nhóm triterpen. Triterpen đã được biết đến với nhiều tác dụng sinh học và có nhiều tiềm năng trong điều trị bệnh như chống lại quá trình tăng sinh của tế bào ung thư, điều trị tiểu đường, chống oxi hoá, kháng viêm và kháng HIV-1... 18
Tương tự lá cây Thạch châu, dịch chiết ethanol lá cây Ổi cũng được chiết bởi các dung môi Hx, EtOAc và BuOH có độ phân cực tăng dần để thu được các cao tương ứng. Khi tiến hành kiểm tra khả năng ức chế pepsin bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và dựa trên đường kính của vòng phân giải cho thấy các phân đoạn Hx và EtOAc có hoạt tính ức chế pepsin tốt nhất. 3.1.3. Khả năng ức chế pepsin của của các dịch chiết và phân đoạn từ thân cây Ma hoàng (Ephedra distachya L.) Ma hoàng Ephedra distachya L. là loài cây bụi thuộc họ Ma hoàng (Ephedraceae). Trong y học cổ truyền, Ma hoàng thường được dùng để chữa các chứng bệnh cảm mạo phong hàn, tức ngực, hen suyễn, phù thũng, làm ra mồ hôi, trừ lạnh, trừ ho hen, long đờm, lợi tiểu… Các nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy, chi Ma hoàng có chứa alkaloid với tỷ lệ 1 – 2,5%, trong đó chủ yếu là ephedrine có tác dụng gây hưng phấn tinh thần và giảm đau. Ngoài ra, ma hoàng còn chứa nhiều hợp chất thứ cấp như flavonoid, tannin, tinh dầu, acid hữu cơ, các hợp chất phenol… Các cao được phân tách từ dịch chiết ethanol của cây Ma hoàng trong các dung môi khác nhau cũng đã được nghiên cứu ảnh hưởng lên hoạt tính của pepsin theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch chứa hemoglobin. Kết quả thu được cho thấy cao BuOH có khả năng ức chế pepsin tốt nhất. Theo kết quả thử khuếch tán trên đĩa thạch, đường kính vòng phân giải của giếng có bổ sung cao ethanol tổng số lá cây Ổi với nồng độ 100 mg/mL là 0,95 cm, trong khi đó, hai giếng bổ sung cao ethanol từ lá Thạch châu và cây Ma hoàng ở cùng nồng độ đều có đường kính là 1,15 cm. Bên cạnh đó, hoạt tính của các cao Hx, cao EtOAc, cao BuOH và cao nước từ dịch chiết ethnol lá Ổi cũng đều ức chế pepsin tốt hơn các cao tương ứng thu được từ dịch ethanol lá Thạch châu và thân Ma hoàng, đặc biệt là hai cao EtOAc và Hx từ lá Ổi. Như vậy, bước đầu chúng tôi có thể kết luận hoạt tính ức chế pepsin của các dịch chiết từ lá Ổi 19