Xây dựng quy trình chiết xuất saponin toàn phần từ lá đu đủ rừng bằng phương pháp chiết siêu âm

t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 9-2019<br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT SAPONIN TOÀN PHẦN TỪ<br /> LÁ ĐU ĐỦ RỪNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT SIÊU ÂM<br /> Lê Thị Thanh Thảo1; Nguyễn Trọng Điệp2; Nguyễn Hồng Vân3<br /> Võ Xuân Minh4; Nguyễn Nữ Huyền My2<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: xây dựng được quy trình chiết xuất saponin toàn phần từ lá đu đủ rừng bằng<br /> phương pháp chiết xuất siêu âm. Phương pháp nghiên cứu: chiết xuất theo phương pháp siêu<br /> âm; khảo sát các thông số quy trình gồm: kích thước tiểu phân dược liệu, loại dung môi, tỷ lệ<br /> dung môi/dược liệu, số lần chiết, nhiệt độ chiết và thời gian chiết; định lượng saponin bằng<br /> phương pháp UV-Vis. Kết quả: đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng và hiệu suất<br /> chiết saponin, từ đó lựa chọn các thông số chiết xuất thích hợp gồm: chiết siêu âm trên thiết bị<br /> 0<br /> SM30-CEP với dung môi là ethanol 50%, nhiệt độ 70 C, chiết 2 lần với tỷ lệ dung môi/dược liệu<br /> mỗi lần 15/1, thời gian chiết 90 phút/lần, kích thước tiểu phân dược liệu 0,5 - 1 mm. Kết luận:<br /> đã xây dựng được quy trình chiết xuất saponin toàn phần từ lá đu đủ rừng bằng phương pháp<br /> chiết xuất siêu âm với hiệu suất đạt 95,74%.<br /> * Từ khóa: Đu đủ rừng; Saponin; Siêu âm; Chiết xuất.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ trên thế giới đã cho thấy saponin là thành<br /> phần hóa học chính, liên quan đến một số<br /> Đu đủ rừng (ĐĐR) (Trevesia palmata tác dụng sinh học quan trọng của ĐĐR.<br /> (Roxb.) Vis.) là một cây nhỡ, mọc nhiều Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam, chưa có<br /> và dễ mọc ở bìa rừng hay rừng tái sinh. công trình nghiên cứu nào về chiết xuất<br /> Với nguyên liệu nghiên cứu là lá, nguồn<br /> saponin từ ĐĐR để ứng dụng vào bào<br /> nguyên liệu dồi dào, sẵn có ở các khu vực<br /> chế thuốc. Trong khi, đây là nguồn nguyên<br /> Ba Vì, Cúc Phương, Phú Thọ, Hà Giang…,<br /> liệu tự nhiên, có tiềm năng khai thác cao.<br /> nên việc thu hái không làm ảnh hưởng<br /> đến môi trường sinh thái hay đa dạng Do đó, việc nghiên cứu chiết xuất saponin<br /> sinh học [1]. Cho đến nay, cây ĐĐR ở từ ĐĐR là rất cần thiết. Kết quả nghiên<br /> Việt Nam mới chỉ được sử dụng theo kinh cứu là tiền đề quan trọng để bào chế bột<br /> nghiệm dân gian lấy lõi thân thay cho vị cao khô ĐĐR, góp phần phát triển các<br /> thuốc thông thảo [2]. Một số ít nghiên cứu chế phẩm thuốc từ ĐĐR.<br /> <br /> 1. Trường Cao đẳng Y tế Hà Đông<br /> 2. Học viện Quân y<br /> 3. Bệnh viện Y học Cổ truyền Hà Đông<br /> 4. Đại học Phenikaa<br /> Người phản hồi (Corresponding): Lê Thị Thanh Thảo (lethanhthao2604@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 10/10/2019; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 13/11/2019<br /> Ngày bài báo được đăng: 28/11/2019<br /> <br /> 17<br /> T¹P CHÝ Y - HäC QU¢N Sù Sè 9-2019<br /> <br /> NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP mỗi lần 2 giờ) để loại chlorophyl. Sau đó<br /> NGHIÊN CỨU sấy khô để đuổi hoàn toàn n-hexan chiết<br /> 1. Nguyên liệu và thiết bị. 2 lần với methanol bằng siêu âm trong 2 giờ<br /> ở -50oC (100 ml/lần). Tập trung toàn bộ DC<br /> * Nguyên liệu:<br /> vào bình định mức 200 ml. Bổ sung vừa<br /> - Dược liệu: lá ĐĐR thu hái tại Hà Giang đủ thể tích. Lắc đều và để ổn định ở nhiệt<br /> được rửa sạch, sấy khô (40°C), xay nhỏ độ phòng 30 phút. Hút chính xác 1,0 ml<br /> và bảo quản trong túi nilon kín, để ở nhiệt dịch trong ở phía trên, cho vào bình định<br /> độ phòng thí nghiệm. mức 100 ml, bổ sung vừa đủ đến vạch,<br /> - Hóa chất: FeCl3, NaOH, amoniac, thu được dung dịch định lượng. Dung dịch<br /> axít acetic băng, vanillin, HCl, HClO 4... mẫu trắng được dùng là methanol.<br /> đạt tiêu chuẩn phân tích; dung môi: ethanol, * Chiết xuất saponin từ lá ĐĐR:<br /> n-hexan, dichloromethan, ethyl acetat,<br /> - Phương pháp chiết: tiến hành trên<br /> aceton, methanol; chất chuẩn: axít oleanolic<br /> thiết bị chiết siêu âm SM30. Cài đặt các<br /> (độ tinh khiết 97,0%).<br /> thông số: nhiệt độ, thời gian chiết, chế độ<br /> * Thiết bị, dụng cụ:<br /> làm việc. Khi thiết bị đạt được thông số về<br /> Thiết bị chiết xuất siêu âm SONY MEDI nhiệt độ, cho nguyên liệu (khoảng 5 g) vào<br /> SM30-CEP (Hàn Quốc); máy quang phổ bình chiết trung gian đặt trong bể siêu âm,<br /> Hitachi U-1900 (Nhật Bản); cân phân tích<br /> thêm dung môi và chiết xuất theo các<br /> Mettler Tolendo ML204 (Thụy Sỹ) có độ<br /> điều kiện xác định cho từng thí nghiệm.<br /> chính xác đến 0,1 mg.<br /> Sau khi chiết xuất, thu lấy dịch chiết, lọc<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu. qua màng 0,45 µm và định lượng saponin<br /> * Định lượng saponin toàn phần trong toàn phần bằng phương pháp UV-Vis.<br /> lá ĐĐR: Trường hợp chiết 2 lần, sau khi chiết lần 1,<br /> Tiến hành theo phương pháp quang phổ thu dịch chiết, ép kiệt bã, thêm dung môi<br /> UV-Vis: lần 2 vào và tiếp tục chiết xuất.<br /> <br /> * Dung dịch chuẩn: dung dịch chuẩn - Các thông số đầu vào khảo sát: kích<br /> gốc axít oleanolic có nồng độ chính xác thước tiểu phân dược liệu, loại dung môi,<br /> 92,50 µg/ml. Từ dung dịch chuẩn gốc, tỷ lệ dung môi/dược liệu (DM/DL), số lần<br /> pha các dung dịch chuẩn làm việc có chiết, nhiệt độ và thời gian chiết; thông số<br /> nồng độ thay đổi từ 370 - 11,10 µg/ml. đầu ra là hàm lượng saponin toàn phần<br /> - Mẫu dược liệu: cân chính xác 5,0 g bột (mg) chiết được trên 1 g nguyên liệu tính<br /> dược liệu, chiết với n-hexan (2 lần x 125 ml, theo công thức sau:<br /> <br /> 18<br />  t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 9-2019<br /> <br /> C × n × V × 100<br /> Saponin (mg/g) =<br /> M × (100-h)<br /> C: Nồng độ saponin toàn phần trong dịch chiết tính theo axít oleanoic (mg/ml);<br /> V: Thể tích dịch chiết (ml), M: Khối lượng dược liệu (g); n: Hệ số pha loãng; h: Độ ẩm<br /> dược liệu (%).<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Kết quả định lượng saponin toàn phần trong lá ĐĐR.<br /> Bảng 1: Hàm lượng saponin toàn phần trong lá ĐĐR.<br /> Lá ĐĐR Hàm ẩm EtOH 50% Mật độ Hệ số Saponin<br /> C (mcg/ml)<br /> (g) (%) (ml) quang pha loãng (mg/g)<br /> <br /> 5,0217 0,606 8,69 23,08<br /> <br /> 5,0704 6,27 500 0,582 25 8,38 22,04<br /> <br /> 5,0263 0,577 8,31 22,06<br /> <br /> Trung bình ± SD 22,39 ± 0,60<br /> <br /> Như vậy, saponin toàn phần tính theo axít oleanoic là 22,39 ± 0,60 mg/g dược liệu<br /> khô kiệt.<br /> 2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng các thông số quy trình chiết xuất.<br /> * Ảnh hưởng của kích thước tiểu phân dược liệu:<br /> Tiến hành chiết siêu âm trong cùng điều kiện: dung môi là ethanol 50%, tỷ lệ DM/DL<br /> 20/1, nhiệt độ chiết 60ºC trong 60 phút, nhưng với hai loại kích thước tiểu phân (KTTP)<br /> khác nhau: 0,5 - 1 mm (mẫu DR1), 2 - 5 mm (mẫu DR2).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1: Ảnh hưởng của kích thước tiểu phân dược liệu đến chiết xuất<br /> saponin toàn phần từ lá ĐĐR (n = 3).<br /> <br /> 19<br /> T¹P CHÝ Y - HäC QU¢N Sù Sè 9-2019<br /> <br /> Việc giảm KTTP dược liệu làm tăng đáng kể hàm lượng và hiệu suất chiết saponin.<br /> Mặc dù, lá ĐĐR là nguyên liệu tương đối mỏng, mềm, nhưng việc giảm KTTP đã tạo<br /> điều kiện thuận lợi để dung môi thấm vào, hòa tan dược chất và khuếch tán ra ngoài<br /> nên hiệu suất chiết tăng gần 10%. Do vậy, đề tài lựa chọn KTTP nguyên liệu từ 0,5 - 1 mm<br /> để khảo sát tiếp.<br /> * Ảnh hưởng của dung môi chiết:<br /> Tiến hành chiết xuất siêu âm lá ĐĐR trong cùng điều kiện: chiết 1 lần với tỷ lệ<br /> DM/DL là 10/1, nhiệt độ chiết 60ºC trong 120 phút, nhưng với các dung môi chiết là nước,<br /> ethanol có nồng độ khác nhau (30, 50, 70, 90%).<br /> Bảng 2: Ảnh hưởng của loại dung môi đến chiết xuất saponin từ lá ĐĐR (n = 3).<br /> Mẫu Dung môi chiết Saponin chiết được (mg/g) Hiệu suất chiết (%)<br /> <br /> DR3 H2O 9,72 ± 0,30 43,4 ± 1,32<br /> <br /> DR4 EtOH 30% 11,43 ± 0,46 51,03 ± 2,04<br /> <br /> DR5 EtOH 50% 13,89 ± 0,22 62,03 ± 0,98<br /> <br /> DR6 EtOH 70% 13,15 ± 0,58 58,75 ± 2,59<br /> <br /> DR7 EtOH 90% 12,26 ± 0,44 54,74 ± 1,97<br /> <br /> Khi chiết xuất một lần trong cùng điều kiện dung môi ethanol nồng độ khác nhau thì<br /> hàm lượng và hiệu suất chiết saponin đạt mức cao nhất khi dùng ethanol 50%. Vì vậy,<br /> ethanol 50% được lựa chọn để tiếp tục khảo sát.<br /> * Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/DL:<br /> Tiến hành chiết xuất siêu âm lá ĐĐR trong cùng điều kiện: dung môi là ethanol 50%,<br /> nhiệt độ chiết 60ºC trong 120 phút, nhưng với các tỷ lệ DM/DL khác nhau.<br /> Bảng 3: Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/DL đến chiết xuất saponin từ lá ĐĐR (n = 3).<br /> <br /> Tỷ lệ DM/DL x Thời gian Hàm lượng và hiệu suất chiết saponin<br /> Mẫu<br /> lần chiết chiết Saponin (mg/g) Hiệu suất chiết (%)<br /> <br /> DR5 10/1 x 1 lần 13,89 ± 0,22 62,03 ± 0,98<br /> <br /> DR8 20/1 x 1 lần 16,53 ± 0,30 73,81 ± 1,34<br /> 2 giờ/lần<br /> DR9 30/1 x 1 lần 18,17 ± 0,58 81,15 ± 2,60<br /> <br /> DR10 40/1 x 1 lần 20,51 ± 0,85 91,62 ± 3,81<br /> <br /> DR11 10/1 x 2 lần 1 giờ/lần x 17,46 ± 0,16 77,99 ± 0,71<br /> <br /> DR12 15/1 x 2 lần 2 lần 19,02 ± 0,88 84,95 ± 3,94<br /> <br /> Khi chiết 1 lần, hàm lượng và hiệu suất chiết saponin tăng lên đáng kể khi tăng tỷ lệ<br /> DM/DL. Ở tỷ lệ DM/DL là 10/1, chỉ cho hiệu suất 62,03 ± 0,98%, nhưng tăng lên 73,81 ±<br /> 1,34% ở tỷ lệ DM/DL là 20/1 và 81,15 ± 2,60% ở tỷ lệ DM/DL là 30/1. Đối với chiết xuất<br /> <br /> 20<br />  t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 9-2019<br /> <br /> hai lần (mẫu DR11 và DR12), khi tăng tỷ lệ DM/DL ở mỗi lần chiết cũng làm tăng hàm<br /> lượng và hiệu suất chiết saponin. So sánh giữa chiết xuất 1 lần và 2 lần (mẫu DR8 với<br /> DR11, mẫu DR9 với DR12), kết quả cho thấy: với cùng tỷ lệ DM/DL, nhưng nếu chia<br /> làm 2 lần chiết và mỗi lần trong 1 giờ, khi chiết 2 lần cho hàm lượng và hiệu suất cao<br /> hơn chiết 1 lần (tăng khoảng 4%). Để tăng hiệu suất chiết saponin từ lá ĐĐR, cần<br /> lượng tương đối dung môi và ở tỷ lệ DM/DL ≥ 30/1 mới cho hiệu suất chiết > 80%.<br /> Trong đó, chiết 2 lần cho hiệu suất chiết cao hơn nên điều kiện ở mẫu DR12 là phù<br /> hợp hơn, vì cho hiệu suất khá cao, còn khi tăng tỷ lệ DM/DL hoặc số lần chiết sẽ tốn<br /> dung môi, thời gian và chi phí.<br /> * Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết:<br /> Tiến hành chiết xuất siêu âm lá ĐĐR trong cùng điều kiện: dung môi ethanol 50%,<br /> chiết 2 lần, mỗi lần với tỷ lệ DM/DL 15/1, thời gian 60 phút/lần x 2 lần.<br /> Bảng 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chiết xuất saponin từ lá ĐĐR (n = 3).<br /> <br /> Mẫu Nhiệt độ chiết Saponin (mg/g) Hiệu suất chiết (%)<br /> <br /> DR13 50⁰C 17,70 ± 0,46 79,05 ± 2,07<br /> <br /> DR12 60⁰C 19,02 ± 0,88 84,95 ± 3,94<br /> <br /> DR14 70⁰C 19,94 ± 0,38 89,06 ± 1,68<br /> <br /> DR15 80⁰C 19,66 ± 0,47 87,79 ± 2,10<br /> <br /> Khi tăng dần nhiệt độ chiết làm tăng dần hàm lượng và hiệu suất chiết saponin và<br /> đạt mức cao nhất ở 70°C. Khi tiếp tục tăng nhiệt độ chiết lên > 70°C, không làm tăng<br /> hiệu suất chiết saponin. Như vậy, nhiệt độ thích hợp nhất để chiết saponin từ lá ĐĐR<br /> là 70ºC, vì khi tăng nhiệt độ không làm tăng hiệu suất chiết mà tốn thêm năng lượng.<br /> * Ảnh hưởng của thời gian chiết:<br /> Tiến hành chiết xuất siêu âm lá ĐĐR trong cùng điều kiện: dung môi ethanol 50%,<br /> chiết 2 lần, mỗi lần với tỷ lệ DM/DL 15/1, nhiệt độ chiết 70ºC, nhưng ở các thời gian chiết<br /> khác nhau.<br /> Bảng 5: Ảnh hưởng của thời gian đến chiết xuất saponin từ lá ĐĐR (n = 3).<br /> Mẫu Thời gian chiết Saponin (mg/g) Hiệu suất chiết (%)<br /> <br /> DR16 30 phút/lần x 2 lần 12,63 ± 0,58 56,39 ± 2,59<br /> DR17 45 phút/lần x 2 lần 14,37 ± 0,48 64,16 ± 2,13<br /> DR14 60 phút/lần x 2 lần 19,94 ± 0,38 89,06 ± 1,68<br /> DR18 75 phút/lần x 2 lần 20,55 ± 0,55 91,76 ± 2,44<br /> DR19 90 phút/lần x 2 lần 21,44 ± 0,63 95,74 ± 2,81<br /> DR20 120 phút/lần x 2 lần 21,58 ± 0,40 96,38 ± 1,80<br /> <br /> <br /> 21<br /> T¹P CHÝ Y - HäC QU¢N Sù Sè 9-2019<br /> <br /> Khi tăng dần thời gian chiết làm tăng số sau: thiết bị SM30-CEP, dung môi<br /> dần hàm lượng và hiệu suất chiết saponin ethanol 50%, chiết 2 lần, mỗi lần với tỷ lệ<br /> từ lá ĐĐR. Mức tăng cao nhất khi thời DM/DL là 15/1, nhiệt độ chiết 700C, thời<br /> gian chiết tăng trong khoảng 60 phút/lần gian chiết 90 phút/lần, KTTP dược liệu<br /> chiết, sau đó tăng nhẹ. Với điều kiện chiết 0,5 - 1 mm; hàm lượng saponin toàn phần<br /> như đã khảo sát, thời gian chiết mỗi lần chiết được là 21,44 mg/g, tương ứng với<br /> 90 phút/lần cho hàm lượng và hiệu suất hiệu suất chiết là 95,74%.<br /> chiết saponin cao nhất, khi kéo dài thời<br /> gian chiết cũng không làm tăng thêm. TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> Do đó, lựa chọn thời gian cho mỗi lần chiết<br /> là 90 phút. 1. Đỗ Tất Lợi. Những cây thuốc và vị thuốc<br /> Việt Nam. NXB Y học. 2000.<br /> KẾT LUẬN<br /> 2. De Tommasi N, Pizza C, Bellino A et al.<br /> Đã xây dựng được quy trình chiết xuất Triterpenoid saponins from Trevesia sundaica.<br /> saponin toàn phần từ lá ĐĐR bằng Journal of Natural Products. 1997, 60 (11),<br /> phương pháp chiết siêu âm với các thông pp.1070-1074.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 22<br />