Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2 - Nguyễn Thị Phương Thảo

Chia sẻ: Minh Vũ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:32

Thêm vào BST

Báo xấu

76
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng "Công nghệ sinh học đại cương - Chương 2: Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại" cung cấp cho người học các kiến thức: Khái niệm thư viện DNA, phân loại thư viện mẫu, kỹ thuật tạo thư viện cDNA. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2 - Nguyễn Thị Phương Thảo

Chương II. Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại dd  Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn  Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen  Phương pháp PCR  Các phương pháp lai phân tử (lai Southern, Northern, Western)  Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Kỹ thuật tạo thư viện DNA
Khái niệm thư viện DNA •Thư viện DNA, giống như thư viện truyền thống được sử dụng để thu thập và lưu trữ thông tin •Trong thư viện DNA thống tin được dự trữ là các phân tử DNA Th- viÖn DNA lµ tËp hîp ngÉu nhiªn c¸c ®o¹n ADN (cã tÝnh ®¹i diÖn ®Æc thï cho hÖ gen cña mét sinh vËt) ®-îc chÌn vµo c¸c vector nh©n dßng
Cã hai lo¹i th- viÖn mÉu chÝnh ®ã lµ: 1. Th- viÖn genom (Genomic library): chøa toµn bé c¸c ®o¹n DNA cã trong nh©n cña mét tæ chøc hay c¬ thÓ. Genomic library cã thÓ ®-îc nh©n dßng b»ng plasmid hoÆc genome cña thùc khuÈn thÓ. 2. Th- viÖn cDNA (cDNA library): chøa c¸c ®o¹n cDNA cã tÝnh ®¹i diÖn ®Æc thï cho toµn bé mARN cña mét m«. Th- viÖn cDNA ®-îc t¹o ra b»ng c¸ch tæng hîp nªn cDNA tõ mRNA.
C¸c b-íc trong t¹o th- viÖn mÉu ®· nh©n dßng 1. T¹o c¸c ®o¹n ADN ngÉu nhiªn tõ hÖ gen hay cDNA 2. ChÌn c¸c ®o¹n ADN vµo vect¬ nh©n dßng thÝch hîp. 3. Nh©n c¸c ®o¹n ADN t¹o ra trong hÖ thèng tÕ bµo chñ (chøa vect¬ nh©n dßng t-¬ng øng) 4. Chän läc c¸c dßng cã chøa vect¬ mang ®o¹n ADN môc tiªu.
Thiết kế thư viện mẫu cho đọc trình tự.
 Mçi mét ®o¹n ADN cµi trong mét vect¬ biÕn n¹p trong 1 tÕ bµo vi khuÈn  S¸ch (Book)  TËp hîp tÊt c¸c c¸c dßng vi khuÈn Th- viÖn
T¹o ®o¹n ADN cã kÝch th-íc phï hîp cho nh©n dßng KÝch th-íc cña ®o¹n ADN tïy thuéc vµo môc ®Ých sö dông th- viÖn §Ó lËp b¶n ®å, x¸c ®Þnh c¸c gen hay t¸ch dßng gen tõ hÖ gen cã kÝch th-íc líncÇn c¸c ®oạn ADN lín vµ sö dông c¸c vect¬ nh- phage, cosmid, BAC hay YAC §Ó x¸c ®Þnh tr×nh tù, lËp b¶n ®å chi tiÕt... cÇn c¸c ®o¹n ADN cã kÝch th-íc nhá, sö dông vect¬ nh©n dßng lµ plasmid C¸c ®o¹n ADN ph¶i cã tÝnh ngÉu nhiªn ®Ó ®¶m b¶o tÝnh ®¹i diÖn cho hÖ gen.
T¹o ®o¹n ADN cã kÝch th-íc phï hîp cho nh©n dßng  Lµm g·y nhiÔm s¾c thÓ  Cắt bằng RE  Ở genom người dùng RE cã vïng nhËn biÕt gåm 8 Nu (Not1, SfiI) sẽ tạo được đoạn cắt có chiều dài lớn  Thông thường dùng RE cã vïng nhËn biÕt gåm 4 Nu AluI, HaeIII  cắt kh«ng hoµn toµn (partial digest) bằng cách sử dụng phối hợp nhiều RE
Bảng. Khả năng chèn đoạn ADN ngo¹i lai của một số vectơ nhân dòng Khả năng chứa đoạn Stt Vectơ ADN(kb) Plasmit
Trong mét th- viÖn sẽ chứa bao nhiªu dßng ? Theo lý thuyÕt:  Sè dßng tèi thiÓu cÇn thiÕt ®Ó t¹o th- viÖn(n) = ®é lín cña hÖ gen (b) ®é lín TB cña ®o¹n ADN (a)
VÝ dô: thiÕt kÕ th- viÖn hÖ gen cña ng-êi, dïng c¸c vector kh¸c nhau: KÝch th-íc genome : 3 x 109 bp  Plasmid = Take inserts of 0.2 - 20 kb (kb = kilobase = 1000 bases)--- > Average insert size of 1000 bases = 3 x 106 clones required to cover one human genome (haploid human)  Lambda Phage = Inserts of 9-23 kb ---> Average insert of 17,000 bases = 1.8 x 105 clones required to cover one human genome  Cosmid = Take inserts of 35-50 kb ---> Average insert of 50,000 bases = 60,000 clones required to cover one human genome  BAC (bacterial artificial chromosome) =Take inserts of ~500 kb ---> Average insert of 500 kb= 6,000 clones required to cover one human genome  YAC (yeast artificial chromosomes) = Take inserts of 200 kb - 1 Mb (Mb = 1 x 106 bases) or greater --> Average insert of 1 Mb = 3,000 clones required to cover one human genome
Trªn thùc tÕ, sè dßng sÏ lín h¬n bëi qu¸ trình c¾t vµ ghÐp vµo vector lµ ngÉu nhiªn.  Mét sè dßng sÏ cã mÆt h¬n mét lÇn trong th- viÖn do hiÖn t-îng lÆp ®o¹n  Mét sè trình tù nµo ®ã sÏ bÞ mÊt nÕu chØ sö dông sè dßng tèi thiÓu.  Clarke and Carbon (1976) ®Ò nghÞ c«ng thøc tÝnh míi nh»m tÝnh x¸c suÊt ®Ó mét ®o¹n ADN ®-îc nh©n dßng trong mét th- viÖn mÉu. N= ln(1-P) ln(1-a/b)  Trong ®ã: P: x¸c xuÊt nh©n dßng mét ®o¹n DNA bÊt kú; a: kÝch th-íc ®o¹n DNA cÇn nh©n (bp), b : ®é lín hÖ gen (bp)
Câu hỏi  Cần bao nhiêu dòng để 99 % một đoạn trình tự có mặt trong thư viện gen của người sử dụng cosmid vector?
The Central Dogma exon DNA Double-stranded intron Precursor AAAAAAAAAAn RNA mRNA AAAAAAAAAAn Single-stranded Reverse transcription Protein AAAAAAAAAAn double-stranded cDNA
cDNA A cDNA or complementary DNA, is a DNA copy of an RNA, usually mRNA cDNA mRNA Double stranded Single stranded Stable unstable Easy to manipulate More difficult to manipulate Need to be transcribed into Can be directly used to make RNA to make a protein a protein
Kỹ thuật tạo thư viện cDNA Khái niệm:  Bộ gen của sinh vật eukaryote thường rất lớn, tuy nhiên số lượng gen mã hoá chỉ chiếm phần nhỏ trong tế bào  Trong các gen mã hoá protein, chỉ có một số gen nhất định hoạt động và biểu hiện ở các mô nhất định tuỳ thuộc vào các giai đoạn sinh trưởng phát triển của cơ thể  Chiết tách mRNA của tế bào, mô ở từng thời điểm nhất định sẽ thu được các loại mRNA khácnhau ứng với số gen đạng hoạt động trong tế bào. Sử dụng kỹ thuật phiên mã ngược từ mRNA tạo nên các c DNA tương ứng, mỗi cDNA được gắn vào vector nhân dòng, tạo nên các dòng cDNA khác nhau
 Tập hợp tất cả các mRNA thu được từ một loại tế bào, ở các giai đoạn phát triển khác nhau tạo nên tập hợp cDNA được tách dòng gọi là ngân hàng cDNA của tế bào  Tổng hợp các ngân hàng cDNA của từng loại tế bào và mô của một sơ quan ngân hàng cDNA của cơ quan đó