Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2 - Nguyễn Thị Phương Thảo (p3)

Chia sẻ: Minh Vũ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:40

Thêm vào BST

Báo xấu

78
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng "Công nghệ sinh học đại cương - Chương 2: Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại" cung cấp cho người học các kiến thức về: Kỹ thuật xác định trình tự DNA, kỹ thuật tạo thư viện hệ gen và cDNA. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2 - Nguyễn Thị Phương Thảo (p3)

 Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn  Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen  Phương pháp PCR  Các phương pháp lai phân tử (lai Southern, Northern, Western)  Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Kỹ thuật tạo thư viện hệ gen và cDNA
2 Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN
Khái niệm •Xác định trình tự ADN là việc xác định trình tự sắp xếp các nucleotides trong một đoạn DNA.
C¸c mèc gi¶i m· hÖ gen cña c¸c sinh vËt kh¸c nhau http://www.genomesonline.org
Các phương pháp xác định trình tự Maxam-Gilbert method (1977) Sanger method (1977) Automated sequencing Next generation sequencing
6 Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN
Nguyên tắc: Nếu chúng ta biết khoảng cách của mỗi loại base từ một nguồn gốc đã biêt, thì có thể suy ra trình tự của DNA Thí dụ nếu ta biết: A ở vị trí 2, 3, 11, 13 ... G ở vị trí 1, 12, ... C ở vị trí 6, 7, 8, 10, 15... T ở vị trí 4, 5, 9, 14.... Thì có thể suy ra trình tự đoạn DNA ban đầu là: GAATTCCCTCAGTC Để có đuợc các thông tin này, có thể tạo ra một vị trí kết thúc của một đoạn DNA đang kéo dài tại một base đã biêt (A, T, C hoặc G) và ở một vị trí đã biết trên DNA 7 Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN
Maxam-Gilbert Method • Là phương pháp phân giải hóa học •Sử dụng hóa chất để phân hủy ADN ở các vị trí base đặc hiệu tạo ra các đoạn có chiều dài khác nhau
Các loại hóa chất sử dụng  Dimethyl sulfat methyl hóa G.  Axit formic pH=2 gây biến đổi và loại A + G.  Hydrazin gây biến đổi tại C và T.  Hydrazin + NaCl nồng độ cao gây biến đổi tại C.  Piperidine được dùng để loại bỏ các base sau khi bị biến đổi và cắt mạch.
Chemical used for Chemical used Base Chemical used for altered base for strand specificity base alteration removal cleavage G Dimethylsulphate Piperidine Piperidine A+G Acid Acid Piperidine C+T Hydrazine Piperidine Piperidine C Hydrazine + alkali Piperidine Piperidine A>C Alkali Piperidine Piperidine
J2 nucleic acid sequencing Maxam and Gilbert chemical method DNA labeled at one end with 32P G C T G C T A Base modification G C T G C T A CH3 Release or displace- ment of reacted bases G C T C T A Strand scission G C T C T A
Các bước tiến hành  Chuỗi ADN kép được đánh dấu phóng xạ với phosphorus (32P) ở đầu 5'. Sử dụng Polynucleotide kinase enzyme và 32P- dATP.  Dùng dimethyl sulphoxide và đun nóng đến 90oC, 2 mạch của ADN tách nhau ra và được tinh chế lại (e.g. dùng điện di trên gel và dựa trên nguyên tắc 1 mạch của ADN chắc chắn sẽ nặng hơn mạch kia bởi có chứa nhiều purine nucleotides (A and G) hơn than pyrimidines (C and T) vốn nhẹ hơn).
 Các sợi đơn được chia thành các mẫu riêng rẽ và được sử lý với các hóa chất đặc hiệu, chỉ gây biến đổi 1 trong 4 base,Xö lý tiÕp c¸c mÉu nµy víi piperidin ®Ó bÎ gÉy ADN t¹i vÞ trÝ baz¬ nit¬ ®· bÞ thay đổi t¹o ra c¸c ®o¹n oligonucleotid cã chiÒu dµi h¬n kÐm nhau mét nucleotid  ĐiÖn di riªng rÏ 4 mÉu trªn cïng 1 gel ®iÖn di, lµm phim phãng x¹ tù ghi và ®äc vÞ trÝ cña c¸c nucleotit lÇn l-ît trªn 4 mÉu tõ cùc d-¬ng cña gel lªn cùc ©m theo nguyªn t¾c: ®o¹n ADN cµng ng¾n cµng dÞch chuyÓn xa so víi ®iÓm xuÊt ph¸t ban ®Çu trªn b¶n ®iÖn di ®å.
§¸nh dÊu phóng x¹ Sîi kÐp ADN Sîi ®¬n ADN T¹o tËp hîp chØ 1 sîi ®¬n cÇn ®oc tr×nh tù, chia vµo 4 èng Ph¸ huû ®Æc hiÖu chØ 1 lo¹i baz¬ t¹o nªn c¸c ®o¹n bÞ g·y ë n¬i ph¸ huû T¸ch c¸c ®o¹n b»ng ®iÖn di ®ång thêi s¶n phÈm ë 4 èng ph¶n øng. HIÖn h×nh qua phim X-ray Dµi h¬n Tr×nh tù Ng¾n h¬n C¸c b¨ng xuÊt hiÖn trªn phim t-¬ng øng víi c¸c ®o¹n bÞ gÉy ë c¸c baz¬ bÞ ph¸ huû Tr×nh tù cña sîi ®-îc gi¶i m· Tr×nh tù cña sîi bæ sung
 Đoạn mạch đơn ADN đánh dấu đầu 5‘ ở nucleotid A có trình tự: 5’-P32 ATAGTCGCAGT3‘
Hạn chế của phương pháp Maxam- Gilbert  C¸c chÊt ho¸ häc dïng ®Ó c¾t m¹ch ®¬n kh«ng hoµn toµn ®Æc tr-ng cho tõng phản øng riªng biÖt, phản øng phô sÏ diÔn ra ảnh h-ëng ®Õn kÕt quả cña sản phÈm c¾t.  đ©y lµ ph-¬ng ph¸p x¸c ®Þnh trình tù trùc tiÕp cña ADN, do ®ã sè l-îng ADN mÉu cÇn dïng lµ rÊt lín, nÕu l-îng mÉu ban ®Çu Ýt thì c¸c băng ®iÖn di kÕt quả b»ng phãng x¹ tù ghi bÞ mê, kh«ng râ rµng, khã ®äc chÝnh x¸c.  Phản øng ®ßi hái ADN mÉu hoµn toµn lµ m¹ch ®¬n, do vËy phải ph©n t¸ch ADN thµnh c¸c sîi ®¬n tr-íc khi tiÕn hµnh x¸c ®Þnh trình tù.  ChØ ¸p dông x¸c ®Þnh trình tù ®o¹n gen t-¬ng ®èi ng¾n, khoảng 250 bp
Phương pháp Sanger (chain termination or dideoxy method) •Phương pháp enzyme •Nguyên tắc hoạt động: trình tự của một sợi DNA đơn được xác định dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp sợi DNA bổ xung. Các sợi DNA được tổng hợp mới này được kết thúc tại các vị trí đặc hiệu. •DNA polymerase xúc tác gắn các Nu vào mạch đơn đang tổng hợp ở vị trí 3'OH, khi gặp nucleotid không có nhóm 3'OH, phản ứng tổng hợp bị dừng lại • Nhân tố kết thúc đặc hiệu được sử dụng là các dideoxynucleotide (phương pháp dideoxynucleotid)
 Các bản sao của DNA khuôn ở dạng sợi đơn  Một mồi thích hợp (bắt cặp với DNA khuôn)  DNA polymerase  4 loại nucleotides  Một lượng nhỏ dideoxynucleotides được đánh dấu (Phóng xạ hoặc chất nhuộm huỳnh quang)
 Chuẩn bị DNA khuôn ở dạng sợi đơn  Clone DNA trong plasmid vector.  Clone DNA trong bacteriophage M13 vector.  Clone DNA trong phagemid.  PCR có thể dùng để nhân sợi DNA đơn.  (thu hồi sợi đơn bằng biến tính nhiệt, hoặc xử lý với alkali)