Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2 - ThS. Ninh Thị Thảo (Bài 5)

Chia sẻ: Minh Vũ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:39

Thêm vào BST

Báo xấu

100
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng "Công nghệ sinh học đại cương - Chương 2: Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại (Bài 5)" cung cấp cho người đọc các kỹ thuật xác định trình tự DNA bao gồm: Khái niệm, các mốc giải mã hệ gen của các sinh vật khác nhau, phương pháp xác định trình tự,... Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2 - ThS. Ninh Thị Thảo (Bài 5)

CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT) 1. Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn 2. Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen 3. Các phương pháp lai phân tử 4. Phương pháp PCR, ứng dụng 5. Kỹ thuật xác định trình tự DNA 6. Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA BM CNSH TV BM-CNSHTV – Khoa CNSH
KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA BM-CNSHTV
Khái niệm Xác định trình tự DNA là phương pháp xác định trật tự sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA. BM-CNSHTV
Các mốc giải mã hệ gen của các sinh vật khác nhau Cho đến nay, hệ gen của hơn 100 tổ chức sinh vật đã được giải mã trình tự BM-CNSHTV
Các phương pháp xác định trình tự Maxam-Gilbert (1977) Sanger (1977) Xác định trình tự tự động  Xác định trình tự thế hệ mới BM-CNSHTV
Phương pháp Maxam-Gilbert • Là phương pháp phân giải hóa học • Sử dụng hóa chất để biến đổi DNA ở các vị trí base đặc hiệu tạo ra các đoạn có chiều dài khác nhau Walter Gilbert BM-CNSHTV
Các loại hóa chất sử dụng  Dimethyl sulfat methyl hóa G.  Axit formic pH=2 gây biến đổi và loại A + G.  Hydrazin gây biến đổi tại C và T.  Hydrazin + NaCl nồng độ cao gây biến đổi tại C.  Piperidine được dùng để loại bỏ các base sau khi bị biến đổi và cắt mạch. BM-CNSHTV
Chemical used for Chemical used Base Chemical used for altered base for strand specificity base alteration removal cleavage G Dimethylsulphate Piperidine Piperidine A+G Acid Acid Piperidine C+T Hydrazine Piperidine Piperidine C Hydrazine + alkali Piperidine Piperidine A>C Alkali Piperidine Piperidine BM-CNSHTV
J2 nucleic acid sequencing Maxam and Gilbert chemical method DNA labeled at one end with 32P G C T G C T A Base modification G C T G C T A CH3 Release or displace- ment of reacted bases G C T C T A Strand scission G C T C T A BM-CNSHTV
BM-CNSHTV
BM-CNSHTV
Hạn chế của phương pháp Maxam- Gilbert • Các chất hoá học dùng để cắt mạch đơn không hoàn toàn đặc trưng cho từng phản ứng riêng biệt, phản ứng phụ sẽ diễn ra ảnh hưởng đến kết quả của sản phẩm cắt. • Đây là phương pháp xác định trình tự trực tiếp của DNA, do đó số lượng DNA mẫu cần dùng là rất lớn, nếu lượng mẫu ban đầu ít thì các băng điện di kết quả bằng phóng xạ tự ghi bị mờ, không rõ ràng, khó đọc chính xác. • Phản ứng đòi hỏi DNA mẫu hoàn toàn là mạch đơn, do vậy phải phân tách DNA thành các sợi đơn trước khi tiến hành xác định trỡnh tự. • Chỉ áp dụng xác định trình tự đoạn gen tương đối ngắn, khoảng 250 bp BM-CNSHTV
Phương pháp Sanger • Còn gọi là phương pháp kết thúc mạch (chain termination method) hay phuong pháp dideoxyribonucleotide (dideoxyribonucleotide method) BM-CNSHTV
Phương pháp Sanger (chain termination or dideoxy method) •Phương pháp enzyme •Nguyên tắc hoạt động: trình tự của một sợi DNA đơn được xác định dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp sợi DNA bổ sung. Các sợi DNA được tổng hợp mới này được kết thúc tại các vị trí đặc hiệu. •DNA polymerase xúc tác gắn các Nu vào mạch đơn đang tổng hợp ở vị trí 3'OH, khi gặp nucleotid không có nhóm 3'OH, phản ứng tổng hợp bị dừng lại • Nhân tố kết thúc đặc hiệu được sử dụng là các dideoxynucleotide (phương pháp dideoxynucleotid) BM-CNSHTV
Cho phép kéo dài mạch ở đầu 3’ Ngăn cản sự kéo dài mạch ở đầu 3’ BM-CNSHTV
Sự kéo dài mạch DNA BM-CNSHTV
Sự kéo dài mạch DNA BM-CNSHTV khi xuất hiện ddNTP
Các bước thực hiện 1. Chuẩn bị DNA khuôn sợi đơn 2. Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng 3. Thực hiện phản ứng 4. Điện di kết quả  Thu nhận kết quả giải trình tự DNA BM-CNSHTV
Thành phần phản ứng Có 4 ống hỗn hợp phản ứng, mỗi ống chứa các thành phần như sau: − DNA khuôn mạch đơn − Mồi được tổng hợp hóa học (có thể đánh dấu phóng xạ) − dNTPs − ddNTP (mỗi ống phản ứng bổ sung 1 trong 4 loại ddNTP là ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP) − DNA polymerase − Dung dịch đệm thích hợp BM-CNSHTV
DNA khuôn mạch đơn chưa biết DNA khuôn và mồi trình tự Mồi Chia thành 4 ống phản ứng Bổ sung DNA Các đoạn kết thúc Các đoạn kết thúc Các đoạn kết thúc polymerase bằng ddG bằng ddC bằng ddT Phân tách mạch mới được tổng hợp ra khỏi mạch khuôn Lớn nhất Nhỏ nhất BM-CNSHTV