Đánh giá chất lượng khối tiểu cầu trong quá trình bảo quản và mối liên quan giữa cường độ huỳnh quang với đời sống của tiểu cầu được sản xuất bằng phương pháp buffy coat

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:4

Thêm vào BST

Báo xấu

2
lượt xem 0
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu đánh giá chất lượng khối tiểu cầu được sản xuất bằng phương pháp buffy coat. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tiểu cầu sau sản xuất và ty thể của 35 mẫu tiểu cầu sản xuất từ lớp buffy coat. Khối tiểu cầu được làm các xét nghiệm về số lượng tiểu cầu, chỉ số pH, Glucose, LDH; ty thể của tiểu cầu được nhuộm và đo cường độ huỳnh quang trong 7 ngày trong điều kiện bảo quản theo quy định.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đánh giá chất lượng khối tiểu cầu trong quá trình bảo quản và mối liên quan giữa cường độ huỳnh quang với đời sống của tiểu cầu được sản xuất bằng phương pháp buffy coat

TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 496 - THÁNG 11 - SỐ 2 - 2020 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG KHỐI TIỂU CẦU TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN VÀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA CƯỜNG ĐỘ HUỲNH QUANG VỚI ĐỜI SỐNG CỦA TIỂU CẦU ĐƯỢC SẢN XUẤT BẰNG PHƯƠNG PHÁP BUFFY COAT Nguyễn Thị Lan*, Lưu Thị Thu Phương*,Trần Văn Tính**, Nguyễn Đắc Thảo**, Trần Thị Thanh Tâm* TÓM TẮT thành các cục máu đông làm ngưng quá trình chảy máu. Các chế phẩm tiểu cầu cung cấp cho 40 Mục tiêu: Nghiên cứu đánh giá chất lượng khối tiểu cầu được sản xuất bằng phương pháp buffy coat. điều trị có nhiều loại: Huyết tương giàu tiểu cầu, Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tiểu cầu khối tiểu cầu pool, tiểu cầu máy... Chất lượng sau sản xuất và ty thể của 35 mẫu tiểu cầu sản xuất khối tiểu cầu phụ thuộc vào nhiều yếu tố ở các từ lớp buffy coat. Khối tiểu cầu được làm các xét nghiệm về số lượng tiểu cầu, chỉ số pH, Glucose, LDH; giai đoạn: thu thập, sản xuất, bảo quản và cấp ty thể của tiểu cầu được nhuộm và đo cường độ phát. Các kỹ thuật xét nghiệm đánh giá chất huỳnh quang trong 7 ngày trong điều kiện bảo quản lượng khối tiểu cầu ngày càng được chú trọng và theo quy định. Kết quả và bàn luận: Trong thời phong phú. Do đời sống tiểu cầu ngắn khoảng gian bảo quản tiểu cầu, khối tiểu cầu sản xuất từ lớp 5-7 ngày nên xét nghiệm đánh giá chức năng buffy coat giảm dầnvề chất lượng được chứng minh tiểu cầu trước khi truyền là rất quan trọng. bằng kết quả các xét nghiệm huyết học, sinh hóa và nhuộm huỳnh quang. Tuy vậy đến ngày thứ 7 các chỉ Ngoài các xét nghiệm thường quy thì nhuộmty số vẫn đạt chất lượng theo thông tư 26/2013/TT-BYT. thể (nơi tổng hợp và sinh năng lượng) có thể Từ khóa: Tiểu cầu, ti thể, buffy coat, truyền máu, giúp đánh giá mức độ tiểu cầu còn hiệu lựchay xét nghiệm không. Hiện nay,các phẩm màu huỳnh quang nhuộm đặc hiệu ty thể sống[2,4,6-8], kết hợp SUMMARY với kính hiển vi laser tia quét đồng tiêu ASSESSMENT THE QUALITY OF PLATELETS (confocal) cho phép xác định được số lượng ty DURING STORAGE PERIOD AND THE thể có trong các tiểu cầu còn sống. Ưu điểm của COLLERATION BETWEEN THE FLUORESCENCE phương pháp này là thao tác đơn giản, hóa chất INTESITY AND THE LIFETIME OF PLATELETS có độ đặc hiệu cao giúp xác định chính xác các PRODUCED BY BUFFY COAT METHOD tiểu cầu có ty thể còn hoạt động. Việc ứng dụng Objectives: To evaluate the quality of platelets xác định tính hoạt động của tiểu cầu bằng kỹ produced by buffy coat method. Objects and research methods: Platelets after production and thuật nhuộm huỳnh quangty thể và chụp ảnh mitochondria of 35 platelet samples produced from huỳnh quang trên kính hiển vi confocal ngay buffy coat layer. Platelets are tested for platelet count, trong hỗn dịch tiểu cầu còn sống sẽ là một bước pH, Glucose and LDH; Mitochondria of platelets are tiến lớn trong xét nghiệm chức năng tiểu cầu. stained and fluorescence intensity measured for 7 Mục tiêu của nghiên cứu là đánh giá chất days under specified storage conditions. Results and lượng khối tiểu cầu điều chế từ lớp Buffy coat discussion: During storage, platelets produced from buffy coat layer decrease in quality which is evidenced của máu toàn phần bằng các xét nghiệm huyết by the results of hematological, biochemical and học, sinh hóa, vi sinh và nhuộm huỳnh quang fluorescent staining tests. However, by the 7th day, đặc hiệu ty thể tiểu cầu sống. the indexes still achieved quality according to Circular 26/2013 / TT-BYT. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Keywords: Platelets, mitochondria, buffy coat, 1.Đối tượng nghiên cứu: Ty thể của 35 blood transfusion, test mẫu tiểu cầu sản xuất từ lớp buffy coat; I. ĐẶT VẤN ĐỀ 2. Phương pháp nghiên cứu: - Thiết kế nghiên cứu: mô tả cắt ngang Trong cơ thể tiểu cầu có chức năng cầm máu Kỹ thuật nghiên cứu: bằng cách tập trung tại chỗ tổn thương hình − Kỹ thuật sản xuất khối tiểu cầu từ lớp buffy coat theo thông tư 26 [1] *Trường Đại học khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN. − 35 khối tiểu cầu được đưa vào bảo quản ở **Bệnh viện 19-8, Bộ Công an. nhiệt độ 22oC và trong máy lắc bảo quản tiểu Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Thị Lan cầu. Vào các thời điểm ngày 0, 1, 3, 5, 7 khối Email: lannhm1@gmail.com Ngày nhận bài: 28.9.2020 tiểu cầu được lấy ra 3 ml trong điều kiện vô Ngày phản biện khoa học: 29.10.2020 trùng để phân tích các chỉ số huyết học, hóa Ngày duyệt bài: 9.11.2020 sinh, vi sinh và nhuộm ty thể theo các kỹ thuật 153
vietnam medical journal n02 - NOVEMBER - 2020 cụ thể như sau: Thể tích trung bình 35 khối tiểu cầu sản xuất + Kỹ thuật tổng phân tích máu bằng máy theo phương pháp Buffy coat: 43,83 ± 2,82 ml. phân tích tế bào tự động DxH Beckman Counter 2. Đặc điểm chỉ số huyết học, vi sinh và của Mỹ; hóa sinh của 35 khối tiểu cầu trong quá + Kỹ thuật đo pH bằng máy đo khí máu trình bảo quản Hanna của Ý; Bảng 2. Kết quả phân tích tế bào huyết + Cấy vi sinh bằng môi trường nuôi cấy và học của các đơn vị tiểu cầu máy đồng bộ của hãng Bactec 9120 của Mỹ; Chỉ số Tiểu cầu Hồng cầu Bạch cầu + Kỹ thuật định lượng Glucose, LDHbằng máy Ngày (109/L) (1012/L) (109/L) xét nghiệm sinh hóa tự động AU 5800 của Đức; 1137,37 ± 0,52 ± 0 0,15 ± 0,04 + Kỹ thuật nhuộm huỳnh quang ty thể bằng 238,47 0,46 kít nhuộm của hãng Thermo scientific và chụp 1081,29 ± 0,51 ± 1 0,14 ± 0,04 ảnh huỳnh quang kèm phân tích ảnh trên kính 253,68 0,45 hiển vi confocal của hãng Nikon. Trên mỗi mẫu 1019,91 ± 3 0,13 ± 0,05 0,42 ± 0,4 khối tiểu cầu và mỗi ngày thí nghiệm đều tiến 253,77 hành nhuộm huỳnh quang ti thể. Sau đó chụp 958,77 ± 5 0,08 ± 0,12 0,28 ± 0,3 ảnh nhiều vi trường để đạt được số tiểu cầu là 254,02 100. Mỗi vi trường đều chụp hai chế độ nền 810,77 ± 0,12 ± 7 0,01 ± 0,01 sáng và huỳnh quang. Phần mềm sẽ tự động 240,61 0,16 phân tích tỷ lệ và cường độ huỳnh quang của Nhận xét: Có hiện tượng giảm dần số lượng tiểu cầu. các tế bào sau thời gian bảo quản. Chuẩn bị dụng cụ, máy móc và hóa chất: Bảng 3. Kết quả cấy vi sinh và đo pH − Các máy phân tích: máy phân tích tế bào tự theo ngày bảo quản (n=35) động DxH Beckman Counter của Mỹ Chỉ số Mức độ Cấy vi pH ( ± − Kính hiển vi Confocal của hãng Nikon, máy giảm sinh SD) xét nghiệm sinh hóa tự động AU 5800 của Đức, Ngày pH máy đo khí máu Hanna của Ý, máy xét nghiệm 0 Âm tính 7,37 ± 0,13 sinh hóa tự động AU 5800 của Mỹ. Cân phân tích 1 Âm tính 7,31 ± 0,12 0,06 của Việt Nam. Máy ly tâm lạnh Kobuta 9942 của 3 Âm tính 7,20 ± 0,15 0,17 Nhật, máy bảo quản tiểu cầu Helmer của Mỹ, 5 Âm tính 6,92 ± 0,23 0,45 máy cấy máu Bactec 9120 của Mỹ, máy lắc túi 7 Âm tính 6,61 ± 0,31 0,76 máu Terumo của Nhật. Nhận xét: pH giảm dần và giảm mạnh nhất − Các bộ kit xét nghiệm LDH 6128 (hãng ở ngày thứ 7. Bảng 4. Kết quả đohoạt độ LDH theo Olympus), pH (Ý), Glucose 6221 (hãng ngày bảo quản (n=35) Olympus), nhuộm huỳnh quang ty thể của hãng Chỉ số Hoạt độ LDH Mức độ Thermo Fisher scientific – Mỹ. Ngày (U/L) tăng LDH − Các dụng cụ: Pipet, đầu côn, ống nghiệm 0 155,92 ± 37,94 tráng silicon của hãng BD, Corning, Thermo. 1 206,13 ± 39,17 50,21143 Địa điểm nghiên cứu: Bệnh viện Nhi Trung 3 259,77 ± 69,2 103,8486 Ương, bệnh viện 19-8; 5 353,77 ± 96,1 197,8514 Xử lý số liệu: Kết quả được xử lý bằng Excel 7 481,82 ± 161,5 325,9029 2010. Nhận xét: Hoạt độ LDH của khối tiểu cầu III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU tăng hơn 3 lần sau 7 ngày bảo quản. 1. Đặc điểm chỉ số huyết học của người Bảng 5. Kết quả đo nồng độ hiến tiểu cầu và thể tích khối tiểu cầu Glucosetheo ngày bảo quản (n=35) Bảng 1. Kết quả phân tích tế bào huyết Chỉ số Nồng độ Mức độ giảm học của người hiến tiểu cầu Glucose Glucose Tên chỉ số Kết quả Đơn vị Ngày (mmol/l) (mmol/l) Tiểu cầu 234,65 ± 51,12 109/L 0 22,35 ± 2,73 Hồng cầu 4,89 ± 0,54 1012/L 1 21,75 ± 2,78 0,60 Bạch cầu 5,73 ± 0,93 109/L 3 20,21 ± 2,45 2,14 Nhận xét: Các chỉ số tế bào máu đều nằm 5 17,62 ± 2,27 4,73 trong ngưỡng cho phép hiến tiểu cầu. 7 13,78 ± 1,96 8,57 154
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 496 - THÁNG 11 - SỐ 2 - 2020 Nhận xét: nồng độ glucose có xu hướng Bảng 3 cho thấy pH của khối tiểu cầu sau 7 giảm theo cấp số nhân kể từ ngày thứ 3 trong ngày bảo quản vẫn đạt yêu cầu của Bộ Y tế về quá trình bảo quản. chất lượng khối tiểu cầu đơn (6,4-7,4) [1]. Sau 1 3. Kết quả nhuộm huỳnh quang ty thể của ngày bảo quản, khối tiểu cầu thu được có pH 35 khối tiểu cầutrong quá trình bảo quản gần như không đổi so với ngày 0 (p>0,05), chỉ Bảng 6. Kết quả nhuộm huỳnh quang ty từ các ngày thứ 3 trở đi, pH mới ghi nhận sự suy thể theo ngày bảo quản giảm mạnh, lần lượt đạt 7,2; 6,9 và cuối cùng là Chỉ số Cường độ 6,6 ở ngày thứ 7 (hình 1). Kết quả thu được cho Tỷ lệ tiểu cầu huỳnh quang thấy pH giảm nhiều hơn so với công bố của huỳnh quang Ngày trung bình Sherrill và cs (2010), khi bảo quản khối tiểu cầu 0 98,6% ± 1,15% 55,88 ± 3,06 trong huyết tương, trong khoảng thời gian từ 1 98,8% ± 1,2% 55,17 ± 3,09 ngày thứ 5 tới ngày thứ 8 sau khi sản xuất, pH 3 93,7% ± 1,6% 48,61 ± 3,55 của khối tiểu cầu chỉ giảm từ 7,54 xuống 7,51. 5 88,3% ± 3,8% 36,55 ± 3,32 - Chỉ số LDH: LDH là enzym chỉ ra có tổn 7 82,9% ± 3,2% 24,98 ± 1,21 thương tế bào. Kết quả cho thấy, lượng LDH Nhận xét: Từ ngày 1 đến ngày 7, tỷ lệ số tăng theo cấp số nhân trong thời gian bảo quản lượng tiểu cầu phát huỳnh quang giảm dần và ở tất cả các mẫu khối tiểu cầu (bảng 4). Các cường độ tín hiệu huỳnh quang trung bình giảm khối tiểu cầu sản xuất có tốc độ tăng LDH cao dần. hơn, trung bình tăng 29,86%/ngày. Ngày từ IV. BÀN LUẬN ngày 1, lượng LDH của các khối tiểu cầu sản 1. Về đặc điểm chỉ số huyết học của người xuất bằng phương pháp Bufy coat đã tăng lên hiến và thể tích khối tiểu cầu sản xuất theo 132,20% so với ngày 1 và sau đó duy trì tốc độ phương pháp Buffy coat trong quá trình bảo tăng đều đặn ở các ngày 3, 5, và 7. Đến ngày quản. Các chỉ số hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu thứ 7, lượng LDH đã tăng lên hơn 3 lần so với (bảng 1) của người hiến đều nằm trong giới hạn ban đầu (xem hình 2). sinh lý. Tại thời điểm kết thúc sản xuất: Thể tích khối tiểu cầu là: 43,83 ± 2,82 ml và các chỉ số tiểu cầu, bạch cầu và hồng cầu (bảng 2) đều đáp đúng yêu cầu của thông tư 26/2013/TT-BYT [1]. Sau thời gian bảo quản các chỉ số này có xu hướng giảm, số liệu tiểu cầu giảm từ 4-5% sau mỗi ngày bảo quản và lên đến 28,71% so với ngày đầu sản xuất. Số liệu thu được thấp hơn so với công bố của Angela và cs (2007) tương ứng là 9,26%[3]. Việc giảm các chỉ số tế bào máu cũng là nguyên nhân gây giải phóng các enzym, các chất có trong Hình 2: Sự thay đổi LDH trong thời gian tế bào làm axit hóa khối tiểu cầu và dễ gây kích bảo quản ứng khi truyền. Như đã nói ở trên, sự tăng hoạt độ LDH trong 2. Chỉ số vi sinh và sinh hóa quá trình bảo quản cũng đồng nghĩa với việc, số - Vi sinh: Cấy tất cả các ngày từ 0 đến 7 đều lượng tế bào chết trong khối tiểu cầu tăng lên, làm âm tính với các loại vi khuẩn đạt tiêu chuẩn của LDH nội bào bị giải phóng ra huyết tương và làm thông tư 26/2013/TT-BYT. tăng LDH trong phương pháp đo. Kết quả này có - Chỉ số pH sự tương đồng với sự giảm số lượng tiểu cầu, bạch cầu và hồng cầu (ở bảng 2). Angela và cs (2007) cũng ghi nhận, chỉ sau 5 ngày, hoạt độ LDH của khối tiểu cầu sản xuất theo phương pháp buffy coat đã tăng lên gần gấp đôi (183,67%), và ở ngày thứ 7 gấp 7,35 lần so với ngày 0. Các tác giả cũng cho rằng tiểu cầu vẫn có tỷ lệ sống và có thể hoạt động đầy đủ chức năng trong 5 ngày đầu tiên, nhưng từ ngày thứ 6, các tế bào bị suy giảm tỷ lệ sống cũng như hoạt động chức năng, kể cả là với các Hình 1: Sự thay đổi pH trong thời gian bảo quản nhóm tiểu cầu đã được bổ sung glucose trong 155
vietnam medical journal n02 - NOVEMBER - 2020 quá trình bảo quản [3]. huỳnh quang giảm rõ rệt theo thời gian bảo - Chỉ số Glucose. Bảng 5 cho thấy lượng quản. Kết quả này có thể chỉ ra số lượng ty thể glucose trong các khối tiểu cầu thu được từ có còn hoạt động chức năng của tiểu cầu đã suy xu hướng giảm trong quá trình bảo quản; từ giảm theo thời gian bảo quản. Điều này có ý ngày thứ 3 đến thứ 7 tốc độ giảm theo cấp số nghĩa rất lớn vì thông qua phân tích cường độ nhân (trung bình 5,5% một ngày). Trong nghiên tín hiệu huỳnh quang của từng tiểu cầu và tính cứu của Sherrill và cs (2014) trên đối tượng khối giá trị cường độ ánh sáng huỳnh quang trung tiểu cầu pool từ lớp buffy coat của máu toàn bình của một quần thể tiểu cầu có thể đánh giá phần, hàm lượng glucose trong khối tiểu cầu trực tiếp tiểu cầu còn chức năng hay đang có cũng giảm dần trong 7 ngày với tốc độ mất dần chức năng. 1,32%/ngày. Glucose là một chất dinh dưỡng thiết yếu cung cấp năng lượng để tiểu cầu có thể tồn tại với đầy đủ chức năng nên Sherrill J. Slichter và cs đã đề xuất nên bổ sung glucose 0,5% (w/v) vào khối tiểu cầu vào ngày 0 và ngày 1, 5 để nâng cao thời gian sống của tế bào. 3. Đánh giá tỷ lệ sống và chức năng của tiểu cầu bằng phương pháp nhuộm ti thể Ty thể là một bộ máy sinh năng lượng cho tiểu cầu, nếu bộ máy này bị tổn thương hoặc giảm khả năng tổng hợp năng lượng (ATP) thì cũng sẽ làm chức năng của tiểu cầu giảm. Vì vậy Hình 4: Sự thay đổi cường độ huỳnh quang nhuộm huỳnh quang đặc hiệu tiểu cầu sống là theo thời gian bảo quản một kỹ thuật có giá trị. Khi kết hợp với kính hiển Như vậy, kết quả xét nghiệm nhuộm huỳnh vi Confocal cho phép chụp hình 3D, định lượng quang đặc hiệu ty thể tiểu cầu sống kết hợp với được cường độ ánh sáng huỳnh quang thông chụp ảnh kính hiển vi confocal là một xét qua phần mềm phân tích ảnh nhờ đó có thể nghiệm hữu ích dùng để đánh giá chức năng đánh giá được tình trạng sống của tiểu cầu. Khi tiểu cầu sống. nhuộm huỳnh quang đặc hiệu ty thể của các tiểu V. KẾT LUẬN cầu sống mà không có tín hiệu huỳnh quang thì 1. Khối tiểu cầu đơn điều chế từ lớp buffy chứng tỏ tiểu cầu đã chết do thuốc nhuộm coat của máu toàn phần tại Viện Nhi đạt tiêu huỳnh quang không đi qua được màng tiểu cầu. Bảng 6 cho thấy số tiểu cầu không lên tín hiệu chuẩn chất lượng theo thông tư 26/2013/TT- huỳnh quang tại các vị trí ty thể tăng lên rõ rệt. BYT. Trong quá trình bảo quản chất lượng của Trung bình mỗi ngày có khoảng 5,2% tiểu cầu khối tiểu cầu giảm thông qua các chỉ số số lượng chết và không cho tín hiệu huỳnh quang (xem tiểu cầu, bạch cầu, hồng cầu, glucose và pH hình 3). Sự suy giảm tỷ lệ sống của tiểu cầu này giảm; hoạt độ LDH lại tăng lên gấp hơn 3 lần so góp phần giải thích vì sao lượng LDH trong huyết với ngày 0, cấy khuẩn âm tính 100%. tương lại tăng cao theo thời gian bảo quản. 2. Tỉ lệ tiểu cầu phát ánh sáng huỳnh quang giảm khoảng 5,2% trong 1 ngày trên tổng số tiểu cầu. Cường độ ánh sáng huỳnh quang trung bình giảm trên 50% sau 7 ngày bảo quản. Kỹ thuật nhuộm huỳnh quang đặc hiệu ty thể tiểu cầu sống có thể là một xét nghiệm dùng để đánh giá chất lượng tiểu cầu có hiệu lực. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. B.Y.tế, Thông tư: Hướng dẫn hoạt động truyền máu, B.Y. tế, Editor. 2013, Bộ Y tế: Hà Nội. 2. Adel Zeidan, D.Y., Reflectance confocal microscopy of red blood cells: simulation and Hình 3: Sự thay đổi tỷ lệ sống của tiểu cầu experiment. Biomed Optics Express, 2015. 6(11): theo thời gian p. 4335-4343. Khi tiến hành phân tích sự thay đổi cường độ 3. Angela Maria Amorini, M.T., Giuseppe Lazzarino, Gabriella Denti, Evaluation of ánh sáng huỳnh quang trung bình tại vị trí ty thể biochemical parameters in platelet concentrates theo thời gian bảo quản đã cho thấy tín hiệu 156