BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
VŨ HOÀNG HIỆP
NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ SINH
TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN, SAI KHÁC DI TRUYỀN CỦA CÁC
DÒNG ĐỘT BIẾN GIỐNG HOA CẨM CHƯỚNG QUẬN CHÚA (DIANTHUS CARYOPHYLLUS L.)
CHUYÊN NGÀNH : KHOA HỌC CÂY TRỒNG
: 62.62.01.10
MÃ SỐ
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
HÀ NỘI – 2014
Công trình hoàn thành tại:
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
Người hướng dẫn: PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH
Phản biện 1: PGS.TS. Nguyễn Thị Phương Thảo
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Phản biện 2: PGS.TS. Lê Huy Hàm
Viện Di truyền Nông nghiệp
Phản biện 3: TS. Đặng Văn Đông
Viện Nghiên cứu Rau quả
Luận án sẽ được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án cấp Học viện họp tại:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Vào hồi , ngày tháng năm 2014
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam
M(cid:1250) Đ(cid:1194)U
1. Tính c(cid:1193)p thi(cid:1219)t c(cid:1259)a đ(cid:1221) tài
Cẩm chướng là một trong bốn loài hoa cắt cành được trồng phổ biến trên thế giới, chiếm 17% tổng sản lượng hoa cắt (Nguyễn Thị Kim Lý, 2012). Đây cũng là loại hoa có nhiều triển vọng trong sản xuất nội tiêu cũng như xuất khẩu c(cid:1259)a Việt Nam. (cid:1250) nước ta hiện nay, ch(cid:1259) yếu trồng các giống cẩm chướng nhập nội từ nước ngoài do đó không ch(cid:1259) động và chi phí sản xuất cao, đặc biệt là không thể m(cid:1251) rộng sản xuất và xuất khẩu b(cid:1251)i không có bản quyền giống. Vì vậy, việc nghiên c(cid:1261)u chọn tạo những giống hoa cẩm chướng mới đáp (cid:1261)ng được nhu cầu thị trư(cid:1249)ng, phù hợp với điều kiện sinh thái và có bản quyền c(cid:1259)a Việt Nam là yêu cầu b(cid:1261)c thiết.
Đối với cây hoa việc chọn tạo giống tập trung ch(cid:1259) yếu là tạo giống có màu sắc mới. Điều này được thực hiện thông qua con đư(cid:1249)ng lai xa và gây tạo đột biến. Tuy nhiên đối với cây hoa cẩm chướng (cid:1251) nước ta việc lai xa rất khó thực hiện b(cid:1251)i khả năng thụ phấn thụ tinh rất khó. Vì vậy việc tạo giống có màu sắc mới chỉ có thể thực hiện thông qua con đư(cid:1249)ng gây tạo đột biến. Phương pháp chọn tạo giống bằng gây tạo đột biến được phát triển từ giữa thế kỷ 20 và ngày càng phát triển rộng rãi mang lại những thành tựu to lớn trong công tác chọn tạo giống cây trồng. Hơn thế nữa, việc gây tạo đột biến nhân tạo kết hợp với nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro đã tr(cid:1251) thành công cụ hữu hiệu giúp giảm thiểu chi phí và th(cid:1249)i gian chọn tạo giống cây trồng mới. Kỹ thuật này đã làm tăng tần số xuất hiện đột biến với các tính trạng có giá trị kinh tế (cid:1251) các loài thực vật nói chung và cây hoa nói riêng, góp phần không nhỏ cho việc cải tiến giống cây trồng. (Okamura, 2006; Shu, 2009; IAEA, 2009, 2013). Xuất phát từ những vấn đề nêu trên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên c(cid:1261)u t(cid:1189)o đ(cid:1245)t bi(cid:1219)n in vitro vƠ đánh giá sinh tr(cid:1133)(cid:1251)ng, phát triển, sai khác di truy(cid:1221)n c(cid:1259)a các dòng đ(cid:1245)t bi(cid:1219)n gi(cid:1237)ng hoa cẩm ch(cid:1133)ớng Qu(cid:1201)n Chúa (Dianthus caryophyllus L.)”.
1
2. Mục tiêu c(cid:1259)a đ(cid:1221) tài
Nghiên c(cid:1261)u phương pháp xử lý đột biến in vitro nhằm xác định được phương pháp xử lý đột biến hiệu quả và tạo được các dòng biến dị di truyền làm nguồn nguyên liệu cho công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới. 3. Yêu cầu của đề tài
- Xác định khả năng nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa, làm cơ s(cid:1251) cho việc tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh các mẫu xử lý đột biến in vitro bằng tác nhân gây đột biến. - Xác định hiệu quả xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng trong nuôi cấy mô mang lại hiệu quả cao: + Xác định nồng độ, th(cid:1249)i gian xử lý EMS thích hợp cho chồi nhân in vitro cây hoa cẩm chướng. + Xác định liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co thích hợp cho chồi nhân in vitro cây hoa cẩm chướng. + Xác định hiệu quả c(cid:1259)a xử lý phối hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co cho chồi nhân in vitro cây hoa cẩm chướng.
- Phân lập các thể đột biến qua các thế hệ nhân chồi in vitro. - Sàng lọc các dạng biến dị c(cid:1259)a cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện tự nhiên. - Đánh giá sự sai khác di truyền c(cid:1259)a một số dòng đột biến có triển vọng đã phân lập bằng chỉ thị SSR.
- Xác định phương pháp khử trùng mẫu, môi trư(cid:1249)ng nhân nhanh, môi trư(cid:1249)ng ra rễ và giá thể ra cây thích hợp cho một số dòng đột biến có tiềm năng được tuyển chọn. 4. Ý nghĩa khoa học và thực ti(cid:1225)n c(cid:1259)a đ(cid:1221) tài 4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên c(cid:1261)u c(cid:1259)a đề tài đã cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị về việc (cid:1261)ng dụng nhân giống in vitro và phương pháp tạo giống mới thông qua xử lý đột biến in vitro c(cid:1259)a cây hoa cẩm chướng. Các kết quả nghiên c(cid:1261)u c(cid:1259)a đề tài là cơ s(cid:1251) để tiếp tục nghiên c(cid:1261)u tạo dòng đột biến làm nguồn nguyên liệu di truyền cho việc chọn tạo giống cẩm chướng mới. Đồng th(cid:1249)i là tư liệu có giá trị cho việc nghiên c(cid:1261)u lĩnh vực công nghệ sinh học và chọn tạo giống cây trồng.
2
4.2. Ý nghĩa thực ti(cid:1225)n
Đề tài đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho một số dòng, giống hoa cẩm chướng, góp phần giải quyết khó khăn trong thực tiễn về nhân giống hiện nay; (cid:1261)ng dụng thành công phương pháp xử lý đột biến in vitro và xây dựng được quy trình xử lý gây tạo đột biến kết hợp nuôi cấy in vitro cho cây hoa cẩm chướng bằng tác nhân EMS và chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co; tạo được các vật liệu kh(cid:1251)i đầu phục vụ cho công tác nghiên c(cid:1261)u chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới và chọn lọc được một số dòng đột biến có triển vọng. 5. Những đóng góp mới c(cid:1259)a lu(cid:1201)n án
Các kết quả nghiên c(cid:1261)u đã xác định được tác nhân gây đột biến EMS và tia gamma cho hiệu quả cao trong việc gây tạo biến dị có tiềm năng có thể làm vật iệu cho công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới.
Đề tài đã tạo ra các dòng đột biến có tiềm năng và đánh giá được đặc điểm sinh trư(cid:1251)ng phát triển c(cid:1259)a các dòng đột biến mới về mầu sắc hoa trong điều kiện tự nhiên. Các dòng đột biến này cũng đã được đánh giá sự sai khác di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR và xác định mối quan hệ di truyền với cây mẹ.
Đề tài đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho 2 dòng đột biến có triển vọng (dòng H6 và dòng H7) trong số các dòng đột biến nêu trên, phục vụ cho các nghiên c(cid:1261)u tiếp theo để phát triển hai dòng này thành giống hoa cẩm chướng mới. 6. Giới h(cid:1189)n c(cid:1259)a đ(cid:1221) tài
- Th(cid:1249)i gian nghiên c(cid:1261)u từ năm 2009 – 2013. - Địa điểm nghiên c(cid:1261)u: Viện Sinh học Nông nghiệp – Học viện
Nông nghiệp Việt Nam. 7. B(cid:1237) cục c(cid:1259)a lu(cid:1201)n án
Nội dung chính c(cid:1259)a luận án được thể hiện trong 130 trang, gồm: 4 trang m(cid:1251) đầu, 34 trang tổng quan, 17 trang vật liệu nội dung và phương pháp nghiên c(cid:1261)u, 73 trang kết quả và thảo luận, 2 trang kết luận và kiến nghị. 126 tài liệu tham khảo, trong đó 32 tài liệu tiếng Việt, 94 tài liệu tiếng Anh. Kết quả nghiên c(cid:1261)u có 34 bảng số liệu và 41 hình. Phần phục lục hình ảnh minh họa và kết quả xử lý số liệu.
3
Ch(cid:1133)(cid:1131)ng 1 T(cid:1240)NG QUAN TÀI LI(cid:1226)U
Cẩm chướng là loại hoa có giá trị kinh tế cao, chiếm tỷ lệ lớn trong các loài hoa cắt cành trên thế giới (chiếm 17%) và trong các loài hoa xuất khẩu (cid:1251) nước ta. Việc đẩy mạnh sản xuất và nâng cao chất lượng sản phẩm hoa cẩm chướng (cid:1251) Việt Nam còn nhiều hạn chế, trong đó đề bản quyền giống đang là khó khăn trong việc tiếp cận thị trư(cid:1249)ng hoa thế giới.
Đột biến đóng vai trò quan trọng trong chọn giống cây trồng, nh(cid:1249) vào quá trình đột biến mà chúng ta đã tạo ra nhiều giống hoa mới, đặc sắc có năng suất cao, khả năng chống chịu tốt, kháng sâu bệnh,... trên lĩnh vực hoa cảnh nói riêng và trong ngành chọn giống nói chung. Xử lý gây tạo đột biến kết hợp nuôi cấy in vitro có nhiều ưu điểm so với phương pháp chọn giống truyền thống: tần số đột biến cao và khả năng thu nhận những thể đột biến đồng nhất về kiểu gen dễ dàng hơn; có thể xử lý một số lượng lớn tế bào, mô, cây con mà không đòi hỏi diện tích lớn; có thể sử dụng nhiều bộ phận khác nhau c(cid:1259)a cây (tế bào, mô sẹo, chồi in vitro, đoạn thân, hạt, …); có khả năng rút ngắn th(cid:1249)i gian so phương pháp truyền thống (chỉ cần 3 - 6 thế hệ). Các kết quả nghiên c(cid:1261)u c(cid:1259)a các tác giả về chọn tạo giống đột biến hoa cẩm chướng cho thấy việc (cid:1261)ng dụng kỹ thuật gây tạo đột biến nhân tạo đối với cây trồng nói chung và cây hoa cẩm chướng nói riêng mang lại hiệu quả rất lớn. Có rất nhiều giống hoa cẩm chướng mới với những tính trạng mới được tạo ra nh(cid:1249) xử lý gây tạo đột biến. Vì vậy, có thể nói rằng, phương pháp chọn giống cẩm chướng và các loại hoa nói chung bằng xử lý đột biến là một phương pháp đầy triển vọng trong công tác chọn tạo giống hoa mới cho sản xuất.
Ch(cid:1133)(cid:1131)ng 2 Đ(cid:1236)I T(cid:1132)(cid:1254)NG, N(cid:1244)I DUNG VÀ PH(cid:1132)(cid:1130)NG PHÁP NGHIÊN C(cid:1260)U 2.1. V(cid:1201)t li(cid:1227)u nghiên c(cid:1261)u
- Mắt ng(cid:1259) c(cid:1259)a chồi in vitro cây hoa cẩm chướng thơm giống Quận Chúa (Tên khoa học Dianthus caryophyllus “Princess”; tên thương mại Princess). - Các thiết bị dụng cụ hóa chất trong nuôi cấy mô tế bào.
4
- Phản (cid:1261)ng PCR-SSR được tiến hành 20 mồi SSR c(cid:1259)a hãng Bioneer (theo Smulders et al., 2003, Tetsuya et al., 2009).
- Hóa chất dùng trong nghiên c(cid:1261)u sinh học phân tử như Tris bazơ, agarose, isopropanol, Ethanol, chloroform, isoamylalcohol, CH3COONa, SDS, CTAB, Nacl, ETDA,… - Các hóa chất cho phản (cid:1261)ng PCR gồm deoxynucleotit triphosphat
(dNTPs) c(cid:1259)a Sigma, Taq-DNA polymeraza c(cid:1259)a Fermentas. 2.2. N(cid:1245)i dung nghiên c(cid:1261)u. 2.2.1. Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa - Nghiên c(cid:1261)u ảnh hư(cid:1251)ng c(cid:1259)a phương pháp khử trùng đến tỷ lệ sống c(cid:1259)a mẫu. - Nghiên c(cid:1261)u ảnh hư(cid:1251)ng c(cid:1259)a môi trư(cid:1249)ng nuôi cấy đến hệ số nhân, sự sinh trư(cid:1251)ng c(cid:1259)a chồi in vitro: + Nghiên c(cid:1261)u ảnh hư(cid:1251)ng c(cid:1259)a BA và kinetin trong môi trư(cid:1249)ng MS đến hệ số nhân, sự sinh trư(cid:1251)ng c(cid:1259)a chồi in vitro. + Nghiên c(cid:1261)u ảnh hư(cid:1251)ng c(cid:1259)a tổ hợp cytokinin và auxin đến hệ số nhân, sự sinh trư(cid:1251)ng c(cid:1259)a chồi in vitro. - Nghiên c(cid:1261)u ảnh hư(cid:1251)ng c(cid:1259)a α-NAA và than hoạt tính trong môi trư(cid:1249)ng MS tới khả năng ra rễ c(cid:1259)a chồi in vitro. - Nghiên c(cid:1261)u ảnh hư(cid:1251)ng c(cid:1259)a giá thể ra cây đến tỷ lệ sống và sinh
trư(cid:1251)ng c(cid:1259)a cây in vitro ngoài vư(cid:1249)n ươm. 2.2.2. Nghiên cứu các phương pháp xử lý gây t(cid:809)o đột biến in vitro cho cây cẩm chướng
- Nghiên c(cid:1261)u xử lý EMS cho cây hoa cẩm chướng in vitro. - Nghiên c(cid:1261)u xử lý tia gamma nguồn 60Co cho cây hoa cẩm chướng in vitro. - Nghiên c(cid:1261)u xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co cho cây
cẩm chướng in vitro. 2.2.3. Nghiên cứu phân lập các d(cid:809)ng chồi in vitro biến dị sau xử lý và đánh giá sự sinh trưởng phát triển của các d(cid:809)ng chồi
- Nghiên c(cid:1261)u phân lập các dạng chồi biến dị về mặt hình thái. - Nghiên c(cid:1261)u khả năng ra rễ c(cid:1259)a các dạng chồi phân lập sau xử lý. - Nghiên c(cid:1261)u khả năng sinh trư(cid:1251)ng phát triển c(cid:1259)a các dạng chồi
5
trong điều kiện vư(cid:1249)n ươm. 2.2.4. Nghiên cứu sự sinh trưởng phát triển và phân lập các d(cid:809)ng biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện tự nhiên Cây cẩm chướng sau xử lý được đưa ra trồng tại nhà lưới, theo
dõi phân lập các dạng biến dị. 2.2.5. Nghiên cứu đánh giá sự sai khác di truyền của một số dòng biến dị có triển vọng đ̃ phân lập bằng chỉ thị SSR Chọn lọc một số dòng biến dị có tiềm năng đánh giá sự sai khác
di truyền (cid:1251) m(cid:1261)c độ phân tử bằng chỉ thị SSR. 2.2.6. Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cho một số dòng đột biến được tuyển chọn
- Nghiên c(cid:1261)u ảnh hư(cid:1251)ng c(cid:1259)a th(cid:1249)i gian khử trùng đến tỷ lệ sống c(cid:1259)a mẫu - Nghiên c(cid:1261)u ảnh hư(cid:1251)ng c(cid:1259)a môi trư(cid:1249)ng nuôi cấy đến hệ số nhân, sinh trư(cid:1251)ng c(cid:1259)a chồi in vitro. - Nghiên c(cid:1261)u ảnh hư(cid:1251)ng c(cid:1259)a auxin trong môi trư(cid:1249)ng MS tới khả năng ra rễ c(cid:1259)a chồi in vitro. - Nghiên c(cid:1261)u ảnh hư(cid:1251)ng c(cid:1259)a giá thể ra cây đến tỷ lệ sống và sinh
trư(cid:1251)ng c(cid:1259)a cây in vitro ngoài vư(cid:1249)n ươm. 2.3. Ph(cid:1133)(cid:1131)ng pháp nghiên c(cid:1261)u. 2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại. 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trư(cid:1249)ng cơ bản MS (Murahige and Skoog, 1962) với 6,5 g/l agar, 30 g/l saccarose và 100 mg/l innositol) có bổ sung các chất điều tiết sinh trư(cid:1251)ng.
Các thí nghiệm nhân nhanh, tạo cây hoàn chỉnh mẫu được nuôi cấy (cid:1251) nhiệt độ 20 – 220C, cư(cid:1249)ng độ chiếu sáng 2.000 lux, th(cid:1249)i gian chiếu sáng 16 gi(cid:1249)/ngày. Các công th(cid:1261)c thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công th(cid:1261)c thí nghiệm bố trí 150 mẫu, chia làm 3 lần nhắc lại. 2.3.3. Phương pháp gây t(cid:809)o đột biến in vitro
Phương pháp gây tạo đột biến được tiến hành theo quy trình c(cid:1259)a Novak and Brunner (1992) có cải tiến. Mỗi công th(cid:1261)c thí nghiệm xử lý 3 lần nhắc lại mỗi lần 60 mẫu với liều lượng xử lý như sau:
- Xử lý gây t(cid:809)o đột biến bằng tác nhân EMS: Mẫu được xử lý (cid:1251)
6
các m(cid:1261)c nồng độ EMS 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0% với 3 m(cid:1261)c th(cid:1249)i gian 1, 2 và 3 gi(cid:1249).
- Xử lý gây t(cid:809)o đột biến bằng tia gamma nguồn 60Co: Mẫu được xử lý với các liều hấp thụ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 Gᵧ.
- Xử lý gây t(cid:809)o đột biến bằng EMS kết hợp tia gamma nguồn 60Co: Mẫu được xử lý EMS với nồng độ 0,1; 0,2; 0,3; 0,4% trong th(cid:1249)i gian 2 gi(cid:1249) kết hợp tia gamma nguồn Co60 với liều hấp thụ 10, 20, 30 Gᵧ. 2.3.4. Phương pháp đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đột biến bằng chỉ thị phân tử SSR
Để tiến hành phân tích và đánh giá sự sai khác di truyền c(cid:1259)a các giống hoa cẩm chướng (cid:1251) m(cid:1261)c độ phân tử, DNA c(cid:1259)a 7 mẫu hoa cẩm chướng được nhân bản bằng phương pháp PCR với 20 mồi SSR. Các sản phẩm được điện di trên gel agarose 3,5%. 2.3.4.1. Phương pháp chiết tách DNA
Trong thí nghiệm này chúng tôi chiết tách DNA tổng số c(cid:1259)a các mẫu cẩm chướng dựa theo phương pháp c(cid:1259)a Obara – Okeyo P. and Kako (1998) có cải tiến. 2.3.4.2. Phương pháp PCR – SSR
Phản (cid:1261)ng PCR được thực hiện với nhiều chu kì, nhiệt độ biến tính DNA 950C, nhiệt độ gắn mồi 37- 550C tuỳ theo từng mồi, nhiệt độ tổng hợp chuỗi DNA 720C. 2.3.4.3. Phương pháp điện di trên gel agarose
Sản phẩm c(cid:1259)a phản (cid:1261)ng PCR-SSR được kiểm tra trên gel agarose 1% và soi gel dưới ánh sáng đèn UV, nhận biết sản phẩm khuếch đại dựa vào thang chuẩn DNA 1Kb. 2.3.4.4. Phương pháp phân tích số liệu
Các số liệu này được đưa vào xử lý theo chương trình NTSYSpc 2.1 c(cid:1259)a Rohlf (2002) để tính ma trận tương đồng giữa các cặp mẫu.
ảệ số PIC - Chỉ số thông tin đa hình (Nei, 1973).
2 = 1 − ∑
Trong đó: pi là tần số xuất hiện alen th(cid:1261) i.
7
Tỷ lệ dị hợp tử (ả%)
Số mồi xuất hiện ≥2 alen/ 1locus SSR H%= x 100 Tổng số mồi sử dụng-Số mồi khuyết số liệu 2.3.5. Phương pháp theo dõi, đánh giá đặc điểm nông, sinh học
Các chỉ tiêu đánh giá ngoài đồng ruộng theo Quy phạm khảo nghiệm tính khác biệt, tính đồng nhất và tính ổn định c(cid:1259)a Hiệp hội Quốc tế về bảo hộ giống cây trồng mới (Hiệp hội Quốc tế về bảo hộ giống cây trồng mới, 2008). 2.4. Ph(cid:1133)(cid:1131)ng pháp xử lý s(cid:1237) li(cid:1227)u
Số liệu được xử lý theo phương phân tích phương sai (ANOVA) theo chương trình Irristat 5.0S và Excel. Số liệu phân tích SSR được xử lý bằng phần mềm NTSYS pc2.1. Sử dụng thuật toán nội suy lagrange để xây dựng mô hình toán học. Sử dụng phương pháp Reed and Muench (1983), Behrens and Karber (1935) để xác định liều gây chết 50% mẫu thí nghiệm (LD50).
Ch(cid:1133)(cid:1131)ng 3 K(cid:1218)T QU(cid:1190) NGHIÊN C(cid:1260)U VÀ TH(cid:1190)O LU(cid:1200)N 3.1. Nghiên c(cid:1261)u nhân gi(cid:1237)ng in vitro cho cây cẩm ch(cid:1133)ớng gi(cid:1237)ng Qu(cid:1201)n Chúa 3.1.1. Nghiên cứu t(cid:809)o vật liệu khởi đầu
Kết quả nghiên c(cid:1261)u cho thấy, đối với cây cẩm chướng giống Quận Chúa sử dụng hóa chất HgCl2 0,1% để khử trùng mẫu có hiệu quả tốt hơn so với NaOCl (5%). Trong các công th(cid:1261)c thí nghiệm được nghiên c(cid:1261)u công th(cid:1261)c 2 (sử dụng HgCl2 0,1% trong th(cid:1249)i gian 7 phút) cho hiệu quả tốt nhất. 3.1.2. Nghiên cứu nhân nhanh chồi in vitro 3.1.2.1. (cid:810)nh hưởng của BA và kinetin trong môi trường MS đến hệ số nhân, sinh trưởng của chồi in vitro cây cẩm chướng
Kết quả nghiên c(cid:1261)u cho thấy: các công th(cid:1261)c có bổ sung kinetin hoặc BA đều cho sự phát sinh chồi cao hơn đối ch(cid:1261)ng. Tuy nhiên, (cid:1251) mỗi nồng độ BA hoặc kinetin bổ sung khác nhau thì số chồi phát
8
sinh và sự sinh trư(cid:1251)ng thân lá c(cid:1259)a các chồi cũng có sự khác nhau khác nhau. Trong các công th(cid:1261)c thí nghiệm công th(cid:1261)c CT6 (MS + 1,0 mg/l kinetin) cho hệ số nhân chồi cao nhất. 3.1.2.2. (cid:810)nh hưởng của của tổ hợp kinetin và auxin đến hệ số nhân, sinh trưởng của chồi in vitro cây cẩm chướng
Số liệu cho thấy, khi cố định nồng độ kinetin thay đổi nồng độ IAA và α-NAA với các m(cid:1261)c 0,25; 0,50; 0,75 và 1,0 mg/l thì chiều cao và hệ số nhân chồi có xu hướng giảm dần (hệ số nhân chồi đạt từ 2,11 đến 2,72 chồi/tháng), thấp hơn so với đối ch(cid:1261)ng.
Từ kết quả thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2 cho thấy môi trư(cid:1249)ng MS bổ sung 1,0 mg/l kinetin cho hệ số nhân chồi cao chất lượng chồi tốt nhất cho giống Quận Chúa. 3.1.3. Nghiên cứu t(cid:809)o cây hoàn chỉnh
Các công th(cid:1261)c thí nghiệm khác nhau cho tỷ lệ mẫu phát sinh rễ, số lượng, chiều dài rễ, chiều cao cây, số cặp lá trên cây (cid:1251) các công th(cid:1261)c thí nghiệm rất khác nhau. Tỷ lệ mẫu phát sinh rễ (cid:1251) các công th(cid:1261)c thí nghiệm đều cao hơn so với đối ch(cid:1261)ng (đạt 92,22 đến 100%). Công th(cid:1261)c thí nghiệm MS bổ sung 0,5 g/l than hoạt tính và 0,25 mg/l α-NAA cho tỷ lệ phát sinh rễ, số rễ và chiều dài rễ cao hơn và th(cid:1249)i gian ra rễ sớm hơn so với các công th(cid:1261)c thí nghiệm khác. 3.1.4. Nghiên cứu (cid:811)nh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm
Qua kết quả nghiên c(cid:1261)u chúng tôi thấy công th(cid:1261)c cho tỷ lệ sống cao thì đồng th(cid:1249)i cây cũng sinh trư(cid:1251)ng phát triển tốt. Trong các loại giá thể được sử dụng giá thể đất cho tỷ lệ sống thấp (83,33%), giá thể đất + trấu hun (1:1) cho tỷ lệ sống cao và chất lượng tốt. 3.2. Nghiên c(cid:1261)u xử lý gây t(cid:1189)o đ(cid:1245)t bi(cid:1219)n cho cây hoa cẩm ch(cid:1133)ớng in vitro bằng EMS và chi(cid:1219)u x(cid:1189) tia gamma ngu(cid:1239)n 60Co 3.2.1. Nghiên cứu xử lý gây t(cid:809)o đột biến cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy in vitro bằng EMS 3.2.1.1. Nghiên cứu (cid:811)nh hưởng của EMS tới sự sinh trưởng của chồi in vitro cây hoa cẩm chướng EMS đã có ảnh hư(cid:1251)ng đến khả năng sống c(cid:1259)a mẫu. (cid:1250) các công
9
th(cid:1261)c xử lý EMS, tỷ lệ mẫu sống giảm mạnh khi tăng nồng độ EMS và th(cid:1249)i gian xử lý. Tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất tại công th(cid:1261)c xử lý nồng độ 0,2% trong th(cid:1249)i gian 1 gi(cid:1249) (91,11%) và tỷ lệ mẫu sống thấp nhất tại công th(cid:1261)c xử lý nồng độ 1,0% trong th(cid:1249)i gian 3 gi(cid:1249) (18,89%). Trong các công th(cid:1261)c xử lý EMS (cid:1251) m(cid:1261)c th(cid:1249)i gian 1 và 2 gi(cid:1249) tỷ lệ phát sinh chồi đạt cao nhất khi xử lý (cid:1251) m(cid:1261)c nồng độ 0,4%.
Y = - 62,16x + 1157,07x2 – 4145,10x3 + 5626,30x4 – 2508,33x5 Y = 1,17 + 52,91x-57,06x2+563,85x3-1107,81x4+581,77x5 Y = 2,22+195,48x-997,26x2+2299,84x3-2109,11x4+689,48x5
Bằng thuật toán nội suy chúng tôi đã xây dựng được mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ EMS xử lý và tỷ lệ mẫu chết với các m(cid:1261)c th(cid:1249)i gian 1, 2 và 3 gi(cid:1249) như sau:
Trong đó: x là nồng độ EMS xử lý ; Y là tỷ lệ mẫu chết. Từ kết quả nghiên c(cid:1261)u đã xác định được liều gây chết 50% mẫu
thí nghiệm (LD50) với các m(cid:1261)c th(cid:1249)i gian 1, 2 và 3 gi(cid:1249) như sau: LD50, EMS,1 gi(cid:1249) = 0,79%; LD50, EMS,2 gi(cid:1249) = 0,76%; LD50, EMS, 3 gi(cid:1249) = 0,71%. 3.2.1.2. (cid:810)nh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái và kh(cid:811) năng sinh trưởng của các d(cid:809)ng chồi in vitro của cây cẩm chướng Sau xử lý chúng tôi đã phân lập được 5 dạng chồi (Dạng A, dạng b, dạng C, dạng D và dạng E).
Dạng A Dạng B
Dạng C Dạng D Dạng E
Hình 3.1. Các d(cid:1189)ng ch(cid:1239)i thu đ(cid:1133)(cid:1255)c sau xử lý EMS EMS có ảnh hư(cid:1251)ng rất lớn đến khả năng sinh trư(cid:1251)ng phát triển
10
c(cid:1259)a chồi cũng như sự biến đổi hình thái c(cid:1259)a chồi. (cid:1250) các công th(cid:1261)c thí nghiệm, tỷ lệ chồi biến dị tăng dần theo sự tăng c(cid:1259)a nồng độ và th(cid:1249)i gian xử lý EMS. Sự phân bố c(cid:1259)a các dạng chồi (cid:1251) các công th(cid:1261)c không giống nhau. Khi xử lý (cid:1251) nồng độ 0,2% xuất hiện 4 dạng chồi: A, B, C và D. Khi tăng nồng độ EMS lên 0,4; 0,6; 0,8% thì kết quả cho cả 5 dạng chồi A, B, C, D, E. (cid:1250) nồng độ xử lý 1,0 % số dạng chồi xuất hiện lại giảm chỉ có 4 dạng: A, B, C và D.
B(cid:1191)ng 3.1. (cid:1190)nh h(cid:1133)(cid:1251)ng c(cid:1259)a EMS đ(cid:1219)n sự phát sinh hình thái c(cid:1259)a ch(cid:1239)i in vitro cây cẩm ch(cid:1133)ớng với th(cid:1249)i gian xử lý 1 gi(cid:1249) Tỷ lệ các dạng chồi (%)
Công th(cid:1261)c Nồng độ EMS (%) Dạng A Dạng B Dạng C Dạng D Dạng E
97,76 86,75 74,40 64,91 54,62 47,50 2,24 8,10 17,32 22,32 33,25 34,72 0,00 2,16 2,54 4,78 6,12 15,45 0,00 3,00 4,19 4,28 3,82 2,33 0,00 0,00 1,55 3,70 2,19 0,00 Tỷ lệ chồi biến dị 2,24 13,20 15,60 34,75 45,72 52,50 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 ĐC CT1.1 CT1.2 CT1.3 CT1.4 CT1.5
B(cid:1191)ng 3.2. (cid:1190)nh h(cid:1133)(cid:1251)ng c(cid:1259)a EMS đ(cid:1219)n sự phát sinh hình thái c(cid:1259)a ch(cid:1239)i in vitro cây cẩm ch(cid:1133)ớng với th(cid:1249)i gian xử lý 2 gi(cid:1249) Tỷ lệ các dạng chồi (%)
Công th(cid:1261)c Dạng A Dạng B Dạng C Dạng D Dạng E
95,81 81,82 70,24 61,36 51,15 42,12 4,19 10,08 17,55 27,11 32,51 36,42 0,00 3,13 3,75 5,42 10,63 21,46 0,00 3,29 4,64 3,69 3,47 0,00 0,00 1,69 3,81 2,41 2,25 0,00 Tỷ lệ chồi biến dị 4,19 18,51 28,25 38,53 49,53 57,88 ĐC CT2.1 CT2.2 CT2.3 CT2.4 CT2.5 Nồng độ EMS (%) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
11
Khi xử lý (cid:1251) nồng độ cao và th(cid:1249)i gian dài cho tỷ lệ chồi biến dị nhiều tuy nhiên số dạng chồi biến dị xuất hiện lại giảm, đa số các chồi bị chết. Dạng biến dị tăng ch(cid:1259) yếu (cid:1251) dạng biến dị B, C, trong đó dạng chồi C có khả năng sinh trư(cid:1251)ng phát triển kém. Nồng độ EMS thích hợp cho xử lý gây tạo đột biến in vitro đối với cây cẩm chướng giống Quận Chúa là 0,4% trong th(cid:1249)i gian 2 gi(cid:1249).
B(cid:1191)ng 3.3. (cid:1190)nh h(cid:1133)(cid:1251)ng c(cid:1259)a EMS đ(cid:1219)n sự phát sinh hình thái c(cid:1259)a ch(cid:1239)i in vitro cây cẩm ch(cid:1133)ớng với th(cid:1249)i gian xử lý 3 gi(cid:1249)
Tỷ lệ các dạng chồi (%)
Công th(cid:1261)c Dạng A Dạng B Dạng C Dạng D Dạng E Nồng độ EMS (%)
94,13 69,71 66,33 53,59 44,71 34,76 5,87 19,71 21,73 31,46 38,06 35,44 0,00 4,69 5,39 9,31 14,33 29,80 0,00 3,50 4,36 3,57 2,90 0,00 0,00 2,39 2,20 2,08 0,00 0,00 Tỷ lệ chồi biến dị 5,87 29,93 33,33 46,01 56,33 64,49 ĐC CT3.1 CT3.2 CT3.3 CT3.4 CT3.5 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Từ kết quả thu được, chúng tôi đã xác định được hệ số tương quan giữa nồng độ EMS xử lý và tỷ lệ chồi biến dị và xây dựng được mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ EMS và tỷ lệ biến dị c(cid:1259)a chồi với các m(cid:1261)c th(cid:1249)i gian xử lý 1, 2 và 3 gi(cid:1249) như sau: Y = 2,24 + 266,34x-1823,63x2+4983,33x3-5431,25x4+2061,46x5 Y = 4,19+99,15x-192,33x2+311,72x3-201,04x4+36,20x5 Y = 5,87+327,25x-1665,40x2+3870,73x3-3865,10x4+1391,15x5 Trong đó : Y là tỷ lệ chồi biến dị; x là Nồng độ EMS xử lý.
3.2.2. Nghiên cứu xử lý gây t(cid:809)o đột biến cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy in vitro bằng chiếu x(cid:809) tia gamma nguồn 60Co 3.2.2.1. Nghiên cứu (cid:811)nh hưởng của xử lý chiếu x(cid:809) tia gamma nguồn 60Co tới sự phát sinh và sinh trưởng của cây hoa cẩm chướng in vitro Kết quả nghiên c(cid:1261)u cho thấy, (cid:1251) các công th(cid:1261)c thí nghiệm cho
12
thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa liều lượng xử lý chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co và tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi. Khi liều lượng xử lý tăng, tỷ lệ mẫu sống và phát sinh chồi giảm. Trong các công th(cid:1261)c thí nghiệm, tỷ lệ mẫu sống và phát sinh chồi đạt cao nhất tại CT1 (tỷ lệ sống đạt 91,33%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đạt 91,99%), khi xử lý (cid:1251) liều hấp thu 70 Gᵧ thì 100% mẫu bị chết.
Từ kết quả thu được, bằng thuật toán nội suy Lagrange chúng tôi đã xây dựng mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa liều lượng xử lý gamma với tỷ lệ mẫu chết. 57,83.10-10x7 6,65.10-3x4 Y=
+ - 1,38.10-4x5 + 2 + 8,096x - + 0,166x3
1,42.10-6x6 - 1,995x2 Trong đó: Y : Tỷ lệ mẫu chết (%); x: Liều lượng xử lý gamma (Gᵧ) Bằng phương pháp Behrens and Karber (1935), đã xác định được
liều lượng gây chết 50% mẫu thí nghiệm LD50= 38,57Gᵧ 3.2.2.2. (cid:810)nh hưởng của chiếu x(cid:809) tia gamma nguồn 60Co đến sự phát sinh biến dị hình thái chồi in vitro cây cẩm chướng Sau xử lý chúng tôi đã phân lập được 6 dạng chồi (Dạng A, dạng F, dạng G, dạng H, dạng I và dạng K).
Dạng A Dạng F Dạng G
Dạng H Dạng K
Dạng I Hình 3.2. Các d(cid:1189)ng chồi thu được sau xử lý tia gamma nguồn 60Co Số liệu thực nghiệm cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính c(cid:1259)a tỷ lệ các chồi biến dị hình thái vào liều lượng xử lý, liều lượng càng cao tỷ lệ chồi biến dị càng lớn. Sự phân bố c(cid:1259)a các dạng chồi (cid:1251) các công th(cid:1261)c thí nghiệm không giống nhau. Khi xử lý (cid:1251) liều hấp thu 20Gᵧ đến
13
50Gᵧ xuất hiện 6 dạng chồi: A, F, G, H, I và K. (cid:1250) liều hấp thu thấp 10Gᵧ chỉ thu được 3 dạng chồi A, F, H. Đặc biệt khi tăng liều lượng xử lý lên 60Gᵧ chỉ thu được 2 dạng chồi I và K. (cid:1250) liều lượng xử lý cao, tỷ lệ chồi biến dị cao tuy nhiên số dạng chồi biến dị lại giảm. Đặc biệt dạng chồi G, H (chồi có khả năng sinh trư(cid:1251)ng phát triển tốt) có xu hướng giảm mạnh.
B(cid:1191)ng 3.4. Tỷ l(cid:1227) ch(cid:1239)i bi(cid:1219)n d(cid:1231) vƠ các d(cid:1189)ng ch(cid:1239)i sau xử lý tia gamma ngu(cid:1239)n 60Co Dạng G (%) Dạng A (%) Dạng I (%) Dạng K (%) Dạng F (%) Dạng H (%)
3,80 6,53 9,53 0,00 0,00 7,39
Liều hấp thu (Gᵧ) 0 10 20 30 40 50 60 70 0,00 96,20 3,79 89,68 64,04 7,39 52,99 10,72 13,69 8,93 41,54 18,00 22,34 25,12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 5,29 6,35 7,14 6,54 6,77 10,16 14,61 8,37 13,71 22,09 0,00 16,67 83,33 0,00 0,00 0,00 8,92 8,37 0,00 0,00 Tỷ lệ biến dị (%) 3,80 10,32 35,96 47,01 58,46 77,66 100,0 0,00
Từ kết quả nghiên c(cid:1261)u chúng tôi cũng đã xây dựng được mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co và tỷ lệ chồi biến dị.
Y= 7,255.10-8x6 - 5,05.10-2x3 -
15,533.10-6x5 0,92x2 + 12,865.10-4x4 3,80 + + 4,639x
- Trong đó: Y là tỷ lệ chồi biến dị (%); X liều hấp thu (Gᵧ).
3.2.3. Nghiên cứu xử lý kết hợp EMS và chiếu x(cid:809) tia gamma ngu(cid:1239)n 60Co cho cây hoa cẩm chướng in vitro 3.2.3.1. Nghiên cứu (cid:811)nh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co tới sự sinh trưởng của chồi in vitro cây hoa cẩm chướng Kết quả thí nghiệm cho thấy khi tăng liều xử lý lên thì tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi giảm dần. Trong các công th(cid:1261)c thí
14
nghiệm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đạt cao nhất tại công th(cid:1261)c CT1 (Tỷ lệ mẫu sống 87,33%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi 89,33%), tỷ lệ mẫu sống thấp nhất tại công th(cid:1261)c CT12 (Tỷ lệ mẫu sống 24,67%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi 60,00%). 3.2.3.2. (cid:810)nh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co đến sự phát sinh biến dị hình thái chồi in vitro Sau xử lý chúng tôi đã phân lập 8 dạng chồi (Dạng A, dạng F, dạng G, dạng L, dạng M, dạng N, dạng O và dạng P).
Dạng A Dạng E Dạng G Dạng L
Dạng M Dạng N Dạng O Dạng P
Hình 3.3. Các d(cid:1189)ng ch(cid:1239)i sau xử lý k(cid:1219)t h(cid:1255)p EMS vƠ tia gamma ngu(cid:1239)n 60Co
Số liệu thực nghiệm cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính c(cid:1259)a tỷ lệ các chồi biến dị hình thái vào liều lượng xử lý, liều lượng càng cao tỷ lệ chồi biến dị càng lớn. Sự biến động về số dạng chồi biến dị cũng có xu hướng tương tự như khi xử lý riêng rẽ EMS hoặc chiếu xạ tia gamma. Khi tăng liều xử lý thì tỷ lệ chồi biến dị có xu hướng tăng lên, tuy nhiên số dạng chồi lại có xu hướng giảm (cid:1251) các công th(cid:1261)c xử lý với liều lượng cao. Đặc biệt dạng chồi G (chồi có khả năng sinh trư(cid:1251)ng phát triển tốt) chỉ xuất hiện (cid:1251) công th(cid:1261)c CT4 đến CT10. Công th(cid:1261)c CT5 xuất hiện nhiều dạng chồi, trong đó dạng chồi tiềm năng có tỷ lệ cao (Dạng G: 9,12%). Xử lý kết hợp EMS và tia gamma xuất hiện nhiều dạng chồi biến dị hơn hơn so với xử lý riêng rẽ hai tác nhân này (Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2009).
15
1 6
Công th(cid:1261)c Dạng P (%) Dạng O (%) Dạng N (%) Dạng F (%) Dạng M (%) Dạng A (%) Dạng G (%) Dạng L (%)
B(cid:1191)ng 3.5. Tỷ l(cid:1227) ch(cid:1239)i bi(cid:1219)n d(cid:1231) vƠ các d(cid:1189)ng ch(cid:1239)i in vitro sau xử lý k(cid:1219)t h(cid:1255)p EMS vƠ tia gamma ngu(cid:1239)n 60Co Tỷ lệ chồi biến dị (%) 4,08 13.21 20,35 28,74 27,34 42,50 62,11 54,04 65,66 70,51 60,38 71,10 72,23 Liều hấp thụ gamma (Gᵧ) 0,0 10 20 30 10 20 30 10 20 30 10 20 30 0,00 0,00 4,84 6,17 7,26 8,72 9,20 11,18 11,45 12,04 11,12 7,82 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 5,37 6,90 9,32 9,39 9,95 8,90 10,36 8,62 0,00 4,73 5,33 11,63 8,48 7,98 18,40 13,27 15,48 18,49 16,36 25,52 27,87 95,92 86,79 79,65 71,26 72,66 57,50 37,89 45,96 34,34 29,49 39,62 28,90 27,77 0,00 0,00 0,00 0,00 3,26 9,12 6,90 6,60 7,16 5,44 4,36 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 4,78 6,54 7,38 7,82 8,96 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 6,90 2,49 6,26 6,02 0,00 3,91 8,62 4,08 8,50 10,18 10,95 8,36 11,30 13,80 11,18 11,13 12,04 12,26 15,65 18,15 Nồng độ EMS (%) 0,0 0,1 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3 0,3 0,4 0,4 0,4 ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 CT10 CT11 CT12
16
3.3. Nghiên c(cid:1261)u kh(cid:1191) năng sinh tr(cid:1133)(cid:1251)ng c(cid:1259)a các d(cid:1189)ng ch(cid:1239)i in vitro 3.3.1. Nghiên cứu kh(cid:811) năng ra rễ của các d(cid:809)ng chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý
Trong môi trư(cid:1249)ng ra rễ, trừ dạng chồi G, các dạng chồi biến dị có khả năng ra rễ thấp hơn so với dạng chồi bình thư(cid:1249)ng. Khả năng ra rễ cao nhất là dạng G (100%) thấp nhất là dạng chồi C (37,78%), đặc biệt dạng chồi I và dạng chồi M không có khả năng sống khi cấy sang môi trư(cid:1249)ng ra rễ. 3.3.2. Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các d(cid:809)ng chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện khí canh
Các dạng chồi biến dị có khả năng sống và sinh trư(cid:1251)ng thân lá thấp hơn rất nhiều so với dạng chồi bình thư(cid:1249)ng. Tỷ lệ sống c(cid:1259)a các dạng chồi rất khác nhau, cao nhất là chồi dạng G (100%) sau đó là chồi dạng A, B, H, D, E, F, L, P, K,. Chồi dạng C, K có khả năng sống rất thấp (Dạng C: 3,33%; dạng K: 13,33%). Chồi dạng I, M, O không có khả năng sống ngay cả trong điều kiện vư(cid:1249)n ươm. 3.3.3. Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các d(cid:809)ng chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý giai đo(cid:809)n ngoài đồng ruộng
Hầu hết các dạng chồi khả năng trong điều kiện vư(cid:1249)n ươm kém (dạng C, K, P) đều bị chết sau khi trồng ra ngoài ruộng. Khả năng sống và sinh trư(cid:1251)ng c(cid:1259)a các dạng chồi (cid:1251) giai đoạn ngoài đồng ruộng cũng có sự tương đồng với giai đoạn trong phòng thí nghiệm và giai đoạn khí canh. Cụ thể dạng chồi G, A có khả năng sinh trư(cid:1251)ng phát triển tương đối tốt, cho tỷ lệ sống cao trên 80%, thân lá phát triển tốt. Các dạng chồi D, E, F, H, L, N có tỷ lệ sống thấp. 3.4. Nghiên cứu (cid:1191)nh hưởng của xử lý gây t(cid:1189)o đột biến đến sự phát sinh biến dị của cây cẩm chướng giai đo(cid:1189)n ngoài đồng ru(cid:1245)ng
Để đánh giá hiệu quả c(cid:1259)a sự tác động c(cid:1259)a các tác nhân gây đột biến chúng tôi đã tiến hành phân lập các dạng biến dị về mặt hình thái và khả năng sinh trư(cid:1251)ng phát triển c(cid:1259)a cây cẩm chướng giai đoạn ngoài đồng ruộng. Qua theo dõi chúng tôi đã phân lập được một số dạng biến dị về th(cid:1249)i gian sinh trư(cid:1251)ng, hình thái lá và màu sắc hoa và được phân thanh 3 nhóm như sau:
17
Nhóm 1: Biến dị về hình thái lá: lá cuộn, lá hình ống. Nhóm 2: Chồi nách phát triển. Nhóm 3: Biến dị về màu sắc hoa: H1: Hoa màu tím; H2: Hoa màu phấn hồng viền tím; H3: Hoa màu trắng viền đỏ; H4: Hoa màu trắng sọc tím; H5: Hoa màu trắng viền tím nhẹ, một số cánh hoa không có viền tím; H6: Hoa trắng viền phấn hồng; H7: Hoa màu tím nhạt viền tím đậm.
Đối ch(cid:1261)ng Lá hình ống Đầu lá cuộn Chồi nách phát triển
Hình 3.10. M(cid:1245)t s(cid:1237) d(cid:1189)ng bi(cid:1219)n d(cid:1231) v(cid:1221) hình thái thơn lá
H1 H2 H3
Đối ch(cid:1261)ng
H4 H5 H6 H7
Hình 3.4. Hình (cid:1191)nh m(cid:1245)t s(cid:1237) d(cid:1189)ng bi(cid:1219)n d(cid:1231) v(cid:1221) màu sắc hoa 3.4.1. (cid:810)nh hưởng của xử lý EMS đến sự phát sinh biến dị của cây cẩm chướng giai đo(cid:809)n ngoài đồng ruộng
Khi xử lý EMS xuất hiện cả 3 nhóm biến dị, trong đó có 5 dạng biến dị về màu sắc hoa (H1, H2, H4, H5, H7), dạng H3, H6 không xuất hiện khi xử lý EMS. (cid:1250) các công th(cid:1261)c xử lý nồng độ cao và th(cid:1249)i gian dài, các biến dị về hình thái thân lá xuất hiện nhiều hơn, biến dị về hoa tăng ch(cid:1259) yếu (cid:1251) dạng H5 (dạng biến dị không có lợi). Trong các công th(cid:1261)c thí nghiệm công th(cid:1261)c CT7 (xử lý EMS nồng độ 0,4% trong th(cid:1249)i gian 2 gi(cid:1249)) cho biến dị về màu sắc hoa nhiều nhất. Đặc biệt là dạng hoa H7 chỉ xuất hiện (cid:1251) công th(cid:1261)c này.
18
3.4.2. (cid:1190)nh hưởng của xử lý chiếu x(cid:1189) tia gamma nguồn 60Co đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai đo(cid:1189)n ngoài đồng ruộng
Kết quả nghiên c(cid:1261)u cho thấy khi xử lý chiếu xạ gamma xuất hiện 2 nhóm biến dị (biến dị về hình thái lá và biến dị về màu sắc hoa), biến dị khả năng phát triển chồi nách mạnh không xuất hiện. Trong nhóm biến dị về màu sắc hoa chỉ thu được 3 dạng (H4, H5, H6), dạng H1, H2, H3 và H7 không xuất hiện khi xử lý chiếu xạ gamma riêng rẽ. Trong các công th(cid:1261)c thí nghiệm công th(cid:1261)c CT3 (xử lý liều 30Gᵧ) cho biến dị về màu sắc hoa nhiều nhất. Đặc biệt là dạng hoa H7 chỉ xuất hiện (cid:1251) công th(cid:1261)c này. 3.4.3. (cid:810)nh hưởng của xử lý kết hợp EMS và chiếu x(cid:809) tia gamma nguồn 60Co đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai đo(cid:809)n ngoài đồng ruộng
Kết quả nghiên c(cid:1261)u cho thấy việc xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ gamma đã làm tăng tỷ lệ biến dị lên rất nhiều so với xử lý riêng rẽ EMS hoặc gamma. Tỷ lệ biến dị đạt cao nhất tại công th(cid:1261)c CT5 (24,66%) và thấp nhất tại công th(cid:1261)c CT1 (4,0%). Xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ gamma cho kết quả xuất hiện cả 3 nhóm biến dị (biến dị về hình thái lá, biến dị về phát triển chồi nách và biến dị về màu sắc hoa). Tuy nhiên, trong nhóm biến dị về màu sắc hoa chỉ thu được 5 dạng (H1, H3, H4, H5 và H7), dạng H2 và H6 không xuất hiện. Kết quả nghiên c(cid:1261)u cho thấy khi xử lý kết hợp làm xuất hiện thêm một dạng mới (H3). Kết quả thực nghiệm cho thấy, các dạng biến dị về màu sắc tập chung ch(cid:1259) yếu (cid:1251) dạng chồi A (dạng chồi bình thư(cid:1249)ng), một số ít xuất hiện (cid:1251) dạng chồi B, F, G, H. Dạng biến dị H5 chiếm tỷ lệ cao (cid:1251) dạng chồi F. Các dạng chồi D, E, L chỉ xuất hiện các biến dị về hình thái lá và khả năng phát triển chồi nách mạnh. 3.4.4. Đặc điểm hình thái một số d(cid:809)ng biến dị về màu sắc hoa sau xử lý giai đo(cid:809)n ngoài đồng ruộng Về đặc điểm hình thái c(cid:1259)a một số dạng biến dị về màu sắc hoa (cid:1251) các chỉ tiêu khác nhau có sự khác nhau.
Trong các giai đoạn phát triển khác nhau, các cá thể trong các dòng đột biến có tốc độ tăng trư(cid:1251)ng tương tự nhau. Trong giai đoạn
19
chuyển sang giai đoạn sinh trư(cid:1251)ng sinh thực các dòng bắt đầu có tốc độ phát triển khác nhau dẫn đến chiều cao trung bình c(cid:1259)a các dòng bắt đầu có sự thay đổi. Chiều cao cây c(cid:1259)a các dạng H1, H3, H4, H6, H7 và dạng đối ch(cid:1261)ng tương đối đồng đều. Dạng H5 có chiều cao cây trung bình thấp hơn (98 ± 9,23cm).
Kích thước hoa khi n(cid:1251) dao động từ 5,2 đến 7,1 cm. Dạng H2, H3, H4 có kích thước lớn hơn dạng đối ch(cid:1261)ng và các dạng còn lại. Cấu trúc cánh hoa có sự khác biệt, bề mặt cánh hoa dạng đối ch(cid:1261)ng, H4 và H5 gấp nếp, dạng H1, H2, H3, H6, H7 bề mặt cánh hoa phẳng; Rìa cánh hoa dạng H2 và dạng H7 có sự khác biệt so với đối ch(cid:1261)ng và các dạng còn lại (rìa cánh hoa răng cưa nhẹ, nông). Độ rộng c(cid:1259)a cánh hoa ngoài cùng c(cid:1259)a các dạng đột biến cũng có sự khác nhau, các dạng H2, H3 và H4 có độ rộng trên 3 cm, các dạng còn lại biến động từ 2,1 đến 2,8 cm. Số lượng vòi nhụy (cid:1251) các dạng không có sự khác nhau tuy nhiên độ dài c(cid:1259)a vòi nhụy c(cid:1259)a dạng H1 và dạng H3 vòi nhụy dài hơn.
3.5. Nghiên c(cid:1261)u đánh giá sự sai khác di truy(cid:1221)n c(cid:1259)a m(cid:1245)t s(cid:1237) dòng cẩm ch(cid:1133)ớng bằng kỹ thu(cid:1201)t SSR 3.5.1. Kết qu(cid:811) phân tích sự nhân b(cid:811)n DNA với các cặp mồi
Kết quả phân tích và đánh giá sự sai khác di truyền c(cid:1259)a các giống hoa cẩm chướng (cid:1251) m(cid:1261)c độ phân tử, DNA c(cid:1259)a 7 mẫu hoa cẩm chướng (gồm 6 dòng đột biến H1, H2, H3, H4, H6, H7 và giống Quận Chúa) được nhân bản bằng phương pháp PCR với 20 mồi SSR thu được tổng số 150 băng với kích thước chiều dài nhỏ nhất khoảng 100bp và băng có kích thước lớn nhất khoảng 1200bp.
Kết quả nghiên c(cid:1261)u cho thấy: Các dòng đột biến đều có sự khác biệt về mặt di truyền so với giống gốc, trong đó sự sai khác lớn nhất là dòng H3 (hệ số tương đồng di truyền H3-H1: 0,5098) và thấp nhất là dòng H4 (hệ số tương đồng di truyền H4-ĐC: 0,8293).
Trong 20 cặp mồi SSR được lựa chọn để nghiên c(cid:1261)u, mồi CB001a, CDB221 không phân biệt được sự sai khác về mặt di truyền giữa các dòng, giống hoa cẩm chướng được nghiên c(cid:1261)u. Mồi CB016a
20
chỉ cho sự sai khác giữa mẫu đối ch(cid:1261)ng và các dòng khác, không có sự sai khác giữa các dòng biến dị được nghiên c(cid:1261)u. Mồi DCA221, CB047a, có thể sử dụng để phân biệt dòng H7 với các dòng khác và đối ch(cid:1261)ng. Cặp mồi cho kết quả đa hình cao nhất là CB004a, CB026a với tổng số băng thu được tương (cid:1261)ng là 13 và 11. 3.5.2. Kết qu(cid:811) phân tích hệ số PIC với các cặp mồi
Kết quả cho thấy hệ số PIC dao động từ 0,0 (các cặp mồi chỉ có đơn hình) đến giá trị cao nhất là 0,83 (cid:1251) cặp mồi CB004a. Hệ số PIC trung bình c(cid:1259)a 20 cặp mồi trên 7 dòng cẩm chướng nghiên c(cid:1261)u là 0,26 cho thấy các locus gen khá đa dạng. 3.5.3. Đánh giá độ thuần di truyền của các dòng cẩm chướng nghiên cứu
Các dòng, giống cẩm chướng nghiên c(cid:1261)u có tỷ lệ dị hợp tử (H%) thay đổi từ 14,29% đến 29,41%. Tỷ lệ dị hợp tử cao nhất (cid:1251) dòng đột biến H3 (29,41%) tiếp theo là dòng H2, H6, H1, H4, ĐC và H7. Tỷ lệ dị hợp tử thấp nhất (cid:1251) dòng H7 (14,29%). Kết quả này cho thấy các dòng, giống cẩm chướng nghiên c(cid:1261)u có độ thuần di truyền rất cao. 3.5.4. ảệ số đồng d(cid:809)ng và mối quan hệ di truyền giữa các dòng, giống cẩm chướng
Kết quả nghiên c(cid:1261)u cho thấy hệ số tương đồng di truyền c(cid:1259)a 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa dao động trong khoảng 0,5098 đến 0,8293. M(cid:1261)c sai khác di truyền lớn nhất là dòng H1-H3 (khoảng cách di truyển là 0,4902). Cặp giống ĐC và dòng H4 có sự tương đồng di truyền cao nhất (khoảng cách di truyền 0,1707)
Từ sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống cẩm chướng cho thấy m(cid:1261)c độ sai khác di truyền giữa các giống có sự khác nhau. (cid:1250) m(cid:1261)c tương đồng 0,75 có thể chia 7 dòng, giống cẩm chướng thành 6 nhóm: Nhóm 1: Gồm giống ĐC và dòng H4; Nhóm 2: Dòng H1; Nhóm 3: Dòng H2; Nhóm 4: Dòng H3; Nhóm 5: Dòng H6; Nhóm 6: Dòng H7.
Kết quả phân tích DNA hoàn toàn phù hợp với sự khác biệt giữa các dòng, giống được nghiên c(cid:1261)u về mặt hình thái như đặc điểm thân lá, màu sắc, cấu trúc cánh hoa.
21
Hình 3.5. Mối quan hệ di truyền giữa các dòng, giống cẩm chướng
3.6. Nghiên c(cid:1261)u nhân gi(cid:1237)ng in vitro m(cid:1245)t s(cid:1237) dòng đ(cid:1245)t bi(cid:1219)n đ(cid:1133)(cid:1255)c tuyển chọn 3.6.1. (cid:810)nh hưởng chế độ khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu
(cid:1250) cả 2 dòng H6 và H7, trong các công th(cid:1261)c thí nghiệm, công th(cid:1261)c sử dụng HgCl2 0,1% trong th(cid:1249)i gian 7 phút cho hiệu quả tốt nhất (tỷ lệ mẫu sống đạt 76,33%; tỷ lệ mẫu nhiễm chỉ có 7,67%; th(cid:1249)i gian phát sinh chồi sớm). 3.6.2. Đánh giá kh(cid:811) năng nhân nhanh in vitro của các dòng cẩm chướng đột biến đ̃ chọn lọc sau xử lý in vitro.
Kết quả cho thấy trong đối với dòng H6, công th(cid:1261)c bổ sung 0,5 mg/l kinetin + 0,5 mg/l BA thích hợp cho việc nhân nhanh in vitro. Đối với dòng H7, công th(cid:1261)c bổ sung 1,0 mg/l kinetin là thích hợp cho việc nhân nhanh in vitro. 3.6.3. Nghiên cứu (cid:811)nh hưởng của auxin đến kh(cid:811) năng t(cid:809)o cây in vitro hoàn chỉnh của hai dòng cẩm chướng H6 và H7
Môi trư(cid:1249)ng tạo rễ tối ưu c(cid:1259)a 2 dòng H6 và H7 có sự khác nhau. Đối với dòng H6 công th(cid:1261)c 1 (MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,25 mg/l α-NAA) là tốt nhất đối với sự ra rễ c(cid:1259)a dòng đột biến này, còn với dòng H7 môi trư(cid:1249)ng tốt nhất cho sự ra rễ in vitro là MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,75 mg/l α-NAA. Trên các môi trư(cid:1249)ng này chồi in vitro không chỉ ra rễ thuận lợi mà chồi sinh trư(cid:1251)ng phát triển tốt.
22
3.6.4. Nghiên cứu (cid:811)nh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm
Qua kết quả nghiên cho thấy công th(cid:1261)c cho tỷ lệ sống cao thì đồng th(cid:1249)i cây cũng sinh trư(cid:1251)ng phát triển tốt. Trong các loại giá thể được nghiên c(cid:1261)u trong phương pháp địa canh sử dụng giá thể đất + trấu hun (1:1) cho cả 2 dòng H6 và H7 cho kết quả tốt nhất.
K(cid:1218)T LU(cid:1200)N VÀ Đ(cid:1220) NGH(cid:1230) 1. K(cid:1219)t lu(cid:1201)n
1) Để nhân giống in vitro cho cây hoa cẩm chướng giống Quận Chúa sử dụng quy trình nuôi cấy như sau: Khử trùng mẫu dùng HgCl2(0,1%) trong th(cid:1249)i gian 7 phút; giai đoạn nhân nhanh dùng môi trư(cid:1249)ng MS có bổ sung 1,0 mg/l kinetin; giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh dùng môi trư(cid:1249)ng dinh dưỡng MS có bổ sung 0,5 g/l than hoạt tính + 0,25 mg/l α-NAA; khi thích (cid:1261)ng cây in vitro trong điều kiện tự nhiên bằng phương pháp địa canh sử dụng giá thể đất + trấu hun (1:1) sẽ cho hiệu quả tốt nhất.
2) Xử lý gây tạo đột biến in vitro bằng tác nhân gây đột biến EMS và tia gamma làm giảm khả năng sống, khả năng phát sinh chồi, sự sinh trư(cid:1251)ng c(cid:1259)a đoạn thân mang mắt ng(cid:1259) cây cẩm chướng giống Quận Chúa (tỷ lệ sống giảm so với đối ch(cid:1261)ng từ 8,89 đến 78,89% khi xử lý bằng EMS; từ 6,67 đến 98,0% khi xử lý bằng chiếu xạ tia gamma; từ 8,00 đến 70,66% khi xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co.
3) Xử lý gây tạo đột biến in vitro bằng tác nhân gây đột biến EMS và tia gamma nguồn 60Co làm làm tăng tỷ lệ biến dị cho cây cẩm chướng nuôi cấy in vitro (từ 2,0 đến 18,66 lần so với đối ch(cid:1261)ng khi xử lý bằng EMS; từ 2,67 đến 16,67 lần so với đối ch(cid:1261)ng khi xử lý bằng chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co; từ 1,5 đến 9,24 lần so với đối ch(cid:1261)ng khi xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co).
4) Để gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng in vitro giống Quận Chúa đạt hiệu quả cao đối với phương pháp xử lý bằng hóa chất EMS, nồng độ và th(cid:1249)i gian xử lý thích hợp là 0,4% trong th(cid:1249)i gian 2 gi(cid:1249); đối với phương pháp xử lý tia gamma nguồn 60Co, xử lý với liều
23
hấp thu 30 Gγ; đối với phương pháp xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co nên xử lý EMS nồng độ 0,2% trong th(cid:1249)i gian 2 gi(cid:1249) kết hợp chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co với liều hấp thu 20 Gγ. Trong các phương pháp gây tạo đột biến in vitro được nghiên c(cid:1261)u, phương pháp xử lý gây tạo đột biến in vitro bằng hóa chất EMS cho hiệu quả tốt hơn, cho tỷ lệ biến dị cao và xuất hiện nhiều biến dị có tiềm năng.
5) Đề tài đã chọn lọc được 6 dòng đột biến về màu sắc có tiềm năng phát triển thành giống mới (dòng H1, H2, H3, H4, H6 và H7). Đánh giá sự sai khác di truyền các dòng đột biến bằng chỉ thị phân tử SSR cho thấy, các dòng đột biến về màu sắc có sự khác biệt về mặt di truyền so với giống gốc. Trong đó dòng H3 có sự sai khác di truyền lớn nhất (hệ số tương đồng di truyền H3 - H1: 0,5098) và sự sai khác di truyền thấp nhất là dòng H4 (hệ số tương đồng di truyền H4 - ĐC: 0,8293).
6) Do có sự khác nhau về cấu trúc di truyền nên sự cảm (cid:1261)ng với môi trư(cid:1249)ng nuôi cấy in vitro giữa dòng H6 và H7 có sự khác nhau. Để nhân giống in vitro cho 2 dòng đột biến H6 và H7 sử dụng môi trư(cid:1249)ng như sau: Đối với dòng H6: Khử trùng mẫu dùng HgCl2(0,1%) trong th(cid:1249)i gian 7 phút; môi trư(cid:1249)ng nhân nhanh phù hợp là MS + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l kinetin; môi trư(cid:1249)ng phù hợp để tạo cây hoàn chỉnh là MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,25 mg/l α-NAA. Khi đưa ra ngoài vư(cid:1249)n ươm nên trồng sử dụng giá thể đất + trấu hun (1:1); Đối với dòng H7: Khử trùng mẫu dùng HgCl2 (0,1%) trong th(cid:1249)i gian 7 phút; các môi trư(cid:1249)ng nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh thích hợp lần lượt là: MS + 1,0 mg/l kinetin và MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,75 mg/l α-NAA. Khi đưa ra ngoài vư(cid:1249)n ươm nên trồng sử dụng giá thể đất + trấu hun (1:1). 2. Đ(cid:1221) ngh(cid:1231) 1) Bổ sung kết quả nghiên c(cid:1261)u nuôi cấy in vitro vào quy trình vi nhân giống cây hoa cẩm chướng. 2) (cid:1260)ng dụng các dòng đột biến đã gây tạo được vào công tác chọn giống hoa cẩm chướng.
3) M(cid:1251) rộng phổ xử lý EMS và tia gamma cho các giống khác nhau để tìm được chế độ xử lý thích hợp cho từng giống nhằm tạo nguồn vật liệu cho ý nghĩa cho công tác chọn tạo giống cây cẩm chướng.
24
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Vũ Hoàng Hiệp và Nguyễn Thị Lý Anh (2013). Ảnh hưởng của xử lý
đột biến in vitro bằng chiếu xạ gamma đối với cây hoa cẩm
chướng (Dianthus caryophyllus L.), Báo cáo khoa học
Proceedings, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc
2013, Quyển 2: Công nghệ sinh học Vi sinh, công nghệ sinh học
Thực vật, NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ: 817 - 821.
2. Vũ Hoàng Hiệp và Nguyễn Thị Lý Anh (2013). Ảnh hưởng của xử lý
đột biến in vitro bằng Ethyl methane sulphonate (EMS) kết hợp
chiếu xạ tia gamma đến sự biến dị ở cây hoa cẩm chướng
(Dianthus caryophyllus L.), Tạp chí Khoa học phát triển, 8:
1092 - 1100.
