Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu phân loại chi Cóc (Spondias L.) ở Việt Nam dựa trên hình thái và phân tử

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:45

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là tiến hành điều tra và khẳng định số lượng loài thuộc chi Spondias ở Việt Nam; điều tra thực địa, tiến hành thu mẫu cho việc tách chiết, phân lập DNA và xây dựng bộ sưu tập tiêu bản khô của một số loài thuộc chi Spondias ở Việt Nam; xây dựng khóa định loại và cây phát sinh loài bằng dữ liệu phân tử cho chi Spondias ở Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu phân loại chi Cóc (Spondias L.) ở Việt Nam dựa trên hình thái và phân tử

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ĐẶNG THỊ ÁNH NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CHI CÓC (SPONDIAS L.) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Thực vật học Hà Nội, tháng 05 năm 2019
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ĐẶNG THỊ ÁNH NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CHI CÓC (SPONDIAS L.) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Thực vật học Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Lê Chí Toàn Hà Nội, tháng 05 năm 2019
LỜI CAM ĐOAN Để đảm bảo tính trung thực của khóa luận, tôi xin cam đoan: Khóa luận ―Nghiên cứu phân loại chi Cóc (Spondias L.) ở Việt Nam dựa trên hình thái và phân tử‖ là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Lê Chí Toàn. Các kết quả trình bày trong khóa luận là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào trước đây. Xuân Hòa, ngày 21 tháng 4 năm 2019 Sinh viên Đặng Thị Ánh i
LỜI CẢM ƠN Trong suốt khoảng thời gian hoàn thành đề tài khóa luận này, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ và ủng hộ của thầy cô, người thân và bạn bè xung quanh. Tôi rất cảm kích về điều đó. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các quý thầy cô, cán bộ của khoa Sinh–KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, bằng cả tấm lòng, sự nhiệt huyết, và những tri thức uyên bác của mình đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu, những bài học kinh nghiệm mà phải mất khoảng thời gian dài mới có thể đúc kết ra được. Đặc biệt, với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Lê Chí Toàn – người thầy, người hướng dẫn trực tiếp đề tài khóa luận này của tôi. Thầy đã đồng hành, trợ giúp tôi trong các bước đọc tài liệu, chắt lọc, thu thập thông tin, làm thí nghiệm; cho tôi những kinh nghiệm hữu ích trong quá trình nghiên cứu. Với kiến thức còn non nớt, và những kinh nghiệm còn hạn chế thì việc thất bại trong quá trình nghiên cứu là lẽ tất yếu, những lời khuyên của thầy đã giúp tôi nhận biết và khắc phục những sai sót gặp phải, vượt qua giới hạn của bản thân để hoàn thành tốt đề tài khóa luận này. Một lần nữa, tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy, chúc thầy có thật nhiều sức khỏe để có thêm nhiều đóng góp hơn trong lĩnh vực nghiên cứu khoa học, và chúc những dự án mà thầy đang ấp ủ thực hiện sẽ gặt hái được nhiều thành công. Ngoài ra chúng tôi xin trân thành cảm ơn trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã hỗ trợ kinh phí cho nghiên cứu này thông qua đề tài mã số C.2019.01. Thời gian tôi được làm quen, tiếp xúc với nghiên cứu khoa học chưa nhiều, kiến thức và kinh nghiệm còn hạn hẹp nên không tránh được những thiếu sót, tôi rất mong nhận được những lời góp ý của các quý thầy cô để bản khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Xuân Hòa, ngày 21 tháng 4 năm 2019 Sinh viên Đặng Thị Ánh ii
MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU ...................................................................................................1 1. Lý do chọn đề tài......................................................................................1 2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu...........................................................2 3. Nội dung chính của đề tài ........................................................................3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .................................................................3 PHẦN NỘI DUNG ...............................................................................................4 CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN ..............................................................................4 1.1. Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu ......................................4 1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước..........................7 1.2.2. Lịch sử nghiên cứu chi Cóc của Việt Nam ........................................9 CHƢƠNG 2 – ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................................................................................................................11 2.1. Đối tượng nghiên cứu .........................................................................11 2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian ........................................11 2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................13 2.3.1. Cách tiếp cận ....................................................................................13 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................13 CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................20 3.1. Kết quả nghiên cứu thực địa ...............................................................20 3.2. Kết quả phân tích điện di và phân tích khối dữ liệu phân tử ..............20 3.3. Kết quả nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài..................................22 3.4 Các sửa đổi sắp xếp phân loại cho spondias l. Ở việt nam..................28 CHƢƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................32 4.1. Kết luận ...............................................................................................32 4.2. Kiến nghị .............................................................................................32 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................33 iii
PHỤ LỤC BẢNG Bảng 2.1. Thông tin mẫu vật và số hiệu trên ngân hàng Gen thế giới của các trình tự DNA được giải mới hoặc sử dụng trong nghiên cứu này. ―–‖ thể hiện thiếu dữ liệu, ―XXX‖ thể hiện các trình tự mới được giải trong nghiên cứu này. ................................................................................................ 12 Bảng 2.2. Dụng cụ, máy móc sử dụng trong nghiên cứu................................. 15 Bảng 2.3. Hóa chất cần thiết được sử dụng cho các thí nghiệm tách chiết DNA, PCR, và điện di ............................................................................... 17 Bảng 2.4. Thông tin các mồi được sử dụng trong nghiên cứu ......................... 18 iv
PHỤ LỤC HÌNH Hình 3.1. Kết quả điện di cho các trình tự của chi Cóc ................................... 20 Hình 3.2. Kết quả alignment. ........................................................................... 21 Hình 3.3. Cây phát sinh loài của chi Cóc (Spondias) theo phân tích Maximum Likelihood từ dữ liệu kết hợp. Chỉ số ủng hộ ML và PP của phân tích BI được trình bày trên các nhánh. ―–‖ thể hiện chỉ số ủng hộ thấp hơn 50%.22 Hình 3.4. Cây phát sinh loài của chi Cóc Spondias theo phân tích Maximum Likelihood từ dữ liệu gen matK. Chỉ số ủng hộ ML và PP của phân tích BI được trình bày trên các nhánh. ―–‖ thể hiện chỉ số ủng hộ thấp hơn 50%.23 Hình 3.5. Cây phát sinh loài của chi Cóc Spondias theo phân tích Maximum Likelihood từ dữ liệu gen trnLF. Chỉ số ủng hộ ML và PP của phân tích BI được trình bày trên các nhánh. ―–‖ thể hiện chỉ số ủng hộ thấp hơn 50%. ................................................................................................ 23 Hình 3.6. Hình thái lá, số lượng lá chét của Allospondias lakonensis (A) và Spondias dulcis (B) .................................................................................... 24 Hình 3.7. Gân ở mép lá của (A) Spondias dulcis và (B) Allospondias lakonenesis ................................................................................................ 25 Hình 3.8. Lông ở bề mặt lá của (A) Spondias dulcis và (B) Allospondias lakonensis ................................................................................................ 25 Hình 3.9. Mẫu chuẩn của Spondias petteloti (A) và Allospondias laxiflora (B) . .................................................................................................................. 26 v
PHỤ LỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ đầy đủ L. Linnaeus PCR Polymerase Chain Reaction PTN SHTT Phòng thí nghiệm Sinh học trung tâm sp. Species var. Varietas Viện NCKH & ƯD Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng vi
PHẦN MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Chi Cóc (Spondias L.) là một chi nhỏ thuộc họ Ðào lộn hột hay còn gọi là họ Xoài (Anacardiaceae R. Br.) với khoảng 18 loài trên thế giới, chi Spondias tập trung phân bố ở Nam Mỹ, châu Á và Madagascar [24]. Spondias là chi mẫu chuẩn của phân họ Spondioideae Takht. emend. Pell & J. D. Mitch. và được ủng hộ bằng dữ liệu phân tử qua nghiên cứu của Pell (2004), Mitchell và cộng sự (2006), Pell và cộng sự (2011). Spondias là chi thực vật có giá trị kinh tế khá cao. Quả, rễ của các loài Spondias có giá trị thương mại và y dược. Lịch sử phân loại của chi Spondias khá phức tạp, đây là một trong những chi đầu tiên của họ Ðào lộn hột (Anacardiaceae) được mô tả bởi Linnaeus (1753). Bentham và Hooker (1862) đầu tiên đã sắp xếp các chi của họ Xoài thành các nhóm và chia họ Xoài thành hai tông Anacardieae và Spondieae. Sau đó, Marchand (1869) đã công bố tông Spondiadeae (như Spondieae) và đây là lần đầu tiên hình thành một mô hình khái niệm của Spondias [16]. Hai quan điểm phân loại của Spondioideae của Châu Á còn nhiều đối lập trong sự phân chia các loài. Trong phiên bản sửa đổi chi Spondias nhiệt đới của Châu Á, Airy Shaw và Forman (1967) đã gộp Allospondias và Solenocarpus với một khái niệm rộng cho chi Spondias, và điều này làm chi này mất đi các đặc điểm nhận biết đặc trưng như: lá đơn với lá kép lông chim, noãn đơn với noãn đa, lá chét có hoặc không có một đường gân ở mép lá [6]. Mitchell và Daly (2015) đưa ra một quan điểm trong đó chấp nhận Allospondias lakonensis rời khỏi Spondias dựa trên các đặc điểm của gân lá và sự phát triển của quả. Tương tự như vậy, Solenocarpus indicus cũng không thuộc về chi Spondias. Ngoài ra các loài Spondias philippinensis, Haplospondias brandisiana, Spondias bipinnata còn là những vấn đề chưa rõ ràng và có lẽ cũng không thuộc về chi Spondias với những đặc điểm hình thái khác biệt. Ngoài ra, 1
Mitchell và Daly (2015) cũng nhấn mạnh rằng, DNA của Spondias là rất khó khuếch đại ngay cả với các mẫu lá tươi [19]. Hiện nay dữ liệu phân tử dựa trên trình tự DNA của các đoạn gen chuẩn hay còn gọi DNA barcoding được sử dụng phổ biến trên thế giới trong các nghiên cứu hệ thống và tiến hóa thực vật. Kết quả từ dữ liệu phân tử thường đảm bảo được chất lượng và đem lại mức độ tin tưởng cao cho nghiên cứu. Tuy nhiên việc áp dụng công nghệ này vào các nghiên cứu trong nước còn ở mức hạn chế cả về chất lượng và số lượng nghiên cứu. Đối với Spondias, kết quả từ dữ liệu phân tử hiện nay gợi ý rằng, phân họ Spondioideae được chia thành hai nhánh, trong đó Spondias Nam Mỹ là chi của Spondias châu Á [27]. Chi Cóc (Spondias L.) ở Việt Nam được ghi nhận bao gồm 3 loài là S. cytherea, S. petelotii, S. pinnata tập trung phân bố ở các tỉnh miền núi phía bắc và Nam bộ (Lạng Sơn, Lai Châu, Sơn La, Hòa Bình, Lâm Đồng, Đồng Nai) [1]. Mặc dù là một chi nhỏ nhưng Spondias là chi có giá trị kinh tế và một số loài của chi này được trồng rộng rãi. Tuy vậy việc nghiên cứu phân loại và mối quan hệ phát sinh của các loài trong chi Spondias ở Việt Nam chưa được thực hiện. Do đó, một nghiên cứu phân loại cho chi Spondias ở Việt Nam là cần thiết. Xuất phát từ lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: ―Nghiên cứu phân loại chi Cóc (Spondias L.) ở Việt Nam dựa trên hình thái và phân tử‖. 2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu Tiến hành điều tra và khẳng định số lượng loài thuộc chi Spondias ở Việt Nam. Điều tra thực địa, tiến hành thu mẫu cho việc tách chiết, phân lập DNA và xây dựng bộ sưu tập tiêu bản khô của một số loài thuộc chi Spondias ở Việt Nam. Xây dựng khóa định loại và cây phát sinh loài bằng dữ liệu phân tử cho chi Spondias ở Việt Nam. 2
3. Nội dung chính của đề tài Nghiên cứu tài liệu, tiêu bản của các loài thuộc chi Spondias ở Việt Nam tại các phòng tiêu bản của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Dược liệu, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Bảo tàng Sinh học thuộc Đại học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội. Điều tra thực địa, tiến hành thu mẫu cho việc tách chiết, phân lập DNA và xây dựng bộ sưu tập tiêu bản khô của một số loài thuộc chi Spondias ở Việt Nam. Tiến hành các thí nghiệm như tách chiết DNA, PCR, giải trình tự một số gen (03 gen lục lạp: rbcL, matK, trnLF) cho các mẫu của chi Spondias ở Việt Nam. Phân tích kết quả xử lí trình tự được nghiên cứu bằng chương trình và thuật toán: Geneious, jModelTest, Maximum Likelihood, Bayesian Inference. Xây dựng khóa định loại và cây phát sinh loài bằng dữ liệu phân tử cho chi Spondias ở Việt Nam. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Đề tài góp phần tìm hiểu thực trạng số lượng các loài của chi Spondias ở Việt Nam, từ đó đánh giá được mức độ đa dạng và đưa ra được các đề xuất nhằm bảo tồn chi Spondias ở Việt Nam. Hơn nữa, đề tài sẽ đóng góp các thông tin, dữ liệu cần thiết (cả hình thái, phân tử và sự phân bố) của chi Spondias ở Việt Nam cho công tác xây dựng hệ thống Thực vật chí của Việt Nam. Ngoài ra, đề tài sẽ giúp sinh viên được tìm hiểu và làm việc trực tiếp với các thí nghiệm và phân tích phân tử hiện đại. 3
PHẦN NỘI DUNG CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về đối tƣợng, lĩnh vực nghiên cứu Theo hệ thống phân loại APG III (2009), họ Xoài/Đào lộn hột (Anacardiaceae) chứa khoảng 70 chi với khoảng 600 loài trên thế giới. Họ Xoài được chia thành hai phân họ là phân họ Xoài với khoảng 10 chi và 115 loài và phân họ Đào lộn hột với khoảng 60 chi và 485 loài [8, 28]. Họ Xoài là họ thực vật có nhiều sản phẩm nông nghiệp nổi tiếng và có giá trị kinh tế cao như là hạt điều, xoài, hạt tiêu hồng, và quả hồ trăn. Nhiều loài trong các chi của họ Xoài được trồng và dùng làm thực phẩm như: Antrocaryon (lấy quả và hạt), Bouea (quả), Buchanania (quả và hạt), Choerospondias (quả), Rhus (quả), Cyrtocarpa (quả), Lannea (quả), Ozoroa (gỗ, quả), Fegimanra (hạt), Haematostaphis (quả, hạt), Harpephyllum (quả), Pleiogynium (quả), Pseudospondias (quả và hạt), Schinus L. (quả), Sclerocarya (quả), Searsia (quả), Sorindeia (quả), Spondias (quả), và Trichoscypha (quả và hạt) [20]. Tuy không có thành viên của Anacardiaceae nào được xếp hạng là cây gỗ lớn, nhưng giữ vai trò quan trọng trong thị trường gỗ nhỏ và được đánh giá cao về chất lượng và khả năng chống mối mọt. Gỗ của Schinopsis ở Nam Mỹ có khả năng chống mối mọt tốt và được sử dụng rộng rãi ở Argentina cho ngành đường sắt. Các loại gỗ khác bao gồm: Abrahamia, Anacardium, Astronium, Campnosperma, Ozoroa, Dracontomelon dao, Loxopterygium, Myracrodruon, Protorhus, Schinopsis, Sclerocarya, Trichoscypha được sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau như trong sản xuất: làm diêm, tủ, cung, than, nhà ở, tay cầm rìu, củi, bát, ván, và cột [20]. Nhiều loài của Anacardiaceae có giá trị việc trong trang trí sân vườn. Các loài của Cotinus, Rhus, Schinus, Searsia, P. chinensis, P. mexicana, Harpephyllum caffrum, Lannea coromandelica, Rhodosphaera, Smodingium, và Toxicodendron được trồng thành cụm, có hoa đẹp để trang trí cho nhà cửa, tạo 4
hàng cây thường xanh hoặc rụng lá. Tuy nhiên, một vài loài sau khi được trồng trong nông, lâm nghiệp hay trang trí đã phát triển vượt ra sự kiểm soát và trở thành loài xâm lấn có thể kể tới như: Toxicodendron succedaneum ban đầu được trồng ở Brazil, nhưng đã phát triển rất mạnh sau khi được giới thiệu trồng tại Nhật Bản, hiện nay đang nằm trong danh sách loài xâm lấn ở Nhật Bản. Gần đây Pistacia chinensishas được nhập trồng và bắt đầu xâm lấn ở Texas (Hoa Kỳ). Ngoài ra, nhiều loài khác có giá trị cao trong y dược phẩm như: Spondias (quả: lợi tiểu; rễ: làm kem dưỡng da; vỏ cây dùng sản xuất: thuốc tẩy, thuốc xổ, chữa bệnh phong, chữa ho, trị các vết thương; lá: chữa bệnh phong, tẩy giun, trị đau dạ dày) [20]. Chi Cóc thuộc phân họ Spondoideae. Chi này gồm 18 loài đã được mô tả, trong số đó có 7 loài tìm thấy ở vùng nhiệt đới châu Á và 10 loài tìm thấy ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ, và 01 loài ở Madagascar. Trong số 18 loài Cóc được tìm thấy, có 10 loài có lá và quả ăn được, các loài này được thuần hóa để trồng ở vùng nhiệt đới châu Á và Nam Mỹ [28], trong đó, S. dulcis được trồng phổ biến trên thế giới. S. dulcis ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ được dùng làm nước ép, làm kem; ở vùng biển Caribbean nó được sử dụng như hương liệu tạo vị cho sữa chua chứa nhiều vitamin C [20]. Trên thế giới, các nghiên cứu phân loại và phát sinh loài của thực vật hạt kín được tiến hành từ rất sớm và đã có rất nhiều công bố khoa học được đăng trên các tạp chí và sách chuyên ngành. Tuy nhiên việc sử dụng dữ liệu phân tử vào các hướng nghiên cứu này ở Việt Nam còn rất hạn chế và tồn tại nhiều khó khăn. Ngoài ra, số lượng và chất lượng các nghiên cứu phát sinh loài và tiến hóa ở Việt Nam trong những năm gần đây là chưa cao. Hiện nay dữ liệu phân tử dựa trên trình tự DNA của các đoạn gen chuẩn hay còn gọi DNA barcoding được sử dụng phổ biến trên thế giới trong các nghiên cứu hệ thống và tiến hóa thực vật và di truyền. Kết quả từ dữ liệu phân tử thường đảm bảo được chất lượng và đem lại mức độ tin tưởng cao cho nghiên cứu. Trong ba hệ gen gồm: gen nhân, gen ty thể và gen lục lạp; các trình tự của 5
gen lục lạp được sử dụng nhiều và phổ biến đối với các nghiên cứu thực vật. Trình tự của ba gen rbcL (ribulose 1,5–bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit), matK (Maturase K), trnLF (tRNA–Leu (trnL) gene, partial sequence (trình tự từng phần); trnL–trnF intergenic spacer, complete sequence; và tRNA–Phe (trnF)) được sử dụng nhiều trong nghiên cứu hệ thống và phát sinh của thực vật hạt kín nói chung và Spondias nói riêng [29]. rbcL (ribulose 1,5–bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit), là gen được tìm thấy trong lục lạp, quy định enzyme RuBisCO trong quá trình quang hợp. rbcL có giá trị lớn và được sử dụng nhiều trong nghiên cứu đánh giá mối quan hệ phát sinh loài [29]. Tuy nhiên trình tự gen rbcL thường có tính bảo thủ loài và chi khá cao, có nghĩa là trình tự rbcL của các loài trong cùng một chi có độ tương đồng cao. Mặc dù vậy, rbcL là gen dễ khuếch đại và tạo thuận lợi cho nhiều nghiên cứu. matK (Maturase K) là một gen lục lạp, protein của nó mã hóa một maturase intron [29]. Trình tự gen matK thường có tính bảo thủ loài thấp do đó rất hữu ích cho nghiên cứu phát sinh. Tuy nhiên, matK lại là một trong những trình tự gen lục lạp khó khuếch đại nhất. Mặc dù vậy, matK vẫn là một gen được sử dụng rất nhiều trong các nghiên cứu hiện nay. Để khắc phục khó khăn trong quá trình khuếch đại (PCR) các nhà khoa học có thể tác động đến chương trình chạy PCR hoặc thay đổi trình tự mồi. Yu và cộng sự (2011) đề xuất việc sử dụng matK và thúc đẩy việc áp dụng matK như một mã vạch DNA bằng việc sử dụng các loại mồi mới. Nghiên cứu sử dụng 58 loài từ 47 họ thực vật hạt kín, kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng các đoạn mồi mới có khả năng khuếch đại mạnh mã gen matK (93,1%) và tỷ lệ trình tự có thể sử dụng được là rất cao (92,6%) [14, 23]. trnLF (tRNA–Leu (trnL) gene, partial sequence; trnL–trnF intergenic spacer, complete sequence; and tRNA–Phe (trnF) gene) cũng là một gen lục lạp, tuy nhiên trnLF là một gen khảm, phân mảnh, nó bao gồm ba đoạn là trnL, trnL–trnF intergenic spacer và trnF. Trình tự của gen trnLF có tính bảo thủ thấp, 6
do đó cung cấp nhiều thông tin cho việc xác định rõ ràng mối quan hệ của các loài nên có giá trị sử dụng cao trong nghiên cứu phát sinh. Tuy nhiên đây cũng là một gen khó khuếch đại và đặc biệt là rất khó gióng hàng và căn trình tự [29]. Hệ thực vật của Việt Nam rất đa dạng và chưa được nghiên cứu kĩ, đặc biệt là các nghiên cứu phát sinh loài sử dụng dữ liệu phân tử. Do đó, đây là một hướng nghiên cứu có thể đóng góp nhiều thông tin và dữ liệu quý giá cho khoa học thế giới và Việt Nam. 1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu chi Cóc trên thế giới Lịch sử phân loại của chi Cóc Spondias khá là phức tạp, đây là một trong những chi đầu tiên của họ Ðào lộn hột (Anacardiaceae) được mô tả bởi Linnaeus (1753). Bentham và Hooker (1862) đầu tiên đã sắp xếp các chi của họ này thành các nhóm và chia họ này thành hai tông Anacardieae và Spondieae [9]. Sau đó, Marchand (1869) đã công bố tông Spondiadeae (như Spondieae) và đây là lần đầu tiên hình thành một mô hình khái niệm của Spondias [16]. Hai quan điểm phân loại của Spondioideae châu Á còn nhiều đối lập trong sự phân chia các loài. Trong phiên bản sửa đổi của Spondias nhiệt đới của châu Á, Airy Shaw và Forman (1967) đã gộp Allospondias và Solenocarpus với một khái niệm rộng cho chi Spondias, và điều này làm chi này mất đi các đặc điểm nhận biết đặc trưng như: lá đơn vs. lá kép lông chim, noãn đơn vs. noãn đa, lá chét có hoặc không có một đường gân ở mép lá [6]. Mitchell và Daly (2015) đưa ra một quan điểm trong đó chấp nhận Allospondias lakonensis rời khỏi Spondias dựa trên các đặc điểm của gân lá và sự phát triển của quả. Tương tự như vậy, Solenocarpus indicus cũng không thuộc về chi Spondias [19]. Ngoài ra các loài Spondias philippinensis, Haplospondias brandisiana, Spondias bipinnata còn là những vấn đề chưa rõ ràng và có lẽ cũng không thuộc về chi Spondias với những đặc điểm hình thái khác biệt. Ngoài ra, 7
Mitchell và Daly (2015) cũng nhấn mạnh rằng, DNA của Spondias là rất khó khuếch đại ngay cả với các mẫu lá tươi [19]. Kết quả từ dữ liệu phân tử hiện nay gợi ý rằng, phân họ Spondioideae được chia thành hai nhánh, trong đó Spondias Nam Mỹ nằm ở một nhánh phát sinh riêng biết và có quan hệ chị em gần gũi với Spondias châu Á, điều này cũng gợi ý cho nghiên cứu lịch sử tiến hóa và phát sinh của chi Spondias trên toàn thế giới. Chayamarit (1997) nghiên cứu mối quan hệ phát sinh của họ Ðào lộn hột ở Thái Lan dựa trên dữ liệu phân tử (bao gồm chi Spondias), tuy nhiên do sự hạn chế về việc lấy mẫu và các trình tự gen (chỉ bao gồm duy nhất một gen rbcL) nên kết quả của nghiên cứu này là rất hạn chế đối với chi Spondias. Kết quả chỉ ra rằng, Spondias có quan hệ gần gũi và nằm trên cùng một nhánh phát sinh với Dracontomelon [10]. Pell (2004) nghiên cứu mối quan hệ phát sinh của họ Ðào lộn hột dựa trên dữ liệu sinh học phân tử và hình thái (bao gồm chi Spondias). Nghiên cứu được tiến hành trên 9 chi của họ Ðào lộn hột bao gồm cả Spondias, sử dụng trình tự của 5 gen: ETS, ITS, trnLF, rps16, matK. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, khi kết hợp 2 gen ETS và ITS cho chỉ số ủng hộ bootstrap cao hơn khi kết hợp 3 gen ETS, ITS và trnLF [20]. Trong thực vật chí Trung Quốc, Min and Barfod (2008) ghi nhận hai loài của chi Spondias ở Trung Quốc là S. pinnata và S. lakonensis. Loài S. lakonensis bao gồm hai thứ là S. lakonensis var. lakonensis và S. lakonensis var. hirsuta [18]. Silva và cộng sự (2015) thực hiện nghiên cứu phát sinh các loài của chi Spondias ở Nam Mỹ dựa trên dữ liệu phân tử. Nghiên cứu được tiến hành trên 6 loài của chi Spondias ở Nam Mỹ sử dụng trình tự của 3 gen là rbcL, matK và trnH–psbA spacer [24]. Kết quả của nghiên cứu chỉ ra rằng, trình tự gen rbcL và matK của các loài thuộc Spondias ở Nam Mỹ là tương đối bảo thủ, trong khi đó, 8
trnH–psbA spacer khá là khác biệt giữa các loài và có thể cho phép phân biệt được các loài. Al–Saghir (2017) tiến hành nghiên cứu bản đồ nhiễm sắc thể của 5 loài thuộc chi Spondias sử dụng kính hiển vi huỳnh quang [7]. Kết quả của nghiên cứu thể hiện rằng, tất cả 5 loài được nghiên cứu đều có chung bộ nhiễm sắc thể là 2n = 32. Hơn nữa, tất cả các loài Spondias có quan hệ di truyền gần gũi. 1.2.2. Lịch sử nghiên cứu chi Cóc của Việt Nam Chi Cóc (Spondias) ở Việt Nam đến nay được ghi nhận bao gồm 3 loài là S. cytherea, S. petelotii, S. pinnata và tập trung phân bố ở các tỉnh miền núi phía bắc và Nam bộ (Lạng Sơn, Lai Châu, Sơn La, Hòa Bình, Lâm Đồng, Đồng Nai) [1]. Mặc dù là một chi nhỏ nhưng Spondias là chi có giá trị kinh tế và một số loài của chi này được trồng rộng rãi. Tuy nhiên, theo Phạm Hoàng Hộ (2003) chi Cóc (Spondias) ở Việt Nam bao gồm 3 loài là S. cythera, S. pinnata và S. mombin. Tuy vậy, tác giả cũng nhấn mạnh rằng ông chỉ quan sát thấy S. cythera, S. pinnata (dọc ven biển từ Vinh tới Đà Lạt, Đồng Nai), trong khi S. mombin có lẽ là không chắc chắn [2]. Lê Thị Kim Phụng và Trần Thị Tướng An (2013) tiến hành nghiên cứu chiết xuất pectin từ vỏ Cóc (S. cytherea) bằng phương pháp hỗ trợ bởi vi sóng [3]. Nghiên cứu đưa ra một quy trình tối ưu cho việc chiết xuất pectin từ vỏ cóc sử dụng các tác nhân hóa học (HCl và cồn 96o) kết hợp với vi sóng (MAE – microwave assisted extraction method) ở 400 W trong 10 phút. Quy trình này được cho là giúp giảm chi phí và nâng cao hiệu quả sản xuất pectin so với phương pháp chiết xuất truyền thống. Nguyễn Xuân Quyền và cộng sự (2015) tiến hành nghiên cứu giá trị sử dụng của các loài trong họ Xoài ở Việt Nam. Nghiên cứu đã chỉ ra các giá trị sử dụng khác nhau của các loài trong họ Xoài, trong đó có giá trị của các loài Cóc (Spondias L.) là: cây ăn quả, làm thuốc, lấy gỗ, làm cảnh [4]. 9
Tuy nhiên, việc nghiên cứu phân loại và hệ thống phát sinh của Spondias chưa được quan tâm chú trọng vì vậy mối quan hệ phát sinh của các loài thuộc chi Spondias ở Việt Nam là chưa rõ ràng. Do đó, một nghiên cứu phân loại và phát sinh cho Spondias ở Việt Nam là cần thiết. Sử dụng phương pháp phân loại dựa trên dữ liệu hình thái và phân tử chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: ―Nghiên cứu phân loại chi Cóc (Spondias L.) ở Việt Nam dựa trên hình thái và phân tử‖. 10
CHƢƠNG 2 – ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành trên các đối tượng loài thuộc chi Cóc như đã được ghi nhận trong ―Danh lục các loài thực vật Việt Nam‖ và một số tài liệu có liên quan. Ngoài ra, nghiên cứu này cũng tiến hành thu thập và phân tích thông tin, dữ liệu phân tử một số loài Cóc trên thế giới dựa trên dữ liệu từ Ngân hàng Gen (Genbank–NCBI). Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 14 loài (16 cá thể) của hai chi Spondias và Allospondias (Bảng 2.1). Trong đó bao gồm: 04 mẫu được thu ở Việt Nam, 12 mẫu được thu thập trên ngân hành Gen thế giới (Genbank – NCBI). Nghiên cứu sử dụng 03 loài thuộc chi Buchanania (B. siamensis, B. reticulata và B. glabra) làm đối chứng cho phân tích phát sinh loài. Nghiên cứu sử dụng 03 gen lục lạp bao gồm rbcL, matK và trnLF cho các phân tích phát sinh loài. Phương pháp tách chiết, PCR, giải trình tự và phân tích được trình bày chi tiết ở mục 3. 2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian 2.2.1. Phạm vi nghiên cứu Phân tích hình thái và phân tử sử dụng các mẫu tươi, các tiêu bản khô, các trình tự DNA của các loài thuộc chi Cóc ở Việt Nam. 2.2.2. Địa điểm Một số địa điểm được ghi nhận phân bố của các loài thuộc chi Spondias tại Việt Nam. Địa điểm kiểm tra tiêu bản khô: Phòng tiêu bản, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật; Viện Dược liệu; Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam; Bảo tàng Sinh học thuộc Đại học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội. 11
Bảng 2.1. Thông tin mẫu vật và số hiệu trên ngân hàng Gen thế giới của các trình tự DNA đƣợc giải mới hoặc sử dụng trong nghiên cứu này. ―–‖ thể hiện thiếu dữ liệu, ―XXX‖ thể hiện các trình tự mới đƣợc giải trong nghiên cứu này. Loài Địa điểm Ngƣời thu mẫu matK rbcL trnLF Spondias tuberosa Arruda Brazil W. Thomas s.n. (NY) KP774614 KP774626 KP055577 Spondias mombin L. USA; Costa Rica Mitchell s.n. (NY); Roberto E. 528 KP774609 JQ590140 KP055575 Spondias venulosa (Engl.) Engl. Brazil KP774610 KP774632 KR081921 Spondias purpurea L. Mexico F. Arreola & F. Mora s.n. KP774612 KP774619 KR081868 Spondias sp. Brazil KP774613 KP774630 – R. Perez s.n.; E. Mart nez S., C. H. Brazil Ramos, R. Lombera & G. Dom nguez Spondias radlkoferi Donn.Sm. 25557 – GQ981883 KR081870 Spondias testudinis J.D. Mitch. & D.C. Brazil M. C. Machado & N. G. Antas 1563 Daly – – KR081875 Spondias malayana Kosterm. USA Pell 775 (BKL) – – KP055574 Spondias globosa J.D. Mitch. & D.C. Daly Brazil C. van den Berg 2171 – – KR081819 Spondias bahiensis P.Carvalho, Van den E. Melo, M. C. Machado & B. M. Silva Brazil Berg & M.Machado 11933 – – KR081811 Spondias acida Blume Australia D.A. Powell & H'ng Kim Chey 579 – – KR081767 M. C. Machado, A. R. Barbosa & M. R. Brazil Spondias dulcis Parkinson Santos 1302; Weiblen, G. D. WS5B0380 KP774606 JF739148 KR081815 Spondias pinnata (Koenig ex L.f.) Kurz Lai Chau, Vietnam C.T. Le Le10 XXX XXX XXX Allospondias laxiflora Lace Lang Son, Vietnam C.T. Le Le04 XXX XXX XXX Allospondias laxiflora Lace Vinh Phuc, Vietnam C.T. Le Le18 XXX XXX XXX Allospondias laxiflora Lace Vietnam C.T. Le Le17 – – XXX Buchanania glabra Wall. ex Engl. Vietnam Pell 1062 (NY) – – KP055491 Pell 1054 (NY); Toyama et al. 554 Buchanania siamensis Miq. Vietnam (KYUM) AB925072 AB925701 KP055493 Pell 1057 (NY); Toyama et al. 167 Buchanania reticulata Hance Vietnam; Cambodia (KYUM) AB924829 AB925441 KP055492 12