Khóa luận tốt nghiệp: Xây dựng quy trình chiết xuất cao chuẩn hoá giàu saponin và tinh chế saponin từ củ tam thất Panax pseudoginseng (Burk) F.H.Chen

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:56

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm xây dựng được quy trình thẩm định ba loại saponin R1, Rg1 và Rb1 có trong củ tam thất; xây dựng được bào chế cao chuẩn hoá giàu saponin từ tam thất và tinh sạch hai loại saponin điển hình từ cao chuẩn hoá giàu saponin.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp: Xây dựng quy trình chiết xuất cao chuẩn hoá giàu saponin và tinh chế saponin từ củ tam thất Panax pseudoginseng (Burk) F.H.Chen

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGÔ HẢI HÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO CHUẨN HOÁ GIÀU SAPONIN VÀ TINH CHẾ SAPONIN TỪ CỦ TAM THẤT PANAX PSEUDOGINSENG (BURK.) F.H.CHEN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2021
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC Người thực hiện: NGÔ HẢI HÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO CHUẨN HOÁ GIÀU SAPONIN VÀ TINH CHẾ SAPONIN TỪ CỦ TAM THẤT PANAX PSEUDOGINSENG (BURK.) F.H.CHEN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa: QH.2016.Y Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Văn Khanh TS. Đào Thị Thanh Hiền Hà Nội - 2021
LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô giáo thuộc Ban Chủ nhiệm, các phòng ban trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã dìu dắt, giúp đỡ trong suốt năm năm học tập, sinh hoạt và rèn luyện trên ghế nhà trường và tạo điều kiện cho em hoàn thành khoá luận tốt nghiệp. Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Thạc sĩ Nguyễn Văn Khanh – giảng viên bộ môn Bào chế và công nghệ dược phẩm trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, cùng tiến sĩ Đào Thị Thanh Hiền là người đã trực tiếp tận tình chỉ bảo và hướng dẫn em trong khoảng thời gian thực hiện đề tài. Đồng thời, em xin cảm ơn các thầy cô trong bộ Bào chế và công nghệ dược phẩm thuộc Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tạo điều kiện để em có thể thực hiện khóa luận này. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn luôn động viên và giúp đỡ em trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này. Hà Nội, tháng 6 năm 2021 Sinh viên Ngô Hải Hà
MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về cây tam thất ( Panax Pseudoginseng) ........................................... 3 1.1.1. Tên khoa học của cây tam thất ............................................................... 3 1.1.2. Phân bố của cây tam thất........................................................................ 3 1.1.3. Đặc điểm thực vật của cây tam thất ....................................................... 4 1.1.4. Thành phần hoá học của cây tam thất .................................................... 5 1.1.5. Tác dụng dược lý của cây tam thất ........................................................ 8 1.1.6. Tam thất trong y học cổ truyền ............................................................ 11 2.2. Các phương pháp chiết xuất và tinh chế saponin từ tam thất ............................ 12 2.2.1. Nguyên tắc chung................................................................................. 12 2.2.2. Các phương pháp chiết xuất saponin toàn phần từ tam thất ................ 13 2.2.3. Các phương pháp tinh chế saponin từ tam thất .................................... 14 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 16 2.1. Đối tượng và nguyên vật liệu thí nghiệm........................................................... 16 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 16 2.1.2. Nguyên liệu, hoá chất........................................................................... 16 2.1.3. Máy móc, dụng cụ ................................................................................ 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 18 2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................. 18 2.2.2. Quy trình chiết xuất và tinh chế saponin ............................................. 20 2.2.3. Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của các saponin tinh chế được ...... 22 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu.................................................................... 22 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ......................................................................................... 23 3.1. Thẩm định phương pháp định lượng R1, Rg1 và Rb1 trong tam thất bằng phương pháp HPLC ................................................................................................................ 23
3.1.1. Độ đặc hiệu của phương pháp .............................................................. 23 3.1.2. Tính thích hợp của hệ thống................................................................. 25 3.1.3. Độ tuyến tính và khoảng nồng độ ........................................................ 26 3.1.4. Độ lặp lại .............................................................................................. 27 3.1.5. Độ đúng ................................................................................................ 28 3.2. Định lượng saponin toàn phần trong mẫu củ tam thất ....................................... 29 3.3. Chiết xuất saponin toàn phần từ củ tam thất ...................................................... 30 3.4. Tinh chế saponin trong mẫu củ tam thất ............................................................ 32 3.4.1. Tinh chế saponin toàn phần ................................................................. 32 3.4.2. Tinh chế saponin điển hình bằng sắc ký lỏng đầu dò PDA ................. 33 3.5. Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của các saponin tinh chế được .................... 34 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ....................................................................................... 37 4.1. Về phương pháp định lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao .......................................................... 37 4.2. Về quy trình chiết xuất và tinh chế saponin ....................................................... 37 4.3. Về quy trình xác định cấu trúc và độ tinh khiết của các saponin tinh chế được 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................... 41 1. Kết luận ................................................................................................................. 41 2. Đề xuất .................................................................................................................. 41
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt, ký hiệu Tên đầy đủ Panax pseudoginseng (Burk.) F. H. Chen 1 PPG hay còn được gọi là panax notoginseng 2 PNS Panax notoginseng saponin 3 ESI Ion hoá tia điện 4 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao 5 DAD Đầu dò mảng diod 6 TB Trung bình 7 SD Độ lệch chuẩn 8 RSD Độ lệch tương đối 9 AOAC Hiệp hội các nhà phân tích hoá học chính thống 10 PDA Màng quang Điot
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Nguyên liệu và hoá chất 16 Bảng 2.2 Máy móc và dụng cụ 17 Bảng 3.1 Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống 26 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát độ tuyến tính 27 Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp 28 Bảng 3.4 Độ đúng của phương pháp 29 Bảng 3.5 Kết quả định lượng hàm lượng R1, Rg1 và Rb1 trong củ 30 tam thất Bảng 3.6 Kết quả chiết xuất saponin của ba phương pháp chiết 31 Bảng 3.7 Kết quả chiết xuất saponin từ củ tam thất thông qua chiết 32 nóng Bảng 3.8 Kết quả tinh chế saponin toàn phần 32 Bảng 3.9 Kết quả hàm lượng R1, Rg1 và Rb1 trong mẫu cao giàu 33 saponin Bảng 3.10 Khối lượng saponin S1 và S2 thu được 34
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Hình ảnh cây và củ Panax pseudoginseng (Burkill) F. H. 4 Chen Hình 1.2 Cấu trúc phân tử notoginsenosid R1 và ginsenosid Rb1 6 Hình 1.3 Cấu trúc phân tử ginsenosid Rg1 và ginsenosid Rd 6 Hình 1.4 Cấu trúc phân tử ginsenosid Re 6 Hình 2.1 Mẫu củ tam thất Panax pseudoginseng (Burk.) F.H. Chen 16 Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn R1 23 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Rg1 23 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Rb1 23 Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp gồm R1, Rg1 và Rb1 24 Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu trắng 24 Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu thử từ củ tam thất 25 Hình 3.7 Sắc ký đồ phân đoạn với đầu dò PDA ở bước sóng 203 nm 34 Hình 3.8 Phổ khối của saponin S1 35 Hình 3.9 Phổ khối của saponin S2 35 Hình 3.10 Sắc ký đồ của mẫu saponin S1 35 Hình 3.11 Sắc ký đồ của mẫu saponin S2 36
MỞ ĐẦU Từ xưa, các loại thảo dược tự nhiên đã được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền với tác dụng bồi bổ cơ thể cũng như điều trị bệnh lý của người bị bệnh. Ngày nay, việc ứng dụng các loại cây cỏ tự nhiên trong các lĩnh vực chăm sức khoẻ con người càng được quan tâm và đẩy mạnh phát triển nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường ngày càng tăng của các chế phẩm có nguồn gốc thảo dược. Trong các loại thảo dược có tác dụng bồi bổ cơ thể, các cây thuộc chi sâm như nhân sâm (Panax ginseng) hay sâm Mỹ (Panax quinquefolium) đã được biết đến và sử dụng rộng rãi bởi những lợi ích và ứng dụng của các loài cây này đối với sức khoẻ con người, và Panax pseudoginseng (Burk.) F. H. Chen, hay còn gọi là tam thất, là một trong những loài cây thuộc chi sâm có tác dụng hàng đầu có thể kể đến. Tam thất là một loài dược liệu quý, được biết đến từ xa xưa với vai trò là một vị thuốc y học cổ truyền sử dụng phổ biến với những tác dụng như bồi bổ thân thể người bị suy nhược, điều trị chảy máu [1, 4, 43, 48]. Đến thời điểm hiện tại, đã có hơn 200 hợp chất hoá học đã được phân lập và xác định từ các bộ phận khác nhau của cây Tam thất, trong đó thành phần chủ yếu là các saponin, với năm loại saponin chính có thể kể đến là notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, Rb1, Rd và Re [43, 48]. Các saponin này đã được chứng minh có tác dụng tốt đối với sức khoẻ, như các lợi ích đối với hệ tim mạch [43, 48, 51], khả năng chống xơ vữa động mạch[50], khả năng chống viêm [12, 45], chống oxi hoá [49], giảm nồng độ cholesterol trong máu cũng như điều hoà huyết áp [31, 36] và giảm rủi ro mắc phải ung thư [9, 20, 24, 43]. Trong tam thất, ba thành phần saponin chính được đặc biệt lưu ý là notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1 và ginsenosid Rb1 bởi tác dụng điều trị các loại bệnh xu hướng của thế kỷ 21, như các bệnh về tim mạch [48, 51], tiểu đường [31, 36] hay ung thư [9, 20, 24]. Từ những minh chứng trên, có thể thấy tam thất là một dược liệu quý giàu saponin với nhiều tác dụng dụng có lợi đối với sức khoẻ con người. Việc sản xuất cũng như ứng dụng tam thất trong lĩnh vực chăm sóc sức khoẻ là một thị trường đầy tiềm năng tại Việt Nam. Tuy nhiên, hiện nay ở nước ta các nghiên cứu về chiết xuất cao chuẩn hoá giàu saponin cũng như phân lập các saponin riêng biệt còn hạn chế. Việc phân lập các saponin chính từ tam thất có nhiều ý nghĩa trong việc đánh giá tác dụng dược lý của các saponin này, từ đó những nghiên cứu sâu hơn về các saponin điển hình trong tam thất có thể được tiến hành. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài 1
“Xây dựng quy trình chiết xuất cao chuẩn hoá giàu saponin và tinh chế saponin từ củ tam thất Panax pseudoginseng (Burk) F.H.Chen với hai mục tiêu chính như sau: 1. Xây dựng được quy trình thẩm định ba loại saponin R1, Rg1 và Rb1 có trong củ tam thất. 2. Xây dựng được bào chế cao chuẩn hoá giàu saponin từ tam thất và tinh sạch hai loại saponin điển hình từ cao chuẩn hoá giàu saponin. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây tam thất (Panax Pseudoginseng) 1.1.1. Tên khoa học của cây tam thất Tên khoa học: Panax pseudoginseng (Burkill) F. H. Chen, trong giới thực vật có vị trí phân loại như sau: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Thực vật hạt kín (Magnoliophyta) Lớp: Thực vật hai lá mầm (Magnoliopsida) Bộ: Hoa tán (Apiales) Họ: Nhân sâm (Araliaceae). Chi: Sâm (Panax) Loài: Tam thất (pseudoginseng) Tên đồng nghĩa: Aralia quinquefolia var. notoginseng Burkill; Panax pseudoginseng var. notoginseng (Burkill) G.Hoo & C.L.Tseng hoặc Panax pseudoginseng Wall. Tên thường gọi: sâm tam thất, kim bất hoán, nhân sâm tam thất, điền thất [1, 4]. 1.1.2. Phân bố của cây tam thất Tam thất có nguồn gốc ở phía nam Trung Quốc, được trồng từ lâu đời và không còn được tìm thấy trong trạng thái mọc trong tự nhiên. Cây được nuôi trồng nhiều nhất ở tỉnh Vân Nam, sau đó là Quảng Tây và ở một số quốc gia khác như Đài Loan, Nhật Bản, Triều Tiên [4]. Sự nhạy cảm với ánh sáng của cây hạn chế sự phân bố của tam thất tại Trung Quốc [43]. Ở Việt Nam, tam thất là một loại cây được nhập trồng từ Trung Quốc [4]. Tam thất được trồng với số lượng ít tại một số tỉnh như: Hà Giang (Đồng Văn), Lào Cai (Mường Khương, Bát Xát, Phà Lùng), Cao Bằng… tại các vùng núi cao 1200 – 1500 m [1]. 3
1.1.3. Đặc điểm thực vật của cây tam thất Tam thất là cây thân thảo, sống nhiều năm. Thân tam thất mọc thẳng, không phân nhánh, cao 30 – 50 cm, màu tím tía. Lá kép chân vịt, màu xanh đậm, 3 – 4 lá mọc vòng, cuống lá dài 3 – 6 cm, mỗi cuống lá gồm 5 – 7 lá chét hình mác, cuống lá chét dài 0,6 – 1,2 cm, gốc thuôn, đầu có mũi nhọn, mép khía răng, hai mặt có lông cứng ở gân, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt [4]. Cụm hoa hoàn chỉnh có đường kính 5 – 25 mm, tổng chiều dài cuống từ 5 – 45mm. Cuống nhỏ ở một đầu và đầu còn lại chứa nhiều nụ hoa, với khoảng 130–230 hoa [48].Cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, có hoa đơn tính, có hoa lưỡng tính cùng tồn tại. Hoa màu lục vàng nhạt, đài 5 răng ngắn, màu xanh, tràng 5 cánh rộng ở phía dưới, nhị 5, bầu 2 ô. Quả mọng, hình cầu dẹt, khi chín màu đỏ, trong có hai hạt hình cầu, màu trắng [4]. Rễ chính có hình nón hoặc trụ, với chiều dài từ 1 – 6 cm, có màu vàng hoặc nâu với các vết nhăn và nếp rễ. Cây thường được thu hoạch vào mùa thu, trong thời gian trước khi nở hoa và có thể được nghiền thành bột sử dụng cho đường uống hoặc kết hợp với các thảo dược khác [4]. Hình 1.1. Hình ảnh cây và củ Panax pseudoginseng (Burkill) F. H. Chen 4
1.1.4. Thành phần hoá học của cây tam thất Theo các nghiên cứu, hơn 200 thành phần hoá học đã được phân lập từ tam thất. Trong số đó, saponin (4,42 – 12%) [4] chiếm hàm lượng lớn và được coi là thành phần chính, ngoài ra trong tam thất còn chứa những thành phần khác như flavonoid, các peptit vòng, đường saccarid và các nguyên tố vô cơ. Những thành phần phân bố trong các bộ phận khác nhau của cây như rễ, thân, hoa và lá với tỉ lệ khác nhau. Saponin được coi là thành phần chính trong Panax pseudoginseng. Trong thực tế, đã có hơn 100 loại saponin được phân lập và xác định, xthuộc ba nhóm ginsenosid, notoginsenosid và gypenosid. Hầu hết các saponin trong cây tam thất là các triterpen thuộc nhóm Dammarane với nhóm aglycon là 20(S)-protopanaxadiol (nhóm Rb) hoặc 20(S)-protopanaxatriol (nhóm Rg). PPG có thành phần không chứa bất cứ saponin nào có nhóm axit oleanolic(nhóm Ro), đây là một khác biệt lớn so với cây Panax ginseng C. A. Meyer and Panax quinquefolius L. Mỗi bộ phận khác nhau của tam thất sẽ chứa thành phần và tỉ lệ saponin khác nhau tuỳ theo từng bộ phận cụ thể. Nghiên cứu cho thấy ginsenosid Rb1 có nhiều trong tất cả các bộ phận của cây, trong khi Rg1 giàu trong thân và rễ. Rg3 – một chất được báo cáo về khả năng bảo vệ thần kinh - có hàm lượng lớn trong nụ hoa tam thất. Thông thường, năm loại saponin chính là notoginsenosid R1 (7 – 10%), ginsenosid Rb1 (30 – 36%), Rg1 (20 – 40%), Rd (5 – 8,4%) và Re (3,9 – 6%) chiếm tới khoảng 90% tổng số saponin trong tam thất được nghiên cứu cùng ứng dụng trong thí nghiệm về dược lý. Trong số đó, ba saponin lần lượt là ginsenosid Rb1, ginsenosid Rg1 và notoginsenosid R1 được chọn làm hợp chất tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng tam thất. Để tăng cường sự đa dạng phân tử của ginsenosid, đồng nghĩa với khả năng tìm kiếm được các chất có hoạt tính sinh học mới, các nghiên cứu khoa học đã được thực hiện nhằm xác định các sản phẩm thuỷ phân và các sản phẩm biến đổi sinh học của saponin nhằm tìm kiếm các chất có hoạt tính mới, mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc ứng dụng tam thất trong điều trị [43]. 5
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử notoginsenosid R1 và ginsenosid Rb1 Hình 1.3. Cấu trúc phân tử ginsenosid Rg1 và ginsenosid Rd Hình 1.4. Cấu trúc phân tử ginsenosid Re 6
Ngoài các loại saponin, các thành phần khác cũng được báo cáo có mặt trong Panax pseudoginseng. Trong PPG, các peptit vòng được tìm thấy có cấu trúc là các hợp chất mạch vòng hình thành dựa trên các liên kết peptit do 2 – 37 protein hoặc axit amin không phải protein tạo nên. Chúng được tìm thấy trong các thực vật thuộc họ Caryophyllaceae và Rhamnaceae và được phân chia thành hai lớp, năm lớp phụ và tám loại. Đã có 14 loại peptit vòng được phân lạp và xác định về cấu trúc dựa trên phương pháp quang phổ, đó là các peptit vòng sau: cyclo- (Leu-Thr), cyclo- (Leu- Ile), cyclo- (Leu-Val), cyclo- (Ile-Val), cyclo- (Leu-Ser), cyclo- (Leu-Tyr), cyclo- (Val-Pro), cyclo- (Ala-Pro), cyclo- (Phe-Tyr), cyclo- (Phe-Ala), cyclo- (Phe-Val), cyclo- (Leu-Ala), cyclo- (Ile-Ala) và cyclo- (Val-Ala) [35]. Saccarid phân lập từ cây bao gồm monosaccarid, oligosaccarid và polysaccarid. Polysaccarid tồn tại trong nhiều bộ phận, với hàm lượng cao nhất ở rễ chính. Tổng hàm lượng đường của rễ PPG gần gấp đôi so với thân rễ, và hàm lượng polysaccarid của hoa gấp đôi so với thân và lá của tam thất. Các nghiên cứu khoa học đã chứng minh rằng các polysaccarid trong PPG có tác dụng bổ trợ và hoạt động kích thích miễn dịch. Một số loại flavonoid đã được phân lập ra từ PPG, chủ yếu là flavonol và flavonglycosid như liquiritigenin, quercetin hay kaempferol-3-O-α-L-rhamnoside. Có một lượng ít sterol đã được phân lập và xác định từ PPG, bao gồm β- sitosterol, daucosterol, stigmasterol, stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid và stigmast-7-en-3β-ol-3-O-β-D-glucopyranosid. Hơn 19 loại amino axit đã được phân lập trong PPG, với 7 trong số chúng được coi là thiết yếu [43]. Các thành phần dầu dễ bay hơi trong PPG gồm tecpen, rượu, aldehit, olefin và ankan. Terpen được coi là một thành phần quan trọng vì tỷ lệ tương đối cao trong hợp chất. Hơn 91 chất dễ bay hơi đã được phân lập từ dầu của hoa nụ hoa tam thất, với các thành phần chính là spathulenol (12.19%), α‐gurjunen (6.73%), bicyclogermacren (6.57%), germacren‐D (5.26%) và bicycloelemen (3.55%) [33]. Ngoài các hợp chất hóa học được liệt kê ở trên, còn có các thành phần khác được phân lập từ PPG, bao gồm icarisid B6, guanosin hydrat, axit béo, các nguyên tố vô cơ và muối khoáng [43]. 7
1.1.5. Tác dụng dược lý của cây tam thất Đúc kết từ các kinh nghiệm xưa cùng với các nghiên cứu hiện đại, tam thất đã được chứng minh là một loài cây với nhiều tác dụng dược lý tốt lên hệ tim mạch, hệ miễn dịch, khả năng chống xơ vữa động mạch, hoạt động cầm máu, khả năng chống ung thư…  Tác động lên hệ tim mạch Rất nhiều nghiên cứu đã cho thấy khả năng điều trị các bệnh tim mạch thông qua việc sử dụng PPG thông qua hai tác dụng chính: khả năng ảnh hưởng đến tế bào nội mô và khả năng bảo vệ tế bào cơ tim. Cụ thể, trong cao huyết áp, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tăng cường hoạt động của các tế bào nội mô cơ tim thông qua tác dụng giảm nồng độ NO và ET-1 trong máu đã làm giảm khả năng tăng huyết áp trong chuột thí nghiệm [43]. Ngoài ra tác dụng bảo vệ tế bào tim mạch của saponin 20 (S) ‐panaxadiol thông qua việc chống lại sự oxi hoá, cùng với tác dụng hình thành mạch máu của ginsenosid Rg1 có tác dụng trong điều trị chữa lành vết thương do thiếu máu cục bộ [48]. Trong suy tim, thông qua thử nghiệm điều trị chuột bị suy tim sử dụng ginsenosid Rb1 (35 và 70 mg/kg) và losartan (4,5 mg/kg) trong 8 tuần, Rb1 đã được chứng minh có tác dụng khôi phục chức năng tim và ty thể, tăng hấp thu glucose và bảo vệ chống lại quá trình tái định dạng tim thông qua các con đường tín hiệu TGF- β1/ Smad, ERK và Akt [51].  Khả năng chống xơ vữa động mạch Thực nghiệm trên 3 nhóm chuột được sử dụng parafin lỏng, zymosan (20mg/kg, 3 ngày 1 lần) và zymosan cùng PNS (100mg/kg hàng ngày) trong 9 tuần, kèm chế độ ăn nhiều chất béo đã đã chứng minh khả năng trong việc điều trị xơ vỡ động mạch của PNS. Kết quả mẫu máu trên chuột đã chứng minh PNS có thể ngăn ngừa và điều trị xơ vữa động mạch dựa trên khả năng chống viêm, giảm mức lipid trong máu cũng như khả năng sửa chữa mạch máu. Cơ chế chính của tác dụng này là do khả năng kháng viêm thông qua sự ức chế chuyển vị của p65 NF-kB [50].  Khả năng gây đông máu và chữa lành vết thương Tam thất được coi là thần dược trong điều trị chảy máu trong và ngoài trong điều trị chấn thương. Các thành phần saponin có tác dụng làm giảm viêm, giảm stress oxy hóa và ức chế endotoxin và myeloperoxidase trong giai đoạn hồi phục của chuột bị sốc xuất huyết [43]. Nghiên cứu riêng về ginsenosid Rg1 được phân lập còn cho 8
thấy tác dụng thúc đẩy tạo mạch máu con đường tín hiệu VEGF-KDR/FIK-1 và I3K- Akt-eNOS [18].  Hoạt động chống oxy hoá Các flavonoid và saponin từ tam thất đã được chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa và loại bỏ gốc tự do. Tại nồng độ 0,2 – 1,0 mg/ml, các flavonoid trong tam thất có hoạt tính chống sự oxi hoá của axit 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzthiazolin-6- sulphonic, các gốc superoxit anion và các gốc hydroxyl vượt trội hơn so với axit ascorbic. Ngoài ra, các flavonoid còn hể hiện tác dụng ức chế đối với Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila và Pseudomonas aeruginosa[17]. Một số loại saponin từ tam thất cũng được báo cáo về tác dụng chống lại stress oxy hoá trên ty thể [49].  Khả năng chống viêm Hoạt động chống viêm của PPG được chứng minh thông qua các cơ chế khác nhau, đặc biệt thông qua con đường NF-kB. Tam thất có tác dụng ngăn chặn sự tập trung và kích hoạt của bạch cầu trung tính, đại thực bào và tế bào lympho dẫn đến sự hạn chế giải phóng của ROS, lysozym, prostaglandin, leukotrien và các cytokin gây viêm, làm giảm thiệt hại cho các mô xung quanh [45]. Thực nghiệm cho thấy ginsenosid Rb1 có khả năng chống viêm thông qua khả năng hạn chế sự giải phóng của các cytokin gây viêm trong các tế RAW264.7, cũng như giảm lượng COX-2 và iNOS. Trong các thử nghiệm trên động vật, Rb1 có tác dụng giảm chấn thương do viêm thận cấp và chữa trị nhiễm trùng huyết do lipopolysaccarid [12].  Khả năng hạ đường huyết và chống tăng lipid máu Trong tam thất, PNS có tác dụng làm tăng đáng kể độ nhạy với insulin cũng như cải thiện cân bằng nội mô glucose trong các thử nghiệm trên chuột KK-Ay, điều này có ý nghĩa rất lớn trong quá trình kiểm soát tiểu đường. Ngoài ra, PNS còn có khả năng điều chỉnh về cả mức độ cũng như độ nhạy cảm của leptin trên chuột KK- Ay, hóc môn này có tác dụng kiểm soát năng lượng tổng thể cũng như sự cân bằng nội môi trong trao đổi chất, thông qua đó giảm nhu cầu thức ăn và và chất béo [37]. Trong 5 thành phần chính của PNS, Rb1 và Rg1 được báo cáo về tác dụng thúc đẩy tiết insulin của tế bào beta và làm giảm tích tụ chất béo trung tính. Tác dụng nói trên được dựa trên cơ chế cải thiện cân bằng đường nội môi bằng cách tăng cường quá trình tạo chất béo trung tính trong tế bào mỡ và tăng cường chức năng và khả năng sống sót của tế bào beta thông qua con đường phụ thuộc PKA [31]. 9
 Tác dụng bảo vệ thần kinh Đã có những ghi nhận về tác dụng của các PNS như ginsenosid Rg1, Rb1, notoginsenosid R1 và các polysaccarid từ cây về khả năng hạn chế sự chết tế bào thông qua việc điều chỉnh tỉ lệ Bcl-2/Bax và biểu hiện của Trx-1, SOD-1, HSP70, giảm biểu hiện của caspase-1, caspase-3 và các protein có liên quan, nhằm khôi phục con đường tín hiệu Akt-NF-kB có tác dụng chống chết tế bào. Các cơ chế chống viêm cũng có tác dụng trong việc bảo vệ thần kinh. Ngoài ra, các saponin còn có tác dụng thúc đẩy quá trình chuyển hóa và bảo vệ cấu trúc của tế bào thần kinh chống lại tổn thương do thiếu oxy trong ống nghiệm một cách toàn vẹn, thúc đẩy tăng sinh tế bào gốc thần kinh hồi hải mã và biệt hóa thành tế bào thần kinh và tế bào thần kinh đệm mới [43]. Ginsenosid Rb1 có thể điều chỉnh mức protein của yếu tố thần kinh có nguồn gốc từ não. Ngoài các tác dụng trên, PPG có tác dụng chống thoái hóa thần kinh, ginsenosid Rb1 có thể điều chỉnh giảm protein Tau quá trình phosphoryl hóa trong bệnh Alzheimer [30].  Khả năng hỗ trợ và kích thích miễn dịch Các chất trong tam thất như saponin dạng protopanaxadiol, ginsenosid -Rb1, - Rd, notoginsenosid -K, -R4 phân lập từ P.notoginseng có tác dụng tăng cường mạnh một số kháng thể đặc hiệu và các phản ứng tế bào chống lại ovalbumin (OVA) trên chuột, và chúng còn có khả năng tặng hoạt hoá tế bào lympho T và tế bào lympho B ở chuột miễn dịch với OVA [43].  Tác dụng lên thận Nghiên cứu chỉ ra rằng các PNS có khả năng bảo vệ chống lại độc tính trên thận do cisplatin gây ra[27], ngoài ra PNS còn có tác dụng giảm sự chết của mô thận thông qua ức chế con đường ty thể, do tác dụng giảm biểu hiện của caspase 9 và Bax và tăng biểu hiện của Bcl-2 [28].  Tác dụng lên gan Các loại PNS còn thể hiện tác dụng bảo vệ các tổn thương gan do nhiều nguyên nhân như rượu, carbon tetrachlorid, … Những tác dụng điều trị của các loại saponin kể trên đối với bệnh xơ gan có thể liên quan đến hoạt động điều hòa miễn dịch của nó đối với các cytokin tiền xơ và chống xơ hóa, cũng như đặc tính chống oxy hóa. Ngoài ra, PNS có thể làm giảm chứng thiếu máu cục bộ đường ruột, rối loạn chức năng vi mạch gan do tái tưới máu và tổn thương tế bào gan bởi cơ chế chống viêm [43]. Cụ thể, tác dụng của ginsenosid Rg1 tại gan đã được chỉ ra như việc giảm nồng 10
độ đường huyết trong máu và chỉ số kháng insulin tại chuột, làm tăng nồng độ aspartate transaminase và alanin transaminase trong mô hình chuột T2 ‐ DM [36]. Tác dụng bảo vệ gan của ginsenosid Rg1 còn được thể hiện thông qua việc điều chỉnh con đường tín hiệu Keap1-Nrf2-ARE [13].  Cơ chế chống ung thư Các chiết xuất và thành phần của PPG đã được kiểm chứng về khả năng chống ung thư đối với bệnh ung thư ruột kết, ung thư gan, ung thư phổi, u lympho, ung thư tuyến tuỵ, ung thư vú. Cơ chế chính có thể do sự ức chế sự tăng sinh tế bào và gây ra quá trình chết rụng tế bào thông qua giảm điều hoà biểu hiện Bcl-2, tăng điều hoà biểu hiện Bax, giảm tiềm năng xuyên màng của ty thể, và sự hoạt hoá của caspase-3 [43]. Trong ung thư vú, ginsenosid Rg1 đã được báo cáo về khả năng gây chết tế bào theo chương trình, và ngăn chặn sự hình thành tế bào khối u ở chuột thực nghiệm thông qua sự ngăn chặn tổn thương do oxi hoá[9]. Ngoài ra, những báo cáo khác về khả năng chống ung thư tại xương hay ung thư bạch cầu cũng đã cho thấy khả năng chống ung thư của Rg1 trong tam thất [20, 24]. 1.1.6. Tam thất trong y học cổ truyền Rễ tam thất được thu hái trước khi ra hoa, rửa sạch, phơi khô hoặc sấy khô, rồi phân loại thành rễ củ, rễ nhánh và thân rễ. Tam thất có vị đắng, ngọt, tính ẩm, vào các kinh can, thận, có công năng hoạt huyết, bổ huyết, cầm huyết, tiêu ứ máu, tiêu sưng, giảm đau. Tam thất được dùng làm vị thuốc trong các bài thuốc y học cổ truyền của Việt Nam như chữa các chứng chảy máu khi bị thương hoặc chữa suy nhược cơ thể ở người cao tuổi hoặc phụ nữ có thai. Trong y học cổ truyền Ấn Độ, tam thất là thuốc bổ và làm tăng khả năng thích nghi của cơ thể [4]. Tại Trung Quốc, từ xa xưa rễ của tam thất đã được sử dụng như một phương thuốc cầm máu nổi tiếng, là thành phần chính trong Vân Nam Bạch Dược – một phương thuốc nổi tiếng của Trung Quốc. Các ghi chép về cây có thể được tìm thấy từ rất sớm trong cuốn Bản Thảo Cương Mục của Lý Thời Trân, với các tác dụng được đề cập đến như cầm máu, loại bỏ máu ứ, giảm đau và điều trị chảy máu do vật sắc, ho ra máu, nôn trớ, chảy máu cam và lỵ ra máu [43]. 11
2.2. Các phương pháp chiết xuất và tinh chế saponin từ tam thất 2.2.1. Nguyên tắc chung Chiết tách là bước đầu tiên và có vai trò lớn trong việc thu hồi và làm sạch các chất có hoạt tính sinh học từ nguyên liệu thô. Trong PPG, sản phẩm chính thu được sau quá trình tách chiết là các loại saponin, tuy vậy do bản chất của saponin là một chất có độ phân cực cao, không bền về mặt hoá học và nhiệt học, không dễ bay hơi dẫn đến những thách thức trong việc tìm ra các biện pháp hiệu quả trong quá trình tách chiết [29]. Chính vì vậy, rất nhiều các biện pháp chiết tam thất đã được thử nghiệm, cụ thể như các phương pháp chiết xuất phổ thông như ngâm, sử dụng soxhlet, chiết nóng hồi lưu cùng với các biện pháp chiết xuất hiện đại như chiết xuất sóng siêu âm, hỗ trợ vi sóng hay chiết dung môi nhanh, với các kỹ thuật có những ưu điểm và nhược điểm riêng biệt. Trong quá trình tách chiết tam thất, các bước được tiến hành lần lượt là: Quá trình tiền xử lý, chiết xuất và sau đó là tinh chế sản phẩm. Tiền xử lý là bước đầu tiên trong quá trình tách chiết, được tiến hành với mục đích tăng hiệu quả của quá trình chiết xuất. Các bước tiền xử lý bao gồm làm khô, giảm kích thước hạt và khử chất béo. Các nguyên liệu thô từ thực vật (rễ, vỏ cây, lá, thân, củ) thường được làm khô và sau đó nghiền thành bột trước khi nhằm giảm kích thước hạt với mục đích tăng hiệu quả truyền khối của quá trình chiết. Các nguyên liệu thô thường được làm khô. Quá trình khử chất béo được tiến hành thông qua việc sử dụng dung môi ưa béo, chẳng hạn như ethyl axetat hoặc n–hexan nhằm loại bỏ chất béo khỏi hỗn hợp. Hiệu quả của quá trình phân tách được cải thiện bằng cách sử dụng một phần của cây có nồng độ saponin cao nhất [29]. Các phương pháp chiết thường được phân loại theo 2 nhóm chính: các phương pháp chiết xuất truyền thống và các phương pháp chiết xuất hiện đại. Các phương pháp chiết xuất truyền thống có thể kể đến như ngâm, chiết bằng soxhlet, chiết nóng hồi lưu (HRE), với hiệu suất chiết xuất trong các phương pháp này phụ thuộc phần lớn vào khả năng tan của nguyên liệu trong dung môi. Điều này dẫn đến sự bắt buộc của việc sử dụng lượng lớn dung môi, kèm theo sự hỗ trợ về nhiệt độ (đun nóng) hoặc cơ học (khuấy và lắc). Các nhược điểm chung có thể thấy của phương pháp truyền thống là về thời gian, lượng dung môi sử dụng lớn, hiệu suất thấp và khả năng phân huỷ của các chất trong thời gian chiết [8]. So sánh với các phương pháp cũ, các phương pháp chiết xuất hiện đại được cho là tối ưu hơn, do các ưu thế như việc sử dụng ít dung môi, tốn ít thời gian hơn, có khả năng tự động hoá cũng như hiệu quả 12