Kỹ thuật gen-công nghệ gen

Chia sẻ: Hoang Thuy | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:17

Thêm vào BST

Báo xấu

208
lượt xem 66
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Kỹ thuật gen hoặc công nghẹ gen (genetic engineering, genetic technology) là công nghẹ cốt lõi của công nghệ sinh học hiện đại được ra đời kể từ năm 1977. Công nghệ gen bao gồm các kỹ thuật thực hiện trên axit nucleic, nhằm nghiên cứu cấu trúc của gen, điều chỉnh và biến đổi gen, tách, tổng hợp và chuyển các gen mong muốn vào các tế bào sinh vật chủ mới tạo ra các cơ thể mới, sinh vật mới mang đặc tính mới. ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Kỹ thuật gen-công nghệ gen

K thu t gen ho c công ngh gen (genetic engineering, genetic technology) là công ngh c t lõi c a công ngh sinh h c hi n i ư c ra i k t năm 1977. Công ngh gen bao g m các k thu t th c hi n trên axit nucleic, nh m nghiên c u c u trúc c a gen, i u ch nh và bi n i gen, tách, t ng h p và chuy n các gen mong mu n vào các t bào sinh v t ch m i t o ra các cơ th m i, sinh v t m i mang c tính m i. Các k thu t ch y u c a công ngh gen là : K thu t tách chi t gen, nhân dòng gen, xác nh trình t gen, thi t k các vectơ chuy n gen, chuy n n p gen, theo dõi ho t ng và bi u hi n gen cơ th nh n. Công ngh gen m ra m t giai o n m i, cho phép chúng ta: - N m ư c c u trúc b genom c a cơ th th c v t gi ng cây tr ng v i s lư ng gen c th , trình t nucleotit c a gen, ch c năng c a gen. ây là n n t ng quan tr ng cho công tác gi ng cây tr ng v t nuôi, cho phép nh hư ng c th các chương trình t o gi ng. - Cho phép xác nh các gen mong mu n, c tính mong mu n, có th c i ti n chúng, nhân và t ng h p chúng, chuy n n p vào cơ th sinh v t mu n c i t o, t o nên gi ng m i mang c tính m i có nh hư ng, rút ng n th i gian t o gi ng. - Qua các ch th phân t cho phép phát hi n và theo dõi s bi u hi n c a gen, s di truy n c a gen qua các th h , tr giúp c l c, chính xác cho công tác ch n t o gi ng. - Cho phép ánh giá a d ng sinh h c c a th c v t m c phân t , ưa ra ư c cách phân lo i m i, quan h h hàng gi a các cá th nghiên c u. B n ch t k thu t gen là s ghép n i hay bi n i có nh hư ng gen và b gen t o ra các gen và b gen m i, nh m t o protein tái t h p ho c hình thành nên nh ng c i m, tính tr ng m i c a sinh v t theo mong mu n c a con ngư i. I. M t s y u t c n thi t trong k thu t gen 1. Chu n b gen c n tách dòng. Gen c n tách dòng thư ng là nh ng gen mã hoá các protein, enzim ho c gen mã hoá các c i m quý c n thi t cho con ngư i trong th c ti n s n xu t ho c nghiên c u. Gen c n tách dòng còn ư c gói là gen c n thi t, o n xen DNA, DNA insert, nó có th ư c chu n b cách tách chi t t b gen vi sinh v t, ng th c v t và con ngư i ho c t ng h p nhân t o các oligonucleotit. Trong th c t , các gen mang các c i m quý hi m, c n thi t cho con ngư i ch y u ư c tách t b gen vi sinh v t ho c t b gen sinh v t b c cao. 1.1.Tách chi t DNA t ng s Tách chi t DNA b gen có th th c hi n qua các bư c ch y u sau: 1 Mai Văn Thu n – K18 Sinh
- L y m u sinh h c, phá v c u trúc t bào b ng enzim lyzozym ho c x lí m u v i các ch t t y m nh như SDS, EDTA ho c siêu âm, un sôi… - Gây t a protein b ng dung d ch phenol- chlorophor và enzim proteinase K, sau khi li tâm trong ng nghi m hình thành ba l p dung dich: l p d ch phenol dư i áy ng nghi m, l p t a protein n m gi a, trên cùng là d ch l ng ch a DNA. - Hút l p d ch l ng ch a DNA phía trên sang ng s ch, b sung sodium acetate 0,3 M. Thêm 2,5 th tích c n tuy t i -200C gây t a DNA, li tâm thu t a DNA. tinh s ch DNA c n r a t a DNA vài l n b ng c n 700, làm khô và hoà tan - trong dung dich TE ho c nư c kh ion ti p t c nghiên c u. - Ki m tra s ch DNA b ng o quang ph k , xác nh t l OD260/OD280 ho c b ng phương pháp i n di. DNA tinh s ch thu ư c b o qu n -200C, có th gi ư c trong vòng m t vài tháng. 1.2. Tách chi t DNA plasmid. Chu n b d ch nuôi c y vi khu n thích h p. Nuôi vi khu n trên máy l c 200vòng/phút qua êm 370C, li tâm v i t c 5000vòng /phút trong 5-6 phút thu sinh kh i. Phá v t bào, sáu ó x lý natri axetat và li tâm 12000 vòng/phút trong vòng 10 phút. Sau khhi li tâm l p d ch n i phía trên ch a DNA plasmid, thu l p d ch n i và chuy n sang ng khác thêm ethanol 100% l nh k t t a DNA plasmid. Li tâm 14000 vòng trong vòng 10-15 phút, thu t a DNA plasmid hoà trong nư c kh ion ho c dung d ch TE, sau ó ki m tra tinh s ch b ng i n di ho c quang ph k . 1.3. Tách chi t RNA toàn ph n và mRNA * Nguyên t c chung. Phân t RRN không b n d b phân hu b i các enzim ribonuclease và các enzim này thì có m t kh p nơi, có ho t tính r t cao và r t b n v ng v i các tác nhân thư ng dung lo i enzim. Do v y vi c tách chi t RNA òi tránh m i t p nhi m t ribonuclease t môi trư ng, thao tác h i r t t h n t r ng ph i trong i u ki n vô trùng. * Tách RNA toàn ph n. G m ba bư c cơ b n như tách chi t DNA. Bư c 1: T bào và mô ư c nghi n trong dung d ch h n h p ch t t y m nh và tách protein lien k t ra kh i RNA. Bư c 2: Lo i b protein kh i m u qua x lí phenol chlorophorm và li tâm. Bư c 3: T a RNA hoà tan trong pha nư c b ng etanol và li tâm thu nh n l i. 2 Mai Văn Thu n – K18 Sinh
* Tách chi t mRNA. 90 -99% RNA t ng s trong t bào là tRNA, rRNA các lo i RNA này có kích thư c và trình t xác nh nên có th tách riêng b ng i n di và li tâm. Riêng mRNA chi m t 1- 5% có kích thư c và trình t vô cùng a d ng song chúng có m t i m chung là có uôi poliA nh ó có th tách nó riêng ra nh s c kí trên c t OligodT- cellulose. 1.4. Các phương pháp tinh s ch axit nucleic. * Siêu li tâm. Khi siêu li tâm dung d ch thì t mi ng ng n áy ng s hình thành d i gradien n ng , các ch t có kh i lư ng phân t tương ng v i t ng l p . Vì v y có th tách ư c các phân t khác nhau ch m t trên gradient n ng nucleotit. * S c ký. Có th trên gi y, th ch, nh a v i m c ích tách riêng các ch t không l n v i nhau. 1.5. nh lư ng và nh tính axit nucleic 1.5.1. nh lư ng b ng quang ph k - Không th t chính xác nhưng cho phép u c lư ng n ng axit nucleic có trong dung d ch dáp ng ư c nhu c u nghiên c u. - Nguyên t c: D a vào s h p th ánh sang tia t ngo i bư c song 260nm c a quang bư c sóng 260nm c a các m u các bazo purin và pirimidin. Giá tr m t o cho phép xác nh n ng axit nucleic có trong m u d a vào s tương quan sau: M t ơn v 260nm tương ng v i n ng 50µg/ml dung d ch DNA s i kép, tương ng v i 40µg/ml dung d ch DNA s i ơn và RNA. Tuy nhiên cách tính này ch úng v i dung d ch axiy nucleic tinh s ch. ki m tinh s ch c a dung d ch ngư i ta o thêm b ng ơn v OD280, tra ó các protein có m c h p th cao nh t. Nhưng các protein cũng h p th ánh sang 260nm như các axit nucleic và do ó làm sai l ch giá tr th t c a n ng axit nucleic. M t dung dich axit nucleic ư c coi là s ch n u t l OD260/OD280 =1,8- 2. 1.5.2. Phương pháp i n di - Là phương pháp nghiên c u s chuy n ng c a các i n tích trong i n trư ng n nh. - Nguyên t c: D a vào c u trúc c a axit nucleic là các i phân t tích i n âm ng u trên kh p b m t, nên khi ch u tác ng c a m t i n trư ng thì chúng s di chuy n v phía c c dương. Tính linh ng c a phân t trong b n gel dư i tác ng c a iênj trư ng ư c tính b ng công th c LogU = LogU0 – Kr.C. Trong ó LogU là tính linh ng c a phân t trong môi trư ng l ng; Kr là h s làm ch m do 3 Mai Văn Thu n – K18 Sinh
ng th i nó cũng ph thu c vào kh i lư ng phân t c a axit c u trúc c a gen c a gen. Như v y tính linh ng ph thu c vào hai ch tiêu là uclêic; C là n ng kh i lư ng phân t c a axit nucleic và n ng c a gen. 2. Enzim gi i h n. 2.1 Khái ni m. Enzim gi i h n (Restriction Ezyme – RE) là các ezim thu c nhóm endonuclease có kh năng nh n bi t các trình t nucleotit c hi u trên phân t DNA ( kho ng 4-8 nucleotit), c t c hi u phân t DNA nh ng v trí nh t nh thành nh ng o n ng n. Căn c vào kh năng nh n bi t và v trí c t c hi u DNA, ngư i ta chia ezim gi i h n thành ba nhóm Nhóm 1 g m các ezim gi i h n nh n bi t trình t nucleotit, sau ó trư t lên phía trư c c t v trí nh n bi t kho ng 1000- 5000 nucleotit. Nhóm 2 g m các enzim gi i h n nh n bi t các trình t nucleotit c hi u và c t ngay tai v trí nh n bi t, các enzim này có vai trò quan tr ng trong k thu t gen Nhóm 3 g m các enzim gi i h n nh n các trình t nucleotit c hi u và c t cách v trí nhân bi t kho ng 20 nucleotit v phía trư c. Enzim gi i h n không mang tính c hi u loài. 2.2 Tên g i c a enzim gi i h n. Tên g i c a các enzim ư c th ng nh t ký hi u 3 -5 ch cái, kèm theo các s La Mã. Ch cái u tiên vi t hoa ch tên chi c a vi khu n ã tách tri t ư c enzim, hai ch cái ti p theo vi t thư ng ch loài ho c gi ng c a sinh v t ã tách chi t enzim gi i h n, ch cái ti p theo vi t hoa ch tên ch ng vi khu n ã chi t ư c enzim gi i h n. Ví d , EcoRI. 2.3 Các ki u c t c a enzim gi i h n. Tuỳ c i m t ng lo i enzim gi i h n, o n DNA c t có u b ng ho c u so le. - Enzim gi i h n c t c hai m ch DNA cùng m t i m t o các o n c t có u b ng, các o n c t không có kh năng t dính l i v i nhau n i các u b ng c n s d ng enzim n i ligase ho c các adaptor chuyên d ng cho m i lo i enzim. - Các lo i enzim gi i h n nh n bi t và c t phân t DNA các v trí khác nhau gi a hai m ch ơn, t o nên các o n c t có u so le hay u dính. Các u so le này có kh năng t n i l i v i nhau. Enzim c t gi i h n u so le g m có hai lo i: Các enzim c t u so le 5’là enzim gi i h n c t phân t DNA, t o nên m ch ơn 4 Mai Văn Thu n – K18 Sinh
u 5’dài hơn m ch ơn DNA có u 3’. Các enzim c t t o u so le 3’cu i là enzim gi i h n c t phân t DNA, t o nên m ch ơn DNA có u 3’ dài hơn m ch ơn u 5’. 3. Các lo i enzim thư ng s d ng trong k thu t gen. Trong k thu t gen, ngoài các enzim gi i h n còn s d ng nhi u lo i enzim khác nhau, trong ó các lo i enzim xúc tác t ng h p DNA, enzim n i DNA và các enzim th y phân DNA, RNA có vai trò r t quan tr ng. M i lo i enzim có c tính khác nhau, có ho t tính cao trong nh ng i u ki n thích h nh t nh. Do v y tùy theo m c ích c a nghiên c u và i u ki n c th c a phòng thí nghi m l a ch n các lo i enzim thích h p, có hi u qu cao trong nghiên c u. 3.1. Enzim xúc tác t ng h p DNA, RNA. Nhóm này g i chung là DNA polymerase, g m r t nhi u lo i khác nhau có vai trò xúc tác g n các nucleotit m i vào chu i m ch ơn DNA ang t ng h p. 3.2. Enzim n i DNA. Enzim DNA ligase là lo i enzim xúc tác hình thành các liên k t photphoeste n i các o n DNA v i nhau. M i lo i enzim DNA ligase có các tính ch t c trưng riêng, có kh năng n i các o n DNA u b ng ho c u so le. 3.3. Các lo i enzim phân c t axit nucleic. Các lo i enzim c t phân t DNA ho c c t phân t RNA có vai trò quan tr ng trong các k thu t tinh s ch DNA, RNA, trong ph n ng phiên mã ngư c t o cADN. En zim c t g m nhi u lo i khác nhau. 4. Vectơ tách dòng. 4.1. Khái ni m. Vi c chuy n gen t sinh v t này sang sinh v t khác có th th c hi n b ng cách bơm th ng t sinh v t cho sang sinh v t nh n. Song cách này có nhi u h n ch như: + Xâm nh p ư c nhưng ph n l n b h y ch m t s ít do tái t h p g n vào h gen c a t bào ch thì m i cùng t n t i. + Lư ng gen ban u ch có vài b n sao mà tái t h p là ng u nhiên và t n s r t th p, nên khó gen l xen vào t bào ch . Vì v y ph i t o ra lư ng l n các b n sao gen r i m i chuy n thì s có hi u qu cao hơn. Chính v n này g i ra ý tư ng c n s d ng m t phân t DNA nh có kh năng tái b n t n t i c l p trong t bào và mang ư c gen c n chuy n. ó là các vectơ tách dòng. Các vectơ tách dòng ph i có tiêu chu n sau: 5 Mai Văn Thu n – K18 Sinh
+ Có trình t kh i u ori có th t sao chép và t n t i c l p trong t bào. + Có các trình t nh n bi t c a enzim gi i h n, c t phân t và xen gen l vào. + Có trình t i u hòa t o i u ki n cho s phiên mã gen l . + Có gen ánh d u. Các plasmid và các phage áp ng ư c y các tiêu chu n trên. 4.2. Các lo i vectơ tách dòng. Vì các gen c n chuy n r t a d ng v i kích thư c và kh i lư ng khác nhau, nên c n nhi u vectơ tách dòng khác nhau. - Vectơ plasmid ch ti p nh n t 8,9,10 kb DNA, b i v y mu n tách dòng các DNA l n hơn c n có các vectơ khác. - Vectơ phage có th ti p nh n 15-20 kb DNA lai tách dòng - Vectơ Cosmis là vectơ nhân t o ghép n i t m t plasmid v i các trình t cos c a phage λ. Chúng có th ti p nh n DNA lai dài t i 45kb xâm nh p vào vi khu n v i hi u qu r t cao. Trong t bào vi khu n chúng ho t ng như m t plasmid và không phá v t bào vi khu n. - Vectơ virut ng v t mang tính c hi u loài. - Vectơ là các nhi m s c th nhân t o n m men. V i nhu c u tách dòng o n DNA ngày càng l n ngư i ta ã phát hi n nhi u vectơ m i, cho n nay t bào nhân th c ch ư c m t lo i plasmid duy nh tlà plasmid d ng vòng 2µ dài kho ng 2600 c p bazơ có nhi u n m men. S c i ti n plasmid này qua nhi u bư c t o ư c nhi m s c th nhân t o n m men YAC, có th tách dòng o n DNA lai t 150- 1000kb. 5. Vectơ bi u hi n gen. Vectơ bi u hi n gen là nh ng vectơ tách dòng mang các promoter m nh, cho phép bi u hi n ng th i c gen ch th và gen tách dòngt o nên các protein lai. Vectơ bi u hi n m nh là các vectơ có c i m: có kh năng t o s lư ng l n b n sao trong t bào ch ; promoter ho t ng m nh, d ch mã t o nhi u protein lai; o n trình t MCS có nhi u v trí c t c hi u c a nhi u lo i enzim gi i h n; các vectơ v n gi ư c ho t tính khi cài g n gen tách dòng kích thư c l n; ho t ng c a vectơ không gây nh hư ng ho c c ch t bào ch ; gen ch th d dàng nh n bi t. 6. Các h th ng bi u hi n gen. Bi u hi n gen t o s n ph m protein tái t h p là k thu t quan tr ng, quy t nh s thành b i c a k thu t gen. H th ng các t bào ch thư ng ư c s d ng trong 6 Mai Văn Thu n – K18 Sinh
bi u hi n gen g m: t bào vi khu n, t bào n m men, t bào tr ng ng v t có vú và Baculovirus. c trưng riêng, cùng v i nh ng M i lo i h th ng bi u hi n gen có c im thu n l i và h n ch nh t nh. Căn c vào c i m c a gen bi u hi n, b n ch t c a protein tách dòng và protein lai, cũng như i u ki n c th c a t ng phòng thí nghi m l a ch n h th ng bi u hi n gen thích h p. II - Nguyên lý k thu t gen. 1. Các bư c ch y u c a k thu t gen G m các bư c sau: 1.1. Chu n b gen c n tách dòng: ư c tách Gen c n tách dòng g i là gen c n thi t hay o n DNA insert, có th chi t t các sinh v t mang ngu n gen t nhiên ho c t ng h p nhân t o. Hình 1: Sơ các bư c ch y u c a k thu t gen 7 Mai Văn Thu n – K18 Sinh
1.2.T o vectơ tái t h p, g m các bư c sau: Bư c 1. Tách chi t DNA t sinh v t cho và DNA vectơ. Bư c 2. C t c hai lo i DNA trên b ng cùng m t enzim gi i h n, c t DNA m c tiêu và m vòng plasmid. Bư c 3. G n n i DNA m c tiêu và DNA vectơ t o DNA tái t h p hay c u trúc DNA xen vectơ. 1.3. Bi n n p vectơ tái t h p vào t bào ch : S d ng các phương pháp bi n n p khác nhau (s c nhi t, xung i n, b n gen…) ư các vectơ tái t h p vào t bào ch . T o các i u ki n môi trư ng thích h p vectơ tái t h p t n t i và ư c nhân lên cùng t bào ch . 1.4. Sàng l c các dòng t bào mang vectơ tái t h p. Là quá trình ki m tra, ch n l c và tách ri ng các dòng tái t h p có ho t tính. 1.5. Nuôi c y t bào tái t h p thu s n ph m: T bào tái t h p ư c nuôi trong các bình lên men, v i i u ki n thích h p v dinh dư ng, nhi t , pH… các dòng t bào tăng sinh kh i nhanh, t o các s n ph m protein tái t h p m c cao nh t. Th c hi n công ngh tách chi tpotein tái t h p, tinh s ch thu ch ph m. 2. Nguyên t c ch n vectơ tách dòng. - D a vào kích thư c và b n ch t c a DNA c n tách dòng làm căn c ch n vectơ. - Khi ch n vectơ tách dòng c n lưu ý n s tương ng các v trí c t c hi u c a các enzim gi i h n gi a o n cài DNA và vectơ tách dòng. - Vectơ tách dòng ph i thích h p v i lo i t bào ch , có kh năng tái b n trong t bào ch , t o s lư ng b n sao l n, nhưng không gây nh hư ng n t bào ch . - Gen ch th trong vectơ tách dòng càng d nh n bi t càng t t, d dàng ch n l c các vectơ tái t h p. - Vectơ tách dòng ph i có hi u qu tách dòng cao, nghĩa là t o t l vectơ tái t h p cao. 3. Nguyên t c t o vectơ tái t h p. T o vectơ tái t h p là k thu t g n n i gen c n tách dòng vào vectơ tách dòng. T o vectơ tách dòng có th th c hi n qua các bư c ch y u sau: - Chu n b nguyên li u: Gen c n ttách dòng tinh s ch c n ư c nh n b ng PCR, t o m t hàm lư ng c n thi t s n ph m PCR. Vectơ tách dòng thích h p có hàm lư ng l n, ư c m b ng enzyme gi i h n phù h p. - Th c hi ph n ng n i gen c n tách dòng v i vectơ: Chu n b thành ph n ph n ng phù h p v i m i lo i vectơ tách dòng. 8 Mai Văn Thu n – K18 Sinh
160C. Sau ó ti n - H n h p các thành ph n ph n ng ư c qua êm nhi t ki m tra k t qu t o vectơ tái t h p. Vectơ hành i n di v i thang DNA chu n tái t h p ã t o ư c c n gi trong t l nh sâu - 800C n – 850C ti p t c các nghiên c u ti p theo. 4. M t s k thu t bi n n p vectơ tái t h p vào t bào ch Bi n n p vectơ tái t h p và t bào v t ch ư c th c hi n b ng nhi u k thu t khác nhau : b n gen, vi tiêm, xung i n, s c nhi t, s d ng PEG… 4.1. Bi n n p vectơ tái t h p vào t bào E. coli b ng k thu t s c nhi t 4.1.1. Chu n b t bào kh bi n T bào E.coli (LE 392, MC 1061, BL 21…) ư c nuôi c y trên môi trư ng th ch LB (5% cao n m men, 10% trypton, 10% NaCl). L y 1 khu n l c E. coli vào 5ml môi trư ng LB l ng , nuôi 370C, l c v i t c 200 vòng/ phút trong 12- 16 gi i. L y 1ml d ch VK + 99ml môi trư ng LB nuôi l c 2-3 gi , khi OD600 t 0,4 -0,6 l y d ch nuôi c y lên á trong 1,0 - 1,5 gi , sau ó li tâm l nh thu c n t bào t c 4500 - 5000 vòng trong 8-10 phút. Hoà c n t bào trong 100ml CaCl2 100mM l nh, trên khay á 15 phút r i li tâm l nh thu c n t bào. C n t bào hoà trong 40 ml CaCl2 100mM l nh, 1 gi trên á, sau ó li tâm thu c n t bào v i t c trong 4000 vòng trong 10 phút, thêm 500 µl CaCl2 100mM l nh, có ch a 15% glycerol vào c n t bào thu ư c các t bào kh bi n. L y vào m i ng eppendorf 50 µl t bào kh bi n, gi trong t l nh sâu nhi t -750C n -800C th c hi n bi n n p. 4.1.2. K thu t bi n n p L y 50 µl t bào kh bi n ang gi trong ng eppendorf nhi t -750C n- 800C trên á kho ng 15 phút, sau ó thêm 0,5 ng ADN aot nh ng 3-4 l n và trên á kho ng 15-20 phút. L y m u t vào b n nhi t có nhi t 420C trong 2 phút, t nhanh trên á 2 phút. Sau ó thêm kho ng 1000 µl môi trư ng LB l nh, nuôi trong 370C máy l c trong 30-60 phút. L y 100 µl d ch t bào ã s c nhi t, tr i lên h p Petri môi trư ng 50 µg/ml, IPTG và X-gal. h p LB 2% agarose có b sung ampicilin v i n ng petri 370C trong 12- 16 gi , ki m tra các khu n l c phát tri n trên h p petri. Thu nh n khu n tr ng, c y vào trong môi trư ng l ng ki m tra k t qu . Bi n n p E.coli b ng k thu t s c nhi t có hi u qu kho ng 1/10000. sàng l c các t bào mang vectơ tái t h p, chuy n sang ng th ch nghiêng gi ch ng gi ng. 9 Mai Văn Thu n – K18 Sinh
4.2. Bi n n p vectơ tái t h p vào t bào n m men b ng k thu t xung i n 4.2.1. Chu n b t bào C y 1 khu n l c n m men vào 5 ml môi trư ng YPD ( 1% cao n m men, 2% pepton, 2% glucose), nuôi 280C v i t c l c 250 vòng/ phút trong 1 ngày êm. L y 30 µl dung d ch nuooi c y vào 100 ml YPD, l c 16-18 gi , o OD600 xác nh m t t bào (OD =1,3 - 1,5). m u trên á 5-10 phút, li tâm v i t c 4500 - 5000 vòng trong 5 phút, l y c n t bào hoà trong 100ml nư c kh ion l nh, li tâm thu c n t bào. Hoà t bào trong 20 ml sorbitol 1M, li tâm 4500 vòng trong 5 phút thu c n t bào. Hoà c n t bào v i 0,2 ml sorbitol, chia u m i ng eppendorf 50 µl d ch t bào kh bi n gi trong t l nh sâu nhi t -750C n -800C. 4.2.2. K thu t xung i n L y 50 µl d ch t bào kh bi n trong ng eppendorf gi trong t l nh sâu thêm vào 10- 15 µg ADN plasmid tái t h p, tr n u và chuy n vào cuvet xung i n 0,2 cm. Th c hi n xung i n 0,25 µF, 200 , 1,5 kV trong 4-5 ph n nghìn giây. B sung 1 ml sorbitol 1M l nh, o u chuy n sang ng m i, c y lên môi trư ng th ch ĩa ki m tra k t qu bi n n p. Hi u qu bi n n p b ng xung i n tương i cao (kho ng 1%). 5. K thu t ch n l c các dòng t bào tái t h p. Dòng t bào tái t h p ( còn g i là t bào tái t h p) là dòng các t bào mang vectơ tái t h p, ư c nuôi trong môi trư ng thích h p t o thành các khu n l c. Tuỳ theo c i m c a gen ch th có trong vectơ tái t h p , có th l a ch n các t bào tái t h p theo nhi u Phuong pháp khác nhau. Phương pháp ch n l c t bào tái t h p có th s d ng nhi u k thu t khác nhau: S d ng ch th kháng sinh, s d ng ch th màu ho c lai phân t v i m u dò ánh d u phóng x , huỳnh quang… 5.1. Ch n l c dòng t bào tái t h p b ng ch th kháng sinh Ch n l c dòng tái t h p b ng ch th kháng sinh là phương pháp ơn gi n và d s d ng. Do hi u qu bi n n p thư ng r t th p, vì v y ssau khi bi n n p c n ph i ch n l c úng các t bào mang vectơ tái t h p. D a vào gen kháng ch t kháng sinh trong vectơ tái t h p, chu n b môi trư ng dinh dư ngcó b sung các ch t kháng sinh tương ng nuôi c y các t bào sau bi n n p. Trong môi trư ng có ch t kháng sinh, các t bào ch a vectơ tái t h p có gen kháng ch t kháng sinh t n t i và phát tri n ư c, nh ng t bào không có vectơ tái t h p không phát tri n ư c. 10 Mai Văn Thu n – K18 Sinh
5.2. Ch n l c dòng t bào tái t h p b ng gen ch th màu. S d ng gen ch th màu k t h p v i gen ch th kháng sinh là phương pháp ch n l c dòng tái t h p có hi u qu cao. Trong các k thu t sang l c th tái t h p t bào vi khu n, gen LacZ k t h p v i IPTG và X-gal làm gen ch th màu ư c s d ng tương i ph bi n. Gen LacZ là gen ch th có giá tr cao, d nh n bi t dòng tái t h p nh màu s c c a khu n l c, ư c s d ng nhi u trong k thu t gen. 5.3. Ch n l c dòng t bào tái t h p b ng phương pháp lai phân t . Phương pháp lai phân t là m t trong nh ng phương pháp ch n l c dòng tái t chính xác cao. Tuy nhiên k thu t th c hi n tương i ph c t p, t n kém h p có v hoá ch t và òi h i các thi t b chuyên dung. Các bư c th c hi n ch y u g m: - Sau khi bi n n p, các t bào vi khu n (ho c n m men) ư c nuôi c y h p petri, các khu n l c in d u lên màng lai các v trí tương ng. - L y màng lai ã in d u các khu n l c vi khu n sau bi n n p, em lai phân t v i m u dó ánh d u phóng x ( ho c huỳnh quang), m u dò ph i có trình t tương ng v i o n c hi u c a gen tái t h p. - nhi t thích h p t o ph n ng lai. R a màng lai lo i b các m u dò không ư c lai và th c hi n k thu t phóng x t ghi. K t qu hi n hình phóng x cho th y nh ng v trí có ph n ng lai s có các ch m en trên phim nh y phóng x , ho c các v t máu khi hi n hình huỳnh quang. L a ch n các khu n l c các v trí tương ng trong h p Petri thu ư c các dòng tái t h p. III. Các phương pháp tách dòng gen Tách dòng gen (gene cloning), còn ư c g i v i nhi u tên khác nhau: t o dòng gen, nhân dòng gen, phân l p gen…Tách dòng gen là t p h p các k thu t nh m ưa m t gen, m t o n DNA c n thi t (DNA ensert) vào t bào ch (host cell), t o i u ki n tích h p các t bào ch phân chia, t o nên vô s các t bào cùng mang m t o n DNA insert gi ng nhau, t o nên m t dòng t bào tái t h p mang gen c n tách dòng. 1. Tách dòng invitro. Tách dòng in vitro hay tách dòng th c nghi m là tách dòng gen ư c th c hi n t các m u sinh h c (mô t vào, lông tóc, d ch sinh h c…), mang các gen c n tách dòng ho c t ng h p nhân t o o n gen c n tách dòng. 11 Mai Văn Thu n – K18 Sinh
Tách dòng invitro g m phương pháp khác nhau, có th tách dòng t DNA, tách RNA ho c tách dòng trên cơ s dòng t trình t cac acid amin trong chu i polypeptid…. 1.1. Tách dòng gen t DNA: Tách dòng t DNA g m các bư c cơ b n sau: Bư c 1: Chu n b gen c n tách dòng (gen c n thi t, gen ích - target gene) và ch n vectơ tách dòng. - Chu n b gen c n tách dòng: Trong các phòng thí nghi m sinh h c ph n t gen c n tách dòng thư ng ư c tách chi t t các m u sinh h c. Phương pháp này chu n b gen tách dòng b ng t ng h p nhân t o t các oligonucleotid ít ư c s d ng, do k thu t ph c t p, t n kém và chu n xác không cao. Trư ng h p chưa bi t trình t c a gen c n tách dòng, ph i d a vào kích thư c ch n l c o n gen c n tách dòng. Các bư c th c hi n ch c a gen c n tách dòng y u: tách chi t DNA b gen, nhân gen b ng PCR, s d ng enzym gi i h n c t thành các o n DNA nh , i n di trên gel agar (ho c gel polyacrylamid) v i thang DNA i n di, d a vào kích thư c c a gen c n tách dòng chu n. T k t qu l a ch n ư c o n DNA ch a gen c n tách dòng. Hình 2: Sơ k thu t tách dòng th c nghi m 12 Mai Văn Thu n – K18 Sinh
- Ch n vectơ tách dòng. D a vào kích thư c gen c n tách dòng và m c ích tách ch n vectơ tách dòng là plasmid, phage, các nhi m s c th nhân t o… dòng Bư c 2: T o vectơ tái t h p. S d ng các enzym gi i h n thích h p c t các gen c n tách dòng và vectơ tách dòng nh ng v trí c hi u gi ng nhau, t o i u ki n thu n l i cho quá trình tái t h p gi a vectơ tách dòng và các o n DNA inset. S d ng enzym n i DNA ligase g n các gen c n tách dòng vào vectơ có hi u qu , hình thành các vectơ tái t h p (recombinant vectơ). hi u qu t o vectơ tái t h p cao, c n chú ý t l thích h p gi a vectơ tách dòng và các o n DNA insert, ng th i b sung các enzym n i DNA thích h p. Enzym T4DNA ligase xúc tác hình thành các liên k t phosphoeste n i các do n DNA c t u b ng v i nhau, nên ư c s d ng r t r ng rãi trong t o vectơ n i các o n DNA. Bư c 3: Bi n n p vectơ tái t h p vào t bào ch . Bi n n p vectơ tái t h p vào t bào ch (host cell) b ng các phương pháp khác nhau: Siêu âm, vi tiêm, b n gen, s d ng PEG (polyethylen glycol)… V i các t bào ch là vi khu n thư ng s d ng phương pháp bi n n p s c nhi t. Phương pháp s c nhi t có hi u qu cao v i các t bào ch là vi khu n E.coli và m t s loài vi khu n khác. Trư ng h p t bào ch là n m men có th s d ng phương pháp bi n n p là xung i n, bán gen…. Bư c 4: Sàng l c các dòng tái t h p. Sàng long (screeing) các th tái t h p nh m ch n l c các t bào mang vectơ tái t h p trong qu n th . Tuỳ thu c gen ch th (marker) trong các vectơ tái t h p là ch th kháng sinh, ho c ch th màu la ch n phương pháp thích h p. Bư c 5: Nuôi c y dòng tái t h p thu sinh kh i và protein tái t h p. Nuôi c y các dòng tái t h p trong môi trư ng dinh dư ng các i u ki n thích h p, khi m t t 108 - 109 t bào/1ml có th li tâm thu sinh kh i t bào. t bào 1.2. Tách dòng gen t RNA thông tin (mRNA). Tách dòng gen t mRNA là m t quá trình ph c t p, th c hi n theo các bư c sau: Bư c 1: Tách chi t mRNA. RNA thông tin ư c tách chi t theo các protcol thông d ng trong các phòng thí nghi m. Có th s d ng s c kí ái l c v i bi t có mang oligo nucleotid T. Các phân t mRNA có uôi poly A t o liên k t v i oligo - dT, làm cho các phân t mRNA bám trên b m t các viên bi t . S d ng k thu t li tâm 13 Mai Văn Thu n – K18 Sinh
phân o n tách mRNA ra kh i bi t thu mRNA. Có th gi mRNA nhi t - 850C ti p t c nghiên c u. Bư c 2: T ng h p cDNA m ch kép. S d ng k thu t PCR ngư c có s tham gia c a enzym phiên mã ngư c (reverse transcriptase enzyme), enzym DNA polymerase t ng h p cDNA (cDNA complêmntary DNA). Thu phân s i khuôn mRNA b ng enzym RNase H, sau ó b sung enzym DNA polymerase và các t ng h p s i ơn cDNA th hai, t o phân t cDNA m ch kép. dNTP Bư c 3,4,5: G n cDNA m ch kép v i các vectơ tách dòng thích h p, hình thành các vectơ tái t h p. Bi n n p vào t bào ch , sau ó sàng l c các t bào mang vectơ tái t h p và c y truy n vào các ng th ch nghiêng t o nên các dòng khác nhau u c tách dòng t mRNA. Hình 3: Tách dòng gen t mRNA 2. Tách dòng in sillico. Tách dòng in silico hay tách dòng o (cloning in silico) là s t ng h p, phân tích các k t qu tách dòng gen in vitro, trên cơ s thông tin t các ngân hàng d li u (STS, EST…) l a ch n m t o n DNA ho c m t gen c n thi t nào ó. K t qu tách dòng in silico cho phép l a ch n phương án thi t k vectơ tái t h p có hi u qu , d toán trư c k t qu tách dòng và hi u qu bi u hi n gen cũng như m c thành công c a th c nghi m. 14 Mai Văn Thu n – K18 Sinh
IV. Ngân hàng b gen (genome bank) 1. Khái ni m ngân hàng b gen. Ngân hàng b gen là t p h p các o n DNA b gen ư c tách dòng trong t bào ch , t o nên các dòng t bào khác nhau, m i dòng mang m t o n DNA khác nhau c a b gen. B gen c a sinh v t b c cao g m các gen phân o n, có các exon xen k intron. Do ó, ngân hàng b gen bao g m các o n DNA có các trình t mang mã di truy n (exon) xen k v i các trình t không mang mã di truy n (intron). M i lo i enzym gi i h n c t c hi u DNA nh ng trình t nh t nh. M t b gen, khi s d ng các lo i enzym gi i h n khác nhau, t o nên s lư ng o n c t khác nhau, s hình thành nên các ngân hàng b gen khác nhau. 2. Thi t l p ngân hàng b gen. Thi t l p ngân hàng b gen có th th c hi n các m c khác nhau: ngân hàng gen c a m t nhi m s c th , m t t bào hay m t loài. Thi t l p ngân hàng b gen có th th c hi n theo các bư c cơ b n sau: Tách chi t và tinh s ch DNA b gen, s d ng m t ho c m t s lo i enzym gi i h n c t DNA b gen thành t ng o n có kích thư c nh theo ý mu n. Tách riêng t ng o n DNA và g n v i m t vectơ tách dòng t o nên các vectơ tái t h p, m i vectơ tái t h p ư c chuy n vào m t t bào ch t o nên m t dòng. Hình 4: Sơ thi t l p ngân hàng b gen 15 Mai Văn Thu n – K18 Sinh
V. Ngân hàng cDNA Tách chi t và tinh s ch mRNA c a t bào, mô t ng th i i m nh t nh thu ư c s lo i mRNA tương ng v i s gen ang ho t ng trong t bào. S d ng k thu t phiên mã ngư c t mRNA t o nên các cDNA tương t ng, m i cDNA ư c g n vào m t vectơ tách dòng, t o nên các còng cDNA khác nhau. T p h p t t c các mRNA thu u c t m t lo i t bào, các giai o n phát tri n khác nhau t o nên t p h p cDNA ư c tách dòng g i là ngân hàng cDNA c a m t t bào. 1. K thu t phiên mã ngư c t o cDNA. 1.1 Phiên mã ngư c b ng phân hu hoàn toàn s i khuôn mRNA S d ng k thu t PCR v i các m i c hi u có uôi oligo - dT, các lo i nucleotid t do và enzym DNA polymerase, t s i khuôn mRNA t ng h p s i ơn cDNA có c u trúc k p tóc (hairpin loop) u cu i ( u 3'). S d ng enzym RNase H phân hu hoàn toàn s i khuôn mRMA, ng th i b sung enzym DNA polymerase và các nucleotid t do t ng h p s i ơn cDNA th 2, nh kéo dài c u trúc k p tóc (c u trúc vòng). X lý enzym S1 nuclease c tb o n c u trúc k p tóc, t o nên phân t cDNA có c u trúc xo n kép, mang mã di truy n tương ng v i gen mã hoá mRNA. Hình 5: Sơ ò t o cDNA theo cách phân hu hoàn toàn mRNA 1.2. Phiên mã ngư c t o cDNA theo k thu t RACE K thu t RACE g m các bư c tương t như tách dòng t mRNA. 16 Mai Văn Thu n – K18 Sinh
Sau khi t ng h p ư c cDNA m ch ơn, thu phân toàn b phân t mRNA b ng RNase H. Th c hi n k thu t n i thêm uôi poly C (CCCC) vào u 3' c a cDNA nh enzym terminal transferase và ATP. B sung thêm các m i oligo dG (GGGG), dNTP, enzym DNA polymerase và th c hi n nhân gen PCR t ng h p m ch cDNA th hai. Hình 6: S d ng k thu t RACE tách dòng gen t mRNA 2. Thi t l p ngân hàng cDNA Ngân hàng cDNA có th xây d ng trên m t nhi m s c th , m t cơ quan ho c toàn b cơ th . T m i phân t mRNA thu ư c, th c hi n phiên mã ngư c t o nên m t cDNA m ch kép. M i phân t cDNA m ch kép ư c g n vào m t vectơ tách dòng và chuy n vào m t t bào ch o nên các dòng cDNA. 17 Mai Văn Thu n – K18 Sinh