Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu tác động dược lý hướng bảo vệ gan, thận của Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack., Rubiaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

MAI NGUYỄN NGỌC TRÁC

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG DƯỢC LÝ HƯỚNG BẢO VỆ GAN, THẬN CỦA BÍ KỲ NAM (Hydnophytum formicarum Jack., Rubiaceae)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH, Năm 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

MAI NGUYỄN NGỌC TRÁC

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG DƯỢC LÝ HƯỚNG BẢO VỆ GAN, THẬN CỦA BÍ KỲ NAM (Hydnophytum formicarum Jack., Rubiaceae)

NGÀNH: DƯỢC LÝ – DƯỢC LÂM SÀNG

MÃ SỐ: 62720405

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS. TS. ĐỖ THỊ HỒNG TƯƠI

2. PGS. TS. NGUYỄN PHƯƠNG DUNG

TP. HỒ CHÍ MINH, Năm 2020

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................... ii

DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ iii

DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................... iv

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ......................................................................................... v

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 1

1.1. BÍ KỲ NAM.......................................................................................................... 1

1.2. STRESS OXY HÓA ........................................................................................... 10

1.3. GAN VÀ TRESS OXY HÓA ............................................................................. 20

1.4. THẬN VÀ STRESS OXY HÓA ........................................................................ 23

1.5. CÁC MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG BẢO VỆ GAN .......................... 26

1.6. CÁC MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG BẢO VỆ THẬN ........................ 35

1.7. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ ................................................................... 41

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 45

2.1. THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU ................................................................................. 45

2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................ 46

2.3. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ..................................................... 46

2.4. DUNG MÔI , HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ ....................... 47

2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................... 50

2.6. PHÂN TÍCH KẾT QUẢ VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU THỐNG KÊ ............................. 69

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ .......................................................................................... 70

3.1. ĐỊNH DANH LOÀI BÍ KỲ NAM ...................................................................... 70

3.2. CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC CÁC CAO TOÀN PHẦN BÍ KỲ NAM .......... 76

3.3. CHIẾT XUẤT VÀ KHẢO SÁT CHẤT LƯỢNG CAO CỒN 50% .................... 80

3.4. CÁC CAO PHÂN ĐOẠN VÀ HOẠT TÍNH CAO PHÂN ĐOẠN .................... 82

3.5. ĐỘC TÍNH CẤP ĐƯỜNG UỐNG CỦA CAO CỒN 50% ................................ 84

3.6. TÁC ĐỘNG BẢO VỆ GAN CỦA BÍ KỲ NAM ................................................ 85

3.7. TÁC ĐỘNG BẢO VỆ THẬN CỦA BÍ KỲ NAM .............................................. 98

3.8. ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN ĐƯỜNG UỐNG CỦA CAO CỒN 50% BÍ

KỲ NAM .......................................................................................................... 111

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ...................................................................................... 117

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................. 148

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào.

Tác giả luận án

Mai Nguyễn Ngọc Trác

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ

ANH – VIỆT

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

ADH Alcohol dehydrogenase Dehydrogenase rượu

Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic AND

Acute intersititial nephritis Viêm ống thận mô kẽ cấp AIN

Acute kidney injury Tổn thương thận cấp AKI

Alcoholic liver disease Bệnh gan do rượu ALD

ALDH Aldehyde dehydrogenase Aldehyd dehydrogenase

Alanine aminotransferase Alanin aminotransferase ALT

Acridine orange Acridin cam AO

Antioxidant response element Yếu tố đáp ứng chống oxy hóa ARE

Acute renal failure Suy thận cấp ARF

Ribonucleic acid Acid ribonucleic ARN

Aspartate aminotransferase Aspartat aminotransferase AST

Acute tubular necrosis Hoại tử ống thận cấp ATN

Bovine Serum Abumin Albumin huyết thanh bò BSA

Catalase Catalase CAT

Carbon tetrachloride Cacbon tetraclorua CCl4

Chronic kidney disease Bệnh thận mãn CKD

Cytochrome Cytochrom CYP

DAMPS Damage-associated molecular patterns Thành phần phân tử đi kèm tổn

thương

DCM Dichloromethane Dichloromethan

DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxit

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH

5,5’-Dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) Acid 5,5’-dithio-bis-(2- DTNB

nitrobenzoic)

EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Acid Acid Ethylen Diamin Tetracetic

EGCG Epigallocatechin gallate Epigallocatechin gallat

EMEM Eagle's Minimum Essential Medium Môi trường thiết yếu tối thiểu của

Eagle

EPO Erythropoietin Erythropoietin

ERA-EDTA European Renal Association - Tổ chức cấy ghép, lọc thận – Hiệp

European Dialysis and Transplant hội thận Châu Âu

Association

ERK Extracellular signal-regulated kinase Kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào

EtOAc Ethyl acetate Ethyl acetat

Glutathione peroxidase Glutathion peroxidase GPx

Glutathione Glutathion GSH

Gamma-glutamyl transpeptidase Gamma-glutamyl transpeptidase GGT

Hemoglobin Hemoglobin Hb

Hepatocellular carcinoma Ung thư biểu mô tế bào gan HCC

Hematoxylin Eosin Hematoxylin Eosin HE

Heme oxygenase-1 Heme oxygenase-1 HO-1

Hepatic sinusoidal obstruction Hội chứng tắc nghẽn xoang gan HSOS

syndrome

Hoạt tính chống oxy hóa HTCO

Interleukin Interleukin IL

Inducible nitric oxide synthase Cảm ứng tổng hợp nitric oxid iNOS

Intraperitoneal injection Tiêm phúc mô I.P.

International Society of Nephrology Hiệp hội thận quốc tế ISN

Keap1 Kelch-like ECH-associated protein 1 Protein liên kết với ECH giống như

Kelch 1

Lactate dehydrogenase Lactat dehydrogenase LDH

Mitogen-activated protein kinase Protein kinase hoạt hóa phân bào MAPK

Malondialdehyde Malondialdehyd MDA

MTT 3-(4,5-Dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5- 3-(4,5-Dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-

Diphenyltetrazolium bromide Diphenyltetrazolium bromid)

NAC N-acetyl cysteine N-acetyl cystein

NAFLD Non-alcoholic fatty liver disease Bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu

NADH Nicotinamide adenine dinucleotide Nicotinamid adenin dinucleotid

NALFD Nonalcoholic fatty liver disease Bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu

NAPQ1 N-acetyl-p-benzoquinone imine N-acetyl-p-benzoquinon imin

Nuclear Factor-kappa B Yếu tố nhân kappa B NF-κB

Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân NMR

NAD(P)H-quinone oxidoreductase 1 NAD(P)H-quinon NOQ1

oxidoreductase 1

Nrf2 Nuclear erythroid 2-related factor Yếu tố liên quan nhân erythroid 2

NSAID Non-steroidal anti-inflammatory drug Thuốc kháng viêm không steroid

Optical Density Mật độ quang OD

Per os Đường uống P.O.

Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR

Polyethylene glycol Polyethylen glycol PEG

Polyvinylidene difluoride Polyvinyliden difluorid PVDF

Ribulose-1,5-biphosphate carboxylate Gen ribulose-1,5- biphosphat rbcL

carboxylat

Reactive nitrogen species Các gốc chứa ni tơ hoạt động RNS

Reactive oxygen species Các gốc chứa oxy hoạt động ROS

Dưới da Subcutaneous S.C.

Superoxid Superoxide SOD

Thioacetamid Thioacetamide TAA

Transforming growth factor Yếu tố tăng trưởng TGF

5'- Thio - 2-nitrobenzoic acid Acid 5'- Thio - 2-nitrobenzoic TNB

Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u TNF-α

World Health Organisation Tổ chức Y tế Thế giới WHO

iii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các nguyên tố vô cơ có trong Bí kỳ nam .................................................... 4

Bảng 1.2 Hoạt tính kháng khuẩn của Bí kỳ nam ........................................................ 7

Bảng 1.3 Một số mô hình in vitro gây tổn thương gan bởi CCl4 tế bào HepG2 ....... 28

Bảng 1.4 So sánh các mô hình đánh giá tác động bảo vệ gan .................................. 29

Bảng 1.5 Một số mô hình in vivo gây tổn thương gan bởi CCl4 ............................... 32

Bảng 1.6 Một số nghiên cứu trên mô hình in vitro gây độc tế bào thận ................... 36

Bảng 1.7 Một số nghiên cứu trên mô hình in vivo gây độc thận .............................. 40

Bảng 2.1 Danh mục dung môi, hóa chất đã sử dụng trong nghiên cứu .................... 47

Bảng 2.2 Danh mục thiết bị đã sử dụng trong nghiên cứu ........................................ 49

Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi rbcL sử dụng trong phản ứng PCR ................................ 73

Bảng 3.2 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học dược liệu Bí kỳ nam ........... 74

Bảng 3.3 Độ ẩm và độ tro của dược liệu Bí kỳ nam ................................................. 75

Bảng 3.4 Hàm lượng polyphenol toàn phần của dược liệu Bí kỳ nam ..................... 76

Bảng 3.5 Phương trình tuyến tính, IC50 của các cao Bí kỳ nam (DPPH) ................. 77

Bảng 3.6 Phương trình tuyến tính, IC50 của các cao Bí kỳ nam (MDA) .................. 77

Bảng 3.7 Hoạt tính của cao Bí kỳ nam đối với sự tăng trưởng các dòng tế bào ....... 78

Bảng 3.8 Giá trị hồi quy đa thức và IC50 các cao toàn phần Bí kỳ nam .................... 80

Bảng 3.9 Độ ẩm và độ tro của cao cồn 50% từ thân củ Bí kỳ nam .......................... 81

Bảng 3.10 Giá trị IC50 của các cao phân đoạn Bí kỳ nam (DPPH) ........................... 82

Bảng 3.11 Giá trị IC50 của các cao phân đoạn Bí kỳ nam (MDA)............................ 82

Bảng 3.12 Tác động của Bí kỳ nam lên sự tăng trưởng của tế bào gan HepG2 ....... 85

Bảng 3.13 Tác động của Bí kỳ nam phòng ngừa ức chế tăng trưởng tế bào gan HepG2

do CCl4 gây ra ..................................................................................................... 85

Bảng 3.14 Tác động của Bí kỳ nam phòng ngừa tình trạng hoại tử tế bào gan HepG2

do CCl4 gây ra ..................................................................................................... 89

Bảng 3.15 Trọng lượng chuột trong khảo sát tác động bảo vệ gan của Bí kỳ nam .. 91

Bảng 3.16 Hoạt tính TNF-α trong khảo sát tác động bảo vệ gan của Bí kỳ nam ..... 93

Bảng 3.17 Kết quả vi thể gan chuột trong thử nghiệm bảo vệ gan của Bí kỳ nam ... 96

iii

Bảng 3.18 Tác động của cisplatin ở các nồng độ và thời gian xử lý khác nhau lên tế

bào HEK 293 nuôi cấy ở các mật độ khác nhau ................................................. 98

Bảng 3.19 Tác động của cisplatin 25 µM sau 24 giờ xử lý lên tế bào HEK 293.... 100

Bảng 3.20 Tác động của Bí kỳ nam lên sự tăng trưởng của tế bào HEK 293 ........ 101

Bảng 3.21 Tác động phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng tế bào thận HEK 293 do

cisplatin gây ra .................................................................................................. 102

Bảng 3.22 Tác động của Bí kỳ nam phòng ngừa hoại tử tế bào thận HEK 293 do

cisplatin gây ra .................................................................................................. 104

Bảng 3.23 Trọng lượng cơ thể chuột trong tác động bảo vệ thận của Bí kỳ nam .. 106

Bảng 3.24 Nồng độ ure và creatinin máu trong khảo sát tác động bảo vệ thận của Bí

kỳ nam .............................................................................................................. 107

Bảng 3.25 Hàm lượng GSH thận trong khảo sát tác động bảo vệ thận in vivo ...... 110

Bảng 3.26 Vi thể thận chuột trong khảo sát tác động bảo vệ thận của Bí kỳ nam . 111

Bảng 3.27 Trọng lượng chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn ............ 112

Bảng 3.28 Tác động của cao cồn 50% Bí kỳ nam lên các chỉ số hồng cầu trong thử

nghiệm độc tính bán trường diễn ...................................................................... 113

Bảng 3.29 Tác động của cao cồn 50% Bí kỳ nam lên các chỉ số bạch cầu trong thử

nghiệm độc tính bán trường diễn ...................................................................... 114

Bảng 3.30 Tác động của cao cồn 50% Bí kỳ nam lên các chỉ số tiểu cầu trong thử

nghiệm độc tính bán trường diễn ...................................................................... 114

Bảng 3.31 Tác động của cao cồn 50% Bí kỳ nam lên các chỉ số chức năng gan và thận

trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn ...................................................... 115

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Các chi Tổ kiến thuộc họ Rubiaceae ............................................................ 1

Hình 1.2 Vị trí phân loại của Bí kỳ nam ..................................................................... 2

Hình 1.3. Bí kỳ nam (H. formicarum) ......................................................................... 3

Hình 1.4. Bí kỳ nam (H. formicarum Jack.) và Kỳ nam gai (M. tuberosa) ............... 3

Hình 1.5. Một số hợp chất phân lập từ Bí kỳ nam ...................................................... 5

Hình 1.6 Stress oxy hóa ............................................................................................ 14

Hình 1.7 Mối tương quan giữa stress oxy hóa và viêm ............................................ 17

Hình 1.8. Cấu trúc vùng của Keap1 .......................................................................... 18

Hình 1.9. Cấu trúc vùng của Nrf2 ............................................................................. 18

Hình 1.10 Vai trò của Nrf2 trong cơ chế điều hòa stress oxy hóa ............................ 19

Hình 1.11 Cấu tạo gan ............................................................................................... 20

Hình 1.12 Cấu trúc thận và nephron ......................................................................... 23

Hình 1.13 Stress oxy hóa và viêm trong cơ chế tổn thương gan do CCl4 ................ 32

Hình 1.14 Tế bào HEK 293 nhuộm miễn dịch huỳnh quang và trong môi trường . 37

Hình 1.15 Stress oxy hóa và viêm trong tổn thương thận do cisplatin ..................... 38

Hình 2.1 Sơ đồ tiến hành nghiên cứu ........................................................................ 45

Hình 3.1 Bí kỳ nam .................................................................................................. 70

Hình 3.2 Cấu tạo giải phẫu rễ Bí kỳ nam .................................................................. 71

Hình 3.3 Cấu tạo giải phẫu thân Bí kỳ nam .............................................................. 72

Hình 3.4 Cấu tạo giải phẫu lá Bí kỳ nam .................................................................. 72

Hình 3.5 Bột thân củ Bí kỳ nam ................................................................................ 73

Hình 3.6 Kết quả điện di ADN mẫu lá tươi Bí kỳ nam và sản phẩm PCR ............... 73

Hình 3.7 Kết quả định tính polyphenol dược liệu Bí kỳ nam ................................... 75

Hình 3.8 Các cao toàn phần từ thân củ Bí kỳ nam .................................................... 76

Hình 3.9 Cao cồn 50% từ thân củ Bí kỳ nam............................................................ 81

Hình 3.10 Cấu trúc của hợp chất BK1 (a) và BK2 (b) .............................................. 84

Hình 3.11 Tế bào HepG2 sau 24 giờ xử lý ............................................................... 87

Hình 3.12 Tác động phòng ngừa tăng sinh gốc tự do tế bào gan HepG2 gây ra bởi CCl4 của các mẫu thử Bí kỳ nam ........................................................................ 88

Hình 3.13 Tác động của Bí kỳ nam kích hoạt protein Nrf2 ở tế bào HepG2 ........... 90

Hình 3.14 Hoạt tính AST, ALT trong tác động bảo vệ gan của Bí kỳ nam.............. 92

Hình 3.15 Hoạt tính LDH trong khảo sát tác động bảo vệ gan của Bí kỳ nam ........ 93

Hình 3.16 Hàm lượng GSH gan trong khảo sát tác động bảo vệ gan in vivo của Bí kỳ nam do CCl4 gây ra ............................................................................................. 95

Hình 3.17 Hàm lượng MDA gan trong khảo sát tác động bảo vệ gan in vivo của Bí kỳ nam do CCl4 gây ra ........................................................................................ 95

Hình 3.18 Đại thể gan chuột trong khảo sát tác động bảo vệ gan của Bí kỳ nam .... 96

Hình 3.19 Vi thể mô gan trong khảo sát tác động bảo vệ gan Bí kỳ nam (40X) ...... 97

Hình 3.20 Tỷ lệ ức chế tế bào HEK 293 ở các nồng độ cisplatin, thời gian nuôi cấy và mật độ tế bào khác nhau .............................................................................. 100

Hình 3.21 Tế bào HEK 239 sinh lý và sau 24 giờ xử lý với cisplatin 25 µM ........ 101

Hình 3.22 Tế bào HEK 293 sau 24 giờ xử lý .......................................................... 103

Hình 3.23 Tác động của Bí kỳ nam phòng ngừa tăng sinh gốc tự do của tế bào thận HEK 293 do cisplatin gây ra ............................................................................ 105

Hình 3.24 Tác động của Bí kỳ nam kích hoạt protein Nrf2 ở tế bào HEK 293 ...... 105

Hình 3.25 Nồng độ LDH trong khảo sát tác động bảo vệ thận của Bí kỳ nam ...... 108

Hình 3.26 Hoạt tính TNF-α trong khảo sát tác động bảo vệ thận của Bí kỳ nam... 108

Hình 3.27 Đại thể thận chuột trong khảo sát tác động bảo vệ thận của Bí kỳ nam 110

Hình 3.28 Vi thể thận chuột trong khảo sát tác động bảo vệ thận Bí kỳ nam ........ 111

Hình 3.29 Hình ảnh gan và thận chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn của Bí kỳ nam .......................................................................................................... 112

Hình 3.30 Hình ảnh vi thể gan chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn . 116

Hình 3.31 Hình ảnh vi thể thận trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn của cao cồn 50% Bí kỳ nam .......................................................................................... 116

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Quy trình chiết xuất các cao phân đoạn Bí kỳ nam .................................. 57

Sơ đồ 2.2. Quy trình phân lập chất từ cao phân đoạn Bí kỳ nam ............................. 58

MỞ ĐẦU

Gan và thận đóng vai trò quan trọng trong các quá trình chuyển hóa và bài tiết

của cơ thể. Do là cửa ngõ tiếp xúc đồng thời là nơi chuyển hóa, bài tiết các chất nên

gan và thận cũng là hai cơ quan chịu sự ảnh hưởng của nhiều tác nhân gây tổn thương.

Các bệnh về gan và thận chiếm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong lớn trên thế giới. Theo báo

cáo về gánh nặng bệnh tật thế giới năm 2019, bệnh gan chiếm khoảng 2 triệu ca tử

vong mỗi năm [32]. Trong khi đó, theo báo cáo năm 2018 của Hiệp hội thận quốc tế

(International Society of Nephrology, ISN) và Tổ chức cấy ghép, lọc thận – Hiệp hội

thận Châu Âu (European Renal Association - European Dialysis and Transplant

Association, ERA - EDTA), ước tính khoảng 850 triệu người trên toàn thế giới mắc

các bệnh về thận [323], con số này gần gấp đôi số người mắc bệnh đái tháo đường

(422 triệu, [234]) và gấp 20 lần số người nhiễm HIV/AIDS (37,9 triệu [327]).

Stress oxy hóa đã được chứng minh là một trong các cơ chế chính dẫn đến tổn

thương gan, thận cấp và mạn tính [20], [131], [205]. Nhiều hợp chất polyphenol từ

dược liệu với tiềm năng chống oxy hóa tốt đã chứng minh tác động bảo vệ gan như

silymarin từ cây Kế sữa (Silybum marianum L.) [290], curcumin từ Nghệ (Curcuma

longa) [102], andrographolid và neoandrographolid từ Xuyên tâm liên (Andrographis

paniculata (Burm.f.) Nees), phyllanthin và glycyrrhizin từ Diệp hạ châu (Phyllanthus

niruri L.) [185]; bảo vệ thận như ginsenoside Rb3 từ lá Sâm (Panax quonthefolius)

[306]; ginsenoside Rh4 và Rk3 từ Nhân sâm (Panax ginseng) [34], hesperidin trong

trái cây họ Cam quýt [240]; isoliquiritigenin từ loài Glycyrrhiza [151]...

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ước tính khoảng 60 – 90% dân số các nước

đang phát triển sử dụng y học cổ truyền để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban

đầu [300]. Xu hướng sử dụng y học cổ truyền trong hỗ trợ và điều trị bệnh thúc đẩy

các nhà khoa học tiến hành nhiều nghiên cứu trên các loại dược liệu và hợp chất chiết

xuất thiên nhiên với các hoạt tính sinh học tiềm năng khác nhau.

Với khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có nguồn dược liệu phong phú và đa

dạng, có bề dày kinh nghiệm trong việc sử dụng cây thuốc để chữa bệnh, đây là kho

tàng giúp phát triển nghiên cứu tạo ra các sản phẩm từ thiên nhiên phục vụ công tác

chăm sóc sức khỏe và phát triển kinh tế. Một trong những loài dược liệu quý ở Việt

Nam đã được biết đến là Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack.), một loài thuộc

nhóm cây “Tổ kiến” (ant-plants), họ Cà phê (Rubiaceae). Một vài loài cây Tổ kiến có

giá trị chữa bệnh như H. formicarum Jack., Myrmecodia pendens, M. tuberosa Jack. [123],

[165]. Bí kỳ nam (H. formicarum) thuộc chi Hydnophytum thường phân bố các nước

châu Á như Indonesia, Thái Lan, Malaysia, Việt Nam. Một số nghiên cứu bước đầu

cho thấy loài cây này có các thành phần polyphenol, có tác dụng chống oxy hóa in

vitro [223], kháng khuẩn [222], ức chế α-glucosidase [84], ức chế sự tăng trưởng của

tế bào u xơ HT1080 [285], tế bào ung thư cổ tử cung Hela [248] và bảo vệ tế bào thần

kinh [97]. Tại Việt Nam, Bí kỳ nam được tìm thấy ở Vườn quốc gia Phú Quốc, một

trong những trung tâm đa dạng sinh học của cả nước. Đây là nơi có hệ động thực vật

phong phú và chứa nhiều nguồn gen quý hiếm cần lưu trữ, phát triển và bảo tồn [10].

Từ xa xưa, dân gian Việt Nam đã dùng Bí kỳ nam chữa viêm gan, vàng da,

đau nhức gân xương, bong gân, thấp khớp, đau bụng, tiêu chảy… bằng cách sắc hoặc

nấu cao uống [5]. Tuy nhiên, đến nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về tác động dược

lý cũng như tính an toàn của dược liệu này. Với mong muốn nghiên cứu một cách

khoa học công dụng dân gian, các tác dụng dược lý cũng như tính an toàn của dược

liệu từ đó góp phần tạo cơ sở cho việc bảo tồn, phát triển, sản xuất sản phẩm thiên

nhiên có chất lượng và gia tăng giá trị sử dụng của Bí kỳ nam, “Nghiên cứu tác động

dược lý hướng bảo vệ gan, thận của Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack.,

Rubiaceae)” được thực hiện với các nội dung cụ thể:

1. Phân tích thực vật và định danh loài Bí kỳ nam thu hái tại Vườn quốc gia Phú Quốc,

tỉnh Kiên Giang.

2. Chiết xuất và sàng lọc các cao toàn phần Bí kỳ nam. Lựa chọn và khảo sát chất lượng

3. Khảo sát các tác dụng dược lý in vitro và in vivo theo hướng bảo vệ gan, thận của Bí

cao chiết. Chiết xuất các cao phân đoạn từ cao toàn phần và phân lập chất.

kỳ nam.

4. Khảo sát độc tính cấp và độc tính bán trường diễn đường uống của cao Bí kỳ nam.

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. BÍ KỲ NAM

1.1.1. Vị trí phân loại

Bí kỳ nam có tên khoa học Hydnophytum formicarum Jack. là một loài thuộc

chi Hydnophytum, thuộc nhóm cây ‘Tổ kiến’ (ant-plants), họ Cà phê (Rubiaceae).

Tên gọi ‘Tổ kiến’ tượng trưng cho nhóm thực vật sống phụ sinh trên các loài cây cổ

thụ, có thân phình to tạo các khoang chằng chịt, là nơi cộng sinh của các loài kiến.

Các cây ‘Tổ kiến’ cung cấp môi trường sống, chất dinh dưỡng cho kiến; đổi lại, kiến

cung cấp chất dinh dưỡng cho cây bằng cách để lại chất thải trong các đường hầm

bên trong tổ. Sự cộng sinh này cũng cho phép thực vật thu thập các chất dinh dưỡng

hiệu quả từ một diện tích lớn hơn nhiều so với rễ cây có thể che phủ [82].

Hydnophytum là chi lớn nhất trong năm chi của nhóm cây Tổ kiến, bốn chi còn lại

là Anthorrhiza, Myrmecodia, Myrmephytum và Squamellaria (Hình 1.1) [126].

Hình 1.1 Các chi Tổ kiến thuộc họ Rubiaceae

“Nguồn: Jebb và Huxley, 2009” [126]

Trong các chi của cây Tổ kiến, chi lớn nhất được biết đến là Hydnophytum gồm

94 loài, có phân bố rộng nhất, kéo dài từ quần đảo Andaman, Nam Thái Lan, Myanmar,

Campuchia, Việt Nam, Malaysia, Indonesia, Philippines, Papua và các đảo, quần đảo

Solomon, Vanuatu, Fiji và Peninsula ở Úc. Người dân Sumatra gọi những cây Tổ kiến

là rumah semut; ở Jawa: ulek-ulek polo; Papua: Lokon; Malaysia: periok hantu; Thái

Lan: Hua roi roo và Việt Nam: Bí kỳ nam, Kì nam kiến [114].

Ở Việt Nam, Bí kỳ nam thường phân bố ở các tỉnh: Kontum, Gia Lai, Đắk Lắk,

Đồng Nai, Lâm Đồng, Quảng Ngãi, Bà Rịa - Vũng Tàu, Vườn quốc gia Bù Gia Mập,

Bình Phước, Vườn quốc gia Phú Quốc (Kiên Giang).

Vị trí phân loại của Bí kỳ nam:

Giới thực vật

Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)

Phân lớp Hoa môi (Lamiidae)

Bộ Long Đởm (Gentianales)

Họ Cà Phê (Rubiaceae)

Chi Hydnophytum

Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack.)

Hình 1.2 Vị trí phân loại của Bí kỳ nam

“Nguồn: Jebb và Huxley, 2009” [126]

1.1.2. Đặc điểm thực vật

Bí kỳ nam có thân nhỏ, sống phụ sinh bám trên cành cây gỗ cao. Thân phình

thành củ lớn, dày và to đến 30 cm, mặt ngoài sần sùi, màu nâu xám bên trong có

những lỗ hổng chằng chịt do kiến sống cộng sinh hình thành nhiều lỗ như tổ ong

(Hình 1.3a). Từ thân củ mọc ra những rễ nhỏ phía dưới và một vài cành mang lá ở

phía trên. Cành ngắn mập, màu nâu. Lá mọc đối, phiến dày, dai, mép nguyên, gốc

thuôn, đầu tù, hai mặt có màu lục nhạt, mặt trên nhẵn bóng, hình bầu dục hoặc hình

trái xoan dài 6 - 10 cm, rộng 2,5 - 6 cm, gân bên 8 - 10 đôi, lá kèm rụng sớm. Hoa

không cuống, tập hợp 4 - 5 cái ở nách lá, màu trắng, đài có ống hình trụ - trứng, cụt

ở đầu; tràng 4 cánh thuôn nhọn, dài bằng nửa ống tràng, có 4 túm lông ở họng, nhị 4,

đính ở đáy ống tràng, chỉ nhị rất ngắn, bầu 2 ô, đầu nhị xẻ đôi. Hoa mẫu 4. Quả hạch

nhỏ, hình thuôn, khi chín màu da cam hay đỏ, bóng, chứa hai hạt, dài 1 - 1,5 cm (Hình

1.3b). Bí kỳ nam (H. formicarum) thường dễ nhầm lẫn với Kỳ nam gai (M. tuberosa)

thuộc chi Myrmecodia. với thân củ có gai xếp thành hàng, cành mọc dài và lá to hơn

(Hình 1.4) [123].

a Hình 1.3. Bí kỳ nam (H. formicarum)

(a) Bí kỳ nam bổ đôi (b) Hoa và quả Bí kỳ nam “Nguồn: Cactus Jungle, 2020” [322]

Hình 1.4. Bí kỳ nam (H. formicarum Jack.) “Nguồn: Alchetron, 2018” [328] và Kỳ

nam gai (M. tuberosa) “Nguồn: Leonardo, 2011” [329]

1.1.1. Bộ phận dùng

Bộ phận dùng của Bí kỳ nam thường là phần thân củ với những hốc nhỏ do kiến

đục làm tổ. Thân củ Bí kỳ nam được thu hái, thái mỏng, phơi đến gần khô, thì phơi

tiếp trong bóng râm. Khi dùng, đem tẩm qua nước đang sôi, rồi sao vàng.

1.1.2. Tổng quan về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.1.2.1. Nghiên cứu về thành phần hóa thực vật

Thành phần hóa học vô cơ

Nghiên cứu của nhóm tác giả Prachayasittikul (2012) cho thấy dựa trên kết

quả phổ phát xạ nguyên tử plasma cao tầng cảm ứng, trong cao n-hexan, cao ethanol,

cao methanol của Bí kỳ nam có chứa 22 nguyên tố kim loại, trong đó 6 nguyên tố thiết

yếu (Mn, Fe, Ca, Zn, Cr và P) có trong cao n-hexan với nồng độ ở mức ppm. Nguyên tố

trị liệu Li có trong cao cloroform. Một số kim loại nặng như Hg, Pb, Cd được tìm thấy

trong cao cloroform. Đặc biệt các nguyên tố rất quan trọng cho cơ thể K, Ca, Mg, Fe, Zn

cũng được tìm thấy trong Bí kỳ nam [223].

Bảng 1.1 Các nguyên tố vô cơ có trong Bí kỳ nam

Mẫu Nguyên tố

Cao hexan Be Al Ca Cr Mn Fe Zn Ba P

(ppm) 0,15 1,47 0,74 0,23 0,14 0,20 0,05 0,09 7,57

Li Sr Rb Hg Tl In Pb Cd As Cs Cao chloroform

(ppm) 0,34 0,03 8,31 1,18 9,67 9,42 2,59 0,08 4,99 1910,00

Cao methanol Na K Mg Mn Fe

(ppm) 35,6 0,49 0,02 0,19

40,6 Thành phần hóa học hữu cơ

Năm 2008, theo kết quả nghiên cứu của Prachayasittikul và cộng sự [222], 5

hợp chất đầu tiên đã được phân lập gồm: stigmasterol từ cao n-hexan, dicloromethan

và 4 hợp chất phenol từ cao EtOAc: isoliquiritigenin, protocatechualdehyd, butin và

butein (Hình 1.5).

Isoliquiritigenin được tìm thấy lần đầu tiên trong tự nhiên vào năm 1953 từ

Dahlia variabilis (Compositae). Hợp chất này cũng được phân lập từ Glycyrrhiza

glabra (Cam thảo), Sinofranchetia chinensis và Broussonetia paccorifera. Các hoạt

tính sinh học của isoliquiritigenin đã được báo cáo bao gồm tác dụng đối với tim

mạch, chống kết tập tiểu cầu, vận mạch, chống oxy hóa, chống ung thư và khả năng

ức chế yếu tố hoại tử khối u TNF-α [222].

Protocatechualdehyd Isoliquiritigenin Butin

Acid deacetylasperulosidic

Butein Acid asperulosidic

Acid sinapinic β-Sitosterol acetat β-Sitosterol

10-Hydroxyloganin Stigmasterol 6α-Hydroxygeniposide

Hình 1.5. Một số hợp chất phân lập từ Bí kỳ nam

miltiorrhiza, Salvia officinalis và quả của Ganoderma applanatum. Hợp chất này

có các hoạt tính sinh học đa dạng như ức chế tăng trưởng, chống oxy hóa và chống

ung thư, giảm đường huyết và ức chế sao chép HIV-1 trong nhiễm trùng tế bào

cấp tính [222].

Butin đã được phân lập từ hạt của Butea frondosa và được chứng minh có

hoạt tính chống nhiễm trùng. Butin cũng được tìm thấy ở Vernonia antmusintica

Procatechualdehyd được phân lập từ quả của Amomun tsao-ko, rễ của Salvia

Willd và trong thân cây khô của Spatholobus suberectus Dunn., cho thấy hoạt tính

kháng tyrosinase [222].

Butein được phân lập từ Butea frondosa, Viguiera multiflora Nutt.,

Coreopsis gigantea... Butein đã được báo cáo như một chất chống oxy hóa mạnh

mẽ, ức chế peroxid hóa lipid bằng cách trung hòa các gốc tự do và thải sắt. Ngoài

ra, butein thể hiện các hoạt tính chống viêm, ức chế TNF-a, ức chế cyclooxygenase

2, ức chế sản xuất oxit nitric, gây ra apoptosis ở các tế bào ác tính như HL-60 và

B16 [222].

Stigmasterol đã được biết là một hợp chất hóa thực vật được phân lập từ

đậu nành và một số loài thực vật khác. Stigmasterol có hoạt tính chống oxy, ức

chế đáng kể hoạt động khử HMG-CoA [222].

Nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Phương Hạnh (2015) đã chiết xuất từ

dịch chiết methanol của Bí kỳ nam thu hái tại huyện Đam Rông, tỉnh Lâm Đồng, Việt

Nam 4 hợp chất iridoid gồm: Acid asperulosidic, acid deacetylasperulosidic, 6α-

hydroxygeniposide và 10-hydroxyloganin (Hình 1.5) [8].

Abdullah và cộng sự (2017) đã phân lập từ dịch chiết methanol thân củ non Bí

kỳ nam hợp chất acid sinapinic, β-sitosterol acetat, β-sitosterol, stigmasterol [16].

1.1.2.2. Tác dụng dược lý

Tác dụng chống oxy hóa

Nghiên cứu của tác giả Prachayasittikul và cộng sự (2008) đã cho thấy cao chiết

ethyl acetat Bí kỳ nam có hoạt tính chống oxy hóa bắt gốc tự do tốt với giá trị IC50 là

8,4 μg/ml (bằng phương pháp DPPH) và hoạt tính SOD trung bình với tỷ lệ 67,91%

so với cao methanol là 74,19% [222].

Tác giả Ahmad và cộng sự (2010) cho thấy dịch chiết methanol Bí kỳ nam thể

hiện tác động chống oxy hóa mạnh với giá trị IC50 22,4 ± 1,73 μg/ml (DPPH) [20].

Tác dụng kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết Bí kỳ nam (cao n-hexan, cao

dicloromethan, cao ethyl acetat và cao methanol) được thực hiện trên 27 chủng vi

khuẩn. Kết quả cho thấy cao n-hexan, dicloromethan và ethyl acetat có hoạt tính

kháng vi khuẩn Gram dương Corynebacterium diptheriae NCTC 10356 với nồng độ

thử nghiệm 256 μg/ml. Ngoài ra cao ethyl acetat còn ức chế sự phát triển của một số

vi khuẩn Gram dương và Gram âm: Achromobacter xylosoxidan ATCC 2706,

Staphylococcus aureus ATCC 25923, Micrococcus lutens ATCC 10240, Shigella

dysenteriae, Streptococcus pyogenes II, Aeromonas hydrophila và Bacillus cereus

với nồng độ thử nghiệm 256 μg/ml; Shewanella putrefaciens ATCC 8671 với nồng

độ thử nghiệm 128 μg/ml. Cao toàn phần methanol ức chế sự phát triển của C.

diptheriae, S. pyogenes II and B. cereus với nồng độ thử nghiệm 256 μg/ml. Đặc biệt,

hợp chất procatechualdehyd phân lập từ cao ethyl acetat có thể ức chế Plesiomonas

shigelloides với MIC ≤ 60 μg/ml [222] (Bảng 1.2).

Bảng 1.2 Hoạt tính kháng khuẩn của Bí kỳ nam

Cao chiết Vi khuẩn Gram

Cao n-hexan C. diptheriae NCTC 10356 Nồng độ thử nghiệm (MIC) 256 (μg/ml) +

Cao dicloromethan C. diptheriae NCTC 10356 + 256

Cao ethyl acetat

Cao methanol

+ - + + - + + - + + + Gram 256 256 256 256 256 256 256 128 256 256 256 MIC (μg/ml) C. diptheriae NCTC 10356 A. xylosoxidan ATCC 2706 S. aureus ATCC 25923 M. lutens ATCC 10240 S. dysenteriae S. pyogenes II B. cereus S. putrefaciens ATCC 8671 C. diptheriae NCTC 10356 S. pyogenes II B. cereus Vi khuẩn Hợp chất

- ≤ 60 Procatechualdehyd P. shigelloides

Nghiên cứu của tác giả Hertianin và Pratiwi (2015) cho thấy dịch chiết ethanol

của Bí kỳ nam có tác dụng ức chế khả năng gây bệnh của Pseudomonas aeruginosa

bằng cơ chế điều hòa quá trình quorum-sensing (phương thức truyền tín hiệu giữa các

tế bào vi khuẩn) [119].

Tác dụng ức chế α-glucosidase

Hiệu quả ức chế lên đến 80% của dịch chiết ethanol Bí kỳ nam trên α-

glucosidase đã được xác định. Acarbose được sử dụng như là mẫu chứng dương ức

chế α-glucosidase. So với IC50 của acarbose 117,20 μg/ml, giá trị IC50 các dịch chiết

từ lá và vỏ của Bí kỳ nam lần lượt là 181,90 μg/ml và 11,04 μg/ml [84].

Tác dụng lên sự tăng trưởng của tế bào

Năm 2002, một nghiên cứu tiến hành sàng lọc hoạt tính ức chế sự tăng trưởng

các dòng tế bào ung thư của 77 cây thuốc Việt Nam trong đó có Bí kỳ nam được tiến

hành trên các cao chiết methanol, methanol - nước (1:1) và nước. Kết quả cho thấy

cao chiết methanol của Bí kỳ nam có khả năng ức chế sự tăng trưởng của một số dòng

tế bào ung thư, đặc biệt chọn lọc trên dòng tế bào u xơ HT1080 (giá trị IC50 là 9,97

μg/ml), tế bào ung thư cổ tử cung Hela (IC50 là 11,3 μg/ml) và dòng tế bào ung thư

phổi A549 (IC50 < 4 μg/ml) [285].

Các hợp chất protocatechualdehyd, butin và butein phân lập từ Bí kỳ nam được

thử nghiệm độc tính trên 2 dòng tế bào ung thư biểu mô ống mật người HuCCA-1 và

tế bào ung thư biểu mô người KB. Tuy nhiên, kết quả cho thấy ba chất này không thể

hiện hoạt tính độc tế bào đối với 2 dòng tế bào này [222].

Nghiên cứu của Abdullah và cộng sự (2010) cho thấy hoạt chất 7, 3’, 5’-

trihydroxyflavanone (3HFD) phân lập từ Bí kỳ nam có hoạt tính độc tế bào ung thư

vú MCF-7 bằng cách kích thích điều hoà protein tiền apoptosis Bax [15].

Năm 2013, tác giả Senawong và cộng sự đã cho thấy dịch chiết ethanol, dịch

chiết giàu phenol và acid sinapinic, thành phần chính có trong dịch chiết giàu phenol

của Bí kỳ nam có hoạt tính ức chế enzym histon deacetylase và ức chế sự tăng trưởng

của tế bào Hela. Tuy nhiên, các dịch chiết này và acid sinapinic không thể hiện hoạt

tính đáng kể trên dòng tế bào Vero, Hela và tế bào ung thư vú MCF-7 [248].

Nghiên cứu của nhóm tác giả Darwis (2014) cho thấy cao chiết ethanol 96%

của Bí kỳ nam có khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư vú T47D ở nồng

độ 100 μg/ml, nhưng ảnh hưởng không đáng kể đến sự tăng trưởng của tế bào biểu

mô thận khỉ Vero [67].

Tác dụng kích thích tế bào lympho

Nghiên cứu của tác giả Darwis và cộng sự (2014) đã chứng minh tác dụng kích

thích tế bào lympho của dịch chiết ethanol 96% của Bí kỳ nam [67].

Tác dụng bảo vệ thần kinh

Hợp chất aldehyd protocatechuic phân lập từ Bí kỳ nam đã được báo cáo có tác

dụng chống thoái hóa thần kinh gây ra do stress oxy hóa trên mô hình in vitro với các

tế bào thần kinh SH-SY5Y [97].

1.1.3. Công dụng dân gian

Ở Việt Nam, dân gian dùng cây Bí kỳ nam chữa: 1. Viêm gan, đau gan, vàng

da; 2. Ðau nhức gân xương, bong gân, thấp khớp; 3. Ðau bụng, tiêu chảy [5].

Bài thuốc:

1. Viêm gan, đau gan, vàng da: Bí kỳ nam 80 g, Hạ khô thảo, Chó đẻ, Hậu

phác nam, mỗi vị 20 g sắc uống. Hoặc Bí kỳ nam 40 g, Thảo quyết minh 10 g, actisô

20 g, Nhân trần 15 g, cho 500 ml nước vào sắc còn 100 ml, chia 2 lần uống trước 2

bữa ăn khoảng 1 giờ. Uống liên tục 10 - 15 ngày.

2. Ðau nhức gân xương, bong gân, thấp khớp: Bí kỳ nam 40 g, phối hợp với

Bổ cốt toái 30 g, rễ Trứng cuốc, rễ Trinh nữ, mỗi vị 20 g, hoặc Ngũ gia bì 30 g, rễ Vú

bò, Xuyên tiêu, mỗi vị 20 g, sắc uống hoặc ngâm rượu 30 - 40 độ (350 g thuốc trong

1 lít rượu), ngày dùng 2 lần trước bữa ăn.

3. Ðau bụng: Sắc 60 g thuốc Bí kỳ nam cho thật đặc, lấy 1/2 chén nước thuốc,

chia 2 lần uống cách nhau 1 giờ.

1.1.3.1. Tiềm năng của các chi khác thuộc nhóm cây tổ kiến

Các loài thuộc nhóm cây tổ kiến được tìm thấy từ Miến Điện, các nước Đông

Dương và trải dài sang Philippines, Malaysia, New Guinea Papua đến Queensland.

Trong bài thuốc dân gian ở các nước thường sử dụng thân củ của các loài nhóm cây

tổ kiến trong điều trị nhiều bệnh như loét, chảy máu, đau lưng, các vấn đề tim mạch,

viêm gan, viêm khớp, tiêu chảy, ung thư. Thành phần hóa học có thể thay đổi giữa

các chi và các loài phụ thuộc vào địa lý và sự cộng sinh [114]. Hydnophytum và

Myrmecodia là hai chi có số loài nhiều nhất trong nhóm cây tổ kiến, họ Cà phê. Tuy

nhiên, đến nay chưa có nhiều nghiên cứu về phân lập các hợp chất cũng như đánh giá

hoạt tính của các loài Myrmecodia. Sự hiện diện của stigmasterol được xác định như

hợp chất không phân cực chính của các loài Myrmecodia. Một nghiên cứu đã báo cáo

về dịch chiết methanol của loài Myrmecodia là M. platytyrea không làm ảnh hưởng

tế bào thận khỉ Vero [114]. Thân củ của M. tuberosa và M. pendens là những tác nhân

điều hòa miễn dịch được đánh giá trên sự tăng trưởng in vitro của tế bào lympho ở

chuột Balb/c, gợi ý tiềm năng của các loài này như tác nhân điều hòa miễn dịch. M.

pendens cũng được báo cáo về hoạt tính ức chế tăng trưởng của tế bào Hela [114].

1.2. STRESS OXY HÓA

1.2.1. Gốc tự do

Gốc tự do là những nguyên tử hay phân tử hóa học có một hay nhiều điện tử tự

do chưa ghép đôi ở lớp ngoài cùng. Gốc tự do có thể mang điện tích dương, điện tích

-),

âm hay trung hòa về điện. Các gốc tự do có khả năng phản ứng cao, thời gian tồn tại

-2) và các nhóm không phải gốc như hydrogen peroxid

ngắn. Trong cơ thể, các gốc chứa oxy hoạt động (ROS) gồm: superoxid (•O2

hydroxyl (•OH), peroxid (•O2

(H2O2) được tạo ra trong quá trình trao đổi chất oxy. Các gốc chứa nitơ hoạt động

- thông qua phản ứng

(RNS) gồm gốc tự do N và các chất không phải gốc như nitrogen dioxid (NO2), nitric

oxid (NO), peroxynitrit (ONOO−) có nguồn gốc từ NO và •O2

với sự xúc tác của nitric oxid synthase cảm ứng (iNOS) và nicotinamid adenin

dinucleotid phosphat oxidase (NADPH) [31]. Trong tế bào, gốc tự do được sinh ra

do các phản ứng chuyển nhường điện tử. Những phản ứng này có thể được thực hiện

bởi các loại enzym hoặc không phải enzym, thông qua sự oxy hóa khử của các ion

kim loại chuyển tiếp [7].

1.2.2. Tác động sinh học của các gốc tự do

Các gốc tự do đóng vai trò như kênh truyền tin thứ cấp trong chuỗi tín hiệu nội

bào nhằm duy trì cân bằng nội môi. Ở mức độ cao hơn, các gốc tự do tăng cao bất

thường sẽ lấn áp hệ thống phòng thủ nội tại của các chất chống oxy hóa trong cơ thể,

tấn công tất cả các thành phần cấu tạo của tế bào, đặc biệt là màng phospholipid tế

bào, protein và ADN [52].

Kích hoạt các yếu tố phiên mã nhạy cảm oxy hóa khử: Các gốc tự do có khả

năng kích hoạt các yếu tố phiên mã như p53, NF-ƘB điều hòa biểu hiện của các

cytokin tiền viêm, biệt hóa tế bào và gây apoptosis [22].

Kích hoạt protein kinase: Khi các protein kinase bị kích hoạt, tế bào sẽ phản

ứng với các tín hiệu ngoại bào và stress thông qua một họ protein kinase hoạt hóa bởi

mitogen (Mitogen-activated protein kinases, MAPK). Việc các gốc tự do kích hoạt

các kinase điều hòa ngoại bào như ERK1/2 thường thúc đẩy tăng sinh tế bào, trong

khi kích hoạt p38MAPK hay JNK gây ra apoptosis. Các phản ứng này là thay đổi

thích nghi sinh lý nhằm khôi phục cân bằng nội môi. Khi lượng các gốc tự do quá

mức sẽ dẫn đến tổn thương tế bào nghiêm trọng hơn và không thể hồi phục, cuối cùng

gây chết tế bào thông qua hoại tử hoặc apoptosis. Tác động này thể hiện qua trung

gian mở các kênh ion, peroxyd hóa lipid, thay đổi protein và oxy hóa ADN [265].

Peroxyd hóa lipid: Màng tế bào có nhiều các acid béo chưa no, phospholipid…

nên khả năng cao bị các gốc tự do tấn công vào các thành phần lipid gây ra quá trình

peroxy hóa lipid [46]. Quá trình này là một chuỗi phản ứng của gốc tự do điển hình

với ba giai đoạn: khơi mào, phát triển và dập tắt mạch [7].

Giai đoạn khơi mào: Gốc tự do xuất hiện sẽ kết hợp ngay với nguyên tử hydro

của acid béo chưa no theo phản ứng:

 + LOOH

→ H2O + L ; L

→ LOO

→ L1

LH + OH

Từ một phân tử acid béo thông thường nhanh chóng bị các gốc OH chuyển

thành phân tử peroxyd. Gốc L mới lại phản ứng với oxy và tạo ra LOOH… Cứ như

thế rất nhiều hợp chất peroxyd được tạo ra tại vị trí xung quanh gốc OH xuất hiện.

Gốc OH xuất hiện nhiều thì nguy cơ phản ứng gốc tự do sẽ lan truyền mạnh.

Giai đoạn phát triển mạch: Đó là giai đoạn chuyển tâm gốc tự do từ phân tử này

sang phân tử khác tạo ra nhiều gốc mới và phân tử mới theo cơ chế:

→ Gốc mới + phân tử mới

Gốc + phân tử

Quá trình này tăng nhanh khi có Fe2+, Cu2+ xúc tác. Gốc mới xuất hiện lại phản

ứng với phân tử mới khác và lan truyền.

ứng không còn ở trạng thái gốc (R + R Giai đoạn dập tắt mạch: Phản ứng gốc tự do chỉ ngừng khi sản phẩm của phản → R-R). Các dạng peroxyd của lipid

(LOOH) hình thành được glutathion (GSH), glutathion peroxidase (GSHPO) …

chuyển về các acid béo (khi các chất chống oxy hóa còn đủ lớn, khả năng phục hồi

các peroxyd về dạng acid béo chưa no vẫn có thể thực hiện được). Ngược lại, khi

lượng các chất chống oxy hóa thấp, quá trình này sẽ không còn hiệu quả và hậu quả

là nhiều phân tử sinh học bị biến đổi, các acid béo chưa no bị cắt mạch tạo ra các

aldehyd độc hại… gây viêm và hoại tử.

Tổn thương các phân tử protein: Các chất tự do có thể biến đổi cấu trúc và chức

năng của phân tử protein. Những protein có acid amin nhạy cảm cao với chất oxy

hóa, khi bị thay đổi cấu trúc vẫn có khả năng phục hồi (sự oxy hóa của nhóm –SH

trong các phân tử protein), trong khi đó các protein có acid amin vòng (histidin,

tryptophan…) bị bẻ gãy vòng thì các tổn thương sẽ không phục hồi. Điều này dẫn

đến tổn thương chức năng sinh học của các phân tử protein đặc hiệu. Các tổn thương

protein tăng theo tuổi tác, tích tụ theo thời gian và gắn với sự lão hóa.

Tổn thương ADN: Các gốc tự do nội, ngoại sinh có thể phản ứng với acid

nucleic, tấn công vào các thành phần của acid nucleic như: phần đường, phần base

purin và pyrimidin, từ đó gây tổn thương, sai lệch cấu trúc ADN dẫn đến sai lệch cấu

trúc gen, gây biến dị tế bào, thúc đẩy lão hóa và gây ung thư [145].

1.2.3. Chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là một chất bất kỳ khi hiện diện ở nồng độ thấp hơn so với

cơ chất oxy hóa cần bảo vệ có khả năng làm chậm hoặc ngăn cản một cách có ý nghĩa

sự oxy hóa của cơ chất này. Những chất chống oxy hóa có thể có nguồn gốc tự nhiên

hay tổng hợp. Các chất chống oxy hóa tổng hợp được dùng rộng rãi trong công nghiệp

thực phẩm. Các chất chống oxy hóa tự nhiên như dược liệu chứa hợp chất phenol

thường được khuyến khích hơn vì tính an toàn trong khi hiệu quả chống oxy hóa thì

tương đương hoặc mạnh hơn so với chất chống oxy hóa tổng hợp [198].

Các chất chống oxy hóa có thể tác động theo 2 cách: làm chậm tốc độ oxy hóa

và phá vỡ chuỗi oxy hóa.

→ LH + A; LO + AH

Ví dụ: Chất chống oxy hóa làm chậm sự khơi mào của quá trình oxy hóa bằng → cách phản ứng với gốc tự do lipid: L + AH

→ LOOH + A

LOH + A; LOO +AH

Hoặc ngăn cản quá trình phát triển mạch bằng cách phản ứng với gốc tự do

→ LOOA; A+ LO

→ LOA

peroxyl hay alkoxyl: A + LOO

Sự phòng vệ của cơ thể chống lại gốc tự do

Bình thường, các gốc tự do được sinh ra trong tế bào và cơ thể có cơ chế chống

lại gốc tự do nhờ các chất nội sinh thông qua hai cơ chế tác động:

Phòng ngừa sinh ra các gốc: Gồm hiệu lực vận chuyển điện tử của oxy và sự

khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, đặc biệt với các protein như

transferrin, lactoferrin, ferritin.

Phòng vệ loại bỏ các gốc đã sinh ra: Trong tế bào quan trọng nhất là enzym

SOD và hệ thống glutathion. Ở tổ chức màng, quan trọng nhất là vitamin E, β-caroten

loại bỏ các gốc LOO, LO. Ở pha nước có vai trò của vitamin C và một số chất như

acid uric.

Hệ thống chống oxy hóa ở gan

Gan có nhiều enzym trong đó thành phần chống oxy hóa đóng vai trò quan trọng

là các chất chống peroxyd, enzym SOD, chất phân hủy các gốc tự do, protein khóa

ion kim loại, trong đó các chất chống peroxyd chiếm thành phần chủ yếu ở gan [7].

Các chất chống peroxyd

Các chất glutathion (GSH), enzym glutathion peroxidase (GSHPO) xúc tác phân

hủy peroxyd với hằng số tốc độ phản ứng k=108 mol/giây theo phản ứng sau:

𝐺𝑆𝐻−𝑃𝑂 → LOH + GSSG + H2O

2GSH + LOOH

¯

Ngoài ra, peroxysom còn có catalase phân hủy H2O2 nồng độ cao:

𝐶𝑎𝑡𝑎𝑙𝑎𝑠𝑒 → 2H2O + O2

¯

2H2O2

Enzym superoxyd dismutase (SOD): Có khả năng phân hủy đặc hiệu gốc O2

¯ + 2H+

với hằng số tốc độ lớn (k=109 mol/giây).

¯ + O2

𝑆𝑂𝐷 → H2O2 + O2

Phân hủy các gốc tự do khác

Vitamin E (-tocopherol) là chất chống oxy hóa quan trọng ở các tổ chức màng.

2LOO + Vitamin E(OH)2 Mỗi phân tử vitamin E có khả năng loại bỏ hai gốc LOO theo phản ứng sau: → 2LOOH + Vitamin E(O2)

Ngoài phản ứng trực tiếp với gốc tự do, vitamin E còn có khả năng loại oxy đơn

→ O2 + vitamin E

𝑉𝑖𝑡 𝐶 → Vitamin E

bội theo phản ứngS: Vitamin E + 1O2

Protein khóa ion kim loại chuyển tiếp

Ion sắt hay đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác phản ứng sinh gốc tự do. Khi

các ion này bị khóa dưới dạng phức sẽ mất khả năng xúc tác. Trong cơ thể, nhiều

protein có chức năng này như transferrin, ferritin, lactoferrin (khóa ion Fe2+),

ceruloplasmin (khóa ion Cu2+).

1.2.4. Stress oxy hóa

Stress oxy hóa được định nghĩa là sự mất cân đối giữa các gốc tự do được tạo

ra và quá trình loại bỏ bằng các chất phòng vệ chống oxy hóa (Hình 1.6). Ở điều kiện

sinh lý, các gốc tự do chịu trách nhiệm biểu hiện các chức năng của tế bào gồm các

đường dẫn truyền tín hiệu, chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn và biểu hiện gen mã

hóa cho các protein tham gia quá trình tăng trưởng hay sự chết của tế bào và giúp

tăng cường cơ chế bảo vệ sinh học. Bình thường, cơ thể có thể loại bỏ gốc tự do ở

mức độ nhất định vì vậy những gốc hoạt động này không nguy hiểm với cơ thể ở điều

kiện sinh lý. Tuy nhiên, với lượng lớn quá mức các gốc tự do sẽ gây hiện tượng stress

oxy hóa, dẫn đến tổn thương oxy hóa mô và các cơ quan [52].

Hình 1.6 Stress oxy hóa [52]

1.2.5. Gốc tự do và một số bệnh lý

Bệnh tim mạch: Các gốc tự do tăng cao dẫn đến stress oxy hóa ở tế bào cơ tim

và mạch máu gây các bệnh tim mạch: cao huyết áp, xơ vữa động mạch, bệnh cơ tim,

thiếu máu cục bộ... Stress oxy hóa gây tổn thương màng phospholipid bởi sự oxy hóa

lipid và gây tổn thương protein bởi sự oxy hóa nhóm thiol dẫn đến thay đổi tính thấm

màng tế bào, phá vỡ sự cân bằng trao đổi chất qua màng, thay đổi chức năng protein

tế bào, gây ra những bất thường trong hoạt động của tế bào cơ tim, mạch máu. Gốc tự

do tấn công và oxy hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp tạo ra các sản phẩm trung gian

là nguyên nhân hình thành các mảng bám. Ngoài ra, stress oxy hóa còn làm tăng nồng độ Ca2+ nội bào, kích thích sự tăng sinh màng trong của mạch gây ra xơ vữa mạch,

tăng co mạch dẫn tới tăng huyết áp, tổn thương tế bào cơ tim trong bệnh tim thiếu

máu cục bộ hoặc suy tim xung huyết [220].

Bệnh viêm khớp: Trong bệnh thấp khớp, triệu chứng viêm tăng kèm theo tăng

sinh các gốc tự do, đặc trưng bởi hàm lượng cao lipoperoxyd trong hoạt dịch [95].

Bệnh nhãn khoa: Các gốc tự do cũng góp phần gây một số bệnh về mắt như

thoái hóa võng mạc, đục thủy tinh thể. Võng mạc giàu oxy là mục tiêu của sự peroxy

hóa lipid. Sự tấn công của các gốc tự do trên thụ thể cảm nhận ánh sáng và sự thoái

hóa võng mạc cùng sự tạo thành các chất chuyển hóa là những nguyên nhân chính

gây thoái hóa điểm vàng [144].

Bệnh đái tháo đường: Nhiều nghiên cứu cho thấy tế bào β tuyến tụy đặc biệt

nhạy cảm với các gốc oxy hoạt động vì nó chứa ít enzym bắt giữ gốc tự do như

catalase, glutathion peroxidase và superoxid dismutase. Tình trạng này làm tế bào β

dễ trở thành đích tấn công của các gốc tự do hơn những mô có lượng chất chống oxy

hóa bảo vệ cao, làm ảnh hưởng chức năng tế bào, dẫn đến việc giảm hoặc mất khả

năng tiết insulin, gây bệnh đái tháo đường [311].

Bệnh lý thần kinh: Não đặc biệt rất dễ bị tổn thương do oxy hóa bởi nhu cầu sử

dụng oxy cao và chứa nhiều acid béo chưa no dễ bị oxy hóa. Gốc tự do làm tăng quá

trình peroxyd hóa lipid trong não, tăng số lượng các sản phẩm oxy hóa như MDA dẫn

đến tăng thoái hóa thần kinh, đặc biệt ở các vùng liên quan đến trí nhớ, khả năng học

hỏi như: hồi hài mã, thùy trước trán, thùy thái dương của vỏ não; 4-hydroxy-2-

nonenal tăng ở vùng não bị thiếu hụt chức năng, não thất và hiện diện trong các mảng

bám amyloid, đám rối protein tau; tăng lượng isopoprostan, một sản phẩm do oxy

hóa các acid béo chưa no trong dịch não tủy và huyết tương, đặc biệt ở những bệnh

nhân Alzheimer [62].

Bệnh Parkinson: Sự oxy hóa dopamin tạo ra dạng trung gian 6-hydro-dopamin

nhanh chóng tự oxy hóa với phân tử oxy tạo ra nhiều gốc tự do khác. 6-hydro-

dopamin được dùng rộng rãi như chất đánh dấu cho tổn thương thần kinh hệ

dopaminergic. Các sản phẩm peroxy hóa lipid, oxy hóa ADN và ARN tế bào chất đều

tăng trong tế bào thần kinh hệ dopaminergic ở não bệnh nhân Parkinson [100].

Rối loạn hệ thống thận: Hệ thống thận dễ bị tổn thương do các gốc oxy hoạt

động gây ra [110]. Các tác động này xảy ra ở cả cầu thận (nội mô), mạch máu (tế bào

nội mô và tế bào cơ trơn) và ống thận (gần, xa và ống góp) [198].

Bệnh ung thư: Gốc tự do có thể làm tổn thương một hay cả hai sợi ADN, gây

hư hỏng purin, pyrimidin hoặc thay đổi deoxyribose và sự bắt chéo của ADN. Sự tổn

thương thể hiện ở việc dịch mã sai, truyền tín hiệu sai, sao chép lỗi và tính không ổn

định của gen… Những tổn thương có thể là khởi đầu của quá trình sinh đột biến, ung

thư và lão hóa. Việc đánh giá mức độ tổn thương do oxy hóa được lưu ý trong nhiều

loại ung thư vì liên quan chặt chẽ đến mức độ tổn thương trong cơ chế bệnh sinh của

ung thư. Ngày nay, hơn 100 sản phẩm oxy hóa của ADN đã được nhận dạng, một

trong số đó là 8-oxo-2’-deoxyguanosin làm mất tính đặc hiệu của enzym glycosylase -

enzym tham gia loại bỏ đoạn ADN bị tổn thương, vì vậy làm tăng tốc độ đột biến tự

phát dẫn đến ung thư [289].

1.2.6. Mối tương quan giữa stress oxy hóa và viêm

Các nghiên cứu đã cho thấy mối tương quan chặt chẽ giữa stress oxy hóa và

viêm trong cơ chế bệnh sinh. Mối liên hệ này diễn ra đồng thời và tăng ảnh hưởng

lẫn nhau tại vị trí tổn thương. Khi nồng độ ROS tăng cao trong tế bào gây stress oxy

hóa đồng thời kích hoạt yếu tố phiên mã hạt nhân kappa B (Nuclear factor kappa B,

NF-κB), điều hòa sao chép ADN và các chất trung gian gây viêm. NF-κB được hoạt

hóa nhằm tăng khả năng chống viêm và chống apoptosis do ROS gây nên. NF-κB là

một yếu tố dimer duy trì bất hoạt trong tế bào chất bằng cách liên kết với các protein

ức chế (các I-kB). Stress oxy hóa gây hoạt hóa NF-κB bằng cách gây nên quá trình

phosphoryl hóa các I-kB. I-kB bị giáng hóa bởi quá trình thủy phân protein hoặc bị

phân hủy do các proteasom hay protease khác, kết quả dẫn đến các NF-κB được giải

phóng, đi vào nhân tế bào và kích thích quá trình sao mã, tăng giải phóng một loạt

các chất trung gian bao gồm các cytokin và chemokin như TNF-α, IL1β…[147],

[176]. TNF-α và các cytokin khác làm hoại tử tế bào được lập trình như một loại chết

tế bào thứ cấp góp phần gây hoại tử và rối loạn chức năng các cơ quan trong cơ thể.

Mặt khác, tình trạng viêm kéo dài cũng dẫn đến stress oxy hóa do sự rò rỉ của các tế

bào miễn dịch và bạch cầu thực bào sinh ra lượng lớn các ROS và RNS [181].

Hình 1.7 Mối tương quan giữa stress oxy hóa và viêm

“Nguồn: Li và cộng sự, 2016” [158]

1.2.7. Con đường tín hiệu chống oxy hóa Keap1/Nrf2/ARE

Sinh học của con đường Keap1/Nrf2/ARE: Đóng vai trò trung tâm của phản

ứng sinh học hằng ngày đối với stress oxy hóa là con đường Keap1/Nrf2/ARE

[Protein 1 liên kết với ECH giống Kelch (Kelch-like ECH-associated protein 1,

Keap1) - Yếu tố hạt nhân liên quan erythroid 2 (Nuclear erythroid 2 related factor,

Nrf2) - Yếu tố đáp ứng chống oxy hóa (Antioxidant response elements, ARE)], điều

hòa phiên mã của nhiều gen chống oxy hóa giúp bảo tồn cân bằng nội môi tế bào và

các gen giải độc giúp xử lý, loại bỏ các chất độc, chất gây ung thư trước khi chúng

gây tổn thương tế bào hay mô [284].

Keap1 là một protein 624 acid amin, giàu cystein, bám vào actin trong tế bào

chất. Keap1 chứa 2 miền tương tác protein: miền BTB (bric-a-brac, tramtrack, broad-

complex) ở vùng đầu N và miền lặp lại Kelch ở vùng đầu C (còn gọi là miền lặp lại

glycin kép, double glycine repeat = DGR). DGR điều hòa gắn kết của Keap 1 với

vùng Neh2 (Nrf2-ECH homology) của Nrf2. Giữa BTB và DGR là vùng can thiệp

(intervening region, IVR) giàu cystein.

Hình 1.8. Cấu trúc vùng của Keap1 “Nguồn: Tu và cộng sự, 2019” [284] Nrf2 là một yếu tố phiên mã gồm 605 acid amin thuộc phân họ Cap’n’collar

(CNC) của nhóm yếu tố phiên mã vùng khóa kéo leucin cơ bản bZip (basic region

leucine zipper). Nrf2 chứa 6 miền Neh (Nrf2-ECH homology) (Hình 1.9). Miền Neh1

bao gồm cấu trúc dây kéo leucin cơ bản (bZIP) đóng vai trò trong quá trình gắn kết

ADN và cho phép liên kết Nrf2 với trình tự yếu tố đáp ứng chống oxy hóa (ARE).

Neh2 và Neh6 đóng vai trò trong quá trình thoái hóa của Nrf2. Các vùng Neh4 và

Neh5 chịu trách nhiệm cho quá trình chuyển hóa kích hoạt của Nrf2 [296].

Hình 1.9. Cấu trúc vùng của Nrf2 “Nguồn: Vomund và cộng sự, 2017” [296]

Nrf2 được mã hóa bởi yếu tố hạt nhân 2 có nguồn gốc erythroid 2 (NFE2L2 =

erythroid-derived 2-like 2), được nhân bản bởi sự gắn kết với mô đun liên kết NFE2,

một trình tự điều hòa cis trong vùng kiểm soát β-globin cần thiết cho sự phát triển

hồng cầu và tiểu cầu. Tuy nhiên Nrf2 không cần thiết cho sự biệt hóa của tế bào máu

mà được tìm thấy như một trung gian cảm ứng của các enzym chuyển hóa thuốc

(DMEs, drug-metabolizing enzymes), dưới kích thích của chất chống oxy hóa. Quá

trình cảm ứng này cần một vùng ADN chung gọi là yếu tố đáp ứng chống oxy hóa

(ARE). Việc cảm ứng các DMEs dẫn đến tăng giải độc và loại bỏ nhiều hóa chất

ngoại sinh và một số chất nội sinh. Vì vậy, Nrf2 đóng vai trò như thụ thể kích hoạt

bởi chất ngoại sinh để điều hòa phản ứng thích nghi với các chất oxy hóa [167].

ARE: Sự cảm ứng của các enzym chuyển hóa thuốc, bảo vệ tế bào đáp ứng với

stress oxy hóa được điều hòa chủ yếu ở cấp độ phiên mã. Phản ứng phiên mã này

được trung gian bởi một yếu tố phản ứng cis gọi là ARE, được tìm thấy đầu tiên ở

các gen mã hóa 2 enzym chính là GSTA2 (glutathion S -transferase A2) và NQO1

(NADPH quinoneoxidoreductase 1). ARE sở hữu các đặc điểm cấu trúc và sinh học

đặc trưng cho khả năng đáp ứng đối với stress oxy hóa [188].

Con đường tín hiệu Keap1/Nrf2/ARE: Dưới tác động của stress, tế bào phải tăng

cường khả năng chống oxy hóa để đảm bảo duy trì cân bằng nội môi. Yếu tố phiên

mã Nrf2 có chức năng như bộ điều khiển của mạng lưới điều hòa gen cân bằng oxy

hóa khử nội môi. Trong điều kiện bình thường, Nrf2 được giữ trong phức hợp, liên

kết với Keap1. Keap1 đóng vai trò thúc đẩy sự thoái hóa Nrf2. Đây là một quá trình

tương đối nhanh, Nrf2 thể hiện thời gian bán hủy ngắn 13 - 21 phút [247], [140]. Quá

trình này dẫn đến duy trì Nrf2 ở mức thấp, cơ bản. Nhiều gốc cystein trong chuỗi acid

amin của Keap1 cho phép hoạt động như một cảm biến, phát hiện những thay đổi của

trạng thái oxy hóa tế bào. Khi xảy ra tình trạng gia tăng các gốc tự do nội bào hoặc

các tác nhân kích hoạt sẽ tạo ra sự tăng quá trình oxy hóa hoặc liên hợp của các cystein

Keap1, làm giảm hoạt động của phức hợp và giải phóng Nrf2 (thời gian bán hủy kéo

dài 100 - 200 phút dưới tác động của stress oxy hóa). Nrf2 xâm nhập vào nhân, liên

kết với yếu tố đáp ứng chống oxy hóa ARE dẫn đến tăng biểu hiện các gen chống oxy

hóa và giải độc, bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do stress oxy hóa (Hình 1.10) [37].

Hình 1.10 Vai trò của Nrf2 trong cơ chế điều hòa stress oxy hóa “Nguồn: Wang và cộng sự, 2015” [298]

1.3. GAN VÀ TRESS OXY HÓA

1.3.1. Cấu tạo gan

Gan là cơ quan nội tạng lớn nhất trong cơ thể, nặng khoảng 1500 g và chiếm

khoảng 2,5% trọng lượng cơ thể trưởng thành [177]. Gan được chia thành 2 thùy:

thùy phải to hơn thùy trái. Phía trên, gan tiếp giáp với cơ hoành, phía dưới gan là ruột

non và ruột già. Phía trước bên phải gan tiếp giáp với dạ dày, phía sau bên phải là

thận phải. Mặt dưới gan có túi mật. Gan được neo giữ cố định tại chỗ bởi tĩnh mạch

chủ dưới và các dây chằng gan. Gan được cấu tạo bởi 3 thành phần chính: bao gan,

nhu mô gan, mạch máu và đường dẫn mật trong gan. Bao gan là các mô liên kết mỏng

bao phủ bề mặt nhu mô gan. Nhu mô gan gồm các tế bào gan sắp xếp vào từng đơn

vị cấu trúc gọi là các tiểu thùy gan. Mỗi tiểu thùy gan có cấu trúc hình đa giác. Giữa

các dãy tế bào gan là các mao mạch kiểu xoang (xoang gan) có các tế bào Kupffer.

Bộ ba động mạch gan, ống mật và tĩnh mạch cửa chạy trong những khoảng giữa của

các tiểu thùy (Hình 1.11). Gan tiếp xúc liên tục với các chất độc do tĩnh mạch cửa

cung cấp máu cho cơ quan này sau khi hấp thu qua ruột [71].

Hình 1.11 Cấu tạo gan “Nguồn: Pearson Education, 2013” [212]

1.3.2. Chức năng gan

Tạo mật: Gan hỗ trợ tiêu hóa bằng cách tiết ra 700 - 1200 ml mật mỗi ngày. Mật

được hình thành bởi các tế bào gan và tiết vào ống mật. Muối mật cần thiết cho quá

trình nhũ hóa ruột và hấp thụ chất béo [206].

Chuyển hoá các chất dinh dưỡng: Chất béo: Tổng hợp từ carbohydrat và

protein, chủ yếu ở gan. Chất béo được hấp thụ bởi nhung mao ruột vào gan chủ yếu

dạng tryglycerid. Tại gan, các tryglycerid có thể thủy phân thành glycerol và acid béo

tự do, được sử dụng để sản xuất năng lượng chuyển hóa adenosine triphosphate (ATP)

hoặc được giải phóng vào máu dưới dạng lipoprotein. Gan cũng tổng hợp

phospholipid và cholesterol, cần thiết cho việc sản xuất muối mật, hormon steroid và

các phân tử đặc biệt khác. Protein: Các protein huyết tương gồm albumin và globulin

được tổng hợp bởi gan. Gan cũng tổng hợp một số acid amin không thiết yếu và

enzym bao gồm aspartat aminotransferase, alanin aminotransferase, lactat

dehydrogenase và phosphatase kiềm. Glucid: Gan tham gia vào ổn định nồng độ

glucose trong máu bằng cách giải phóng glucose khi xảy ra tình trạng hạ đường huyết

(lượng đường trong máu thấp) và hấp thụ glucose khi có tình trạng tăng đường huyết

(đường huyết cao), lưu trữ dưới dạng glycogen hoặc chuyển hóa thành chất béo [206].

Chức năng chống độc: Gan làm thay đổi các chất nội sinh và ngoại sinh, các

phân tử lạ và các hormon làm cho chúng ít độc hoặc ít hoạt tính sinh học hơn. [206].

Dự trữ khoáng chất và vitamin: Gan có thể lưu trữ vitamin B12 và D trong vài

tháng và vitamin A trong vài năm. Gan cũng lưu trữ vitamin E và K. Sắt được lưu trữ

trong gan dưới dạng ferritin, một phức hợp sắt và protein, được giải phóng khi cần

thiết cho sản xuất hồng cầu [206].

1.3.3. Stress oxy hóa và các bệnh về gan

Trong bệnh gan do rượu (alcoholic liver disease, ALD) có sự tham gia của stress

oxy hóa do quá trình chuyển hóa rượu ở gan. Đầu tiên, rượu sẽ được chuyển hóa

thành acetaldehyd dưới tác động của enzym dehydrogenase (ADH). Tiếp theo, enzym

acetaldehyd dehydrogenase (ALDH) oxy hóa acetaldehyd thành acetat không ổn

định, dễ dàng phân hủy thành nước và carbon dioxid. Sự hình thành của acetaldehyd

gây phá hủy tế bào gan vì đây là một tác nhân phản ứng với ADN và tạo ra các chất

làm tổn thương mô. Acetaldehyd và dẫn xuất-malondialdehyd (MDA) đồng thời liên

kết với protein, tạo thành các phức hợp MAA, được nhận biết bởi các thụ thể tế bào

gan, kích thích điều hòa của các cytokin và kích hoạt phản ứng [27]. Con đường thoái

hóa thứ hai của rượu thông qua hệ thống microsom xúc tác bởi enzym CYP2E1, chịu

trách nhiệm chính cho sự phân hủy rượu ở người nghiện rượu. CYP2E1 được kích

hoạt sẽ giải phóng ROS, dẫn đến stress oxy hóa và chết tế bào [242].

Trong bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (non-alcoholic fatty liver disease,

NAFLD) và viêm gan thoái hóa mỡ (non-alcoholic steatohepatitis, NASH): Tình trạng

viêm do tích lũy mô mỡ và xơ ở gan, xảy ra ở những người hầu như không uống rượu,

lượng mỡ tích tụ trong gan > 5% trọng lượng gan. Acid béo tự do tích luỹ trong tế

bào làm tăng peroxyd hóa ở gan đồng thời tạo gốc tự do và kích thích biểu hiện TNF-

α, gây tổn thương ty thể, ADN, ARN, protein, làm biến đổi enzym, rối loạn nội tiết

tố thông qua phản ứng oxy hóa khử, làm tế bào gan nhạy cảm với các yếu tố độc tế

bào, gây viêm, chết tế bào gan theo chương trình và hoại tử [117].

Tổn thương gan do các chất độc: Quá trình chuyển hóa hay biến đổi sinh học

của các chất gây độc gan là một quá trình giải độc khi các phân tử được biến đổi thành

dạng ít độc hơn bởi hệ thống các enzym khác nhau. Do quá trình biến đổi sinh học

diễn ra với tần suất cao nên các gốc tự do được tạo ra liên tục. Phần lớn các chất độc

gan chủ yếu gây tổn thương gan do tạo ra stress oxy hóa; làm tăng peroxyd hóa lipid,

giảm ATP và tổn thương oxy hóa ADN và protein. Trong cơ chế tác động của CCl4

.), tricloromethyl peroxyl

có sự hình thành các gốc tự do như tricloromethyl (CCl3

(CCl3OO.) gây bão hòa hệ thống chống oxy hóa phòng thủ của cơ thể, gây peroxyd

hóa lipid, giảm lượng cytochrom P450 dẫn đến suy giảm chức năng do giảm protein

và tích tụ triglycerid, thay đổi trạng thái cân bằng nước, điện giải đồng thời làm tăng

các enzym gan trong huyết tương [71].

Tổn thương gan do các thuốc (Drug induced liver injury, DILI) là bệnh lý phổ

biến, có thể xảy ra ở hầu hết các nhóm thuốc. DILI có thể là kết quả của độc tính trực

tiếp của thuốc hoặc các chất chuyển hóa của thuốc hoặc do các cơ chế qua trung gian

miễn dịch [69]. Quá trình chuyển hóa thuốc ở gan thường trải qua hai giai đoạn. Pha

1 xảy ra các phản ứng sinh hóa như phản ứng khử, phản ứng thủy phân nhưng chủ

yếu là phản ứng oxy hóa do enzym Cytochrom P450 xúc tác, thuốc bị ion hóa do các

phân tử thuốc bị mất điện tử… Pha 2 xảy ra các phản ứng kết hợp giữa thuốc với các

nhóm ion hóa như: acid glucuronic, glutathione, glycin, gốc methyl, acetyl… tại tế

bào chất của tế bào gan, kết quả tạo ra chất chuyển hóa dễ hòa tan trong nước. Kết

quả của quá trình chuyển hóa thuốc là đa số các thuốc bị giảm hoạt tính, một số ít

tăng hoạt tính hoặc vẫn giữ hoạt tính, một số tiền chất không hoạt tính chuyển sang

dạng có hoạt tính, một số trở thành chất chuyển hóa có độc tính.

1.4. THẬN VÀ STRESS OXY HÓA

1.4.1. Cấu tạo thận

Thận là cơ quan trong hệ tiết niệu, có dạng hai quả hình hạt đậu nằm trong

khoang bụng sau phúc mạc, hai bên cột sống (ngang đốt ngực T11 đến đốt thắt lưng

L3). Thận phải nhỏ hơn và thấp hơn thận trái khoảng 1 đốt sống. Mặt trước thận nhẵn

bóng, mặt sau sần sùi [270]. Thận gồm 2 vùng: phần vỏ (màu hồng tới đỏ hay đỏ

sẫm) dày khoảng 7 – 10 mm, kế tiếp là phần tủy. Rốn thận là chính giữa bờ cong phía

trong, nơi có mạch máu đến và đi khỏi thận, có niệu quản và dây thần kinh.

Hình 1.12 Cấu trúc thận và nephron

“Nguồn: Sundararajan và cộng sự, 2014” [270]

Cấu trúc nephron: Mỗi quả thận của người được cấu tạo từ hơn một triệu đơn

vị thận (nephron), trong khi của chuột là khoảng 30.000 đơn vị [270]. Đơn vị thận

vừa là đơn vị cấu tạo vừa là đơn vị chức năng. Mỗi đơn vị thận gồm có cầu thận và

ống thận. Cầu thận là nơi khởi đầu của nephron, nằm ở vùng vỏ thận, có chức năng

lọc huyết tương để tạo thành dịch lọc cầu thận. Ống thận tiếp nối với cầu thận, có

chức năng tái hấp thu và bài tiết một số chất để biến dịch lọc cầu thận thành nước

tiểu. Ống thận gồm có: ống lượn gần, quai Henle, ống lượn xa và ống góp.

1.4.2. Chức năng thận

Lọc và bài tiết: Lọc nước, tạp chất và chất thải từ máu là chức năng chính của

thận. Khi máu đi vào thận thông qua các động mạch thận, qua các nephron, nơi chất

độc từ gan, chất thải chuyển hóa và nước dư thừa được loại bỏ. Sau đó tập trung để

hình thành nước tiểu. Nước tiểu được thu gom ở bể thận. Các niệu quản mang nước

tiểu xuống bàng quang sau đó ra khỏi cơ thể qua niệu đạo [9].

Duy trì hằng định nội môi: Thận giúp cân bằng nước, cân bằng điện giải, acid-

base thông qua quá trình lọc, tái hấp thu và loại bỏ chọn lọc nước, khoáng chất và các

hợp chất khác nhau [9].

Điều hòa huyết áp: Khi áp lực động mạch trong thận giảm, thận tạo ra renin

phóng thích trong máu phản ứng với angiotensinogen (tổng hợp bởi gan) để tạo ra

angiotensin I, sau đó được thủy phân thành angiotensin II có tính chất chống co mạch

và kiểm soát sự tiết của aldosteron [9].

Chức năng nội tiết: Thận tiết ra renin giúp điều chỉnh huyết áp. Vitamin D được

chuyển hóa trong thận tạo thành chất có tác dụng calcitriol (vitamin D3) giúp ruột

hấp thu canxi. Thận tổng hợp erythropoietin (EPO), kích thích sinh ra các tế bào hồng

cầu tạo bởi các cơ quan máu [9].

1.4.3. Các bệnh về thận

Suy thận cấp: Hội chứng suy thận cấp (Acute Renal Failure, ARF) gây ra bởi

nhiều nguyên nhân, ngoài thận hoặc tại thận, làm suy giảm và mất chức năng tạm

thời, cấp tính của cả hai thận, ngừng hoặc suy giảm nhanh mức lọc cầu thận [110].

Các nguyên nhân gây tổn thương thận cấp được chia thành 3 nhóm: nguyên nhân

trước thận như tăng huyết áp, giảm thể tích tuần hoàn, giảm cung lượng tim; nguyên

nhân trong thận gồm hoại tử ống thận cấp do các chất độc thận hoặc thiếu máu nuôi

lâu dài, viêm thận mô kẽ cấp do phản ứng dị ứng hoặc do thuốc, viêm cầu thận cấp

do tổn thương màng cầu thận, tổn thương mạch máu hay biểu mô thận; nguyên nhân

sau thận do tắc nghẽn đường tiết niệu. Thuốc là một trong những nguyên nhân chính

gây hoại tử ống thận cấp (acute tubular necrosis – ATN) và viêm ống thận mô kẽ

(acute intersititial nephritis – AIN) [120].

Suy thận mạn: Suy thận mạn là sự suy giảm dần dần và không thể phục hồi chức

năng thận, được thể hiện bởi sự suy giảm chức năng lọc của cầu thận. Suy thận giai

đoạn cuối cần chạy thận hoặc ghép thận. Về sinh bệnh học, suy thận mạn là do giảm

số nephron chức năng. Nephron bị tổn thương nghiêm trọng sẽ không thực hiện được

các chức năng sinh lý, dẫn đến rối loạn cân bằng điện giải, tuần hoàn, hô hấp, tiêu

hóa, hệ thần kinh và gây suy thận mạn [262].

1.4.4. Stress oxy hóa trong bệnh thận

Sự hiện diện với số lượng lớn các acid béo không bão hòa làm thận dễ bị tác

động bởi các gốc tự do gây stress oxy hóa. Stress oxy hóa tham gia hàng loạt các rối

loạn tại thận từ tổn thương thận cấp, bệnh thận tắc nghẽn, tăng lipid huyết, tổn thương

cầu thận đến suy thận mạn và chạy thận nhân tạo.

Stress oxy hóa tác động cầu thận: Tổn thương oxy hóa có thể làm thay đổi cấu

trúc và chức năng cầu thận, chủ yếu do tác động của các gốc tự do đến các các tế bào

gian mao mạch và tế bào nội mô cầu thận. Stress oxy hóa tổn thương thận do tăng

lipid máu chủ yếu liên quan đến sự tích lũy các lipoprotein tỷ trọng thấp (low-density

lipoprotein, LDL) tại cầu thận. Bệnh cầu thận lipoprotein được đặc trưng bởi sự tiến

triển nhanh đến suy thận và xơ hóa cầu thận [243]. Ngoài ra, LDL có thể kích thích

biểu hiện của fibronectin qua trung gian TGF-β [74]. Stress oxy hóa cũng tham gia

vào các tổn thương viêm cầu thận với hàng loạt các cytokin và chemokin dẫn đến

kích thích bạch cầu, gia tăng sản xuất gốc tự do và tổn thương cầu thận. Các gốc tự

do đã được chứng minh kích hoạt yếu tố NF-ƙB thúc đẩy đáp ứng viêm ở các tế bào

gian mao mạch cầu thận [173].

Thay đổi ống kẽ thận: Tổn thương ống kẽ thận thường gặp trong suy thận mạn.

Các đại phân tử xuất hiện trong đường niệu do cầu thận mất tính thấm chọn lọc. Do

đó, biểu mô ống thận có thể tiếp xúc trực tiếp với các chất độc gây tổn thương. Bên

cạnh đó, sự tích lũy của các đại thực bào trong khoảng kẽ vỏ thận đóng vai trò bệnh

lý trong sự tiến triển của tổn thương ống thận và xơ hóa kẽ thận. Các tế bào biểu mô

ống thận được xem là trung gian xâm nhập của các đại thực bào kẽ thận do vị trí giải

phẫu, khả năng sản sinh các cytokin hóa ứng động, chemokin và các trung gian gây

viêm khác. Các gốc tự do đã được báo cáo kích thích sự hiện diện của các trung gian

trong tế bào biểu mô ống thận dẫn đến thu hút bạch cầu [204]. Tắc nghẽn niệu quản

là một thay đổi khác của thận do stress oxy hóa [139].

Rối loạn chức năng nội mô: Lớp nội mô là thành phần thiết yếu trong điều hòa

và duy trì chức năng thận bình thường. Một trong những chức năng quan trọng nhất

của lớp nội mô là tiết ra nitric oxid (NO) tham gia vào nhiều quá trình sinh hóa bao

gồm giãn mạch ở các tế bào cơ trơn, đáp ứng viêm và miễn dịch. Trong các tế bào

nội mô, NO hiện diện trên màng tế bào và trong tế bào chất của ty thể. Mối quan hệ

giữa NO và các gốc tự do mang tính chất 2 chiều: NO làm tăng biểu hiện của các gen

chống oxy hóa giúp bảo vệ các tế bào nội mô và trung mô khỏi apoptosis và xơ hóa,

mặt khác sự gia tăng các gốc tự do làm giảm sản xuất NO từ nội mô.

1.5. CÁC MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG BẢO VỆ GAN

Mục tiêu của các mô hình nghiên cứu tác động bảo vệ gan là đánh giá khả năng

các hợp chất, các phân đoạn hoặc dịch chiết tương tác hoặc tránh tổn thương do các

chất độc gan gây ra. Tác động bảo vệ gan có thể đo lường bằng các chỉ số sinh hóa,

tỷ lệ sống hay đặc điểm mô học của gan. Các mô hình có thể là mô hình in vitro, ex

vivo hay in vivo và mỗi mô hình có thể đánh giá tác động bảo vệ hay điều trị gan, dựa

vào việc các tác nhân bảo vệ gan được dùng trước hay sau khi dùng chất gây độc [71].

Mô hình in vitro: Tế bào gan tươi, môi trường nuôi cấy tế bào gan sơ cấp hay

các dòng tế bào bất tử là các mô hình in vitro được sử dụng để đánh giá tác động bảo

vệ gan [71]. Những mô hình in vitro là lựa chọn tốt nhất để sàng lọc và lựa chọn các

hợp chất bảo vệ gan tiềm năng và có thể thiết lập cơ chế tác động ở mức độ tế bào và

phân tử [19]. Để đánh giá tác động bảo vệ, các thông số như nồng độ enzym phóng

thích ngoại bào, tăng sinh tế bào, hình dạng tế bào… sẽ được khảo sát [146].

Ưu điểm của các mô hình in vitro: nhanh chóng (thường 2 - 3 ngày thử nghiệm),

yêu cầu lượng mẫu nhỏ (khoảng vài miligram) và điều kiện thử nghiệm có thể kiểm

soát chặt chẽ vì vậy có khả năng tái lập lại cao; nhiều mẫu khác nhau có thể phân tích

trong cùng thử nghiệm và chi phí thấp. Đặc biệt, mô hình in vitro giúp nhà nghiên

cứu tuân thủ nguyên tắc 3R về y đức (replacement: thay thử nghiệm in vivo bằng thí

nghiệm in vitro, reduction: giảm số thú vật, refinement: hạn chế tổn thương, đau đớn

trên động vật).

Nhược điểm của các mô hình in vitro: các tế bào không thể hoạt động như trong

sinh vật sống; mặt khác, các tế bào có thể hình thành tương tác với nhau và với cấu

trúc ngoại bào, vì vậy cần xem xét biện luận các dữ liệu in vitro, so sánh và đánh giá

với mô hình in vivo.

Trong các mô hình in vitro, các tế bào gan phân lập trong huyền dịch hoặc môi

trường nuôi cấy sơ cấp thường tăng trưởng chậm, số lượng tế bào thu được ít, đời

sống ngắn, do đó khó lặp lại thí nghiệm nhiều lần dẫn đến những hạn chế trong nghiên

cứu. Vì vậy, hiện nay các mô hình nghiên cứu in vitro thường dùng các dòng tế bào

từ khối ung thư gan người với đặc tính phát triển nhanh, khả năng tăng sinh không

giới hạn, có thể thực hiện thí nghiệm nhiều lần, kết quả có độ lặp lại và chính xác

cao… Trên thế giới, một số dòng tế bào gan người đã được dùng trong mô hình nghiên

cứu in vitro như HepG2, Hep3B, Huh7, HBG, HepaRG [109].

Dòng tế bào HepG2: Tế bào HepG2 là dòng tế bào ung thư biểu mô gan người

được phân lập từ khối ung thư gan của bệnh nhân nam Mỹ da trắng 15 tuổi. Tế bào

HepG2 đã được đề xuất như một thay thế cho tế bào gan người trong các mô hình

nghiên cứu dược lý in vitro về gan [11], [14], [143], [278]. Ưu điểm của tế bào HepG2

là một dòng tế bào bất tử, có sẵn với số lượng lớn, dễ duy trì vì có thể bảo quản lạnh

và các hoạt động của enzym chuyển hóa thuốc không bị giảm trong quá trình nuôi

cấy tế bào [79]. Tế bào HepG2 cho thấy tỷ lệ tương đồng khoảng 81,3% so với tế bào

gan người mới phân lập [115]. Tế bào HepG2 cũng sở hữu nhiều đặc điểm sinh hóa

và hình thái của tế bào gan bình thường [47]. Tế bào HepG2 biểu hiện nhiều enzym

tham gia chuyển hóa thuốc ở pha I như CYP1A, CYP2B, CYP3A, CYP2E… và một

số enzym chuyển hóa thuốc pha II. Dưới tác động của chất ngoại sinh, HepG2 biểu

hiện các gen mã hóa protein tham gia quá trình vận chuyển, đáp ứng kích thích bên

ngoài, quá trình chuyển hóa acid amin, carbohydrat, lipid, truyền thông tin… tương

tự tế bào gan người nuôi cấy sơ cấp [127].

Bảng 1.3 Một số mô hình in vitro gây tổn thương gan bởi CCl4 trên dòng tế bào HepG2

Tác giả Đối tượng và phương pháp Kết quả Nồng độ CCl4 Thời gian

Vijayan và cộng sự, Tế bào HepG2 xử lý với môi trường có 1% 24h Sau 24h xử lý với CCl4, khả năng sống tế

2003 [295] bào giảm khoảng 24% so với nhóm chứa CCl4 (1%) trong vòng 24h.

chứng.

Krithika và cộng sự, 0,4% (v/v) 0,16, 0,33, Tế bào HepG2 được xử lý với CCl4 CCl4 làm giảm đáng kể khả năng sống của

2009 [143] 0,4% trong DMSO 0,25% ở: 0,16, 0,33, trong DMSO 0,5, 3, 6, 12 tế bào, làm tăng giải phóng ALT và LDH,

0,5, 3, 6, 12, 24 h. 0,25% và 24 h. tăng peroxy hóa lypid, giảm GSH.

Zeashan và cộng sự, Tế bào HepG2 xử lý với môi trường có 1% 24h Sau 24 giờ xử lý với CCl4, khả năng sống

2009 [313] tế bào giảm 24,38% so nhóm chứng. chứa CCl4 (1%) trong vòng 24h.

Surendran và cộng 1% 24h Tế bào HepG2 xử lý với CCl4 (1%) Sau 24h xử lý với CCl4, giảm khả năng

sự, 2011 [273] trong vòng 24h. sống tế bào 24,30 % so nhóm chứng.

Pareek và cộng sự, Tế bào HepG2 được xử lý với môi 1% 10, 30 phút, So với nhóm chứng, nhận thấy được sự

2013 [210] 3h, 6h, 12h tăng oxy hóa lipid, sự tăng AST, ALT, trường chứa 1% CCl4

và 24h. LDH và sự giảm đi khả năng sống tế bào.

Đỗ Thị Hồng Tươi 1 mM, 2 mM, 24 giờ Tế bào HepG2 được xử lý với CCl4

và cộng sự, 2014 4 mM và 8

CCl4 2 mM trong 24 giờ gây tổn thương tế bào gan HepG2 tăng phóng thích enzym AST, ALT, LDH, giảm hàm lượng GSH, [13] mM hoạt hóa apoptosis.

Mô hình ex vivo: Các lát cắt gan là môi trường ex vivo mô phỏng các đặc điểm

đa tế bào của các cơ quan in vivo. Tương tác giữa các tế bào và phân bố được giữ

nguyên trong mô hình này, nên có thể dùng trong các thử nghiệm đánh giá thay đổi

hình dạng mẫu. Các lát cắt gan có đặc điểm giữ được chức năng của các enzym

chuyển hóa và tiểu quản mật [200]; các mô hình này cũng đã chứng tỏ là hệ thống để

đánh giá quá trình chuyển hóa, tổn thương gan, đồng thời có chức năng như cầu nối

giữa hệ thống in vivo và môi trường tế bào [92]. Gan phân lập được tưới máu là một

mô hình kết hợp các đặc điểm in vitro dưới điều kiện in vivo. Mô hình đầu tiên được

phát triển là gan heo và sau đó là gan của các động vật nhỏ hơn (chuột, thỏ). Mô hình

này giữ được cấu trúc 3 chiều của ống mật tại thời điểm xử lý.

Ưu điểm của mô hình ex vivo: Mô phỏng giống môi trường in vivo nhưng chi

phí thấp hơn và có thể tái lập. Trong mô hình sử dụng các lát cắt gan, số lượng động

vật thử nghiệm giảm và mô hình cũng có thể áp dụng với các cơ quan người.

Nhược điểm của mô hình ex vivo: Trong mô hình sử dụng các lát cắt gan, dòng

chảy mật và các thông số chức năng như dòng chảy động mạch cửa cũng không thể

đánh giá. Việc cung cấp nguồn oxy cho các tế bào bên trong và ngay cả khi có sự

phát triển của các phương tiện nuôi cấy, khả năng sống của các lát cắt vẫn còn ngắn

(8 – 10 ngày) [92]. Trong các phòng thí nghiệm nhỏ, do giới hạn không gian và chi

phí, ưu tiên lựa chọn là gan chuột được tưới máu, tuy nhiên vẫn có sự khác biệt về

kích thước, chức năng và hình dạng của gan chuột so với gan người.

Mô hình in vivo: Các mô hình in vivo thực hiện trực tiếp trên động vật sống,

phổ biến là chuột, thỏ, khỉ…; qua mô hình này có thể giúp đánh giá cơ chế bảo vệ.

Tổn thương gây ra ở các động vật thử nghiệm do các chất độc gan khác nhau với liều

lượng đã biết và tác động của tổn thương và/hoặc khả năng bảo vệ được đánh giá

thông qua các thông số chuyển hóa và sinh hóa cũng như các đặc điểm mô học.

Ưu điểm của mô hình in vivo: Là mô hình có sự tương thích cao với người. Mô

hình in vivo thể hiện được sự tương tác giữa các tế bào, phát hiện được những thay

đổi về cấu trúc giải phẫu của cơ quan nghiên cứu. Nhờ sự ảnh hưởng giữa các cơ

quan trong cơ thể nên mô hình in vivo thích hợp nghiên cứu dược động học, quá trình

chuyển hóa các chất và độc tính mạn. Mô hình in vivo cũng cho thấy khả năng tác

động của hệ thống miễn dịch và thần kinh trung ương trong tiến triển của các loại

bệnh gan [71].

Nhược điểm của mô hình in vivo: Yêu cầu số lượng lớn động vật thử nghiệm và

thường tiến hành trong khoảng thời gian dài, quan ngại về vấn đề y đức và tài chính.

Mô hình in vivo cần lượng mẫu thử lớn, đây cũng là một hạn chế đặc biệt khi thử các

mẫu thử nguồn gốc tự nhiên.

Bảng 1.4 So sánh các mô hình đánh giá tác động bảo vệ gan

“Nguồn: Delgado và cộng sự, 2015” [71]

Mô hình Ví dụ Ưu điểm Nhược điểm

Tế bào gan tươi Nhanh và chi phí thấp Do thiếu sự phức tạp như

Môi trường nuôi Cần lượng mẫu ít trong hệ thống chuyển hóa

cấy tế bào gan sơ Kiểm soát tốt; khả năng của cơ quan nên kết quả

In vitro cấp. lặp lại cao cần biện luận thận trọng.

Các dòng tế bào Có thể phân tích nhiều Mẫu không trải qua quá

bất tử (HepG2, mẫu trong cùng thử trình biến đổi sinh học

HUH7, HepRG) nghiệm

Lát cắt gan Mô phỏng môi trường in Tỷ lệ cung cấp oxy thấp ở

Gan phân lập vivo những tế bào phía trong

được tưới máu Giảm số lượng động vật Khả năng sống thấp Ex vivo thử nghiệm Có sự khác biệt về kích

Mô hình mô người có thể thước và chức năng giữa

được phát triển mô chuột và người

Mô hình trên Được sử dụng rộng rãi Yêu cầu số lượng động vật

chuột Có sự tương thích lớn hơn thử nghiệm lớn

In vivo với người Lượng mẫu thử cần nhiều

Tất cả thông số sinh hóa Chi phí cao

và mô học có thể đánh giá

Một số mô hình in vivo gây tổn thương gan

Mô hình gây tổn thương gan bằng CCl4

Cacbon tetraclorid (CCl4) là chất không màu, sử dụng chủ yếu làm chất phản

ứng trong tổng hợp hữa cơ. Độc tính do CCl4 gây ra phụ thuộc vào liều và thời gian

tiếp xúc. Ở liều thấp gây ra các tác động như mất cân bằng nội môi, peroxyd hóa

lipid, giải phóng các cytokin và apoptotic, sau đó tái tạo lại tế bào. Ở liều cao hoặc

nếu thời gian tiếp xúc lâu hơn, sẽ gây ảnh hưởng nghiêm trọng hơn và tổn thương

xảy ra trong thời gian dài hơn, bệnh nhân có thể bị xơ hóa, xơ gan hoặc thậm chí là

ung thư. Trong cơ chế tác động chính của CCl4 có sự hình thành các gốc tự do gây

stress oxy hóa và kích thích gây viêm. CCl4 dưới chuyển hóa của cytochrom P450

. là một gốc tự do, tiếp tục

2E1 (CYP2E1) biến đổi thành tricloromethyl CCl3

.. CCl3

kết hợp với oxy tạo gốc tricloromethyl peroxyl (CCl3OO.) hoạt tính mạnh hơn. Các

gốc tự do này gây bão hòa hệ thống chống oxy hóa phòng thủ của cơ thể, phản ứng

với các protein, tấn công các acid béo chưa no, gây peroxyd hóa lipid, giảm lượng

cytochrom P450 dẫn đến suy giảm chức năng do giảm protein và tích tụ triglycerid,

thay đổi trạng thái cân bằng nước, điện giải đồng thời làm tăng các enzym gan trong

huyết tương. Sự peroxyd hóa lipid dẫn đến một loạt các phản ứng, như phá hủy lipid

màng , tạo ra các chất độc hại nội sinh, gây ra nhiều biến chứng về gan và bất thường

chức năng. Vì vậy, peroxid hóa lipid được coi là một yếu tố quan trọng trong cơ

chế bệnh sinh của tổn thương gan do CCl4. Việc ức chế hình thành các gốc tự do được

xem là điểm mấu chốt trong việc bảo vệ chống lại tổn thương do CCl4 gây ra. Do đó,

mô hình này được sử dụng rộng rãi để đánh giá dược phẩm và các sản phẩm tự nhiên

có hoạt tính bảo vệ gan và chống oxy hóa [71]. Bên cạnh đó, sự gia tăng stress oxy

hóa do CCl4 kích thích gây tình trạng viêm. Các cytokin gây viêm đồng thời làm biến

đổi yếu tố tăng trưởng beta-1 (TGF-β1) kích hoạt các tế bào hình sao thông qua thụ

thể liên kết với TGF-β1. Các tế bào hình sao được kích hoạt sẽ làm tăng hình thành

sợi và tổng hợp collagen, cuối cùng dẫn đến xơ hóa gan (Hình 1.13). Liều duy nhất

của CCl4 có thể đạt nồng độ đỉnh trong 3 giờ. Trong vòng 24 giờ, CCl4 gây ra thay

đổi các chỉ số sinh hóa và mô học của tế bào gan. Sử dụng liều lặp lại CCl4 có thể gây

xơ hóa và hoại tử gan. Tiêm dưới da CCl4 liều 2 ml/kg trong 2 ngày làm tăng hàm

lượng SGPT và SGOT, nếu tiếp tục trong 2 – 4 tuần sẽ dẫn đến xơ hóa và xơ hóa tiến

triển trong 5 – 7 tuần, xơ gan nặng trong 8 – 9 tuần [124]. Một số mô hình gây tổn

thương gan chuột với CCl4 đã được báo cáo (Bảng 1.3).

Hình 1.13 Stress oxy hóa và viêm trong cơ chế tổn thương gan do CCl4

“Nguồn: Tsai và cộng sự, 2015” [283]

Mô hình gây tổn thương gan do acetaminophen: Acetaminophen là thuốc giảm

đau và hạ sốt được sử dụng rộng rãi. Ở liều cao, acetaminophen gây tổn thương gan

cấp tính và hoại tử tế bào gan. Ở liều điều trị, acetaminophen chủ yếu được chuyển

hóa thành glucuronic hoặc dẫn xuất sulfat và bài tiết, phần còn lại chuyển hóa thành

các chất phản ứng trung gian, được loại bỏ bằng cách kết hợp với glutathion. Khi

dùng quá liều, acetaminophen được oxy hóa bởi cytochrom P450 (chủ yếu là đồng

phân CYP2E1) thành N-acetyl-p-benzoquinon (NAPQI), nhanh chóng gắn vào

glutathion. Trong điều kiện hình thành quá mức NAPQI và sự suy giảm glutathion,

chất chuyển hóa liên kết hóa trị với protein, tạo chất cộng hợp, gây rối loạn chức năng

ty thể và stress oxy hóa, kết quả gây hoại tử hoặc chết tế bào gan [174].

Mô hình gây tổn thương gan do rượu: Phần lớn rượu được chuyển hóa tại gan

qua hai giai đoạn: Giai đoạn 1: Chuyển hóa rượu thành acetaldehyd được thực hiện

bởi ba hệ thống men: alcoholdehydrogenase nằm trong bào tương; hệ thống oxy hóa

rượu ở microsom và các men catalase. Giai đoạn 2: Acetaldehyd được hình thành và

nhanh chóng được oxy hóa chuyển thành acetat. Ở những người lạm dụng rượu, lượng

acetaldehyd được sản sinh với một mức quá lớn sẽ không được chuyển hóa hết nên

sẽ ở lại màng tế bào gây tổn thương tế bào thông qua các cơ chế gây độc, viêm và

miễn dịch với hậu quả là quá trình tạo xơ gan. Rượu cũng ức chế glutathion

peroxidase và làm giảm hoạt động của catalase, disutase superoxid [258]. Mô hình

dùng ethanol gây tổn thương gan chuột: cho chuột nhắt trắng hoặc chuột cống trắng

uống ethanol 96% với liều hàng ngày là 4 ml/kg (trước khi uống, phải hòa loãng

ethanol với nước cất) liều trong 45 ngày, gan sẽ bị tổn thương. Lô thuốc, sau khi cho

chuột uống ethanol được 30 ngày thì cho dùng thuốc (song song vẫn cho uống ethanol

tiếp) hàng ngày cho đến ngày 45 (sau khi dùng thuốc) tiến hành xét nghiệm [7].

Mô hình gây tổn thương gan do D-galactosamin: Chất gây độc gan này tạo ra

tổn thương tương tự như viêm gan virut liên quan đến đặc điểm hình thái và chức

năng. Một liều duy nhất có thể gây hoại tử tế bào gan và gan nhiễm mỡ. D-

galactosamin gây ra sự cạn kiệt của nucleotid uracil, dẫn đến ức chế tổng hợp

ARN và protein. Cơ chế gây độc làm mất hoạt động của bơm ion và tăng tính thấm

của màng tế bào, dẫn đến giải phóng enzym và tăng nồng độ Ca2+ nội bào, được coi

là nguyên nhân gây chết tế bào [258].

Mô hình gây tổn thương gan do thioacetamid (TAA): TAA là một hợp chất hữu

cơ có chứa lưu huỳnh, ban đầu được sử dụng làm thuốc diệt nấm và hiện được sử

dụng để xử lý da, trong phòng thí nghiệm và trong các ngành công nghiệp dệt may

và giấy. TAA có thể gây ra tổn thương gan cấp và mạn tính, tác động lên quá trình

tổng hợp protein, ADN, ARN và hoạt động của gamma-glutamyl transpeptidase

(GGT) [233].

Nghiên cứu sử dụng mô hình in vitro gây tổn thương tế bào gan HepG2 và mô

hình in vivo gây tổn thương gan chuột nhắt với tác nhân CCl4 với các ưu điểm gồm

cơ chế gây độc gan được biết rõ, độ lặp lại cao, tác động gây tổn thương cấp tính

nhanh, các biến đổi trên động vật về mô học, huyết động tương tự như trên người.

Bảng 1.5 Một số mô hình in vivo gây tổn thương gan bởi CCl4

Liều CCl4, thời gian, Năm Tác giả Đối tượng đường dùng

Chuột đực 2005 Bahashwan và cộng sự [36] 0,2 ml / 100 g (i.p.), 2 ngày liên tục/tuần trong 2 tuần Sprague-Dawley

Chuột đực 2008 Palanivel và cộng sự [208] 2 ml/kg (s.c.) mỗi 72 giờ trong 10 ngày Wistar

Chuột đực 0,5 ml/kg (i.p.) liều duy nhất vào ngày thứ 3 sau khi dùng 2010 Xu và cộng sự [308] Sprague-Dawley mẫu thử, đánh giá sau 24 giờ tiêm CCl4

Chuột Swiss 0,1 mg/10 g (0,2% trong dầu oliu) (i.p.) liều duy nhất, , 2011 Nguyễn Bảo Trân và cộng sự [12] albino đánh giá sau 24 giờ tiêm CCl4

Chuột đực 2012 Eidi và cộng sự [80] 0,5 ml/kg (50% trong dầu oliu) (i.p.) 2 lần/tuần trong 4 tuần Wistar

10 ml/kg (i.p.) vào ngày thứ 14, đánh giá sau 24 giờ tiêm 2017 Hamed và cộng sự [113] Chuột CCl4, dùng mẫu thử trong 15 ngày liên tục

10 ml/kg (i.p.) 0,2% liều duy nhất sau 7 ngày dùng mẫu thử, 2019 Yang và cộng sự [310] Chuột đực ICR đánh giá sau 24 giờ tiêm CCl4

Chuột đực 2019 Zhang và cộng sự [316] 10 ml/kg (i.p.) vào ngày thứ 3 sau khi dùng mẫu thử BALB/c

1.6. CÁC MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG BẢO VỆ THẬN

Mô hình in vitro

Thận phân lập: Thích hợp nhất để nghiên cứu độc tính trên thận khi cần có sự

toàn vẹn hệ thống mạch máu - ống thận. Mô hình này không bị ảnh hưởng bởi các

như hormon, hệ thần kinh... và có thể dễ dàng kiểm soát nồng độ của chất nghiên cứu.

Tuy nhiên, thận phân lập không được sử dụng phổ biến do chức năng thận chỉ được

duy trì ổn định trong thời gian ngắn (khoảng 2 giờ) và chi phí cao [218].

Lát cắt mô thận: Là một trong những kỹ thuật sớm nhất trong nuôi cấy in vitro

và hay được sử dụng trong nghiên cứu về chuyển hóa và độc tính trên thận. Tuy nhiên,

lát cắt thận có một số nhược điểm: (1) lát cắt chứa quần thể tế bào không đồng nhất

gồm nhiều loại tế bào khác nhau, gây khó khăn trong việc đánh giá sự thay đổi chức

năng của một loại tế bào cụ thể khi tiếp xúc với chất độc; (2) nhiều tế bào và bề mặt

tiếp xúc bị hư hỏng khi cắt; (3) không đảm bảo tất cả các tế bào được tiếp xúc với

chất dinh dưỡng và oxy ở cùng mức độ. Mặc dù kỹ thuật cắt chính xác và nuôi cấy

kéo dài đã được phát triển, việc sử dụng các phần phân lập của nephron và các tế bào

của nephron vẫn chiếm ưu thế trong nghiên cứu trên thận [218].

Phân lập cầu thận, mảnh ống thận: Tiểu cầu thận, các mảnh hoặc tế bào từ

nephron được sử dụng để đánh giá độc tính cấp của các chất. Mô hình này được sử

dụng trong nghiên cứu về thuốc ức chế enzym chuyển, cephalosporin, cisplatin...

Nhược điểm của phương pháp là thời gian thử nghiệm giới hạn trong vài giờ [218].

Nuôi cấy tế bào thận: Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thận in vitro phát triển mạnh và

đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu tác động trên thận. Hiện nay có hai hướng

chính: nuôi cấy sơ cấp và nuôi cấy dòng tế bào liên tục. Nuôi cấy dòng tế bào có ưu

điểm là nguồn cung cấp không giới hạn, kết quả lặp lại, hiểu rõ kiểu hình, kiểu gen

của dòng tế bào và khắc phục được một số nhược điểm của nuôi cấy sơ cấp như phân

lập phức tạp, tuổi thọ ngắn, chi phí cao. Một số dòng tế bào nguồn gốc từ thận đã

được phân lập và sử dụng trong các mô hình in vitro gồm tế bào biểu mô thận heo

(Lilly Laboratories Cell-Porcine Kidney 1, LLC-PK1), tế bào phôi thai thận người

(Human embryonic kidney 293, HEK 293), tế bào thận khỉ Vero.... [218].

Bảng 1.6 Một số nghiên cứu trên mô hình in vitro gây độc tế bào thận

Tác giả Năm Đối tượng Tác nhân Nồng độ Thời gian

Seung và cộng sự [249] 2017 LLC-PK1 Cisplatin 20 µM 24 giờ

Negrette và cộng sự [186] 2015 LLC-PK1 Gentamicin 8 mM 48 giờ

Pessoa và cộng sự [217] 2009 LLC-PK1 Gentamicin 2 mM 24 giờ

Kamilia và cộng sự [134] 2012 HEK 293 Polymyxin B 4 mg/ml 48 giờ

Mi và cộng sự [175] 2018 HEK 293 Cisplatin 15 - 30 µM 24 giờ

Amuthan và cộng sự [28] 2019 Hela Cisplatin 10-500 µg/mL 48 giờ

Grauzdytė và cộng sự [106] 2018 HEK293 20 μL 1 giờ H2O2

Zhang và cộng sự [318] 2017 NRK-52E Doxorubicin 5 µM 24 giờ

Gao và cộng sự [94] 2013 HK-2 Cisplatin 8 µg/ml 24 giờ

Dòng tế bào HEK 293: Dòng tế bào phôi thận người 293 (HEK 293) được tạo

ra vào năm 1973 từ các mẫu nuôi cấy tế bào thận phôi người bình thường trong phòng

thí nghiệm của Alex van der Eb ở Leiden, Hà Lan. Tế bào được lấy từ một bào thai

đơn, khỏe mạnh, bị hủy bỏ hợp pháp theo luật pháp Hà Lan, được nuôi cấy bởi Van

der Eb và xử lý bởi Frank Graham. Tế bào sau đó được công bố vào năm 1977 [301].

Dòng tế bào HEK 293 được xem như tế bào biểu mô thận và nguyên bào sợi, đã được

sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu sinh học tế bào nhờ ưu điểm tăng trưởng ổn

định, khả năng dễ lưu trữ, sinh trưởng và phát triển, thể hiện nhiều chức năng chuyên

biệt của tế bào thận người và có khả năng thay đổi các phân tử protein giống như

người để thể hiện các hoạt động sinh học [169], [267], [279]. HEK 293 còn được sử

dụng để sản xuất protein, dùng cho virus trị liệu trong liệu pháp gen [121].

b Hình 1.14 Tế bào HEK 293 nhuộm miễn dịch huỳnh quang và Tế bào HEK 293 trong môi trường nuôi cấy “Nguồn: Iznewton, 2014” [325]

Mô hình in vivo

Mô hình gây tổn thương thận với cisplatin: Cisplatin là một hợp chất platinum

được sử dụng rộng rãi để điều trị các loại ung thư như ung thư buồng trứng, ung thư

đầu, cổ, tử cung… Độc thận là tác dụng phụ thường gặp và quan trọng nhất của việc

hóa trị bằng cisplatin. Cisplatin gây hoại tử ống thận cấp, với các cơ chế chính được

báo cáo gồm stress oxy hóa và viêm [215]. Cisplatin được hấp thu chủ yếu qua kênh

vận chuyển cation hữu cơ 2 (OCT2) tại ống thận gần. Sau khi được hấp thu, cisplatin

được kích hoạt thành dạng phản ứng cao, tạo liên kết chéo bên trong và ở giữa các

ADN, làm thay đổi cấu trúc ADN và ức chế tổng hợp ADN, protein, ARN. Cisplatin

phản ứng cao đồng thời phản ứng nhanh chóng với các phân tử chứa thiol bao gồm

glutathion (GSH) gây suy giảm hoặc bất hoạt GSH và các chất chống oxy hóa dẫn

đến sự tích tụ ROS nội sinh trong các tế bào, kích thích trung gian gây viêm và dẫn

đến hoại tử tế bào ống thận.

Hình 1.15 Stress oxy hóa và viêm trong tổn thương thận do cisplatin

“Nguồn: Perazella, 2012” [214]

Thử nghiệm độc tính do cisplatin được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1971 [141].

Trong những năm qua, các nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng độc tính trên thận của

cisplatin phụ thuộc vào liều và sự tích lũy. Nhiễm độc thận có thể được gây ra bởi

liều duy nhất hoặc lặp lại của cisplatin. Tùy thuộc vào liều lượng và tần suất tiêm

cisplatin, động vật có thể biểu hiện mức độ nghiêm trọng khác nhau của tổn thương

thận cấp tính (giai đoạn sớm) và mãn tính (tiến triển). Ở động vật gặm nhấm, cisplatin

thường được tiêm phúc mô (i.p.), đường tiêm tĩnh mạch (i.v.) hoặc tiêm dưới da (s.c.)

ít sử dụng hơn. Tổn thương thận cấp tính thường được gây ra bởi liều duy nhất

cisplatin (i.p.), tuy nhiên cũng có thể gây ra bởi tiêm liều thấp trong vài ngày liên tiếp.

Tuy nhiên, trong trường hợp tiêm nhiều lần, những thay đổi lâm sàng và mô học ở

thận phát triển chậm hơn so với dùng liều duy nhất [215].

Gây tổn thương thận cấp: Khi dùng cisplatin liều thấp duy nhất sẽ gây độc thận

thấp (ví dụ, 5 - 8 mg/kg ở chuột nhắt và 1 - 3 mg/kg ở chuột cống) gây ra tổn thương

thận nhẹ có thể thấy 4-5 ngày sau khi dùng cisplatin trên mô học hoặc đôi khi là

những thay đổi trong nước tiểu và máu. Ở chuột nhắt, khi dùng cisplatin liều duy nhất

thấp gây độc thận sẽ không ảnh hưởng đến nồng độ BUN hoặc creatinin huyết thanh.

Khi sử dụng liều độc thận cao (ví dụ, 10 – 16 mg/kg ở chuột nhắt và 3-8 mg/kg ở

chuột cống) sẽ gây ra những thay đổi tối thiểu (như giảm ty thể, giảm tế bào chất …)

1 - 2 ngày đầu, trong khi những thay đổi về hình thái (như mất đường viền bàn chải,

các tế bào hoại tử trong lòng ống thận) thường được ghi nhận không sớm hơn 3 - 4

ngày sau khi dùng cisplatin. Mức BUN, creatinin tăng thường được quan sát từ 3 - 7

ngày sau khi dùng cisplatin và sau đó trở về mức cơ bản trong vòng 14 ngày. Dấu

hiệu tái tạo cấu trúc đầu tiên được quan sát thấy 7 ngày sau khi tiêm cisplatin. Tuy

nhiên, trong trường hợp sử dụng liều gây chết, tử vong có thể xảy ra trong vòng 10

ngày [215]. Trong trường hợp sử dụng cisplatin lặp đi lặp lại liên quan đến sự gia

tăng theo thời gian của các thông số. Tuy nhiên, thời gian gây bệnh cũng phụ thuộc

vào liều lượng, tần suất tiêm cisplatin. Ví dụ, điều trị bằng cisplatin ở chuột cống (1

mg/kg mỗi ngày trong 14 ngày) dẫn đến tổn thương thận từ ngày thứ 5 trở đi.

Creatinin tăng gấp 2-3 lần kể từ ngày thứ 5 trở đi, trong khi BUN gấp 3 lần vào ngày

thứ 5 và tăng đến 6 lần vào ngày 14. Glucose được phát hiện trong nước tiểu từ ngày

thứ 5 trở đi (gấp 150 lần vào ngày thứ 5, gấp 18 lần vào ngày 7 và gấp 5 lần vào ngày

14), mà không có bất kỳ thay đổi nào về glucose huyết thanh. Kiểm tra mô học cho

thấy tỷ lệ mắc bệnh và mức độ nghiêm trọng của thay đổi hình thái tăng theo thời

gian. Gây tổn thương thận mãn: Các nghiên cứu đã chứng minh liều gây độc duy nhất

cisplatin không chỉ gây tổn thương thận cấp tính mà còn có thể tác động lâu dài đối

với cấu trúc và chức năng của thận chuột. 20 ngày sau khi tiêm cisplatin (5 mg/kg)

ghi nhận đặc điểm mô học của bệnh thận mạn tính như xơ hóa kẽ thận, teo ống thận.

Xơ hóa cũng được quan sát xung quanh các ống thận 14 và 28 ngày sau tiêm liều duy

nhất cisplatin (6 mg/kg). 15 tháng sau khi tiêm liều duy nhất cisplatin (6 mg/kg) đã

giảm đáng kể độ lọc cầu thận, thẩm thấu nước tiểu và tăng số lượng ống lượn gần bất

thường (teo hoặc tăng sản), như biểu hiện của xơ cứng cầu thận và xơ hóa mô kẽ.

Điều này chỉ ra rằng tác dụng gây độc thận của cisplatin là lâu dài ở chuột, giống như

ở người [215].

Mô hình gây độc thận với gentamycin: Gentamycin là kháng sinh

aminoglycosid phổ rộng được dùng trong trường hợp nhiễm khuẩn Gram âm và Gram

dương. Cơ chế gây độc đã được đề cập liên quan đến stress oxy hóa, tăng peroxyd

hóa lipid màng, biến tính protein, tổn thương ADN và tế bào [256]. Các mô hình in

vivo gây tổn thương thận do gentamycin đã được báo cáo (Bảng 1.5).

Bảng 1.7 Một số nghiên cứu trên mô hình in vivo gây độc thận

Tác giả Năm Đối tượng Tác nhân Liều

Chuột đực Sohn và cộng sự [264] 2011 Cisplatin i.p. 7 mg/kg vào ngày thứ 14 Sprague-Dawley

Chuột đực uống thuốc thử 2 ngày trước và 8 ngày sau tiêm Ugur và cộng sự [286] 2015 Cisplatin Wistar Albino cisplatin i.p. 7 mg/kg.

Chuột đực uống thuốc thử 30 ngày và tiêm cisplatin i.p. 12 Almaghrabi và cộng sự [25] 2015 Cisplatin Albino mg/kg trong 5 ngày.

Chuột Öktem và cộng sự [199] 2005 Vancomycin 200 mg/kg ngày 2 lần trong 7 ngày, i.p.

Ortega và cộng sự [284] 2005 Chuột nhắt Gentamicin 200 mg/kg * 2 lần mỗi ngày trong 4 ngày liên tiếp

Palani và cộng sự [207] 2009 Chuột nhắt Acetaminophen 750 mg/kg, P.O trong 24 giờ

Adeneye và cộng sự [18] 2008 Chuột nhắt Acetaminophen liều duy nhất 800 mg/kg, i.p, pha trong nước muối

Cekmen và cộng sự [58] 2009 Chuột nhắt Acetaminophen liều duy nhất 800 mg/kg, ip

liều duy nhất 700 mg/kg, i.p., pha trong propylene Kheradpezhouh và cộng sự [137] 2010 Chuột nhắt Acetaminophen glycol và nước cất (50:50)

Mô hình gây độc thận với vancomycin: Vancomycin là một glycopeptid ức chế

sự tổng hợp peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn dùng cho nhiễm khuẩn Gram

dương với tác dụng phụ thường gặp là gây độc thận. Độc tính trên thận từ 0 - 17%

trong các trường hợp đơn trị liệu và 7 - 35% trường hợp phối hợp với các kháng sinh

khác. Các nghiên cứu đã cho thấy vai trò của oxy hóa tiền viêm, rối loạn chức năng ty

lạp thể và apoptosis gây ra các tổn thương chính. Sử dụng đồng thời (hoặc dự phòng)

các chất chống oxy hóa trên chuột tổn thương ống thận có suy giảm superoxid

dismutase sẽ cải thiện tình trạng thận trên kết quả mô học [199].

Mô hình gây độc thận với acetaminophen: Acetaminophen là thuốc giảm đau

được sử dụng rộng rãi nhất trên thế giới. Tuy nhiên, nó cũng được biết là nguyên nhân

gây xơ gan và suy thận trên người và động vật khi quá liều. Một số nghiên cứu trên mô

hình độc thận với acetaminophen đã được báo cáo với liều sử dụng từ 600 – 800 mg/kg

bằng cả đường uống và tiêm i.p. (Bảng 1.5).

Nghiên cứu sử dụng mô hình in vitro gây tổn thương tế bào thận người HEK 293

và mô hình in vivo gây tổn thương thận chuột nhắt với tác nhân cisplatin với cơ chế

gây độc thận đã được biết rõ.

1.7. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ

Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa

Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro bằng phương pháp DPPH [26]: Hoạt

tính chống oxy hóa in vitro của mẫu được xác định thông qua phản ứng đánh bắt gốc

tự do (DPPH). Phản ứng dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)

có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch ethanol bão hoà. Khi cho các chất

thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà các gốc tự do sẽ làm

giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxy hoá

được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của mẫu thử so với đối chứng khi đọc

trên máy Elisa ở bước sóng 515 nm. Hoạt tính chống oxy hóa được biểu hiện qua giá

trị IC50, được xác định thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử mà ở

đó 50% các gốc tự do tạo bởi DPPH được trung hòa bởi chất thử.

Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp MDA [7], [194]: Malonyl

diadehyd (MDA) là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào,

là chỉ thị của tổn thương oxy hóa ở các tế bào và mô. MDA khi cho phản ứng với acid

thiobarbituric tạo phức màu hồng có đỉnh hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm. Đo

cường độ phức xác định hàm lượng MDA của mẫu, từ đó đánh giá khả năng chống

oxy hóa của chất nghiên cứu thể hiện qua việc làm giảm hàm lượng MDA.

Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp định lượng GSH [229]:

Glutathion (GSH) là hợp chất thiol đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ các tế

bào khỏi tổn thương do stress oxy hóa. Định lượng GSH có vai trò quan trọng trong

việc đánh giá tình trạng oxy hóa và chuyển hóa của các hệ thống sinh hóa in vitro và

in vivo. Định lượng GSH gợi ý cơ chế gây tổn thương oxy hóa khử của mẫu thử.

(2-nitrobenzoic) (hay thuốc thử Ellman) dẫn đến sự hình thành GSSG và acid 5-

thio-2-nitrobenzoic (TNB). GSSG sau đó được khử thành GSH bởi glutathion

reductase và NADPH. Lượng TNB hình thành tỷ lệ với lượng GSH có trong mẫu

và được xác định bằng cách đo sự hình thành TNB ở 415 nm.

Phương pháp thực hiện dựa trên nguyên tắc GSH bị oxy hóa bởi acid 5,5′-dithio-bis-

Khảo sát sự tăng trưởng tế bào bằng test MTT [72]. Tỷ lệ sống của tế bào được

xác định nhờ hoạt tính enzym succinat dehydrogenase (SDH) của ty thể chỉ có trong

tế bào sống. SDH chuyển thuốc thử MTT [3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl

tetrazolium bromid)] thành tinh thể formazan tan trong dung môi hữu cơ như

isopropanol acid hóa tạo dung dịch màu tím hấp thu ở bước sóng 570 nm, phản ánh số

lượng tế bào sống trong mẫu nuôi cấy.

Khảo sát hoạt tính enzym gan (ALT, AST) [71]: Các enzym aspartat

aminotransferase (AST) và alanin aminotransferase (ALT) đóng vai trò quan trọng

trong chuyển hóa của các acid amin. ALT xúc tác sự chuyển nhóm amin của L-alanin

sang α-ketoglutarat để tạo thành pyruvat và L-glutamat, AST xúc tác chuyển nhóm

amin của L-aspartat sang α-ketoglutarat để tạo thành oxaloacetat và L- glutamat. Bình

thường, AST và ALT chỉ có trong tế bào và hoạt độ của chúng trong huyết thanh rất

thấp. Nhưng khi tế bào gan bị tổn thương, AST và ALT sẽ giải phóng từ tế bào gan

vào máu làm cho hoạt độ của chúng trong huyết thanh tăng.

Khảo sát thông số đánh giá chức năng thận (urea, creatinin): Ure là sản phẩm

thoái hóa của protein, tổng hợp chủ yếu ở gan và lọc qua thận, một phần được tái hấp

thu ở ống thận. Creatinin là sản phẩm thoái hóa của creatin phosphat ở cơ. Creatinin

được lọc hoàn toàn qua cầu thận và không tái hấp thu, bài tiết một lượng nhỏ ở ống

thận. Đo hàm lượng ure, creatinin trong máu đánh giá được một phần chức năng thận.

Khảo sát chức năng gan, thận thông qua định lượng GSH, MDA: Trong cơ

thể, GSH tồn tại tự do hoặc kết hợp với protein tạo nên glutathion toàn phần. Hơn 90%

glutathion tự do ở trạng thái có nhóm –SH (GSH), một phần nhỏ ở dạng oxy hóa có

nhóm –S-S- (GSSG). GSSG được chuyển thành dạng GSH nhờ enzym glutathion

reductase. Lượng GSH tăng chứng tỏ tác dụng chống oxy hóa mạnh. Lượng GSH được

xác định dựa trên nguyên tắc GSH bị oxy hóa bởi DTNB hay thuốc thử Ellman [229].

Xác định khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid thông qua định lượng MDA sinh

ra trong các cơ quan gan, thận bằng phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) tạo phức

màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm [7], [194].

Khảo sát tình trạng hoại tử tế bào [71]: Lactat dehydrogenase (LDH) là một

enzym nằm ở tế bào chất, xúc tác cho sự chuyển đổi qua lại giữa lactat và pyruvat.

Sự giải phóng LDH có thể được hiểu là sự mở màng tế bào hoặc sự chết của tế

bào. Quá trình khử hydro của lactat thành pyruvat, chuyển NAD thành NADH. NADH

khử muối tetrazolium tan trong nước tạo formazan màu cam. Lượng formazan hình

thành tỷ lệ thuận với lượng LDH giải phóng vào môi trường.

Khảo sát tình trạng viêm bằng định lượng nồng độ TNF-α [209]: Yếu tố hoại

tử khối u α (tumor necrosis factor, TNF-α) là một protein tín hiệu tế bào (cytokin) đóng

vai trò chính trong viêm, chết theo chương trình, tăng sinh, xâm lấn, di căn. Các protein

này hoạt động trong vai trò là các chất trung gian điều hòa giữa các tế bào trong cơ thể.

TNF-α được sản xuất chủ yếu bởi các đại thực bào được kích hoạt. Định lượng TNF-

α giúp đánh giá tình trạng viêm của tế bào. Hàm lượng TNF-α có thể định lượng bằng

phương pháp miễn dịch ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay - xét nghiệm

hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym) dựa vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể.

Khảo sát biểu hiện của yếu tố phiên mã Nrf2: Yếu tố phiên mã Nrf2 đóng vai

trò quan trọng trong điều hoà tổng hợp các chất chống oxy hóa của cơ thể. Thông qua

việc đánh giá biểu hiện của yếu tố Nrf2 giúp đánh giá khả năng và cơ chế chống oxy

hóa của các chất thử. Biểu hiện của protein Nrf2 thường được đánh giá bằng phương

pháp miễn dịch Western blot [276]. Phương pháp này sử dụng điện di trên gel để phân

tách các protein còn nguyên vẹn bằng cấu trúc 3D hay protein đã biến tính theo độ dài

của mạch polypeptid. Protein này sau đó sẽ được chuyển lên màng (nitrocellulose hay

PVDF). Trên màng, các protein mục tiêu được cho liên kết với kháng thể đặc hiệu.

Đánh giá đại thể, vi thể tổn thương gan, thận trên tiêu bản mô bệnh học: Quan

sát đại thể, vi thể giúp khẳng định tình trạng và mức độ tổn thương. Cơ quan gan, thận

được thu thập khi kết thúc thời gian thử nghiệm. Đánh giá thay đổi đại thể các cơ quan

bằng cách quan sát tổn thương bằng mắt thường, ghi nhận các đặc điểm về màu sắc,

tình trạng bề mặt gan, thận…; Các cơ quan cũng được cắt, nhuộm hematoxylin-eosin

(HE) để phân tích vi thể, đánh giá thay đổi mức độ tổn thương trên hình ảnh mô dưới

kính hiển vi quang học.

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU

Các nội dung nghiên cứu được bố trí thực hiện theo sơ đồ sau:

Chiết xuất cao toàn phần

Định danh

Khảo sát chất lượng dược liệu

Dược liệu Bí kỳ nam

Cao nước

Cao cồn 96%

Cao cồn 70%

Cao cồn 50%

- Định lượng polyphenol toàn phần - Hoạt tính sinh học in vitro

Cao tiềm năng

Khảo sát độc tính cấp và bán trường diễn

Hóa phân tích thực vật

Độc tính cấp

Độc tính bán trường diễn

Khảo sát chất lượng cao

- Chiết phân đoạn: EtOAc, n-butanol, nước - Định lượng polyphenol - Hoạt tính chống oxy hóa (DPPH, MDA)

Cao EtOAc tiềm năng

Chất phân lập: BK1, BK2

Khảo sát tác động dược lý

Khảo sát tác động bảo vệ thận / tác nhân cisplatin

Khảo sát tác động bảo vệ gan / tác nhân CCl4

In vivo: chuột nhắt

In vitro: tế bào HepG2

In vitro: tế bào HEK 293

Test thử: MTT; LDH

GSH; Nrf2

TNF-α

GSH; Nrf2

 ALT, AST, LDH  GSH, MDA gan   Đại thể, vi thể gan

 Ure, creatinin, LDH  GSH thận  TNF-α  Đại thể/vi thể thận

Hình 2.1 Sơ đồ tiến hành nghiên cứu

2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.2.1. Mẫu thử

Dược liệu thân củ Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack.) được thu hái tại

rừng quốc gia Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang vào tháng 02/2014. Dược liệu được định

danh bởi PGS. TS. Trương Thị Đẹp và so sánh với các tài liệu của tác giả Võ Văn Chi

[5], Huxley [123].

2.2.2. Dòng tế bào

Các dòng tế bào gồm tế bào ung thư phổi người (NCI-H460), tế bào ung thư vú

người (MCF-7), tế bào ung thư cổ tử cung người (HeLa), tế bào ung thư cơ vân người

(RD) (CCL-136™), tế bào biểu mô thận heo (LLC-PK1) (ATCC CL-101), tế bào biểu

mô thận khỉ (Vero), tế bào ung thư gan người HepG2 (ATCC HB8065), tế bào phôi

thận người HEK 293 (CRL 1573™) được cung cấp bởi American Type Culture

Collection (ATCC). Các dòng tế bào được hoạt hóa và lưu giữ tại Viện Pasteur Thành

phố Hồ Chí Minh và Trung tâm công nghệ sinh học Tp. Hồ Chí Minh.

2.2.3. Động vật thử nghiệm

Chuột nhắt giống Swiss albino được cung cấp bởi Viện vaccin và sinh phẩm

y tế Nha Trang. Chuột khỏe mạnh, không có biểu hiện bất thường, được nuôi ở nhiệt

độ phòng trong bocal nhựa có nắp lưới inox được thiết kế đặc biệt cho phép chuột tiếp

xúc với thức ăn và nước uống. Lồng nuôi, kệ và các thiết bị phụ kiện được làm sạch

và vệ sinh định kỳ một cách thích hợp. Chuột được nuôi ổn định trong môi trường thí

nghiệm 3 – 5 ngày trước khi tiến hành thử nghiệm.

2.3. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Thời gian nghiên cứu: 08/2014 – 08/2019.

Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Dược lý, Khoa Dược, Đại học Y dược Thành phố

Hồ Chí Minh; Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí

Minh; Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm công nghệ sinh học Thành

phố Hồ Chí Minh; Bệnh viện Bình An Kiên Giang.

2.4. DUNG MÔI , HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ

Bảng 2.1 Danh mục dung môi, hóa chất đã sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên nguyên liệu Hãng/nước sản xuất

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl- Sigma-Aldrich, Mỹ 1 tetrazolium bromid (MTT)

Acemuc® (N-acetyl cystein 200 mg) (lô Sanofi-Aventis 2 17005, hạn sử dụng 08/02/2020).

Acid ethylen diamin tetraacetic (EDTA) Merck & Co., Inc, Đức 3

4 Acid protocatechuic Toronto Research Chemicals

5 Acid thiobarbituric (TBA) Sigma-Aldrich, Mỹ

6 Acid tricloroacetic (TCA) Guangdong Guanghua, TQ

7 Agarose Bio Basic, Canada

8 β-mercaptoethanol Bio Basic, Canada

9 Chemsol, Việt Nam (CH3COO)2Pb 1%

10 Cisplatin Sigma-Aldrich, Mỹ

11 Cloroform Bio Basic, Canada

12 Cồn 96%, 70%, 50% Chemsol, Việt Nam

13 Cytotoxicity LDH assay kit – WST Dojindo, Nhật

14 Dầu ô liu nguyên chất Fragata, Tây Ban Nha

15 Dichloromethan (DCM) Chemsol, Việt Nam

16 Dimethyl sulfoxid (DMSO) Prolabo, Pháp

17 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl hydrat) Sigma-Aldrich, Mỹ

Bio Basic, Canada 18 Đệm CTAB

Sigma-Aldrich, USA 19 Đệm phosphat

Eagle’s Minimum Essential (EMEM) Gibco, Mỹ 20

Bio Basic, Canada 21 Enzym RNase

Guangdong Guanghua, TQ 22 Ethanol

Chemsol, Việt Nam 23 EtOAc

24 Chemsol, Việt Nam FeCl3

Chemsol, Việt Nam 25 H2SO410%/EtOH

26 Huyết thanh thai bò (FCS) Gibco, Mỹ

27 Isoamyl alcohol Bio Basic, Canada

28 Isopropanol Merck & Co., Inc, Đức

29 Kali clorid (KCl) Guangdong Guanghua, TQ

30 Kháng thể kháng Nrf2 (ab62352) Abcam, Mỹ

31 Kháng thể horseradish peroxidase (ab97051) Abcam, Mỹ

L-catechin 32 Toronto Research Chemicals

L-glutamin 33 Sigma-Aldrich, Mỹ

L-glutathion reduced (GSH chuẩn) Sigma-Aldrich, Mỹ 34

Loading dye 6x 35 Promega, Mỹ

36 Methanol Guangdong Guanghua, TQ

37 Mouse TNF alpha ELISA® Kit (ab208384) Abcam, Mỹ

38 N-acetyl cystein (lô 201803094033) Frabbica Italiana Sintetici

Chemsol, Việt Nam 39 Na2CO3

40 NaOH Chemsol, Việt Nam

41 Natri clorid (NaCl) Guangdong Guanghua, TQ

n-BuOH 42 Chemsol, Việt Nam

43 Paclitaxel (Anzatax® 30 mg/5 ml) Mayne Pharma, New Zealand

PCR Mix 44 NEXpro, Korea

Pyrogallol 45 Sigma-Aldrich, Mỹ

46 Quercetin Sigma-Aldrich, Mỹ

47 Silymarin 70 mg (Légalon® 70 Protect) Madaus, Đức

48 Silymarin Sigma – Aldrich

49 Tetraclorid carbon Guangdong Guanghua, TQ

50 Thang chuẩn 1 kb plus Promega, Mỹ

51 Thuốc nhuộm GelRed Promega, Mỹ

Thuốc thử Ellman Sigma-Aldrich, Mỹ 52

Thuốc thử Folin - Ciocalteu Merck & Co., Inc, Đức 53

Tris acetat EDTA (TAE) 1X 54 Promega, Mỹ

Tris acetat EDTA (TE) pH 8,0 55 Promega, Mỹ

56 Tris- HCl Merck & Co., Inc, Đức

57 Trypan blue Sigma-Aldrich, Mỹ

58 Trypsin-EDTA Gibco, Mỹ

59 Vanillin sulfuric Chemsol, Việt Nam

Bảng 2.2 Danh mục thiết bị đã sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên thiết bị - dụng cụ Hãng sản xuất

1 Bể siêu âm Elma, Đức

2 Bếp cách thủy Memmert, Đức

3 Cân kĩ thuật Sartorius, Thụy Sĩ

4 Cân phân tích Kern, Đức

5 Đèn UV 2 bước sóng CN- 15- LC Vilber Lourmart

6 Máy chu kỳ nhiệt GeneAmp PCR System 2700 Amplied Biosys, Singapore

7 Máy chụp ảnh điện tử Canon, Nhật

8 Máy cô quay R- 200 Buchi

9 Máy đo pH Orion Thermo Scientific, Mỹ

10 Máy đo quang Multiskan Thermo Electron, Mỹ

11 Máy đo tín hiệu quang hóa ChemiDoc-It515 Analytik Jena, Mỹ

12 Máy LC- MS (hệ thống Waters Alliance 2695) Waters, Mỹ

13 Máy ly tâm lạnh Hitachi, Nhật

14 Máy NMR AVANCE 500 Brucker, Đức

15 Máy sinh hóa AU480 Beckman Coulter, Inc, Mỹ

16 Máy sinh hóa ADVIA 1800 Siemens, Đức

17 Tủ đông -20 oC , -80 oC Toshiba, Nhật

18 Tủ sấy Gallenkamp, Mỹ

Falcon 15, 50 ml; pipet 5, 10, 25 ml, micropipet; bình nuôi cấy 75 cm2; eppendorf

1,5 ml, 2 ml; đĩa nuôi cấy 6 hoặc 96 giếng; máng; đầu tip; các màng lọc milipore 0,45

µm, 0,22 µm; buồng đếm tế bào; găng tay... Các dụng cụ được gói trong giấy và hấp

tiệt trùng ở nhiệt độ 121oC trong 30 phút. Bơm tiêm cho chuột uống thuốc, bơm tiêm

1 ml, bông gòn, kéo, kẹp. Bocal, lồng nuôi chuột, vỉ lưới...

2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.5.1. Khảo sát dược liệu

2.5.1.1. Khảo sát đặc điểm thực vật và mã vạch ADN

Khảo sát đặc điểm hình thái: Các đặc điểm hình thái được quan sát bằng mắt

thường, kính lúp hay kính hiển vi quang học; mô tả và chụp ảnh các đặc điểm khảo sát.

Tên khoa học của loài được xác định dựa vào đặc điểm hình thái đã phân tích của cây

và so với các tài liệu của tác giả Võ Văn Chi (1991) [5], Huxley (1978) [123].

Khảo sát đặc điểm giải phẫu: Cắt ngang thân, rễ (đường kính 2 – 4 mm), lá thành

lát mỏng bằng dao lam. Thân cây được cắt ở phần lóng, phiến lá được cắt ở 1/3 phía

dưới của phiến. Nhuộm vi phẫu bằng son phèn và lục iod. Quan sát vi phẫu trong nước

bằng kính hiển vi quang học (Olympus, model QH20). Chụp ảnh và mô tả cấu trúc.

oC đến khô, nghiền và rây qua rây số 32 (đường kính lỗ rây 0,1 mm). Quan sát thành

Bột dược liệu: Phần thân củ Bí kỳ nam được cắt nhỏ và sấy ở nhiệt độ 60 – 70

phần của bột dưới kính hiển vi quang học. Chụp ảnh và mô tả các thành phần.

Khảo sát đặc điểm mã vạch ADN: Thực hiện phản ứng PCR khuyếch đại vùng

trình tự rbcL trong ADN lục lạp cloroplast (cpDNA) của mẫu Bí kỳ nam.

Tách chiết ADN toàn phần: ADN toàn phần từ mô lá được tách chiết theo phương

pháp của Doyle và Doyle (1990) [77] tóm tắt như sau: Nghiền lá non, phá màng tế bào

trong đệm CTAB 2X, ủ ở 65 oC 15 phút. Bổ sung CTAB, trộn đều, ly tâm 13000 rpm

10 phút, loại cắn tế bào. Chiết ADN bằng β-mercaptoethanol ở 65 oC 60 phút, thêm

500 µl cloroform, trộn đều, ly tâm 13000 rpm 10 phút. Rửa ADN bằng cloroform (2

lần, ly tâm 13000 rpm 10 phút/lần). Hút lấy 350 µl lớp dịch bên trên, thêm 5 µl RNase,

lắc đều, ủ 37 oC 2 giờ. Sau đó, thêm CTAB 2X và 500 µl cloroform, ly tâm 13000 rpm

10 phút. Hút 400 µl lớp dịch, thêm 400 µl isopropanol, trộn đều, ủ ở -20 oC 30 phút,

ly tâm 13000 rpm 10 phút. Thu tủa ADN, rửa 2 lần bằng ethanol 70%, làm khô trong

1 giờ, hòa tan trong 30 µl TE và bảo quản ở -20 oC.

Kiểm tra ADN: Bằng cách điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X. Trộn mẫu

với 1 µl loading dye 6X, 1 µl ADN, 1 µl GelRed, 3 µl nước cất, bơm mẫu vào giếng,

chạy điện di ở 85V 30 phút. Sau đó, chụp ảnh với máy đọc gel bằng UV.

Khuếch đại ADN: Sử dụng PCR Kit (NEXproTM Diagnostics) gồm 10X e-Taq

Buffer, 10 mM dNTP, e-Taq ADN polymerase, thêm nước cất, cặp mồi rbcL và ADN

để có thể tích 50 µl. Trộn đều, cho vào máy GeneAmp PCR System 2700, thực hiện

PCR với chu trình nhiệt như sau: 5 phút -95 oC; (30 giây -95 oC, 30 giây -60 oC, 30

giây -72 oC) x 35 chu kỳ; 5 phút -72 oC, sau đó giữ ở 10 oC 20 phút. Sản phẩm PCR

được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.

Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự ADN: Sản phẩm PCR được tinh sạch

bằng kit Wizard SV Gel và PCR Clean-up System (Promega), xác định trình tự bằng

phương pháp Sanger (1977) [245] tại Công ty Phù Sa Biochem, tỉnh Vĩnh Long.

Phân tích số liệu: Trọng lượng phân tử được tính toán bằng phần mềm

GelAnalyzer. Kết quả giải trình tự được lưu trữ ở dạng FASTA và phân tích bằng phần

mềm BioEdit phiên bản 7.0.5. Trình tự được so sánh với trình tự tương ứng đã được

công bố trên GenBank bằng phương pháp BLAST, từ đó kết luận mã vạch phân tử để

định danh loài.

2.5.1.2. Khảo sát chất lượng dược liệu

Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật của dược liệu

Áp dụng phương pháp Ciulei cải tiến [66], [1]: Thực hiện trên 20 g dược liệu,

chiết hỗn hợp các chất trong dược liệu thành 3 phân đoạn theo độ phân cực tăng dần,

thu được 50 ml dịch chiết ether ethylic, 50 ml dịch chiết ethanol, 50 ml dịch chiết nước

rồi dùng các phản ứng hóa học đặc trưng để phát hiện các nhóm hợp chất.

Định tính alkaloid: Bằng thuốc thử Mayer và Dragendoff. Nếu dung dịch đục

hơn so với ống chứng hoặc có tủa trắng – vàng nhạt (Mayer), đỏ cam (Dragendoff): có

alkaloid.

Định tính các acid hữu cơ: Với tinh thể natri carbonat. Nếu có các bọt khí nhỏ

sủi lên từ các tinh thể Na2CO3: có acid hữu cơ.

Định tính chất béo: Nếu tại nơi nhỏ dịch chiết có vết trong mờ: có chất béo.

Định tính các chất khử: Dịch chiết phản ứng với dung dịch Fehling A và Fehling

B. Đun. Nếu có kết tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm: có các hợp chất khử.

Định tính coumarin: a. Phản ứng với dung dịch KOH 10% trong cồn trên giấy

lọc. Che một nửa vết dịch chiết và soi dưới đèn tử ngoại 365nm. Sau vài phút, nếu

phần bị che có cường độ phát quang yếu hơn nửa không bị che: có coumarin. b. Phản

ứng dịch chiết với KOH 10%. Đun cách thủy và soi dưới đèn tử ngoại 365nm. Dung

dịch có huỳnh quang mạnh: có coumarin.

Định tính flavonoid bằng phản ứng cyanidin (Shinoda): Dung dịch có màu từ

hồng tới đỏ: có flavonoid.

Định tính glycosid tim: Phản ứng Raymon-Marthoud, nếu xuất hiện màu tím: có

các cardenolid glycosid tim. Định tính đường 2-desoxy: Phản ứng với 5ml thuốc thử

xanthydrol, nếu có màu hồng đến đỏ mận: có đường 2-desoxy.

Định tính saponin: Phản ứng tạo bọt với cồn 25%, nếu có bọt bền: có saponin.

Định tính tannin: Phản ứng với thuốc thử FeCl3 5%, nếu dung dịch có màu xanh

đen hay xanh rêu: có polyphenol; phản ứng với dung dịch gelatin muối, nếu có tủa

bông trắng: có tannin.

Định tính triterpenoid: Phản ứng với thuốc thử Salkowski.

Khảo sát độ ẩm, độ tro toàn phần và độ tro không tan trong acid của dược liệu:

Tiến hành theo Phụ lục 9.6, 9.8, 9.7 Dược điển Việt Nam V [4].

Định tính polyphenol bằng phản ứng hóa học: Cân 5 g bột dược liệu cho vào

bình nón, thêm 50 ml ethanol 50%, lắc đều, đun hồi lưu cách thủy khoảng 2 giờ. Lọc,

thu dịch lọc để thực hiện các phản ứng.

Phản ứng với FeCl3 2%: 2 ml dung dịch thử pha loãng, thêm vài giọt FeCl3 2%.

Phản ứng NaOH 20%: 2 ml dung dịch thử, thêm vài giọt NaOH 20%.

Phản ứng với (CH3COO)2Pb: 2 ml dung dịch thử, vài giọt (CH3COO)2Pb 1%.

Định lượng polyphenol toàn phần: Hàm lượng polyphenol toàn phần trong mẫu

thử được xác định bằng phương pháp Folin – Ciocalteu. Thuốc thử là một hỗn hợp của

phosphomolybdat và phosphotungstat được sử dụng cho phản ứng màu trong ống

nghiệm nhằm đánh giá các chất chống oxy hóa phenol và polyphenol [261].

Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 50 mg pyrogallol chuẩn vào

bình định mức 100 ml thêm cồn 50% để hòa tan và vừa đủ đến vạch. Hút chính xác 5

ml dung dịch cho vào bình định mức 50 ml, thêm cồn 50% vừa đủ, lắc đều (nồng độ

pyrogallol 50 µg/mL). Xây dựng đường chuẩn: Hút chính xác lần lượt 0,1 ml; 0,2 ml;

0,3 ml; 0,4 ml; 0,5 ml dung dịch chuẩn vào các ống nghiệm riêng biệt, thêm lần lượt

0,4 ml; 0,3 ml; 0,2 ml; 0,1 ml và 0 ml cồn 50% vào mỗi ống nghiệm ứng (dãy nồng độ

của pyrogallol là 10 - 50 μg/ml). Sau đó thêm vào mỗi ống 0,5 ml thuốc thử Folin –

Ciocalteu, 1,5 ml dung dịch Na2CO3 29% và 2,5 mL nước cất, lắc đều. Ly tâm 5 phút,

tốc độ 5000 rpm để lắng các tinh thể Na2CO3 29%. Hút 2 ml dịch trong các dung dịch

vào cốc đo quang. Đo độ hấp thu của các dung dịch ở bước sóng 760 nm. Chuẩn bị

song song 1 mẫu trắng gồm thuốc thử Folin – Ciocalteu, Na2CO3 29% và nước cất.

Chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác 1 g bột dược liệu Bí kỳ nam vào bình

nón, chiết bằng cồn 50% rồi lọc qua giấy lọc cho đến khi dịch lọc không đổi màu khi

phản ứng với FeCl3. Cô toàn bộ dịch lọc bằng chén sứ tới cắn. Hòa tan cắn trong nước

cất (siêu âm cho cắn tan hoàn toàn) sau đó lọc qua giấy lọc. Cho toàn bộ dịch lọc vào

một bình định mức 50ml, thêm nước vừa đủ (dịch A). Hút 1 ml dịch A cho vào bình

định mức 50ml, thêm nước vừa đủ (dịch B). Cho vào ống nghiệm lần lượt 500 µl dịch

B, 500 µl thuốc thử Folin – Ciocalteu và 1,5 ml dung dịch Na2CO3 29%, thêm nước

cất vừa đủ 5 ml. Lắc kỹ và để ống nghiệm ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng trong 30

phút. Hút 2 mL dịch trong vào cốc đo quang. Đo mật độ quang ở 760 nm. Mỗi mẫu

được lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình. Hàm lượng polyphenol toàn phần trong dược

liệu Bí kỳ nam được xác định dựa trên phương trình đường chuẩn pyrogallol thu được.

𝑎.𝑉.𝑘

Kết quả được thể hiện bằng đơn vị mg pyrogallol/g dược liệu.

Hàm lượng polyphenol trong dược liệu được tính bằng công thức: P= 𝑚 (1−𝑤)

Trong đó: P: hàm lượng polyphenol tổng (mg pyrogallol/g dược liệu); a: nồng độ xác

định từ đường chuẩn với pyrogallol (µg/ml); V: thể tích dung dịch đo (ml); k: hệ số

pha loãng; m: khối lượng dược liệu (g), w: độ ẩm của dược liệu (%).

2.5.2. Chiết xuất và sàng lọc các cao toàn phần

2.5.3. Chiết xuất các cao toàn phần

Dược liệu thân củ Bí kỳ nam được rửa sạch, thái lát, phơi khô, xay nhỏ thành bột,

sàng qua rây có đường kính lỗ rây 2 mm. Chiết với 4 dung môi nước, cồn 50%, cồn

oC, chiết 3 lần, 30 phút /lần. Dịch chiết được bốc hơi dung môi trên bếp cách thủy ở

70%, cồn 96% theo tỷ lệ 1 g bột dược liệu với 10 ml dung môi trên bếp cách thủy 90

50 oC thu cao, hút ẩm đến khối lượng không đổi.

Tính hiệu suất chiết H theo công thức: H (%) = (m1- m2)/ m1 x 100%, trong đó,

m1 và m2 lần lượt là khối lượng (g) của dược liệu khô và cao thu được sau khi chiết.

2.5.4. Sàng lọc các cao toàn phần

2.5.4.1. Định lượng polyphenol toàn phần

Chuẩn bị dung dịch thử: Hòa tan mỗi cao Bí kỳ nam trong nước cất đến nồng độ

50 µg/ml sau đó lọc qua giấy lọc. Cho vào ống nghiệm lần lượt 500 µl dịch lọc, 500 µl

thuốc thử Folin - Ciocalteu, 1,5 ml dung dịch Na2CO3 29%, thêm nước cất vừa đủ 5

ml. Lắc kỹ và để ống nghiệm ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng trong 30 phút. Đo mật

độ quang ở 760 nm. Tiến hành tương tự với dung dịch chuẩn pyrogallol (10 - 50 μg/ml)

bằng cách cho vào dãy ống nghiệm 500 µl dung dịch ở từng nồng độ, sau đó là các

thành phần còn lại. Mẫu trắng bao gồm thuốc thử Folin – Ciocalteu, Na2CO3 29% và

nước cất. Mỗi mẫu được lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình. Hàm lượng polyphenol

toàn phần trong cao cồn Bí kỳ nam được xác định dựa trên phương trình đường chuẩn

pyrogallol thu được. Kết quả được thể hiện bởi đơn vị mg pyrogallol/g cao.

2.5.4.2. Khảo sát hoạt tính sinh học in vitro

Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro bằng phương pháp DPPH [26]

Thuốc thử: Pha dung dịch DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 90 µM trong

methanol. Chỉ pha dung dịch này trước khi dùng vì dung dịch này không bền với ánh

sáng. Khi pha xong đựng trong chai thủy tinh màu nâu, đậy kín nút.

Mẫu thử: Pha dãy mẫu quercetin ở 10 nồng độ: 5 µg/ml; 4,5 µg/ml; 4 µg/ml; 3,8

µg/ml; 3,6 µg/ml; 3,4 µg/ml; 3,2 µg/ml; 3 µg/ml; 2,5 µg/ml; 2 µg/ml; 1 µg/ml. Pha

giai mẫu cao dược liệu: khảo sát ở các nồng độ khác nhau.

Tiến hành phản ứng và đo quang: Mỗi mẫu thử (2 ml) ở từng nồng độ khảo sát

được cho phản ứng với đồng lượng dung dịch DPPH. Lắc đều hỗn hợp phản ứng, để

yên trong tối ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Đo quang ở bước sóng 515 nm.

Mỗi mẫu được đo 3 lần, lấy giá trị trung bình. Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO)

được theo công thức: HTCO% = [(ODchứng – ODthử) / ODchứng] x 100

ODchứng: độ hấp thu của mẫu chứng, ODthử: độ hấp thu của mẫu thử

Từ các giá trị HTCO, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ của

mẫu thử và HTCO; từ đo suy ra giá trị IC50 (nồng độ có HTCO là 50%).

Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa ex vivo bằng phương pháp MDA [194]

Tiến hành: Nghiền đồng thể gan chuột trong dung dịch KCl 1,15% (tỉ lệ 1 g:10

ml) ở nhiệt độ 0 - 5 oC. Dùng 0,1 ml mẫu thử các cao toàn phần Bí kỳ nam ở các nồng

độ khác nhau phản ứng với 0,5 ml dịch đồng thể gan. Thêm đệm phosphat 50 mM vừa

đủ 2 ml, ủ hỗn hợp phản ứng trong 15 phút ở 37 oC và dừng phản ứng bằng 1 ml acid

tricloacetic 10%. Sau khi ly tâm (3000 vòng/10 phút), lấy 1 ml dịch trong phản ứng

với 1 ml acid thiobarbituric 0,8% ở 100 oC trong 15 phút. Làm lạnh và đo độ hấp thu

ở bước sóng 532 nm. Mẫu chứng được tiến hành trong cùng điều kiện nhưng không sử

dụng cao. Quercetin được dùng làm chất chứng dương. Thực hiện 3 lần, lấy giá trị

trung bình.

Tính hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) theo công thức: HTCO (%) = [(ODchứng -

ODthử)/ODchứng] x 100, trong đó ODchứng và ODthử lần lượt là độ hấp thu của mẫu chứng

và mẫu thử. Thông qua phương trình hồi quy, xác định IC50 của mẫu thử.

Khảo sát tác động lên sự tăng trưởng tế bào in vitro

Tác động của các cao chiết toàn phần dược liệu Bí kỳ nam được khảo sát trên sự

tăng trưởng của các dòng tế bào: Tế bào ung thư phổi người NCI-H460, tế bào ung thư

vú người MCF-7, tế bào ung thư cổ tử cung người HeLa, tế bào ung thư cơ vân người

RD, tế bào ung thư gan người HepG2, tế bào biểu mô thận heo LLC-PK1 và tế bào

biểu mô thận khỉ Vero bằng cách đánh giá tỷ lệ tế bào sống qua test MTT của Denizot

và Lang (1986) [72].

Dung dịch MTT 5 mg/ml: Pha MTT trong nước khử khoáng, vortex đều. Lọc qua

màng lọc 0,22 µm, bảo quản ở -20 oC.

Dung dịch isopropanol acid hóa: Cho 1 µl HCl đậm đặc vào 1 ml dung dịch

isopropanol.

Thao tác: Các tế bào được nuôi cấy trong môi trường EMEM được cung cấp 10%

FCS, 2 mM L-glutamin, 100 IU/ml penicillin, và 100 µg/ml streptomycin ở 37oC, 5%

CO2. Sau đó, các tế bào được trypsin hóa, thu nhận và đếm số tế bào sống bằng xanh

trypan và được chuyển vào các dĩa 96 giếng ở nồng độ 104 tế bào/ giếng. Sau khi ủ 24

giờ, bổ sung môi trường có chứa mẫu thử dược liệu ở các nồng độ thử nghiệm vào giếng,

ủ trong 24 giờ ở 37oC, 5% CO2. DMSO ở các nồng độ khác nhau tương ứng với nồng độ

các mẫu thử được dùng như mẫu trắng. Sử dụng chất chứng dương là Paclitaxel (PTX, biệt

dược Anzatax® 30 mg/5 ml) ở nồng độ 10 µM. Mỗi nồng độ được lặp lại trên 6 giếng.

Sau 24 giờ xử lý, tiến hành hút bỏ môi trường nuôi cấy. Thêm 100 µl môi trường chứa

MTT/giếng. Hút bỏ môi trường chứa MTT. Thêm 100 µl dung dịch isopropanol acid

hóa/giếng. Ủ ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng trong 15 phút. Lắc rung trong 10 phút

và đo mật độ quang OD ở 570 nm trên máy đọc microplate MultiskanTM

ThermoScientific.

2.5.5. Chiết xuất và khảo sát cao toàn phần, cao phân đoạn Bí kỳ nam

Dựa trên kết quả về hiệu suất chiết, hàm lượng polyphenol toàn phần và các hoạt

tính sinh học in vitro/ex vivo của các cao toàn phần Bí kỳ nam, nghiên cứu lựa chọn

cao cồn 50% để tiếp tục khảo sát chất lượng. Từ 4 kg dược liệu khô thân củ Bí kỳ nam

được làm ẩm với cồn 50% trong 60 phút. Nạp mẫu vào bình ngấm kiệt. Cho cồn 50%

vào bình chiết, mức dung môi cao hơn bề mặt dược liệu 15 cm. Ngâm trong 24 giờ.

Rút dịch chiết đến khi lượng cắn ít hơn 0,1%. Gộp dịch chiết, cô thu hồi dung môi thu

2133 g cao lỏng. Lắc phân bố cao lỏng với ethyl acetat (6 x 1000 ml), thu được cao

ethyl acetat (245,3 g), dịch cồn nước tiếp tục phân bố lỏng - lỏng với n-butanol (7 x

1000 ml) thu được cao n-butanol (270,7 g), dịch nước còn lại cô, thu cao nước. Cao

cồn 50% được đánh giá chất lượng dựa trên các tiêu chuẩn chung theo Dược điển Việt

Nam V [4] về: Cảm quan, độ ẩm, độ tro toàn phần, độ tro không tan trong acid, định

Dược liệu

Chiết với cồn 50 %

Cao cồn toàn phần

Lắc với EtOAc Bay hơi dung môi

Cao ethyl acetat (245,3 g)

Dịch nước

Lắc với n- BuOH bão hòa Bay hơi dung môi

Cao butanol (270,7 g)

Cao nước

tính, định lượng polyphenol.

Sơ đồ 2.1. Quy trình chiết xuất các cao phân đoạn Bí kỳ nam

Các cao phân đoạn của cao cồn 50% Bí kỳ nam được khảo sát về độ ẩm, hàm

lượng polyphenol toàn phần và hoạt tính chống oxy hóa in vitro, ex vivo bằng các

phương pháp DPPH và MDA. Từ kết quả khảo sát hàm lượng polyphenol toàn phần

và hoạt tính chống oxy hóa in vitro, ex vivo của các cao phân đoạn, lựa chọn cao phân

đoạn tiềm năng để phân lập chất. Việc phân lập được thực hiện tại Bộ môn dược liệu

– Khoa dược, Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh. Sử dụng các phương pháp sắc

ký lớp mỏng, sắc ký cột cổ điển, sắc ký rây phân tử khảo sát các phân đoạn, tinh chế

và phân lập hợp chất tinh khiết, thu được hợp chất BK1, BK2. Kiểm tra độ tinh khiết

các chất phân lập trên sắc ký lớp mỏng. Dựa vào phổ khối MS và phổ cộng hưởng từ

hạt nhân NMR (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) để xác định cấu trúc của

các hợp chất phân lập.

Cao EtOAc (A)

VLC

23 phân đoạn A-1- A-23

A-8

A-9

A-10

A-4

Cột Sephadex

A8.2

Chưa thu được chất

A-9.2

BK1 (20 mg)

BK2 (10 mg)

Sơ đồ 2.2. Quy trình phân lập chất từ cao phân đoạn Bí kỳ nam

2.5.6. Khảo sát độc tính cấp của cao cồn 50% Bí kỳ nam

Cao cồn 50% Bí kỳ nam được pha ở nồng độ tối đa có thể bơm qua kim cho

uống (500 mg/ml) nhằm khảo sát độc tính cấp. Cho chuột thử nghiệm (6 chuột đực, 6

chuột cái) nhịn đói ít nhất 12 giờ trước khi cho uống cao Bí kỳ nam thể tích 0,2 ml/10

g trọng lượng chuột. Theo dõi và ghi nhận các triệu chứng bất thường và số lượng

chuột chết trong 72 giờ. Nếu có chuột chết thì xét nghiệm đại thể chủ yếu gan, thận,

tim, phổi. Nếu sau 72 giờ, chuột không có dấu hiệu bất thường hoặc chết, tiếp tục theo

dõi trong 14 ngày [2], [6].

2.5.7. Khảo sát tác động dược lý hướng bảo vệ gan của Bí kỳ nam

2.5.7.1. Khảo sát tác động bảo vệ gan in vitro

Tham khảo kết quả nghiên cứu trước đây của tác giả Đỗ Thị Hồng Tươi và cộng

sự (2014) [13] đã xây dựng mô hình in vitro mô phỏng tình trạng tổn thương tế bào

gan HepG2 do CCl4 gây ra, nghiên cứu lựa chọn các thông số khảo sát gồm: mật độ

nuôi cấy tế bào 1 x 105 tế bào/ml, CCl4 nồng độ 2 mM, thời gian nuôi cấy 24 giờ.

Thiết kế thí nghiệm gồm các bước:

Bước 1: Khảo sát tác động của các mẫu thử lên sự tăng trưởng tế bào

Chuẩn bị mẫu thử: Dung dịch CCl4 22 mM được hòa tan trong DMSO và nước

cất và lọc vô trùng qua màng lọc 0,22 µm ngay trước khi xử lý tế bào. Nồng độ cuối

cùng của CCl4 trong môi trường nuôi cấy là 2 mM. Cao cồn 50% Bí kỳ nam và cao

EtOAc được hòa tan trong DMSO thu dung dịch nồng độ 110 mg/ml và 220 mg/ml.

Chất BK1, BK2 được hòa tan trong DMSO ở nồng độ 11 mM và 22 mM (tương ứng

với BK1: 3,19 mg/ml và 6,38 mg/ml; BK2: 1,694 mg/ml và 3,388 mg/ml). Nồng độ

cuối cùng tối đa của DMSO trong môi trường nuôi cấy là 0,1% (v/v). Các dung dịch

được vô trùng bằng chiếu UV/60 phút, bảo quản ở -20ºC. Trước khi xử lý tế bào, các

dung dịch được hòa tan trong môi trường nuôi cấy để đạt nồng độ cuối cùng cần thí

nghiệm. Nồng độ cuối cùng trong môi trường nuôi cấy của cao là: 100 μg/ml và 200

μg/ml; Nồng độ cuối cùng trong môi trường nuôi cấy của chất BK1, BK2 là: 10 μΜ và

20 μΜ. Nồng độ cuối cùng của silymarin trong môi trường nuôi cấy là 100 μg/ml.

Nuôi cấy tế bào: Dòng tế bào HepG2 được hoạt hóa tại Trung tâm công nghệ

sinh học Thành phố Hồ Chí Minh. Tế bào được nuôi trong môi trường EMEM, bổ sung

10% FCS, 2 mM L-glutamin, 100 IU/ml penicilin, 100 µg/ml streptomycin, trong bình

nuôi cấy 75 cm2, ủ ở 37 oC, 5% CO2. Khi tế bào đạt trạng thái đông tụ (độ phủ 70 -

80%), thu tế bào theo quy trình xử lý với trypsin, đếm tế bào và chia vào đĩa nuôi cấy

6 hoặc 96 giếng với mật độ 1 x 105 tế bào/ml.

Xử lý tế bào: Tế bào được xử lý với các mẫu thử ở các nồng độ khác nhau hoặc

đối chứng dương silymarin 100 μg/ml, có hoặc không bổ sung CCl4 2 mM, sau đó ủ

trong 24 giờ ở 37 °C, 5% CO2. Môi trường nuôi cấy gồm DMSO 0,1% được sử dụng

như đối chứng âm.

Các mẫu thử nghiệm gồm:

- Mẫu sinh lý: Tế bào HepG2 nuôi cấy trong môi trường, không xử lý.

- Mẫu bệnh: Tế bào HepG2 được xử lý với CCl4 2 mM.

- Mẫu đối chứng dương: HepG2 xử lý với CCl4 2 mM và silymarin 100 μg/ml.

- Mẫu thử: Tế bào HepG2 được xử lý với CCl4 2 mM và mẫu thử (cao thử hoặc

chất phân lập) ở từng nồng độ khác nhau.

Bước 2: Khảo sát tác động bảo vệ tế bào gan HepG2 của các mẫu thử trong

phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng, tình trạng hoại tử tế bào và stress oxy hóa do

CCl4 gây ra

Tác động bảo vệ gan của mẫu thử được đánh giá qua % bảo vệ tổn thương do

CCl4 gây ra theo công thức:

Khảo sát sự tăng trưởng của tế bào: Tế bào HepG2 được nuôi trong đĩa 96 giếng,

sau 24 giờ xử lý với mẫu thử hoặc chất đối chứng, tế bào được đánh giá tỷ lệ sống bằng

test MTT.

Khảo sát tình trạng hoại tử tế bào: Tình trạng hoại tử tế bào được đánh giá qua

hoạt tính enzym lactat dehydrogenase (LDH) phóng thích vào môi trường bằng kit

“Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST” (Dojindo). Tế bào được nuôi cấy và xử lý trong

đĩa 96 giếng ủ 37oC trong 24 giờ, 5% CO2. Hút chuyển 100 μl môi trường nuối cấy

vào đĩa 96 giếng, thêm 100 μl dung dịch phản ứng vào mỗi giếng. Ủ tối ở nhiệt độ

phòng trong 30 phút. Thêm 50 μl dung dịch ngừng phản ứng. Đo độ hấp thu ở 490 nm.

Định lượng glutathion nội bào

Chuẩn bị hoá chất:

Dung dịch KCl 1,15%: Hòa tan 1,15 g KCl trong 100 ml nước khử khoáng

Dung dịch đệm Tris-HCl pH 8,9: Cân 48,44g Tris base và 8,32g EDTA, hòa trong

800 ml nước khử khoáng. Chỉnh pH với HCl 3N đến pH 8,9. Thêm nước khử khoáng

vừa đủ 1000 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

TCA 10 %: Cân 10 g TCA pha trong 100 ml nước khử khoáng. Bảo quản ở 4°C.

Thuốc thử Ellman: Hòa tan 29,7 mg thuốc thử/25 ml methanol. Bảo quản ở 4°C.

Dung dịch GSH chuẩn: Hòa tan 1,54 mg bột L-Glutathion reduced trong 10 ml

nước khử khoáng, thu dung dịch có nồng độ 500 nmol/ml. Từ dung dịch GSH 500

nmol/ml, pha loãng với nước khử khoáng tạo dãy nồng độ 0,195 – 500 nmol/ml.

Thao tác: Tế bào HepG2 được nuôi cấy trong đĩa 6 giếng. Sau 24 giờ ủ ở 37 °C,

5% CO2, thay môi trường, xử lý tế bào trong 24 giờ với CCl4 2 mM có hoặc không bổ

sung mẫu thử hoặc chất đối chứng. Rửa tế bào một lần với dung dịch PBS 1X lạnh và

thu nhận tế bào. Ly tâm 5000 vòng/phút ở 4 oC trong 5 phút, thu cắn tế bào. Hòa trong

KCl 1,15% lạnh, siêu âm trong đá thu dịch ly giải tế bào. Thêm dung dịch TCA 10%

(1v/1v mẫu), vortex đều, ly tâm thu dịch nổi. Lấy 50 µl dịch nổi hoặc GSH chuẩn cho

vào đĩa 96 giếng, thêm 200 µl Tris-HCl và 20 µl thuốc thử Ellman 150 µM. Lắc đều,

để yên 5 phút ở nhiệt độ phòng. Đo OD ở 412 nm.

Hàm lượng GSH (nmol/ml dịch đồng thể) được tính theo phương trình hồi quy

tuyến tính của chất chuẩn GSH. Từ đó, suy ra hàm lượng GSH (nM/mg protein).

Định lượng protein bằng phương pháp Bradford [48]

Đường cong chuẩn độ của BSA: Hòa tan 2 mg BSA (Sigma-Aldrich, Mỹ) trong

1 ml dung dịch PBS 1X, thu dung dịch BSA 2 mg/ml. Pha loãng liên tiếp ½ trong dung

dịch PBS 1X lạnh để thu dãy dung dịch có nồng độ 2,0 -1,0 - 0,5 - 0,25 - 0,125 - 0,0625

- 0,0312 -0 mg/ml.

Thuốc thử Bio-Rad: Hòa tan 100 mg Brilliant Blue G 250 (Sigma-Aldrich, Anh)

trong 50 ml dung dịch methanol, thêm 100 ml acid phosphoric H3PO4 85% (w/v). Cho

từ từ hỗn hợp vào 850 ml nước cất, vortex đều. Lọc qua giấy lọc, bảo quản trong chai

màu, tránh ánh sáng ở 4 oC.

Thao tác: 5 µl dịch ly giải tế bào ở trên hoặc dung dịch BSA được cho vào đĩa 96

giếng, thêm 100 µl thuốc thử Bio-Rad. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, lắc rung 1

phút. Đo OD ở bước sóng 590 nm trên máy đọc VersaTM Microplate Reader. Dựa vào

đường chuẩn độ của BSA (0 - 2 mg/ml) để tính nồng độ protein toàn phần.

Bước 3: Khảo sát cơ chế hoạt hóa yếu tố điều hòa stress oxy hóa Nrf2

Chuẩn bị mẫu: Tế bào HepG2 sau khi xử lý với các mẫu thử được rửa với PBS

lạnh, hút bỏ PBS, thu tế bào. Bổ sung đệm ly giải CAO (HEPES, NaCl, β-

glycerophosphat, Na2-4-Nitrophenylphosphat.6H2O, Na2EDTA.2H2O, pH 7,9) có bổ

sung 1 mM DTT và 1 mM PMSF; ủ lạnh trong 30 phút. Ly tâm 500 vòng/phút trong

10 phút ở 4°C, thu dịch nổi. Định lượng protein trong mẫu bằng phương pháp Bradford,

xác định lượng mẫu cần nạp vào mỗi giếng. Bổ sung 2X Laemmli vào mỗi mẫu. Ly

tâm mẫu ở 8000 vòng trong 5 giây. Ủ ở nhiệt độ 95 °C trong 10 phút và lắng mẫu ở

8000 vòng trong 5 giây.

Chuẩn bị gel điện di: Pha gel polyacrylamid 10% có bổ sung sodium dodecyl

sulfate (SDS) (phương pháp điện di SDS - PAGE) kích thước 1,5 mm (thành phần pha

gel gồm: Tris 1,5 M pH 8,8, SDS 1%, AA / Bis AA40%, TEMED, APS 40% và nước

cất vừa đủ), cài lược vào gel và để đông 30 phút. Sau khi gel đông, tháo lược, rửa giếng

và đặt vào khuôn chạy điện di. Bổ sung dung dịch chạy điện di (gồm các thành phần

Tris 1 M pH 6,8, SDS 1%, AA/Bis AA40%, TEMED, APS 40%, nước cất vừa đủ).

Nạp mẫu: Lượng mẫu tương ứng 10 µg protein toàn phần được nạp vào mỗi giếng

của bản gel. Thiết lập điện thế 100V trên bản gel trong 2 giờ, các protein di chuyển với

tốc độ khác nhau phụ thuộc vào khối lượng phân tử.

Chuyển màng: Các protein sau khi phân tách trên bản gel được chuyển lên màng

lai PVDF đã hoạt hóa với methanol với điện thế 20 V trong 2 giờ, sau đó được xử lý

với BSA 5% trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.

Ủ kháng thể sơ và thứ cấp: Màng lai sau xử lý được ủ với kháng thể sơ cấp Nrf2

(1 : 2000) của Abcam (ab62352) qua đêm ở 4°C. Rửa với đệm TBST (Tween 20 trong

đệm Tris-saline). Tiếp tục ủ với kháng thể thứ cấp có gắn enzym horseradish

peroxidase của Abcam (ab97051) trong vòng 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Rửa với TBST.

Hiện màu với thuốc thử phát quang (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Phân tích và chụp

ảnh gel trên máy đọc tín hiệu quang hóa ChemiDoc-It515. Cường độ các vết được đo

và ghi nhận bằng phần mềm Image J.

2.5.7.2. Khảo sát tác động bảo vệ gan in vivo

Bố trí thí nghiệm

Chuột được chia ngẫu nhiên thành 8 lô, mỗi lô 8 con, như sau:

- Lô sinh lý: Chuột uống nước cất trong 14 ngày liên tục.

- Lô chứng bệnh: Chuột uống nước cất trong 14 ngày liên tục và tiêm phúc mô CCl4

0,2% pha trong dầu oliu.

- Lô đối chiếu: Chuột uống silymarin liều 100 mg/kg trong 14 ngày liên tục và

tiêm phúc mô CCl4 0,2% pha trong dầu oliu.

- Các lô thử: Chuột uống cao dược liệu Bí kỳ nam hoặc chất phân lập ở các nồng

độ (tính toán dựa vào thử nghiệm độc tính cấp và thử nghiệm in vitro) trong 14 ngày

liên tục và tiêm phúc mô CCl4 0,2% pha trong dầu oliu.

Trong 14 ngày liên tục, chuột được cho uống nước cất hoặc silymarin hoặc cao

thử hay các chất phân lập phân tán trong nước cất, thể tích uống là 10 ml/kg cân nặng,

1 lần/ngày vào khoảng 8 - 11 giờ sáng. Tất cả chuột được cung cấp nước uống và thức

ăn cám viên không giới hạn trong quá trình thí nghiệm. Chuột được theo dõi và ghi

nhận trọng lượng cơ thể mỗi ngày. Vào ngày thứ 15, chuột được tiêm phúc mô dầu ô

liu (lô sinh lý) hoặc CCl4 0,2% pha trong dầu ô liu (các lô còn lại), thể tích tiêm 10

ml/kg. Sau khi gây tổn thương gan chuột bằng CCl4 trong dầu oliu, chuột được cho

nhịn đói qua đêm. Sáng ngày thứ 16 (24 giờ sau tiêm CCl4), chuột được gây mê bằng

đá CO2, mổ lấy máu tim để tiến hành các xét nghiệm sinh hóa đánh giá hoạt tính men

gan ALT, AST, định lượng TNF-α, LDH và tách gan để quan sát mô bệnh học (đại

thể, vi thể), định lượng MDA, GSH gan.

Khảo sát hoạt tính AST, AST: Máu tim chuột được ly tâm 3000 vòng/phút trong

10 phút ở 25 oC, thu huyết tương dùng để xác định hoạt tính enzym gan ALT (alanin

aminotransferase), AST (aspartat aminotransferase) bằng phương pháp đo động học

enzym bằng bộ kit thử và máy sinh hóa ADVIA 1800 (Siemens) tại Bệnh viện Bình

An, Thành phố Rạch Giá, Tỉnh Kiên Giang (vận chuyển mẫu ngay sau khi thu huyết

tương trong điều kiện bảo quản lạnh với đá khô, thời gian vận chuyển 8 giờ).

Khảo sát tình trạng hoại tử: Nồng độ LDH trong huyết tương chuột được định

lượng bằng phương pháp động học enzym trên máy sinh hóa Beckman Coulter AU480

tại Bệnh viện Bình An, Thành phố Rạch Giá, Tỉnh Kiên Giang.

Khảo sát tình trạng viêm: Nồng độ TNF-α huyết tương chuột được định lượng

bằng Mouse TNF alpha SimpleStep ELISA® Kit (ab208348) (Abcam, US).

Tiến hành: Chuẩn bị dãy nồng độ TNF-α chuẩn (nồng độ 0 – 3000 pg/ml) với

dung dịch pha loãng 10BS (theo quy trình của nhà sản xuất). Cho 50 µl mẫu thử hoặc

dung dịch chuẩn vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng đã phủ kháng thể cố định. Bổ sung

50 µl hỗn hợp kháng thể thứ cấp và kháng thể phát hiện vào mỗi giếng. Đậy bề mặt

đĩa và ủ trong tối ở nhiệt độ phòng trên máy lắc rung 400 vòng/phút trong 1 giờ. Rửa

giếng với 350 µl đệm rửa 1X x 3 lần cho mỗi giếng. Hút bỏ hoàn toàn dung dịch rửa.

Lần rửa cuối, trút ngược đĩa trên giấy thấm. Bổ sung 100 µl cơ chất TMB (3,3′,5,5′-

Tetramethylbenzidin) và ủ trong tối trên máy rung 400 vòng/phút trong 20 phút. Thêm

100 µl dung dịch ngừng phản ứng vào mỗi giếng. Lắc rung đĩa trong 1 phút. Đo quang

ở bước sóng 450 nm.

Định lượng GSH gan: Hàm lượng GSH trong gan được đánh giá với thuốc thử

Ellman [229].

Tiến hành: Một phần gan được nghiền đồng thể trong KCl 1,15% theo tỉ lệ 1 g

gan tươi/10 ml ở nhiệt độ 0 - 4°C. Hút 100 μl dịch đồng thể cho vào eppendorf, thêm

2 x 50 μl đệm TCA 10%. Ly tâm lạnh ở 4 oC tốc độ 5000 vòng/phút trong 15 phút, thu

dịch trong. Hút 50 μl dịch trong cho vào đĩa 96, thêm 200 μl đệm Tris.HCl pH 8,9 và

20 μl thuốc thử Ellman 10 mM. Trộn đều trên máy lắc rung đĩa 96 trong 1 phút, để yên

ở nhiệt độ phòng 3 phút, đo độ hấp thu ở bước sóng 405 nm trên máy Powerwave HT

(BioTek, Mỹ). Hàm lượng GSH (nmol/ml dịch đồng thể) được tính theo phương trình

hồi quy tuyến tính của chất chuẩn GSH (3,125 nmol/ml đến 1000 nmol/ml). Từ đó,

suy ra hàm lượng GSH (nmol/mg protein) của mẫu gan.

Định lượng MDA gan: Hàm lượng MDA gan được đánh giá bằng phản ứng với

thuốc thử TBA [194].

Tiến hành: Hút 300 μl dịch đồng thể gan cho vào eppendorf, thêm 300 μl đệm

Tris-HCl 0,2 M. Trộn đều, ủ ở 37 oC trong 60 phút. Thêm 300 μl TCA 10% vào mỗi

eppendorf. Ly tâm lạnh 4 oC 9600 vòng/phút trong 15 phút. Lấy 300 μl dịch trong cho

vào eppendorf mới, thêm 150 μl TBA 0,8%, trộn đều. Đun cách thủy ở 100 oC trong

15 phút. Để nguội, hút 200 μl ở mỗi eppendorf cho vào giếng trong đĩa 96, đo độ hấp

thu ở 532 nm trên máy Powerwave HT (BioTek, Mỹ). Hàm lượng MDA (nmol/ml dịch

đồng thể) được tính theo phương trình của MDA chuẩn (0,312 – 40 nmol/ml). Từ đó

suy ra hàm lượng MDA (nmol/mg protein) của mẫu gan.

Định lượng protein toàn phần: Nồng độ protein toàn phần được xác định bằng

phương pháp Bradford [48].

Tiến hành: Hút 5 µl dịch trong thu được từ dịch đồng thể gan hoặc dung dịch

BSA cho vào đĩa 96 giếng. Thêm 100 µl thuốc thử Bio-rad. Ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút,

lắc rung 2 phút, đo độ hấp thu ở 590 nm trên máy Elisa quang phổ Powerwave HT

(BioTek, Mỹ). Dựa vào đường cong chuẩn độ BSA (0 - 2 mg/ml) để tính nồng độ

protein toàn phần trong gan.

Phân tích đại thể và vi thể gan: Tiến hành: Tách lấy gan chuột, rửa sạch bằng

NaCl 0,9% lạnh, thấm khô, cân và ghi nhận trọng lượng gan. Quan sát đại thể, ghi nhận

các đặc điểm về màu sắc, tình trạng bề mặt gan, tổn thương… Một phần gan được cố

định trong formol 10% để làm xét nghiệm vi thể bằng phương pháp nhuộm

hematoxylin-eosin (HE). Cấu trúc, hình thái tế bào gan được quan sát dưới kính hiển

vi quang học để đánh giá mức độ tổn thương gan tại khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện

Quận 2, Thành phố Hồ Chí Minh.

2.5.8. Khảo sát tác động dược lý hướng bảo vệ thận của Bí kỳ nam

Tác động chống oxy hóa, bảo vệ thận của dược liệu Bí kỳ nam được khảo sát ở

mức độ in vitro trên mô hình gây độc tế bào phôi thận người HEK 293 và ở mức độ in

vivo trên mô hình gây độc thận chuột bằng cisplatin.

2.5.8.1. Khảo sát tác động bảo vệ thận in vitro

Bố trí thí nghiệm:

Bước 1. Xây dựng mô hình in vitro mô phỏng tình trạng tổn thương thận do

cisplatin gây ra trên dòng tế bào HEK 293 bằng cách khảo sát sơ bộ các thông số về

mật độ tế bào nuôi cấy, thời gian xử lý và nồng độ cisplatin

Chuẩn bị mẫu thử: Dung dịch cisplatin (TLPT: 300,01 g/mol) 11 mM được pha

trong DMSO và lọc vô trùng (màng lọc 0,22 μm) ngay trước khi sử dụng. Dung dịch

mẹ được pha loãng trong môi trường nuôi cấy để đạt nồng độ khảo sát là 12,5; 25; 50

và 100 μΜ trước khi xử lý tế bào.

Nuôi cấy tế bào: Tế bào HEK 293 được nuôi trong môi trường DMEM, bổ sung

10% FCS, 2 mM L-glutamin, 100 IU/ml penicilin, 100 µg/ml streptomycin, trong bình

nuôi cấy 75 cm2, ủ ở 37 oC, 5% CO2. Khi tế bào đạt trạng thái đông tụ (độ phủ 70 -

80%), thu tế bào theo quy trình xử lý với trypsin, đếm tế bào và chia vào đĩa nuôi cấy

với mật độ 0,5 x 105 tế bào/ml, 1 x 105 tế bào/ml, 2 x 105 tế bào/ml..

Xử lý tế bào: Ủ tế bào 24 giờ ở 37 oC, 5% CO2, thay môi trường nuôi cấy và xử

lý tế bào với cisplatin ở các nồng độ 0, 12,5; 25; 50 và 100 µM trong 24, 48, 72 giờ.

Khảo sát tỷ lệ tế bào HEK 293 sống bằng phương pháp MTT, chọn các thông số

thích hợp cho các thử nghiệm tiếp theo.

Bước 2. Khảo sát tình trạng hoại tử tế bào và tình trạng tăng sinh gốc tự do

của tế bào HEK 293 do cisplatin gây ra với các thông số đã chọn

Khảo sát tình trạng hoại tử tế bào thông qua hoạt tính enzym lactat dehydrogenase

(LDH) ngoại bào bằng kit “Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST” (Dojindo), tương tự

nội dung phần 2.2.8.1.

Khảo sát tình trạng tăng sinh gốc tự do bằng phương pháp định lượng GSH, tương

tự nội dung phần 2.2.8.1.

Bước 3. Khảo sát tác động bảo vệ tế bào thận HEK 293 của các mẫu thử trong

phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng, tình trạng hoại tử tế bào và stress oxy hóa do

cisplatin gây ra

Sau khi chọn được mô hình gây tổn thương tế bào thận bằng cisplatin thích hợp

theo các thông số (mật độ nuôi cấy, thời gian xử lý và nồng độ cisplatin), khảo sát tác

động bảo vệ tế bào thận của mẫu thử so với chứng dương là N-acetyl cystein (NAC).

Tác động bảo vệ tế bào thận HEK 293 của mẫu thử được đánh giá qua % phòng

ngừa tổn thương do cisplatin gây ra theo công thức:

Kết quả của mẫu thử bảo vệ thận – kết quả của mẫu bệnh lý

% phòng ngừa = x 100%

Kết quả của mẫu sinh lý – kết quả của mẫu bệnh lý

Chuẩn bị mẫu thử: Pha NAC mẹ 1100 mM: Lấy 3590 mg N-acetylcystein (MW:

163,2 g/mol) pha trong 20ml DMSO, kiểm tra tan hoàn toàn, lọc vô trùng, bảo quản -

20oC. Nồng độ cuối cùng trong môi trường nuôi cấy của NAC là 1000 μM. Các mẫu

thử được chuẩn bị tương tự như nội dung 2.2.8.1.

Xử lý tế bào: Tế bào được chia vào các đĩa nuôi cấy với mật độ thích hợp được

lựa chọn. Sau khi ủ tế bào 24 giờ ở 37 oC, 5% CO2, thay môi trường nuôi cấy và xử lý

tế bào với cisplatin và mẫu thử. Các mẫu thử nghiệm gồm:

- Mẫu sinh lý: Tế bào HEK 293 nuôi cấy trong môi trường, không xử lý.

- Mẫu bệnh: Tế bào HEK 293 được xử lý với cisplatin.

- Mẫu đối chứng dương: Tế bào HEK 293 xử lý với cisplatin và NAC 1000 μM.

- Mẫu thử: Tế bào HEK 293 được xử lý với cisplatin và mẫu thử (cao thử hoặc

chất phân lập) ở các nồng độ khác nhau.

Sau khi xử lý tế bào, thu nhận môi trường nuôi cấy và tế bào để thực hiện các thử

nghiệm khảo sát sự tăng trưởng tế bào bằng test MTT, tình trạng hoại tử tế bào với kit

“Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST” và tình trạng stress oxy hóa với test định lượng

GSH (tương tự nội dung 2.5.7.1).

Bước 4. Khảo sát biểu hiện của protein Nrf2 bằng kỹ thuật western blot

Biểu hiện của protein Nrf2 trong tế bào HEK 293 được khảo sát bằng phương

pháp western blot với các bước xử lý mẫu, ly trích protein, điện di trên gel, chuyển

màng, lai màng với kháng thể sơ cấp Nrf2 (ab62352) và phát hiện với thuốc thử huỳnh

quang tương tự như đối với tế bào HepG2 trong mô hình gây độc gan in vitro bởi CCl4.

2.5.8.2. Khảo sát tác động bảo vệ thận in vivo

Chuột được chia ngẫu nhiên thành 8 lô, mỗi lô 10 con.

- Lô sinh lý: Chuột uống nước cất.

- Lô chứng bệnh: Chuột uống nước cất và tiêm i.p. cisplatin 16 mg/kg.

- Lô đối chiếu: Chuột uống NAC 100 mg/kg và tiêm i.p. cisplatin 16 mg/kg.

- Các lô thử: Chuột uống cao dược liệu, chất phân lập và tiêm cisplatin 16 mg/kg.

Chuột được cho uống nước cất, NAC hoặc mẫu thử trong 13 ngày liên tục, thể

tích 10 ml/kg cân nặng, 1 lần/ngày vào khoảng 8 - 11 giờ sáng. Ngày 11, chuột ở các

lô chứng bệnh, thử và đối chiếu được tiêm i.p. cisplatin pha trong NaCl 0,9%, liều duy

nhất 16 mg/kg. Lưu ý mang găng tay, khẩu trang và kính phòng hộ khi thao tác với

cisplatin. Ngày 14, sau khi tiêm cisplatin được 72 giờ, chuột được gây ngạt bằng đá

CO2, mổ lấy máu tim để định lượng ure, creatinin, TNF-α, LDH và tách thận, rửa sạch

bằng nước muối sinh lý lạnh, thấm khô. Quan sát đại thể, ghi nhận đặc điểm về màu

sắc, tình trạng bề mặt, tổn thương. Một phần thận được ngâm trong dung dịch formol

10% để phân tích vi thể, một phần ngâm trong KCl 1,15% với tỷ lệ 1 g: 10 ml để định

lượng GSH.

Đánh giá chỉ số sinh hóa: Máu tim chuột được cho vào ống EDTA, ly tâm 3000

vòng/phút trong 10 phút ở 25 oC, thu huyết tương để định lượng ure, creatinin bằng bộ

kit thử và máy sinh hóa ADVIA 1800 (Siemens) tại Bệnh viện Bình An, Thành phố

Rạch Giá, Kiên Giang.

Đánh giá tình trạng hoại tử: Nồng độ LDH trong huyết tương chuột được định

lượng bằng phương pháp động học enzym trên máy sinh hóa Beckman Coulter AU480

tại Bệnh viện Bình An, Thành phố Rạch Giá, Tỉnh Kiên Giang.

Đánh giá tình trạng viêm: Nồng độ TNF-α huyết tương chuột được định lượng

bằng phương pháp ELISA với kit Mouse TNF alpha ELISA® (ab208348) (Abcam,

US), tương tự nội dung 2.5.7.2.

Định lượng protein toàn phần trong gan: Protein toàn phần trong dịch đồng thể

thận được định lượng bằng phương pháp Bradford, tương tự nội dung 2.5.7.2.

Định lượng GSH thận: Hàm lượng GSH trong dịch đồng thể thận được đánh giá

bằng phản ứng với thuốc thử Ellman, tương tự nội dung 2.5.7.2.

Phân tích đại thể và vi thể thận: Đánh giá tổn thương thận qua quan sát thay đổi

đại thể thận chuột, ghi nhận các đặc điểm về màu sắc, tình trạng bề mặt thận… Phân

tích vi thể thận bằng phương pháp nhuộm hematoxylin-eosin (HE). Cấu trúc, hình thái

tế bào thận được quan sát dưới kính hiển vi quang học để đánh giá mức độ tổn thương

thận tại khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Quận 2, Thành phố Hồ Chí Minh.

2.5.9. Khảo sát độc tính bán trường diễn đường uống của cao cồn 50% Bí kỳ nam

Dựa trên kết quả khảo sát độc tính cấp và các thử nghiệm dược lý in vivo, tiến

hành khảo sát độc tính bán trường diễn đường uống của cao cồn 50% từ thân củ Bí kỳ

nam theo Hướng dẫn của Bộ Y tế về thử nghiệm lâm sàng và tiền lâm sàng thuốc đông

y, thuốc từ dược liệu [3].

Để tiến hành thử nghiệm độc tính bán trường diễn, 46 chuột nhắt trắng, chủng

Swiss albino (50% đực, 50% cái) được phân ngẫu nhiên thành 3 lô (lô sinh lý và hai lô

thử). Lô sinh lý (n = 14): Uống nước cất; lô thử 1 và 2 (mỗi lô n = 16): Uống cao thử

phân tác trong nước cất lần lượt ở các liều xác định từ kết quả khảo sát độc tính cấp và

tác động dược lý in vivo. Chuột uống nước cất hoặc cao thử mỗi ngày trong vòng 60

ngày liên tiếp. Theo dõi tình trạng chung hàng ngày và cân nặng của chuột hàng tuần

trong quá trình thử nghiệm. Chuột được đánh giá cân nặng, sau đó được gây mê, mổ

vào ngày thứ 30 đối với 8 con mỗi lô và vào ngày thứ 60 đối với các chuột còn lại. Thu

thập mẫu máu tim và các cơ quan (gan, thận) để thực hiện các xét nghiệm sinh hóa, chỉ

số huyết học và phân tích giải phẫu bệnh.

Phân tích chỉ số sinh hóa:

Mẫu máu được chia vào 2 loại tube, một nửa lượng máu được cho vào tube có

chất chống đông EDTA và được dùng đánh giá các chỉ số huyết học; phần máu còn lại

được cho vào tube không có chất chống đông, được quay ly tâm và thu huyết thanh để

đánh giá các chỉ số chức năng gan và thận (AST, ALT, ure và creatinin). Mẫu máu

được phân tích tại Bệnh viện Medlatec, Thành phố Hồ Chí Minh.

Phân tích giải phẫu bệnh

Sau khi phân tích đại thể, các mẫu gan, thận chuột được cho vào dung dịch formol

10% để làm xét nghiệm vi thể bằng phương pháp nhuộm hematoxylin - eosin (HE),

mỗi lô 6 mẫu. Cấu trúc, hình thái tế bào gan, thận được quan sát dưới kính hiển vi để

đánh giá mức độ tổn thương tại khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Quận 2, Tp. Hồ Chí

Minh.

2.6. Phân tích kết quả và xử lý số liệu thống kê

Các kết quả được xử lý, trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn

(Mean ± SEM) và được đánh giá ý nghĩa thống kê với phần mềm SPSS 22.0 bằng các

phép kiểm Kruskal-wallis và Mann-Whitney. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi giá

trị p < 0,05.

Chương 3. KẾT QUẢ

3.1. ĐỊNH DANH LOÀI BÍ KỲ NAM

3.1.1. Đặc điểm thực vật

3.1.1.1. Hình thái bên ngoài

Dược liệu được nghiên cứu là Bí kỳ nam sống phụ sinh trên các thân cây lớn

trong rừng Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang (Hình 3.1a). Cây có thân phình to ở gốc tạo

thành củ. Mặt trên của thân củ có từ hai đến bốn thân dài khoảng 60 cm, màu nâu

(Hình 3.1b). Trên những thân cây có các lá mọc đối phiến dày, hình bầu dục, dài 4 -

15 cm và rộng 2 - 7 cm, gốc thuôn, đầu tù, hai mặt có màu lục nhạt, mặt trên nhẵn

bóng (Hình 3.1c,d). Mặt ngoài củ sần sùi, màu nâu xám, không có gai, có nhiều rễ

nhỏ mọc phía dưới củ, bám nhiều đất, trên bề mặt có nhiều lỗ để kiến chui vào làm

tổ (Hình 3.1đ). Thân củ Bí kỳ nam có kích thước 15 - 20 cm, khi bổ dọc có nhiều lỗ

hổng chằng chịt mang đầy kiến, thịt nạc màu trắng, chứa nhiều nước (Hình 3.1e).

a b c

d e

đ Hình 3.1 Bí kỳ nam (a) Bí kỳ nam trong rừng Phú Quốc; (b) Bí kỳ nam đầy đủ

thân và lá; (c) Thân mang lá; (d) Lá; (đ) Mặt ngoài; (e) Mặt trong thân củ

3.1.1.2. Đặc điểm giải phẫu

Đặc điểm giải phẫu rễ: Bên ngoài vi phẫu rễ là lớp bần gồm nhiều lớp tế bào

xuyên tâm nhuộm màu xanh (Hình 3.2a), tiếp đến là lớp mô mềm vỏ xen lẫn nhiều

tế bào mô cứng và có các khuyết lớn (Hình 3.3b), libe 1 và libe 2 bị ép dẹp, trong

cùng là lớp gỗ 2 chiếm tâm (Hình 3.2c).

Đặc điểm giải phẫu thân: Bên ngoài vi phẫu thân là lớp bần gồm các tế bào

vách dày xếp thành lớp, nhuộm màu xanh (Hình 3.3a), tiếp theo là các mô mềm vỏ

xen lẫn các tế bào mô cứng (Hình 3.3b). Bên trong có 1 vòng tế bào mô cứng gồm 4

- 5 lớp tế bào, tiếp đến là libe 1 gồm lớp tế bào màu hồng bị ép dẹp, dưới libe 1 là

libe 2 gồm các tế bào màu hồng xếp xuyên tâm (Hình 3.3c), bên trong là gỗ 2 và tận

cùng là các bó gỗ 1 xếp hướng tâm (Hình 3.3d).

Đặc điểm giải phẫu lá: Mặt trên vi phẫu lá là lớp biểu bì có cutin lồi, phía dưới

có 1 hàng tế bào hạ bì có kích thước to (Hình 3.4a). Dưới hạ bì có 2 lớp tế bào mô

giậu chứa diệp lục tố. Gân chính có vòng libe - gỗ với các tế bào mô cứng bao quanh

(Hình 3.4b). Lớp biểu bì dưới có cutin lồi, các tế bào mô cứng tập trung phần mô

mềm mặt dưới lá (Hình 3.4c).

Hình 3.2 Cấu tạo giải phẫu rễ Bí kỳ nam

Hình 3.3 Cấu tạo giải phẫu thân Bí kỳ nam

Hình 3.4 Cấu tạo giải phẫu lá Bí kỳ nam

3.1.1.3. Đặc điểm bột dược liệu

Bột thân củ Bí kỳ nam có màu vàng nâu, không mùi, không vị (Hình 3.5a).

Dưới kính hiển vi, bột Bí kỳ nam có các cấu tử như sau: Tinh thể calci oxalat hình

kim (1), nhiều tế bào mô cứng thành dày, có ống trao đổi rõ, đứng riêng lẻ hay dính

thành từng đám (2), sợi dài có vách dày (3), mảnh bần với tế bào hình đa giác, thành

dày, màu nâu đỏ (4), đám tế bào mô mềm có nhiều cạnh, thành mỏng (5), nhiều mảnh

mạch mạng đứng riêng lẻ hay tụ thành đám (6) (Hình 3.5b).

a b

Hình 3.5 Bột thân củ Bí kỳ nam

3.1.2. Đặc điểm mã vạch ADN

ADN mẫu lá tươi Bí kỳ nam được ly trích theo phương pháp CTAB [77]. ADN

sau ly trích được điện di trên gel agarose 1% cho thấy ADN được ly trích nguyên vẹn,

không đứt gãy, đạt yêu cầu cho thí nghiệm tiếp theo (Hình 3.6a). ADN ly trích được

khuếch đại với cặp mồi rbcL thu được sản phẩm PCR kích thước 600 bp (Hình 3.6b).

a b

Hình 3.6 (a) Kết quả điện di ADN mẫu lá tươi Bí kỳ nam trên gel aragose 1%

và (b) sản phẩm PCR với cặp mồi rbcL (M, thang chuẩn 1 kb plus)

Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi rbcL sử dụng trong phản ứng PCR

Tên mồi Trình tự (5’-3’) Tm (oC) Tác giả

rbcL.F ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC [88], [156] 60 rbcL.R GTAAAATCAAGTCCACCRCG

(Ghi chú: Tm, nhiệt độ gắn mồi)

Kết quả so sánh đoạn rbcL của mẫu thử lá Bí kỳ nam với mẫu đối chứng loài

Hydnophytum formicarum Jack. [mã số X81099.1 – tác giả Manen và Natali, 1995]

được công bố trên Genbank [171] cho thấy mức độ tương đồng là 99%. Kết quả này

có thể xác định mẫu dược liệu thu hái tại rừng Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang là loài

Hydnophytum formicarum Jack.

Trình tự ADN của đoạn rbcL mẫu Bí kỳ nam được xử lý bằng BioEdit 7.0.5:

GTAAAATCCAGTCCACCACGAAGGCATTCATAAACTGGCTCTACCGTAG TTTTTAGCGGATAAACCTAATTTAGGTTTAATAGTACATCCCAACAGGG GACGACCATACTTGTTCAATTTATCTCTCTCGACTTGAATGCCGTGAGGC GGACCTTGGAAGGTTTTAACATACGCAATGGGAATTCGCAAATCTTCCA GACGCAGAGCACGCAGGGCTTTGAACCCAAATACATTACCTACAATAGA AGTAAACATGTTAGTAACAGAACCTTCTTCAAAAAGGTCTAAGGGGTAA GCTACATAAGCAATATATTGATTTTCTTCTCCGGCAACTGGCTCAATATG GTAGCATCGCCCTTTGTAACGATCAAGACTGGTAAGCCCATCCGTCCAT ACAGTTGTCCATGTACCAGTAGAAGACTCGGCAGCTACCGCGGCCCCAG CTTCTTCCGGCGGAACTCCAGGTTGGGGAGTTACTCGGAATGCTGCCAA GATATCAGTATCTTTGGTTTGGTATTCAGGAGTATAATAAGTCAATTTGT ACTCTTTAACACCAGCTTTGAACCCAACACTTGCTTTAGTCTCTGTTTTG GGGTGACATA. 3.1.3. Chất lượng dược liệu

3.1.3.1. Thành phần hóa thực vật sơ bộ của dược liệu Bí kỳ nam

Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật cho thấy trong thân củ Bí kỳ

nam có sự hiện diện của acid hữu cơ, các nhóm hợp chất flavonoid, hợp chất khử,

saponin, tannin và triterpenoid.

Bảng 3.2 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học dược liệu Bí kỳ nam

Phương pháp Nhóm hợp chất

Alkaloid Acid hữu cơ Chất béo Coumarin Flavanoid Thuốc thử Mayer; Dragendoff Thuốc thử Na2CO3 Phản ứng bay hơi Phản ứng phát quang Phản ứng cyanidin

Glycosid tim Thuốc thử Raymond, Xanthydrol Hợp chất khử Saponin Tannin Triterpenoid Thuốc thử Fehling Phản ứng tạo bọt Thuốc thử gelatin, FeCl3 Thuốc thử Salkowski Dịch chiết ether - + - - + - + + - + Dịch chiết cồn - + - - + - + + + - Dịch chiết nước - + - - + - + + + -

3.1.3.2. Độ ẩm và độ tro

Kết quả khảo sát độ ẩm, độ tro toàn phần và độ tro không tan trong acid của

dược liệu thân củ Bí kỳ nam được trình bày trong Bảng 3.3.

Bảng 3.3 Độ ẩm và độ tro của dược liệu Bí kỳ nam

Độ ẩm (%) Độ tro toàn phần (%) Độ tro không tan trong HCl (%) 13,1 9,9 0,6 12,9 8,8 0,7 Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Trung bình 13,0 13,0 ± 0,1 10,1 9,6 ± 0,4 0,7 0,7 ± 0,03

3.1.3.3. Định tính polyphenol bằng phản ứng hóa học

Kết quả định tính polyphenol trong dược liệu thân củ Bí kỳ nam bằng các phản

ứng với FeCl3 2%, NaOH 20% và (CH3COO)2Pb 1% (Hình 3.7) dương tính cho thấy

có sự hiện diện của polyphenol trong thân củ Bí kỳ nam.

Phản ứng với FeCl3 2% Phản ứng với NaOH 20% Phản ứng với(CH3COO)2Pb 1%

(1): mẫu thử, (2) mẫu thử bổ sung FeCl3 2%, (3) mẫu thử bổ sung NaOH 20%, (4)

mẫu thử bổ sung (CH3COO)2Pb 1%

Hình 3.7 Kết quả định tính polyphenol dược liệu Bí kỳ nam

3.1.3.4. Định lượng polyphenol toàn phần

Hàm lượng polyphenol toàn phần được xác định theo phương pháp Folin-

Ciocalteu. Pyrogallol được sử dụng làm chất chuẩn (10 - 50 μg/mL). Các dung dịch

được đo độ hấp thu ở bước sóng 760 nm. Từ phương trình tuyến tính biểu diễn độ

hấp thu theo nồng độ pyrogallol y = 0,0177x - 0,0394 với R2 = 0,9984 suy ra hàm

lượng polyphenol toàn phần trong 1 g bột thân củ Bí kỳ nam khô tương đương với

58,8 ± 1,7 mg pyrogallol, chiếm tỷ lệ khoảng 5,9% (kl/kl) (Bảng 3.4).

Bảng 3.4 Hàm lượng polyphenol toàn phần của dược liệu Bí kỳ nam

Hàm lượng polyphenol toàn phần trong 1 ml dịch (µg pyrogallol/mL) Hàm lượng polyphenol trung bình (mg pyrogallol/g bột)

58,8 ± 1,7

25,1 23,8 24,2 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Hàm lượng polyphenol toàn phần trong 1 g bột (mg pyrogallol/g bột) 60,7 57,5 58,3

3.2. CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC CÁC CAO TOÀN PHẦN BÍ KỲ NAM

3.2.1. Chiết xuất cao toàn phần Bí kỳ nam

Dược liệu thân củ Bí kỳ nam được chiết xuất với các dung môi thu được các

cao toàn phần gồm: Cao nước, cao cồn 50%, cao cồn 70% và cao cồn 96% (Hình

3.8) có hiệu suất chiết lần lượt là 14,4%, 26,1%, 21,5% và 18,4%. Cao Bí kỳ nam thu

được đặc, màu vàng nâu, vị cay, đắng, mùi thơm đặc trưng của dược liệu.

Hình 3.8 Các cao toàn phần từ thân củ Bí kỳ nam

3.2.2. Hàm lượng polyphenol toàn phần

Dựa vào phương trình đường tuyến tính của độ hấp thu (y) của sản phẩm sau

phản ứng với thuốc thử Folin - Ciocalteu theo nồng độ pyrogallol (x) là y = 0,019x -

0,022 (R2 = 0,998), hàm lượng polyphenol của cao nước, cao cồn 50%, cao cồn 70%

và cao cồn 96% tính theo khối lượng pyrogallol lần lượt là 376,8 mg/g cao, 703,2

mg/g cao, 669,5 mg/g cao và 820,0 mg/g cao. Kết quả cho thấy hàm lượng polyphenol

khá lớn trong các cao cồn Bí kỳ nam, có thể chiếm 70% đến 80% khối lượng cao.

3.2.3. Sàng lọc hoạt tính sinh học in vitro của các cao toàn phần Bí kỳ nam

3.2.3.1. Hoạt tính chống oxy hóa

Hoạt tính chống oxy hóa in vitro của các cao toàn phần Bí kỳ nam được khảo

sát bằng phương pháp DPPH và MDA. Từ phương trình đường tuyến tính giữa nồng

độ mẫu thử và độ hấp thu, xác định nồng độ IC50 (nồng độ mẫu thử có hoạt tính chống

oxy hóa là 50%) của các cao toàn phần Bí kỳ nam và chất đối chiếu. Kết quả được

trình bày trong Bảng 3.5 và Bảng 3.6.

Bảng 3.5 Phương trình tuyến tính, IC50 của các cao Bí kỳ nam (DPPH)

Mẫu thử Phương trình tuyến tính Giá trị R2 Giá trị IC50 (μg/ml)

Cao nước y = 1,136x + 9,934 0,957 35,3

Cao cồn 50% y = 1,498x + 22,98 0,949 18,0

Cao cồn 70% y = 1,961x + 2,376 0,977 24,3

Cao cồn 96% y = 2,310x + 6,113 0,997 19,0

Quercetin y = 10,43x - 2,149 0,997 4,8

Bảng 3.6 Phương trình tuyến tính, IC50 của các cao Bí kỳ nam (MDA)

Giá trị IC50 (μg/ml) Mẫu thử Phương trình tuyến tính Giá trị R2

Cao nước y = 0,1516x + 9,6584 0,9758 266,1

Cao cồn 50% y = 0,4651x - 4,3469 0,9721 116,8

Cao cồn 70% y = 0,4360x + 2,8572 0,9995 108,1

Cao cồn 96% y = 0,5193x - 0,6565 0,9728 97,5

Quercetin y = 1855,4x - 31,984 0,9930 13,3

3.2.3.2. Tác động lên sự tăng trưởng của tế bào

Tác động của các cao chiết toàn phần từ thân củ Bí kỳ nam được khảo sát đối với

sự tăng trưởng của các dòng tế bào: Tế bào ung thư cổ tử cung người (HeLa), tế bào

ung thư cơ vân người (RD), tế bào ung thư vú người (MCF-7), tế bào ung thư phổi

người (NCI-H460), tế bào ung thư gan người (HepG2), tế bào biểu mô thận heo

(LLC-PK1) và tế bào biểu mô thận khỉ (Vero). Tỷ lệ phần trăm ức chế tăng trưởng tế

bào của các cao Bí kỳ nam được đánh giá so với mẫu chứng âm (chứa DMSO ở nồng

độ tương tự mẫu thử nghiệm). Kết quả ở 5 nồng độ khác nhau (từ 50 - 1000 μg/ml)

được trình bày trong Bảng 3.7. So với mẫu chứng, cao nước không thể hiện hoạt tính

độc tế bào đối với các tế bào ung thư người ở tất cả nồng độ thử nghiệm. Sau xử lý

24 giờ, các cao cồn biểu hiện hoạt tính độc tế bào, ức chế sự tăng trưởng của các tế bào

ung thư ở nồng độ cao (500 và 1000 μg/ml) làm giảm tỷ lệ sống của tế bào. Tuy nhiên,

hoạt tính độc tế bào ung thư cơ vân RD không đáng kể. Giá trị IC50 của các cao cồn Bí

kỳ nam được đánh giá dựa trên giá trị hồi quy đa thức bậc 2 giữa phần trăm ức chế tăng

trưởng và nồng độ thử nghiệm (Bảng 3.8). Hoạt tính độc tế bào theo thứ tự: HeLa >

MCF-7 > NCI-H460. Đối với tế bào HeLa và MCF-7, giá trị IC50 lần lượt là 400 µg/ml

- 600 µg/ml.

Bảng 3.7 Hoạt tính của cao Bí kỳ nam đối với sự tăng trưởng các dòng tế bào

Tỷ lệ ức chế (%)

OD570nm (Mean ± SEM)

Dòng tế bào

Chứng DSMO

Cao nước

Nồng độ (µg/ml)

Cao cồn 50%

Cao cồn 70%

Cao cồn 96%

83,0

83,8

84,0

1000

- 23,0

54,5

47,5

59,0

500

- 13,1

250

- 17,7

- 18,0

- 18,4

- 2,9

HeLa

2,3

10,4

3,9

100

- 1,2

4,2

5,7

1,5

5,1

50

1,552 ± 0,051 1,513 ± 0,040 1,574 ± 0,032 1,411 ± 0,022 1,384 ± 0,028

Cao cồn 50% 0,215 ± 0,005 0,609 ± 0,020 1,577 ± 0,019 1,295 ± 0,023 1,362 ± 0,015

Cao cồn 70% 0,204 ± 0,012 0,702 ± 0,020 1,583 ± 0,043 1,462 ± 0,028 1,423 ± 0,044

Cao cồn 96% 0,202 ± 0,008 0,549 ± 0,005 1,376 ± 0,019 1,388 ± 0,016 1,371 ± 0,010

1,262 ± 0,019 1,338 ± 0,011 1,337 ± 0,029 1,445 ± 0,019 1,445 ± 0,019

0,703 ± 0,013

52,7

PTX 10 µM

29,0

42,4

33,5

27,6

1000

24,5

32,1

37,9

32,1

500

16,7

25,8

30,7

35,3

250 RD

11,8

12,9

10,1

100

- 3,1

5,3

4,3

4,0

50

- 6,4

0,249 ± 0,007 0,264 ± 0,003 0,292 ± 0,010 0,309 ± 0,011 0,332 ± 0,003

0,167 ± 0,014 0,220 ± 0,010 0,246 ± 0,008 0,305 ± 0,010 0,335 ± 0,009

0,193 ± 0,005 0,201 ± 0,004 0,229 ± 0,010 0,315 ± 0,008 0,336 ± 0,006

0,210 ± 0,005 0,219 ± 0,010 0,214 ± 0,018 0,361 ± 0,011 0,373 ± 0,008

0,290 ± 0,004 0,323 ± 0,005 0,331 ± 0,004 0,350 ± 0,011 0,350 ± 0,011

0,184 ± 0,006

47,6

PTX 10 µM

78,4

70,2

71,4

1000

- 2,0

72,2

67,2

68,4

500

- 13,4

9,8

12,2

21,6

250

- 15,1

MCF- 7

4,2

2,2

-9,9

100

- 10,1

4,5

3,0

-8,2

50

- 12,1

1,031 ± 0,023 1,268 ± 0,025 1,310 ± 0,037 1,167 ± 0,005 1,162 ± 0,014

0,218 ± 0,009 0,311 ± 0,008 1,026 ± 0,017 1,191 ± 0,039 1,181 ± 0,027

0,301 ± 0,015 0,366 ± 0,018 0,999 ± 0,014 1,338 ± 0,026 1,318 ± 0,027

0,289 ± 0,009 0,354 ± 0,015 0,892 ± 0,017 1,341 ± 0,030 1,365 ± 0,037

1,011 ± 0,010 1,118 ± 0,025 1,138 ± 0,016 1,218 ± 0,021 1,218 ± 0,021

0,981 ± 0,014

29,5

PTX 10 µM

66,6

61,6

80,4

1000

- 24,8

7,2

8,4

32,2

500

- 7,1

250

- 8,8

- 12,1

- 17,2

- 16,3

NCI- H460

4,4

7,2

9,6

12,5

100

3,3

8,2

4,3

13,3

50

2,033 ± 0,057 1,854 ± 0,050 1,850 ± 0,047 1,679 ± 0,066 1,699 ± 0,081

0,544 ± 0,017 1,605 ± 0,062 1,905 ± 0,063 1,631 ± 0,079 1,614 ± 0,072

0,626 ± 0,008 1,585 ± 0,032 1,993 ± 0,044 1,588 ± 0,009 1,682 ± 0,040

0,320 ± 0,018 1,174 ± 0,025 1,977 ± 0,039 1,537 ± 0,024 1,524 ± 0,028

1,630 ± 0,091 1,731 ± 0,059 1,700 ± 0,037 1,757 ± 0,053 1,757 ± 0,053

1,355 ± 0,018

34,8

PTX 10 µM

- 16,2

- 73,8

- 91,5

- 62,4

1000

- 21,7

- 82,0

- 68,0

- 83,3

500

- 15,1

- 43,9

- 21,2

- 60,8

250 HepG2

0,317 ± 0,014 0,332 ± 0,027 0,314 ± 0,008

0,339 ± 0,009* 0,397 ± 0,009* 0,363 ± 0,005*

0,373 ± 0,010* 0,366 ± 0,012* 0,305 ± 0,002*

0,317 ± 0,010* 0,400 ± 0,008* 0,405 ± 0,005*

0,195 ± 0,006 0,218 ± 0,010 0,252 ± 0,005

- 18,2

- 2,8

- 5,3

- 19,3

100

0,323 ± 0,017

0,363 ± 0,008*

0,287 ± 0,006

0,326 ± 0,008

0,273 ± 0,020

49,1

0,170 ± 0,007

PTX 10 µM

13,7

9,5

- 4,9

- 21,0

500

13,9

5,0

5,5

- 6,8

250 LLC- PK1

4,0

6,0

7,7

- 10,2

100

0,108 ± 0,003 0,107 ± 0,002 0,120 ± 0,007

0,099 ± 0,002 0,114 ± 0,002 0,120 ± 0,003

0,115 ± 0,008 0,114 ± 0,002 0,118 ± 0,001

0,132 ± 0,002 0,128 ± 0,005 0,141 ± 0,002

0,109 ± 0,003 0,120 ± 0,001 0,128 ± 0,003

0,125 ± 0,004

28,5

PTX 10 µM

- 11,2

6,0

- 9,1

14,9

500

- 5,1

- 9,3

- 11,6

- 2,5

250 Vero

- 9,7

- 7,6

- 13,8

- 2,8

100

0,488 ± 0,000 0,461 ± 0,009 0,481 ± 0,014

0,406 ± 0,002 0,478 ± 0,007 0,474 ± 0,002

0,471 ± 0,012 0,488 ± 0,006 0,501 ± 0,008

0,367 ± 0,008 0,448 ± 0,005 0,453 ± 0,011

0,431 ± 0,025 0,437 ± 0,016 0,440 ± 0,010

0,305 ± 0,004

30,5

PTX 10 µM

Bảng 3.8 Giá trị hồi quy đa thức và IC50 các cao toàn phần Bí kỳ nam

Cao cồn 50%

Cao cồn 70%

Cao cồn 96%

Dòng tế bào

HeLa Hồi quy đa thức

IC50 (µg/ml)

Hồi quy đa thức

MCF- 7

IC50 (µg/ml)

y = 0,1396x2 - 1,6457x + 175,16 441,9 y = -0,2247x2 + 22,433x + 51,734 611,6

y = 0,0977x2 + 0,9518x + 234,45 526,3 y = -0,0291x2 + 6,8542x + 170,71 440,7

Hồi quy đa thức

y = - 0,0576x2 + 12,671x + 411,76

y = - 0,0047x2 + 9,7246x + 418,64

NCI- H460

IC50 (µg/ml)

901,3

893,1

y = 0,1837x2 - 6,2653x + 230,29 376,3 y = 0,0078x2 + 4,6425x + 146,1 397,7 y = 0,054x2 + 4,2965x + 305,69 655,5

3.3. CHIẾT XUẤT VÀ KHẢO SÁT CHẤT LƯỢNG CAO CỒN 50%

Các kết quả khảo sát về các cao toàn phần của Bí kỳ nam cho thấy cao cồn 50%

cho hiệu suất chiết cao nhất (26,1%) so với cao cồn 96%, cao cồn 70% và cao nước;

có hàm lượng polyphenol toàn phần cao (khoảng 70% khối lượng cao). Cao cồn 50%

Bí kỳ nam thể hiện hoạt tính chống oxy hóa tốt nhất theo phương pháp DPPH (giá trị

IC50 là 18,0 µg/ml). Bên cạnh đó, cao cồn 50% có ưu thế về kinh tế, an toàn trong

định hướng sử dụng phát triển sản phẩm trong sản xuất công nghiệp. Vì vậy, cao cồn

50% Bí kỳ nam được lựa chọn để chiết xuất khối lượng lớn và chiết tách các phân

đoạn tiếp theo.

Chiết xuất cao cồn 50% với khối lượng lớn: Từ 10 kg dược liệu khô thân củ Bí

kỳ nam chiết xuất ngấm kiệt với dung môi cồn 50%, cô thu hồi dung môi và thu được

2,6 kg cao cồn 50%.

Cao cồn 50% Bí kỳ nam có dạng đặc, màu vàng nâu, vị cay, đắng, mùi thơm

đặc trưng của dược liệu (Hình 3.9).

Hình 3.9 Cao cồn 50% từ thân củ Bí kỳ nam

Khảo sát chất lượng của cao cồn 50%

Cao cồn 50% Bí kỳ nam được khảo sát các tiêu chuẩn chất lượng theo Dược

điển Việt Nam V. Kết quả độ ẩm, độ tro toàn phần và độ tro không tan trong acid của

cao cồn 50% được trình bày trong Bảng 3.9.

Bảng 3.9 Độ ẩm và độ tro của cao cồn 50% từ thân củ Bí kỳ nam

Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Trung bình

Độ ẩm (%) 7,2 7,4 7,4 7,3 ± 0,1

Độ tro toàn phần (%) 6,3 6,2 6,6 6,4 ± 0,1

Độ tro không tan trong HCl (%) 0,9 0,7 0,8 0,8 ± 0,1

Độ vô khuẩn: Mẫu cao cồn 50% từ thân củ Bí kỳ nam được gửi kiểm nghiệm về

độ vô khuẩn tại Công ty sắc ký Hải Đăng Eurofins. Kết quả cho thấy trong cao cồn 50%

không phát hiện các vi khuẩn: Escherichia coli, Salmonella spp., Staphylococcus aureus

và Pseudomonas aeruginosa.

Định tính polyphenol bằng phản ứng hóa học: Kết quả định tính polyphenol

trong cao cồn 50% Bí kỳ nam bằng các phản ứng với FeCl3 2%, NaOH 20% và

(CH3COO)2Pb 1% đều dương tính chứng tỏ có sự hiện diện của polyphenol trong cao

cồn 50% Bí kỳ nam.

Định lượng polyphenol toàn phần: Hàm lượng polyphenol toàn phần được xác

định theo phương pháp Folin-Ciocalteu. Kết quả được thể hiện thông qua phương

trình đường chuẩn y = 0,0193x – 0,0224 với giá trị R2 = 0,998. Từ phương trình

đường chuẩn, hàm lượng polyphenol trong cao cồn 50% từ thân củ Bí kỳ nam là

678,9 mg pyrogallol/g cao.

3.4. CÁC CAO PHÂN ĐOẠN VÀ HOẠT TÍNH CAO PHÂN ĐOẠN

Từ 2133 g cao cồn 50% Bí kỳ nam lỏng chiết xuất phân bố với dung môi ethyl

acetat (EtOAc), n-butanol và nước thu được 245,3 g cao EtOAc, 270,7 g cao n-

butanol và 358,3 g cao nước với độ ẩm lần lượt là 10,2 %, 14,8 % và 16,7%.

Hàm lượng polyphenol toàn phần của các cao phân đoạn EtOAc, n-butanol và

cao nước được xác định lần lượt là 365,4 ± 5,9 mg pyrogallol/g cao, 281,7 ± 5,7 mg

pyrogallol/g cao và 15,9 ± 1,8 mg pyrogallol/g cao. Cao EtOAc có hàm lượng

polyphenol cao nhất so với cao n-butanol và cao nước.

Các cao phân đoạn được khảo sát tác động chống oxy hoá dựa trên khả năng

đánh bắt gốc tự do và ức chế peroxyd hóa lipid. Kết quả trình bày trong Bảng 3.10

và 3.11 cho thấy cao EtOAc thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất với giá trị

IC50 là 5,6 µg/ml (DPPH); với phương pháp MDA, cao EtOAc thể hiện hoạt tính

chống oxy hóa lần lượt gấp khoảng 3 và 3000 lần so với cao n-butanol và cao nước.

Bảng 3.10 Giá trị IC50 của các cao phân đoạn Bí kỳ nam (DPPH)

Mẫu thử Phương trình tuyến tính Giá trị R2 Giá trị IC50 (μg/ml)

Cao EtOAc y = 9,1494x – 9,5078 0,9998 5,6

Cao n-BuOH y = 3,0893x + 0,3133 0,9938 16,1

Cao nước y = 0,1157x + 7,858 0,9986 366,4

Bảng 3.11 Giá trị IC50 của các cao phân đoạn Bí kỳ nam (MDA)

Mẫu thử Phương trình tuyến tính Giá trị R2 Giá trị IC50 (μg/ml)

Cao EtOAc y = 2,3893x + 4,9393 0,9957 18, 9

Cao n-BuOH y = 1,3975x – 17,219 0,9794 48,1

Cao nước y = 0,0182x - 5,9997 0,9978 3076,8

Phân lập chất từ cao phân đoạn

Cao ethyl acetat (EtOAc) với hàm lượng polyphenol cao và hoạt tính chống oxy

hóa mạnh so với cao n-butanol và cao nước, được lựa chọn để phân lập và định danh

chất tại bộ môn Dược liệu (Khoa dược, Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh).

Cao EtOAc (A) được phân lập bằng sắc ký cột nhanh với hệ dung môi

dicloromethan (DCM) – methanol (MeOH) (gradient MeOH tăng dần) thu được 23

phân đoạn (A1 - A23). Hai phân đoạn chính (A8 và A9) có các vết chính tách tốt nên

được lựa chọn phân tích tiếp. Phân đoạn A8 được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với

DCM - MeOH – acid formic (90: 10: 0,5) và được tinh chế bằng sắc ký cột Sephadex

LH20 thu được 3 phân đoạn, trong đó phân đoạn 8.2 thu được tủa kí hiệu BK1. Phân

đoạn A9 được phân tách bằng cột Sephadex LH-20 tách rửa với MeOH thu được 5

phân đoạn A9.1, A9.2, A9.3, A9.4 và A9.5 trong đó phân đoạn A9.2 tinh lọc được

chất BK2. Hai chất BK1 và BK2 được xác định độ tinh khiết bằng phương pháp sắc

ký lớp mỏng khai triển với 3 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau. Chất BK1 được

kiểm tra độ tinh khiết qua 3 hệ dung môi: DCM- MeOH- FA (90: 10: 0,5); DCM-

Aceton- FA (80: 20: 0,5); DCM- EtOAc- FA (50: 50: 0.5). Kết quả cho thấy BK1 chỉ

có một vết khi kiểm tra dưới UV 254, hiện màu đỏ với thuốc thử VS nên BK1 được

xem tinh khiết trên sắc ký lớp mỏng. Chất BK2 được kiểm tra độ tinh khiết qua 3 hệ

dung môi: DCM - EtOAc - FA (50: 50: 0,5), DCM - Aceton - FA (80: 20: 0,5), DCM-

MeOH - FA (95: 5: 0,5). Kết quả cho thấy BK2 chỉ có một vết khi kiểm tra dưới UV

254 nm, hiện màu xanh với thuốc thử FeCl3 nên BK2 được xem tinh khiết trên SKLM.

Cấu trúc chất BK1 và BK2 được xác định bằng dữ liệu phổ MS, phổ NMR.

Khối phổ ESI-MS của BK1 chế độ ion âm cho đỉnh [M-H]- là 289 m/z, chế độ ion

dương cho đỉnh [M+Na]+ là 313 m/z. Như vậy khối lượng phân tử của BK1 là 290

tương ứng với công thức phân tử là C15H14O6. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13C,

DEPT cho thấy chất BK1 có 1 cacbon bậc II (- CH2-) với δC = 28,5 ppm, 7 carbon

bậc III: 5 carbon sp2 (=CH-) thuộc vòng thơm và 2 carbon liên kết với oxy (>CH-O-

) δC 82,9 ppm và δC 68,8 ppm, 7 carbon bậc IV với đặc trưng của các carbon sp2 có

hoặc không có oxy, không có tín hiệu của –C=O. Với các dữ liệu phổ trên, có thể xác

định BK1 có cấu trúc khung là C6-C3-C6, là một flavan, không có nhóm chức >C=O

ở vị trí số 4 trên vòng C. Phân tích dữ liệu phổ 2 chiều (COSY, HSQC và HMBC)

xác định BK1 là (+)-catechin (Hình 3.10a).

Khối phổ ESI-MS của BK2 chế độ ion âm cho đỉnh [M-H]- là 153 m/z tương

ứng với khối lượng phân tử là 154. Công thức phân tử của BK2 là C7H6O4. Phổ cộng

hưởng từ hạt nhân 1H, 13C và HSQC cho thấy chất BK2 có 3 carbon bậc III lai hóa

sp2 thuộc vòng thơm, 4 carbon bậc IV trong đó có 3 carbon thuộc vòng thơm (δC

151,5 ppm, δC 146,1 ppm, δC 123,2 ppm) với hai carbon có liên kết với oxy, 1 carbon

thuộc nhóm chức –COOH (δC 170,2 ppm). Với dữ liệu trên, có thể xác định BK2 là

một dẫn chất phenol đơn giản có 3 nhóm thế (1 nhóm –COOH và 2 nhóm –OH) gắn

trên vòng thơm. Phân tích phổ 1H-NMR thấy có có sự hiện diện của hệ ABX proton

trên vòng thơm: δH 6,81 ppm (1H, d, J=8 Hz), δH 7,43 ppm (1H, dd, J=8,0; J=2,0 Hz)

và δH 7,46 ppm (1H, d, J=2,0 Hz). Kết hợp những dữ liệu trên với dữ liệu từ phổ

HMBC, có thể xác nhận hai nhóm thế OH được gắn trên ở vị trí 3 và 4 trên vòng

thơm. Công thức BK2 được xác định là acid 3,4-dihydroxy benzoic (Hình 3.10b).

(a) (b)

Hình 3.10 Cấu trúc của hợp chất BK1 (a) và BK2 (b)

3.5. ĐỘC TÍNH CẤP ĐƯỜNG UỐNG CỦA CAO CỒN 50%

Trước khi khảo sát tác động dược lý, cao cồn 50% dược liệu Bí kỳ nam được

khảo sát độc tính cấp trong 72 giờ và kéo dài đến 14 ngày.

Cao cồn 50% Bí kỳ nam được phân tán trong nước cất với nồng độ tối đa có thể

bơm qua kim cho uống là 500 mg/ml. Chuột được cho uống với thể tích 0,2 ml/10 g

trọng lượng. Trong 72 giờ quan sát, tất cả chuột đều khỏe mạnh, ăn cám viên, uống

nước, tiêu tiểu, cử động bình thường, không có dấu hiệu bất thường và không có

chuột nào chết. Tiếp tục theo dõi chuột trong 14 ngày tiếp theo, kết quả cho thấy

không có chuột nào chết và biểu hiện của chúng đều bình thường. Sau 14 ngày quan

sát, chuột được gây ngạt bằng đá CO2 sau đó mổ quan sát đại thể các cơ quan. Không

có sự thay đổi về đại thể nào được ghi nhận. Kết quả trên cho thấy cao cồn 50% từ

Bí kỳ nam không gây độc tính cấp đường uống ở liều 10 g cao khô/kg trọng lượng

chuột (tương đương với 32,3 g dược liệu khô/kg thể trọng).

3.6. TÁC ĐỘNG BẢO VỆ GAN CỦA BÍ KỲ NAM

3.6.1. Tác động bảo vệ gan in vitro

3.6.1.1. Tác động của Bí kỳ nam trên sự tăng trưởng tế bào gan HepG2

Kết quả tác động của các mẫu thử Bí kỳ nam bao gồm cao cồn 50%, cao phân

đoạn EtOAc và 2 hợp chất phân lập được là catechin và acid protocatechuic lên sự tăng

trưởng của tế bào HepG2 được trình bày trong Bảng 3.12.

Bảng 3.12 Tác động của Bí kỳ nam lên sự tăng trưởng của tế bào gan HepG2

Phần trăm thay đổi so với OD570nm ± SEM Mẫu thử / Nồng độ (n=6) mẫu sinh lý (%)

Mẫu chứng sinh lý 0,602 ± 0,047

Cao cồn 50% 100 µg/ml 0,888 ± 0,053* + 47,44

Cao cồn 50% 200 µg/ml 0,907 ± 0,091* + 50,68

Cao EtOAc 100 µg/ml 0,648 ± 0,057 + 7,62

Cao EtOAc 200 µg/ml 0,779 ± 0,085 + 29,31

Catechin 10 µΜ 0,709 ± 0,063 + 17,75

Catechin 20 µΜ 0,702 ± 0,052 + 16,62

Acid protocatechuic 10 µΜ 0,669 ± 0,045 + 11,13

Acid protocatechuic 20 µΜ 0,683 ± 0,030 + 13,39

*: p < 0,05 so với mẫu sinh lý

Sau 24 giờ xử lý với các mẫu cao Bí kỳ nam, catechin hoặc acid

protocatechuic, tế bào HepG2 phát triển tốt, không làm thay đổi giảm tỷ lệ sống của tế

bào so với mẫu sinh lý, chứng tỏ các cao và chất phân lập từ Bí kỳ nam không gây độc

đối với tế bào HepG2 ở các nồng độ khảo sát. Do đó, những nồng độ này có thể sử dụng

để khảo sát tác động bảo vệ tế bào gan của các mẫu thử.

3.6.1.2. Tác động phòng ngừa ức chế tăng trưởng tế bào gan HepG2 do

CCl4 gây ra

Tác động phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng tế bào gan HepG2 do CCl4 gây ra

của các mẫu thử cao cồn 50%, cao EtOAc, các chất catechin và acid protocatechuic

từ thân củ Bí kỳ nam được trình bày trong Bảng 3.13 và Hình 3.11. Với mật độ nuôi

cấy 1 x 105 tế bào/ml, kết quả cho thấy sau 24 giờ xử lý, CCl4 2 mM làm giảm đáng

kể tỷ lệ sống của tế bào HepG2 (29,1%) so với mẫu chứng sinh lý (p < 0,05). Sự ức

chế tăng trưởng này được phòng ngừa khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy chất đối

chứng dương silymarin nồng độ 100 µg/ml hay các mẫu thử của Bí kỳ nam (p < 0,05).

Tỷ lệ sống của tế bào ở mẫu cao cồn 50% nồng độ 200 µg/ml và 2 mẫu cao EtOAc

có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với mẫu chứng sinh lý (p <0,05). Riêng mẫu

cao EtOAc ở cả 2 nồng độ và mẫu acid protocatechuic 20 µΜ có sự khác biệt có ý

nghĩa so với lô chứng dương silymarin 100 µg/ml (p < 0,05). Các mẫu thử còn lại của

Bí kỳ nam đều không khác biệt có ý nghĩa so với mẫu chứng sinh lý và mẫu chứng

dương silymarin 100 µg/ml (p > 0,05). Không có sự khác biệt giữa các nồng độ của

cùng một mẫu thử hoặc giữa các mẫu thử của Bí kỳ nam (p > 0,05).

Bảng 3.13 Tác động của Bí kỳ nam phòng ngừa ức chế tăng trưởng tế bào gan

HepG2 do CCl4 gây ra

Phần trăm phòng ngừa so OD570nm trung bình Mẫu (n=6) ± SEM với mẫu chứng bệnh (%)

Sinh lý 0,602 ± 0,047

Chứng bệnh 0,427 ± 0,046*

Silymarin 100 µg/ml 0,655 ± 0,018## 130,43

Cao cồn 50% 100 µg/ml 0,759 ± 0,053## 189,55

Cao cồn 50% 200 µg/ml 0,786 ± 0,062##* 204,77

Cao EtOAc 100 µg/ml 0,817 ± 0,043##*@ 222,81

Cao EtOAc 200 µg/ml 0,852 ± 0,033##**@@ 242,98

Catechin 10 µΜ 0,695 ± 0,057# 152,96

Catechin 20 µΜ 0,738 ± 0,046## 177,73

Acid protocatechuic 10 µΜ 0,699 ± 0,012## 155,50

Acid protocatechuic 20 µΜ 0,721 ± 0,015##@ 167,75

@: p < 0,05; @@: p < 0,01 so với mẫu chứng dương silymarin

*: p < 0,05 so với mẫu sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với chứng bệnh

Tác động của CCl4 và các mẫu thử còn thể hiện trên hình thái tế bào HepG2

được quan sát dưới kính hiển vi 10X (Hình 3.11). Tế bào HepG2 xử lý với DMSO

0,1% sinh trưởng ở trạng thái trải dài, bám xuống đáy đĩa nuôi cấy (Hình 3.11a) và

có hình thái tương tự như tế bào biểu mô gan biệt hóa trong khi phần lớn các tế bào

HepG2 xử lý với CCl4 2 mM có hình dáng co tròn và một số tế bào hoại tử (Hình

3.11b). Ngược lại, các tế bào được xử lý với CCl4 2 mM có bổ sung chất đối chứng

dương silymarin 100 µg/ml hay các mẫu thử Bí kỳ nam đều có hình thái tương tự như

mẫu chứng sinh lý với DMSO 0,1% (Hình 3.11c,d).

a c b

e đ d

Hình 3.11 Tế bào HepG2 sau 24 giờ xử lý (a) với DMSO 0,1% ; (b) CCl4 2 mM;

(e) Catechin 10 µM; (g) Acid protocatechuic 10 µM

3.6.1.3. Tác động phòng ngừa tăng sinh gốc tự do của tế bào gan HepG2

do CCl4 gây ra

Tác động bảo vệ tế bào gan HepG2 phòng ngừa stress oxy hóa do CCl4 gây ra

của các cao cồn 50% Bí kỳ nam, cao EtOAc ở nồng độ 100 và 200 µg/ml hoặc các

chất phân lập catechin, acid protocatechuic ở nồng độ 10 và 20 µM được đánh giá

qua hàm lượng GSH của tế bào. Dựa vào phương trình đường chuẩn GSH: y =

0,0008x + 0,0976 với R² = 0,9979 và nồng độ protein toàn phần của tế bào, suy ra

## ##

hàm lượng GSH (nM/mg) trong tế bào gan HepG2. Kết quả thể hiện ở Hình 3.12.

*: p < 0,05 so với mẫu sinh lý; ##: p < 0,01: so với chứng bệnh

Hình 3.12 Tác động phòng ngừa tăng sinh gốc tự do của tế bào gan HepG2 gây

ra bởi CCl4 của các mẫu thử Bí kỳ nam

Sau 24 giờ xử lý, CCl4 2 mM làm giảm 45,5% lượng GSH so với mẫu sinh lý

(p < 0,05). Silymarin nồng độ 100 µg/ml và các mẫu cao, chất phân lập từ Bí kỳ nam

ở các nồng độ khảo sát thể hiện tác động phòng ngừa tình trạng tăng sinh gốc tự do,

làm tăng hàm lượng GSH nội bào đáng kể so với mẫu chứng bệnh (p < 0,01). Không

có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các mẫu thử Bí kỳ nam và mẫu chứng dương

silymarin 100 µg/ml hay mẫu chứng sinh lý (p > 0,05). Đồng thời không có sự khác

biệt có ý nghĩa giữa các nồng độ của cùng một mẫu thử Bí kỳ nam (p > 0,05). Trong

đó, mẫu thử cao cồn 50% ở 2 nồng độ 100 và 200 µg/ml thể hiện tác động phòng

ngừa tăng sinh gốc tự do trong tế bào gan tốt nhất với tỷ lệ phòng ngừa lần lượt là

163,5% và 178,4%.

3.6.1.4. Tác động phòng ngừa tình trạng hoại tử tế bào gan HepG2 do

CCl4 gây ra

Kết quả khảo sát tác động bảo vệ tế bào gan HepG2, phòng ngừa tình trạng

hoại tử gây ra bởi CCl4 được thể hiện trong Bảng 3.14. Kết quả cho thấy CCl4 2 mM

làm tăng 28,5% hoạt tính LDH huyết tương so với mẫu chứng sinh lý (p < 0,01). Tình

trạng hoại tử được phòng ngừa đáng kể khi bổ sung silymarin và các mẫu thử từ Bí

kỳ nam vào môi trường nuôi cấy, thể hiện ở hoạt tính enzym LDH giảm đáng kể so

với mẫu chứng bệnh (p < 0,05). Các mẫu cao cồn Bí kỳ nam làm giảm hoạt tính LDH

ngoại bào tốt nhất so với mẫu chứng bệnh, thậm chí tốt hơn mẫu chứng dương

silymarin 100 µg/ml (p < 0,01). Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các

mẫu thử Bí kỳ nam và giữa các nồng độ của cùng một mẫu thử Bí kỳ nam (p > 0,05).

Bảng 3.14 Tác động của Bí kỳ nam phòng ngừa tình trạng hoại tử tế bào gan

HepG2 do CCl4 gây ra

Phần trăm phòng ngừa so OD490nm trung bình ± Mẫu (n=6) SEM với mẫu chứng bệnh (%)

Sinh lý 0,309 ± 0,011

Chứng bệnh 0,397 ± 0,004**

Silymarin 100 µg/ml (SM) 0,284 ± 0,004## 128,41

Cao cồn 50% 100 µg/ml 0,235 ± 0,003##@@ 183,74

Cao cồn 50% 200 µg/ml 0,233 ± 0,001##@@ 186,06

Cao EtOAc 100 µg/ml 0,262 ± 0,006##@ 152,66

Cao EtOAc 200 µg/ml 0,251 ± 0,007##@@ 166,18

Catechin 10 µΜ 0,237 ± 0,003##@@ 186,46

Catechin 20 µΜ 0,234 ± 0,004##@@ 183,40

Acid protocatechuic 10 µΜ 0,244 ± 0,002##@@ 173,07

**: p < 0,01 so với mẫu sinh lý; ##: p < 0,01: so với mẫu chứng bệnh

@: p < 0,05; @@: p < 0,01 so với mẫu chứng dương silymarin

Acid protocatechuic 20 µΜ 0,241 ± 0,008##@@ 177,30

3.6.1.5. Tác động phòng ngừa stress oxy hóa qua tăng biểu hiện protein

phiên mã Nrf2

Kết quả khảo sát trên các thông số hàm lượng GSH và hoạt tính LDH của các

mẫu thử cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa 2 nồng độ 100 và

200 µg/ml của cao cồn 50% Bí kỳ nam, giữa cao cồn 50% và cao EtOAc hay giữa 2

nồng độ 10, 20 µΜ của catechin và acid protocatechuic vì vậy nghiên cứu khảo sát

biểu hiện của yếu tố điều hòa stress oxy hóa Nrf2 trên các mẫu sinh lý, mẫu chứng

bệnh CCl4 2 mM, mẫu đối chứng dương silymarin 100 µg/ml (SILY), mẫu cao cồn

50% 100 µg/ml (BC), mẫu catechin (CAT) và mẫu acid protocatechuic 10 µΜ (AP)

bằng phương pháp miễn dịch Western blot được trình bày trong Hình 3.13.

Kết quả cho thấy biểu hiện của protein Nrf2 gia tăng đáng kể ở các tế bào HepG2

được xử lý với silymarin hoặc cao cồn 50% so với mẫu chứng sinh lý và chứng bệnh

(gấp 3 - 4 lần). Điều này gợi ý tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan của cao Bí kỳ nam

liên quan đến cơ chế kích hoạt yếu tố phiên mã chống oxy hóa Nrf2.

Hình 3.13 Tác động của Bí kỳ nam kích hoạt protein Nrf2 ở tế bào HepG2

3.6.2. Tác động bảo vệ gan in vivo

3.6.2.1. Tác động trên trọng lượng chuột

Trọng lượng chuột các lô trong thời gian thử nghiệm khảo sát tác động của Bí kỳ

nam bảo vệ gan in vivo được trình bày trong Bảng 3.15. Kết quả cho thấy trọng lượng

chuột ở các lô đều không khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Các cao chiết Bí kỳ

nam và các chất phân lập cũng như chất đối chứng silymarin không làm thay đổi trọng

lượng của chuột trong thời gian thử nghiệm.

Bảng 3.15 Trọng lượng chuột trong khảo sát tác động bảo vệ gan của Bí kỳ nam

Lô (n = 8)

Ngày 1 Ngày 3 Ngày 5 Ngày 7 Ngày 9 Ngày 11 Ngày 13

Sinh lý

26,45 ± 0,72

28,89 ± 1.01

29,73 ± 0,97

23,95 ± 0,51

32,08 ± 0,92

34,85 ± 0,93

21,11 ± 0,41

Chứng bệnh

24,81 ± 0,59

29,91 ± 0,61

19,61 ± 0,42

22,74 ± 0,63

28,14 ± 0,72

29,49 ± 0,45

33,59 ± 0,74

Silymarin 100 mg/kg

23,49 ± 0,37

25,86 ± 0,42

18,53 ± 0,33

21,19 ± 0,35

28,69 ± 0,34

32,03 ± 0,42

33,17 ± 0,56

Cao cồn 50% 100 mg/kg

25,85 ± 0,5

29.53 ± 0,55

30,21 ± 0,55

19,24 ± 0,40

22,75 ± 0,58

32,51 ± 0,45

35,39 ± 0,71

Cao EtOAc 100 mg/kg

25,40± 0,33

27,90 ± 0,49

30,30 ± 0,49

20,04 ± 0,34

22,95 ± 0,45

31,78 ± 0,42

33,36 ± 0,22

Cao EtOAc 25 mg/kg

25,63 ± 0,39

28,80 ± 0,60

30,63 ± 0,50

19,51 ± 0,55

22,31 ± 0,43

32,78 ± 0,54

34,23 ± 0,45

Catechin 10 mg/kg

25,26 ± 0,56

28,23 ± 0,55

30,24 ± 0,42

19,76 ± 0,38

22,79 ± 0,30

32,53 ± 0,36

33,38 ± 0,36

Acid protocate- chuic 10 mg/kg

24,58 ± 0,33

28,91 ± 0,49

31,19 ± 0,50

19,26 ± 0,28

21,61 ± 0,47

31,56 ± 1,02

34,14 ± 0,52

3.6.2.2. Tác động lên hoạt tính enzym gan

Tác động của các cao Bí kỳ nam và các chất trên hoạt tính enzym gan ALT,

AST sau 14 ngày thử nghiệm trên mô hình gây tổn thương gan chuột bằng CCl4 0,2%

được trình bày trong Hình 3.14. Kết quả cho thấy các chỉ số AST, ALT ở lô chứng

bệnh cao hơn so với lô sinh lý có ý nghĩa thống kê (p < 0,05): cụ thể AST tăng gấp

12,2 lần, ALT tăng gấp 39,2 lần. Điều đó chứng tỏ CCl4 0,2% đã gây tổn thương tế

bào gan, phóng thích enzym gan AST, ALT vào máu. Điều trị bằng silymarin liều

uống 100 mg/kg hoặc cao cồn 50% Bí kỳ nam liều 100 mg/kg, cao EtOAc 100mg/kg,

catechin 10 mg/kg hoặc acid protocatechuic 10 mg/kg làm giảm chỉ số enzym gan

ALT, AST có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p < 0,05). Cụ thể so với lô

chứng bệnh, lô chuột uống silymarin liều 100 mg/kg AST giảm 2,35 lần, ALT giảm

1,85 lần, lô uống cao cồn 50% Bí kỳ nam liều 100 mg/kg làm AST giảm 3,11 lần,

ALT giảm 2,23 lần, lô uống cao EtOAc Bí kỳ nam liều 100 mg/kg AST giảm 2,02

lần, ALT giảm 1,75 lần, lô uống L-catechin liều 10 mg/kg AST, ALT đều giảm

khoảng 1,8 lần, lô uống acid protocatechuic AST giảm khoảng 1,95 lần, ALT giảm

khoảng 2,39 lần. Lô cao EtOAc liều 25 mg/kg có hoạt tính enzym gan ALT, AST

giảm không có ý nghĩa thống kê với lô chứng bệnh (p > 0,05), gợi ý hiệu quả bảo vệ

gan của cao EtOAc 25 mg/kg không rõ trên chuột thử nghiệm. So với lô đối chứng

dương silymarin 100 mg/kg, sự khác biệt về hoạt tính ALT, AST của các lô cao cồn,

cao EtOAc và các chất đều không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

*: p < 0,05 so với mẫu sinh lý; #: p < 0,05: so với mẫu chứng bệnh

Hình 3.14 Hoạt tính AST, ALT trong tác động bảo vệ gan của Bí kỳ nam

3.6.2.3. Tác động phòng ngừa tình trạng hoại tử do CCl4 gây ra

Tác động của CCl4 và khả năng phòng ngừa của các cao chiết Bí kỳ nam và

các chất catechin, acid protocatechuic lên tình trạng hoại tử gan thông qua hoạt tính

LDH huyết tương được trình bày trong Hình 3.15. Kết quả cho thấy LDH của chuột

lô chứng bệnh (tiêm i.p. với CCl4 0,2%) tăng mạnh có ý nghĩa thống kê (p < 0,01) so

với lô sinh lý, chứng tỏ CCl4 0,2% gây tình trạng hoại tử gan, làm tăng hoạt tính LDH

huyết tương. Ở các lô chuột được cho uống silymarin liều 100 mg/kg, cao cồn 100

mg/kg và acid protocatechuic 10 mg/kg, nồng độ LDH giảm có ý nghĩa thống kê so

với lô chứng bệnh (p < 0,01) lần lượt là 50,80%, 48,17% và 23,70%. Không có sự

khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nồng độ LDH của lô chứng silymarin 100 mg/kg,

*: p < 0,01 so với mẫu sinh lý; #: p < 0,05; ## p < 0,01: so với mẫu chứng bệnh

@@: p < 0,01 so với mẫu chứng dương silymarin

lô cao cồn và cao EtOAc 100 mg/kg (p > 0,05).

Hình 3.15 Hoạt tính LDH trong khảo sát tác động bảo vệ gan của Bí kỳ nam

3.6.2.4. Tác động phòng ngừa tình trạng viêm do CCl4 gây ra

Kết quả tác động của các cao Bí kỳ nam và các chất trên tình trạng viêm thông

qua nồng độ của yếu tố trung gian gây viêm TNF-α được trình bày trong Bảng 3.16.

Bảng 3.16 Hoạt tính TNF-α trong khảo sát tác động bảo vệ gan của Bí kỳ nam

Lô (n=6) TNF-α (pg/ml)

Sinh lý

197,5 ± 44,3 1040,1 ± 50,2** Chứng bệnh

436,9 ± 68,6## Silymarin 100 mg/kg

392,1 ± 44,9## Cao cồn 50% 100 mg/kg

544,8 ± 84,3## Cao EtOAc 100 mg/kg

410,3 ± 56,5## Catechin 10 mg/kg

**: p < 0,01 so với mẫu sinh lý

##: p < 0,01: so với mẫu chứng bệnh

488,0 ± 82,7## Acid protocatechuic 10 mg/kg

Hàm lượng TNF-α mẫu thử (pg/ml) được tính theo phương trình hồi qui tuyến

tính của TNF-α chuẩn: y = 0,0011x + 0,0997 với R2 = 0,9964. Kết quả cho thấy nồng

độ TNF-α của chuột lô chứng bệnh (tiêm phúc mô với CCl4 0,2%) tăng đáng kể gấp

5,3 lần so với lô chứng sinh lý (p < 0,01). Việc điều trị phòng ngừa với silymarin liều

100 mg/kg và các mẫu thử Bí kỳ nam làm giảm đáng kể nồng độ TNF-α so với lô

chứng bệnh (p < 0,01). Trong đó, cao cồn 50% làm giảm TNF-α tốt nhất, 2,6 lần so

với lô chứng bệnh. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nồng độ TNF-α

của lô chứng dương silymarin 100 mg/kg và các lô thử Bí kỳ nam (p > 0,05).

3.6.2.5. Tác động phòng ngừa tình trạng tăng sinh gốc tự do do CCl4 gây ra

Tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan của các cao chiết và chất từ thân củ Bí kỳ

nam được đánh giá thông qua hàm lượng GSH và MDA gan.

Hàm lượng GSH, MDA (nmol/mg) trong dịch đồng thể gan chuột thử nghiệm

được tính dựa vào phương trình đường chuẩn của GSH: y = 576,18x – 74,697 với R2

= 0,9949; phương trình đường chuẩn MDA: y = 8,4829x - 0,3145 với R2 = 0,9981;

phương trình đường chuẩn của protein: y = 3,083x – 0,6813 với R2 =0,9904 và mối

quan hệ giữa nồng độ GSH, MDA với độ hấp thu. Kết quả được trình bày trong Hình

3.16 và 3.17 cho thấy hàm lượng GSH nội bào giảm 1,71 lần và hàm lượng MDA

sinh ra trong gan tăng gấp 3,06 lần ở lô chứng bệnh so với lô sinh lý, khác biệt có ý

nghĩa thống kê (p < 0,01). Như vậy, việc tiêm phúc mô CCl4 0,2% liều 10 ml/kg đã

gây tổn thương gan chuột làm tăng sinh các gốc tự do, giảm các chất chống oxy hóa

và tăng quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào gan.

Đối với hàm lượng GSH, ở lô thử cao cồn liều 100 mg/kg, cao EtOAc 100

mg/kg, catechin và acid protocatechuic liều 10 mg/kg đều làm tăng hàm lượng GSH

có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với lô chứng bệnh, lần lượt từ 1,20 – 1,54 lần, trừ

lô cao EtOAc liều 25 mg/kg (p > 0,05). Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

giữa hàm lượng GSH của lô thử và lô chứng dương silymarin 100 mg/kg (p > 0,05).

Đối với MDA, chất chứng dương silymarin 100 mg/kg, cao cồn liều 100 mg/kg,

cao EtOAc liều 100 mg/kg, 25 mg/kg, catechin và acid protocatechuic liều 10 mg/kg

đều làm giảm MDA gan so với lô chứng bệnh (p < 0,05) từ 1,63 – 2,50 lần. MDA ở

các lô dùng cao chiết Bí kỳ nam và các chất đều không khác biệt có ý nghĩa thống kê

so với lô chứng dương silymarin 100 mg/kg (p > 0,05). Như vậy, hiệu quả làm giảm

hàm lượng MDA trong gan của cao Bí kỳ nam và các chất tương đương với chất đối

**: p < 0,01 so với mẫu sinh lý

#: p < 0,05: so với mẫu chứng bệnh

chứng silymarin 100 mg/kg.

Hình 3.16 Hàm lượng GSH gan (nmol/mg) trong khảo sát tác động bảo vệ gan

**: p < 0,01 so với mẫu sinh lý

#: p < 0,05: so với mẫu chứng bệnh

in vivo của Bí kỳ nam do CCl4 gây ra

Hình 3.17 Hàm lượng MDA gan (nmol/mg) trong khảo sát tác động bảo vệ gan

in vivo của Bí kỳ nam do CCl4 gây ra

3.6.2.6. Tác động trên đại thể và vi thể gan

Kết quả khảo sát đại thể, vi thể gan của chuột ở các lô thử nghiệm được trình

bày trong Hình 3.18, 31.19 và Bảng 3.17.

Sinh lý Chứng bệnh Silymarin Cao cồn 50%

Cao EtOAc 100 Catechin Cao EtOAc 25

Acid protocatechuic Hình 3.18 Đại thể gan chuột trong khảo sát tác động bảo vệ gan của Bí kỳ nam

Kết quả cho thấy tất cả gan chuột ở lô sinh lý có màu đỏ, mặt ngoài nhẵn, không

phù nề và không xung huyết. Ở lô chứng bệnh với CCl4, gan nhạt màu, bề mặt có

nhiều chấm xuất huyết hoặc chấm trắng có đường kính 0,5 – 1 mm. Ở chuột uống

silymarin và các mẫu thử đa số gan có màu đỏ, mặt ngoài nhẵn, không phù nề và

không xung huyết, tương tự như gan chuột ở lô sinh lý. Về vi thể gan chuột, khi gây

độc bằng cách tiêm phúc mô CCl4 0,2% trong dầu oliu liều 10 ml/kg gây tổn thương

gan dẫn tới hoại tử nhu mô gan, viêm quanh khoảng cửa cũng như viêm nhu mô gan.

Khi cho chuột uống cao cồn 50% Bí kỳ nam liều 100 mg/kg, cao EtOAc liều 100

mg/kg, catechin liều 10 mg/kg hay acid protocatechuic liều 10 mg/kg cũng như chất

đối chiếu silymarin liều 100 mg/kg làm giảm tổn thương gan rõ rệt so với lô chứng

bệnh. Tác dụng của các lô điều trị bằng cao chiết Bí kỳ nam hoặc các chất có trong

Bí kỳ nam tương đương với thuốc đối chứng silymarin.

Bảng 3.17 Kết quả vi thể gan chuột trong thử nghiệm bảo vệ gan của Bí kỳ nam

Kết quả phân tích vi thể

Lô (n=6) Sinh lý (SL) Chứng bệnh

6/6 mẫu: Mô gan bình thường. 1/6 mẫu: Mô gan viêm quanh khoảng cửa. 5/6 mẫu: Mô gan bị viêm quanh khoảng cửa, viêm nhu mô gan, hoại tử tiểu thùy.

Silymarin 100 mg/kg

4/6 mẫu: Mô gan bình thường 2/6 mẫu: Viêm quanh khoảng cửa.

Cao EtOAc 100 mg/kg

Catechin 10 mg/kg Acid protocatechuic 10 mg/kg Cao cồn 50% 100 mg/kg 4/6 mẫu: Mô gan bình thường; 2/6 mẫu: Mô gan bị viêm quanh khoảng cửa. 4/6 mẫu: Mô gan bình thường; 2/6 mẫu: Mô gan bị viêm quanh khoảng cửa. 4/6 mẫu: Mô gan bình thường; 2/6 mẫu: Viêm quanh khoảng cửa. 5/6 mẫu: Mô gan bình thường; 1/6 mẫu: Viêm quanh khoảng cửa.

Khoảng cửa bình thường Viêm quanh khoảng cửa

Tĩnh mạch trung tâm bình thường Viêm quanh tĩnh mạch trung tâm

Nhu mô gan bình thường Viêm và hoại tử nhu mô gan

Hình 3.19 Vi thể mô gan trong khảo sát tác động bảo vệ gan Bí kỳ nam (40X)

3.7. TÁC ĐỘNG BẢO VỆ THẬN CỦA BÍ KỲ NAM

3.7.1. Tác động bảo vệ thận in vitro

3.7.1.1. Xây dựng mô hình in vitro mô phỏng tình trạng tổn thương tế bào

thận do cisplatin gây ra trên dòng tế bào HEK 293

Đánh giá sơ bộ tác động của mật độ tế bào, thời gian xử lý và nồng độ

cisplatin lên tỷ lệ sống của tế bào HEK 293

Kết quả đánh giá tác động của cisplatin ở các nồng độ 12,5, 25, 50 và 100 µM

so với mẫu chứng (cisplatin 0 µM) lên tỷ lệ sống của tế bào thận HEK 293 được nuôi

cấy ở 3 mật độ 0,5 x 105 tế bào/ml, 1 x 105 tế bào/ml và 2 x 105 tế bào/ml sau thời

gian xử lý là 24, 48 và 72 giờ được trình bày trong Bảng 3.18 và Hình 3.20.

Các thông số được xét theo thứ tự: Thời gian xử lý  mật độ tế bào  nồng độ

cisplatin và đảm bảo tỷ lệ giảm tế bào sống so với mẫu sinh ký từ 30% trở lên. Sau

48 và 72 giờ xử lý, tỷ lệ ức chế tế bào HEK 293 ở các mật độ nuôi cấy không tuyến

tính giữa các nồng độ cisplatin. Sau 24 giờ xử lý, ở mật độ 0,5 x 105 tế bào/ml, tất cả

nồng độ cipslatin cho thấy tỷ lệ ức chế của tế bào không khác biệt có ý nghĩa thống

kê so với mẫu sinh lý (p > 0,05). Ở mật độ 1 x 105 tế bào/ml, nồng độ cisplatin 12,5

µM, gây ức chế tế bào không khác biệt đáng kể so với mẫu sinh lý (p > 0,05). Với

nồng độ cisplatin từ 25 - 100 µM, tỷ lệ ức chế tế bào khác biệt so với mẫu sinh lý (p

< 0,05), tuy nhiên không tuyến tính với nồng độ cisplatin. Ở mật độ 2 x 105 tế bào/ml,

nồng độ cisplatin 12,5 µM, tỷ lệ ức chế của tế bào không khác biệt so với mẫu sinh

lý (p > 0,05); với nồng độ cisplatin 25 µM, tỷ lệ ức chế của tế bào HEK 293 là 52,1%,

khác biệt đáng kể so với mẫu sinh lý (p < 0,05); khi tăng nồng độ cisplatin lên 50 µM

và 100 µM, tỷ lệ ức chế tế bào gia tăng, tuy nhiên không khác biệt đáng kể so với

nồng độ 25 µM (p > 0,05), gợi ý việc tăng nồng độ cisplatin là không cần thiết.

Dựa trên kết quả về tỷ lệ tế bào sống thu được bằng phương pháp MTT khi khảo

sát các thông số về thời gian xử lý, mật độ nuôi cấy, nồng độ cisplatin, nghiên cứu

chọn mật độ nuôi cấy tế bào HEK 293 là 2,0 x 105 tế bào/ml, thời gian xử lý tế bào

trong 24 giờ với cisplatin ở nồng độ 25 µM cho các thử nghiệm tiếp theo.

Bảng 3.18 Tác động của cisplatin ở các nồng độ và thời gian xử lý khác nhau

lên tế bào HEK 293 nuôi cấy ở các mật độ khác nhau

OD570nm ± SEM (n=4)

MẬT ĐỘ/ CISPLATIN

0,5 x 105 tế bào/ml

105 tế bào/ml

2 x 105 tế bào/ml

Xử lý tế bào trong 24 giờ

0,195 ± 0,024 0,151 ± 0,015 0,150 ± 0,016 0,122 ± 0,005 0,139 ± 0,012

0,419 ± 0,026 0,325 ± 0,021* 0,245 ± 0,012* 0,186 ± 0,039* 0,208 ± 0,015*

0,833 ± 0,038 0,617 ± 0,054 0,399 ± 0,057* 0,342 ± 0,038* 0,292 ± 0,033*

0 µM 12,5 µM 25 µM 50 µM 100 µM

Xử lý tế bào trong 48 giờ

0,513 ± 0,044 0,178 ± 0,015* 0,189 ± 0,008* 0,116 ± 0,009* 0,146 ± 0,007*

1,426 ± 0,028 0,557 ± 0,039* 0,388 ± 0,063* 0,253 ± 0,027* 0,519 ± 0,227*

2,256 ± 0,146 1,014 ± 0,048* 0,842 ± 0,033* 0,892 ± 0,089* 0,778 ± 0,072*

0 µM 12,5 µM 25 µM 50 µM 100 µM

Xử lý tế bào trong 72 giờ

0,580 ± 0,095 0,147 ± 0,015* 0,097 ± 0,011* 0,223 ± 0,156 0,081 ± 0,004*

1,850 ± 0,196 0,528 ± 0,084* 0,143 ± 0,027* 0,185 ± 0,027* 0,341 ± 0,078*

0 µM 12,5 µM 25 µM 50 µM 100 µM

1,616 ± 0,073 0,299 ± 0,043* 0,104 ± 0,019* 0,143 ± 0,025* 0,126 ± 0,013* Tỷ lệ ức chế so với mẫu chứng sinh lý (%) Xử lý tế bào trong 24 giờ

22,4 23,0 37,3 28,8

22,4 41,7 55,6 50,5

26,0 52,1 59,0 65,0

12,5 µM 25 µM 50 µM 100 µM

Xử lý tế bào trong 48 giờ

65,3 63,1 77,5 71,5

61,0 72,8 82,2 63,6

55,1 62,7 60,4 65,5

12,5 µM 25 µM 50 µM 100 µM

Xử lý tế bào trong 72 giờ

74,7 83,3 61,5 86,0

81,5 93,6 91,2 92,2

71,5 92,3 90,0 81,6

12,5 µM 25 µM 50 µM 100 µM

100

Hình 3.20 Tỷ lệ ức chế tế bào HEK 293 ở các nồng độ cisplatin, thời gian nuôi

cấy và mật độ tế bào khác nhau

3.7.1.2. Đánh giá tình trạng tổn thương tế bào HEK 293 do cisplatin gây ra

Sau khi chọn được các thông số thích hợp, nghiên cứu đánh giá tình trạng tổn

thương tế bào HEK 293 do cisplatin gây ra. Với mật độ nuôi cấy 2,0 x 105 tế bào/ml,

kết quả cho thấy sau 24 giờ xử lý, cisplatin 25 µM làm giảm 39,1 % tỷ lệ sống của tế

bào, giảm 69,5% hàm lượng GSH so với mẫu chứng sinh lý (p < 0,01) và làm tăng

19,1% hoạt tính LDH ngoại bào (p < 0,01) (Bảng 3.19).

Bảng 3.19 Tác động của cisplatin 25 µM sau 24 giờ xử lý lên tế bào HEK 293

Mẫu (n=6) OD570nm trung bình ± SEM (n=6) Hàm lượng GSH trung bình (nM/mg protein) ± SEM Hoạt tính LDH trung bình (mU/ml) ± SEM

1,636 ± 0,089 77,2 ± 4,6 0,712 ± 0,012

0,997 ± 0,054** 23,6 ± 4,5** 0,848 ± 0,008**

**: p < 0,01 so với mẫu sinh lý; #: p < 0,05,##: p < 0,01 so với mẫu chứng bệnh

1,213 ± 0,092# 62,5 ± 9,9## 0,631 ± 0,006## Sinh lý (Cisplatin 0 µM) Chứng bệnh (Cisplatin 25 µM) NAC 1000 µM

101

Những kết quả này chứng minh các thông số được chọn thích hợp để thực hiện

những thí nghiệm tiếp theo khảo sát tác động tổn thương tế bào thận HEK 293 do

cisplatin gây ra. N-acetylcystein (NAC 1000 µM) được chọn là chất đối chứng dương.

Sự thay đổi hình dạng của tế bào HEK 293 dưới tác động của cisplatin 25 µM sau

24 giờ xử lý cũng thể hiện rõ trên hình ảnh hiển vi điện tử (Hình 3.21), cho thấy dưới

tác động của cisplatin, các tế bào HEK 293 có hiện tượng co rút, độ bám dính tế bào

kém và giảm số lượng tế bào rõ rệt so với mẫu chứng sinh lý.

Hình 3.21 Tế bào HEK 239 (a) sinh lý và (b) sau 24 giờ xử lý với cisplatin 25 µM

3.7.1.3. Tác động bảo vệ tế bào thận HEK 293 của Bí kỳ nam

Tác động của Bí kỳ nam lên sự tăng trưởng của tế bào thận HEK 293

Kết quả tác động của các mẫu thử Bí kỳ nam lên sự tăng trưởng tế bào thận

HEK 293, trong 24 giờ, so với mẫu chứng DMSO 0,1% bằng thử nghiệm MTT, được

trình bày trong Bảng 3.20.

Bảng 3.20 Tác động của Bí kỳ nam lên sự tăng trưởng của tế bào HEK 293

Sự tăng trưởng của tế bào

Mẫu thử / Nồng độ (n=6) OD570nm ± SEM

Mẫu chứng sinh lý Cao cồn 50% 100 µg/ml Cao cồn 50% 200 µg/ml Cao EtOAc 100 µg/ml Cao EtOAc 200 µg/ml Catechin 10 µΜ Catechin 20 µΜ Phần trăm thay đổi so với mẫu sinh lý (%) +21,4 +23,8 +29,0 +30,6 +12,1 +13,9

Acid protocatechuic 10 µΜ 1,638 ± 0,098 1,989 ± 0,025* 2,027 ± 0,038* 2,112 ± 0,260 2,139 ± 0,142* 1,836 ± 0,100 1,866 ± 0,052 1,995 ± 0,029* +21,8

*: p < 0,05: so với mẫu chứng sinh lý

+14,5 Acid protocatechuic 20 µΜ 1,875 ± 0,112

102

Sau 24 giờ xử lý với các mẫu thử từ Bí kỳ nam, tế bào HEK 293 phát triển tốt,

tăng tỷ lệ sống so với mẫu chứng DMSO 0,1%, chứng tỏ các mẫu thử Bí kỳ nam không

gây độc đối với tế bào HEK 293 ở các nồng độ khảo sát. Do đó, những mẫu thử ở các

nồng độ này có thể sử dụng để khảo sát tác động bảo vệ tế bào thận của Bí kỳ nam trong

các thí nghiệm tiếp theo.

Tác động phòng ngừa ức chế tăng trưởng tế bào HEK 293 do cisplatin gây ra

Tác động phòng ngừa ức chế tăng trưởng tế bào thận HEK 293 do cisplatin gây

ra của cao cồn 50%, cao EtOAc và các chất phân lập catechin, acid protocatechuic từ

Bí kỳ nam được trình bày trong Bảng 3.21.

Mẫu (n=6) Bảng 3.21 Tác động phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng tế bào thận HEK 293 do cisplatin gây ra OD570nm trung bình ± SEM Phần trăm phòng ngừa so với mẫu chứng bệnh (%)

1,638 ± 0,098 0,997 ± 0,047**

Sinh lý Chứng bệnh (Cis 25 µM) NAC 1000 µM Cao cồn 50% 100 µg/ml Cao cồn 50% 200 µg/ml Cao EtOAc 100 µg/ml Cao EtOAc 200 µg/ml Catechin 10 µΜ Catechin 20 µΜ Acid protocatechuic 10 µΜ Acid protocatechuic 20 µΜ 33,7 66,4 61,4 61,2 56,2 54,8 51,8 45,4 35,8

1,213 ± 0,092#* 1,423 ± 0,018## 1,391 ± 0,040##* 1,390 ± 0,087# 1,358 ± 0,055##* 1,348 ± 0,039##* 1,329 ± 0,062##* 1,288 ± 0,026##* 1,226 ± 0,070#* *: p < 0,01 so với mẫu sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với mẫu chứng bệnh

Với mật độ nuôi cấy 2 x 105 tế bào/ml, sau 24 giờ xử lý, cisplatin 25 µM ức chế

đáng kể sự tăng trưởng của tế bào HEK 293 so với mẫu chứng sinh lý (p < 0,01). Sự

ức chế này được phòng ngừa khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy chất đối chứng

dương NAC 1000 µM hay các mẫu thử của Bí kỳ nam (p < 0,05). Trong đó, cao cồn

50% ở nồng độ 100 µg/ml cho thấy tác động phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng do

cisplatin gây ra là tốt nhất (tỷ lệ phòng ngừa 66,4%), đồng thời tỷ lệ tế bào sống không

khác biệt đáng kể so với mẫu sinh lý (p > 0,05). Tỷ lệ tế bào HEK 293 sống ở tất cả

103

các mẫu thử Bí kỳ nam đều không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với mẫu chứng

dương NAC 1000 µM (p > 0,05). Đồng thời, không có sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ

tế bào sống giữa 2 nồng độ của cùng một mẫu thử Bí kỳ nam (p > 0,05). Tác động ức

chế tăng trưởng tế bào HEK 293 của cisplatin 25 µM và khả năng phòng ngừa của

các mẫu thử cũng thể hiện trong hình ảnh trên kính hiển vi 10x (Hình 3.22).

b.

a.

c.

d.

đ.

e.

g.

Hình 3.22 Tế bào HEK 293 sau 24 giờ xử lý với (a) DMSO 0,1%; (b) cis 25 µM;

(e) catechin 10 µM; (g) acid protocatechuic 10 µM

Tác động phòng ngừa hoại tử tế bào thận HEK 293 do cisplatin gây ra

Kết quả khảo sát tác động phòng ngừa tình trạng hoại tử tế bào thận HEK 293

trên hoạt tính LDH của Bí kỳ nam được trình bày trong Bảng 3.22 cho thấy cisplatin

25 µM sau 24 giờ tiếp xúc làm tăng đáng kể LDH so với mẫu chứng sinh lý (p <

0,01). Tình trạng này được phòng ngừa bởi mẫu đối chứng dương NAC 1000 µM và

các mẫu thử Bí kỳ nam ở tất cả nồng độ, thể hiện hoạt tính LDH giảm đáng kể so với

mẫu chứng bệnh (p < 0,05). Trong đó mẫu cao cồn 50% nồng độ 100 µg/ml và mẫu

104

thử acid protocatechuic ở 2 nồng độ 10, 20 µΜ thể hiện hoạt tính ức chế hoại tử tế

bào HEK 293 tốt nhất (tỷ lệ lần lượt là 72,8%, 80,4% và 84,6%). Không có sự khác

biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nồng độ của cùng một mẫu thử (p > 0,05), giữa cao

cồn 50%, cao EtOAc và acid protocatechuic (p > 0,05).

Bảng 3.22 Tác động của Bí kỳ nam phòng ngừa hoại tử tế bào thận HEK 293

do cisplatin gây ra

Mẫu (n=6) Sinh lý Cisplatin 25 µM NAC 1000 µM Cao cồn 50% 100 µg/ml Cao cồn 50% 200 µg/ml Cao EtOAc 100 µg/ml Cao EtOAc 200 µg/ml Catechin 10 µΜ Catechin 20 µΜ Acid protocatechuic 10 µΜ Acid protocatechuic 20 µΜ OD490nm trung bình ± SEM 0,712 ± 0,012 0,848 ± 0,008** 0,631 ± 0,006## 0,749 ± 0,015## 0,755 ± 0,012## 0,765 ± 0,024# 0,754 ± 0,021## 0,821 ± 0,009# 0,803 ± 0,011# 0,722 ± 0,011## 0,733 ± 0,016##

**: p < 0,01 so với sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với chứng bệnh Tác động phòng ngừa tăng sinh gốc tự do của tế bào thận HEK 293 do

cisplatin gây ra

Dựa vào phương trình đường chuẩn GSH: y = 0,0009x + 0,1003 với R² = 0,9986

và nồng độ protein toàn phần của tế bào thận HEK 293, suy ra hàm lượng GSH

(nM/mg) trong tế bào thận. Kết quả thể hiện ở Hình 3.23 cho thấy sau 24 giờ xử lý,

cisplatin 25 µM làm giảm 69,5% lượng GSH nội bào so với mẫu sinh lý (p < 0,05).

Khi bổ sung NAC 1000 µM hoặc các cao chiết và chất phân lập từ Bí kỳ nam vào

môi trường nuôi cấy, hàm lượng GSH nội bào được khôi phục đáng kể so với mẫu

chứng bệnh (p < 0,05). Cao cồn 50% 100 µg/ml thể hiện hoạt tính khôi phục hàm

lượng GSH tốt nhất với tỷ lệ 63,7%. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa

hàm lượng GSH của cao cồn 50% và mẫu chứng dương NAC 1000 µM, cũng như

mẫu sinh lý (p > 0,05). Đồng thời, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa

các nồng độ của cùng một mẫu thử (p > 0,05).

105

*: p < 0,05 so với mẫu sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với chứng bệnh

Hình 3.23 Tác động của Bí kỳ nam phòng ngừa tăng sinh gốc tự do của tế bào

thận HEK 293 do cisplatin gây ra

Tác động tăng biểu hiện protein điều hòa chống oxy hóa Nrf2

Kết quả tác động của cisplatin và các mẫu thử NAC, cao cồn 50% Bí kỳ nam,

catechin và acid protocatechuic lên biểu hiện của protein phiên mã điều hòa stress

oxy hóa Nrf2 bằng kỹ thuật lai miễn dịch western blot với kháng thể kháng Nrf2

(Ab62352) được biểu thị trong Hình 3.24. Kết quả cho thấy sau 24 giờ xử lý, biểu

hiện protein Nrf2 gia tăng rõ rệt ở mẫu chứng dương NAC 1000 µM, mẫu cao cồn

50% Bí kỳ nam và các chất phân lập so với mẫu sinh lý. Điều này chứng tỏ mẫu

chứng dương NAC và các mẫu thử Bí kỳ nam dưới tác động của stress oxy hóa do

cisplatin gây ra đã kích hoạt protein Nrf2 dẫn đến tác động phòng ngừa, chống oxy

hóa, bảo vệ tế bào thận của Bí kỳ nam.

Hình 3.24 Tác động của Bí kỳ nam kích hoạt protein Nrf2 ở tế bào HEK 293

106

3.7.2. Tác động bảo vệ thận in vivo

3.7.2.1. Tác động trên trọng lượng chuột

Kết quả theo dõi thay đổi trọng lượng cơ thể chuột trong quá trình thử nghiệm

được trình bày ở Bảng 3.23.

Bảng 3.23 Trọng lượng cơ thể chuột trong tác động bảo vệ thận của Bí kỳ nam

Lô (n = 10) N1

N3

N5

N7

N9

N11

N12

N13

Sinh lý

Chứng bệnh

27,08 ± 0,64 28,43 ± 0,63 23,26 ± 0,80 26,18 ± 0,73 25,94 ± 0,74 26,58 ± 0,82 26,72 ± 0,70 25,54 ± 0,73

33,13 ± 1,81 35,87 ± 0,82 34,29 ± 1,14 35,94 ± 1,02 32,89 ± 1,55 33,24 ± 0,91 36,16 ± 1,21 34,54 ± 0,83

31,30 ± 1,10 33,53 ± 0,48 31,20 ± 0,95 32,74 ± 0,81 31,49 ± 0,91 31,84 ± 0,85 33,30 ± 0,93 31,53 ± 0,94

34,08 ± 1,99 34,71 ± 0,80 33,00 ± 1,25 34,65 ± 1,03 31,96 ± 1,71 31,80 ± 0,91 34,37 ± 1,10 33,38 ± 0,88

32,25 ±1,47 34,32 ± 0,50 32,64 ± 1,02 34,05 ± 0,83 31,96 ± 1,51 32,36 ± 0,86 34,61 ± 1,11 32,36 ± 1,16

30,27 ± 0,82 32,53 ±0,59 30,01 ± 0,88 31,78 ± 0,85 31,34 ± 0,70 29,93 ± 0,78 32,71 ± 1,01 31,17 ± 0,64

32,68 ± 1,72 34,97 ± 0,58 33,15 ± 1,12 34,78 ± 0,95 32,1 ± 1,50 32,45 ± 0,90 35,01 ± 1,17 33,11 ± 1,01

NAC 100 mg/kg Cao cồn 50% 100 mg/kg Cao EtOAc 100 mg/kg Cao EtOAc 25 mg/kg Catechin 10 mg/kg Acid protocatechuic 10 mg/kg

34,84 ± 2,15 32,09 ± 0,78 30,89 ± 1,45 32,11 ± 0,93 30,02 ± 1,50 29,47 ± 0,90 31,95 ± 1,08 30,77 ± 0,97 Kết quả cho thấy trọng lượng chuột không khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa

các lô dùng mẫu thử Bí kỳ nam và giữa các lô thử so với lô sinh lý hay lô chứng

dương NAC 100 mg/kg trong thời gian thử nghiệm (p > 0,05).

3.7.2.2. Tác động trên chỉ số sinh hóa

Kết quả khảo sát tác động của các mẫu thử Bí kỳ nam trên chỉ số nồng độ ure

và creatinin huyết được trình bày ở Bảng 3.24 cho thấy nồng độ urê và creatinin huyết

ở lô chứng bệnh lần lượt tăng gấp 4,5 lần và 8,1 lần so với lô sinh lý (p < 0,001). Việc

điều trị với chất chứng dương NAC liều 100 mg/kg hoặc các mẫu thử từ Bí kỳ nam

làm giảm nồng độ ure huyết có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p < 0,01), cụ

thể, nồng độ ure huyết ở lô thử NAC, cao cồn 50%, cao EtOAc 100 mg/kg, 25 mg/kg,

catechin và acid protocatechuic lần lượt giảm 4,18 lần; 3,18 lần; 3,66 lần; 2,90 lần;

2,80 lần và 3,06 lần; trong khi nồng độ creatinin huyết lần lượt giảm 5,71 lần; 4,60

lần; 5,00 lần; 4,21 lần và 4,00 lần so với lô chứng bệnh. Nồng độ ure huyết ở các lô

107

cao cồn 50%, cao EtOAc 100 mg/kg, catechin, acid protocatechuic và nồng độ

creatinin huyết ở tất các lô thử (trừ lô acid protocatechuic) đều khác biệt không có ý

nghĩa thống kê so với lô chứng dương NAC 100 mg/kg (p > 0,05). Như vậy, hầu hết

các mẫu thử Bí kỳ nam có tác động bảo vệ thận làm giảm nồng độ ure và creatinin

tăng do cisplatin gây ra, tương tự chất chứng dương NAC.

Bảng 3.24 Nồng độ ure và creatinin máu trong khảo sát tác động bảo vệ thận của Bí kỳ nam

Lô (n = 10) Ure (mg/dL) Creatinin (µmol/L)

Sinh lý 60,32 ± 3,70 0,10 ± 0,01

Chứng bệnh 260,47 ± 49,48*** 0,80 ± 0,26***

NAC 100 mg/kg 62,31 ± 4,93### 0,14 ± 0,01###

Cao cồn 50% 100 mg/kg 82,01 ± 10,05## 0,17 ± 0,02##

Cao EtOAc 100 mg/kg 71,20 ± 8,16### 0,16 ± 0,02###

Cao EtOAc 25 mg/kg 89,78 ± 9,16##@ 0,19 ± 0,02##

Catechin 10 mg/kg 96,13 ± 15,02## 0,20 ± 0,03##@

***: p < 0,001 so với lô sinh lý; ###: p < 0,001; ##: p < 0,01 so với lô chứng bệnh; @: p < 0,05 so với chứng dương NAC

Acid protocatechuic 10 mg/kg 85,04 ± 10,12## 0,20 ± 0,03##

3.7.2.3. Tác động phòng ngừa tình trạng hoại tử do cisplatin gây ra

Tác động của cisplatin và khả năng phòng ngừa hoại tử của các cao chiết và các

chất catechin, acid protocatechuic từ thân củ Bí kỳ nam được đánh giá trên hoạt tính

LDH và được trình bày trong Hình 3.25. Kết quả khảo sát cho thấy cisplatin liều 16

mg/kg (i.p.) gây tình trạng hoại tử tế bào, làm tăng đáng kể nồng độ LDH ngoại bào

gấp 3,14 lần so với lô sinh lý (p < 0,01). Ở các lô chuột được điều trị dự phòng với

chất chứng dương NAC liều 100 mg/kg và các mẫu thử Bí kỳ nam, nồng độ LDH

giảm đáng kể so với lô chứng bệnh (p < 0,05) từ 1,39 đến 2,26 lần. Trong đó, cao cồn

Bí kỳ nam 100 mg/kg cho tác động tương đương với lô chứng dương NAC 100 mg/kg

với khả năng giảm hoạt tính LDH về gần giá trị bình thường của lô sinh lý (p > 0,05).

108

**: p < 0,01: so với sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với chứng bệnh

Hình 3.25 Nồng độ LDH trong khảo sát tác động bảo vệ thận của Bí kỳ nam

3.7.2.4. Tác động phòng ngừa tình trạng viêm do cisplatin gây ra

Tác động của cisplatin và khả năng phòng ngừa của các mẫu thử trên tình trạng

viêm được đánh giá thông qua nồng độ TNF-α, dựa vào phương trình tuyến tính giữa

nồng độ TNF-α chuẩn và độ hấp thu: y = 0,001x + 0,1385 với R2 = 0,9928. Kết quả

*: p < 0,05; **: p < 0,01: so với lô sinh lý; ## p < 0,01: so với lô chứng bệnh

được trình bày trong Hình 3.26.

Hình 3.26 Hoạt tính TNF-α trong khảo sát tác động bảo vệ thận của Bí kỳ nam

Khảo sát cho thấy TNF-α của chuột lô chứng bệnh tăng đáng kể, gấp 5,52 lần

so với lô chứng sinh lý, có ý nghĩa thống kê (p < 0,01), chứng tỏ cisplatin liều 16

109

mg/kg (i.p.) gây tình trạng viêm ở chuột. Ở lô chuột dùng phòng ngừa với NAC liều

100 mg/kg, cao cồn 50% Bí kỳ nam, cao EtOAc, catechin và acid protocatechuic

nồng độ TNF-α giảm đáng kể so với lô chứng bệnh (p < 0,01) lần lượt là 3,25; 3,76;

2,73; 4,91 và 2,27 lần. Đồng thời, nồng độ TNF-α của lô chứng dương NAC, lô cao

cồn 50% và catechin giảm về gần tương đương với lô sinh lý (p > 0,05). Không có

sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nồng độ TNF-α của các lô thử Bí kỳ nam và lô

chứng dương NAC 100 mg/kg (p > 0,05).

3.7.2.5. Tác động phòng ngừa tăng sinh gốc tự do

Tác động chống oxy hóa, phòng ngừa tình trạng tăng sinh gốc tự do, bảo vệ

thận của các cao chiết Bí kỳ nam và các chất được đánh giá thông qua sự thay đổi

hàm lượng glutathion (GSH) trong thận. Hàm lượng GSH thận (nmol/mg protein)

được tính dựa vào phương trình tuyến tính giữa nồng độ GSH chuẩn và độ hấp thu:

C (nmol/ml) = 526,04 x ODthử - 64,621, R² = 0,994 và phương trình tuyến tính giữa

nồng độ protein toàn phần trong thận với độ hấp thu: C (mg/ml) = 5,7754 x ODthử -

1,0824, R² = 0,9971. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.25. Kết quả cho thấy ở lô

chứng bệnh, cisplatin liều 16 mg/kg gây tổn thương thận, làm giảm hàm lượng GSH

1,57 lần so với lô sinh lý (p < 0,01). Ở lô chứng dương NAC liều 100 mg/kg và các

lô cao cồn 50% 100 mg/kg, cao EtOAc 25 mg/kg và catechin 10 mg/kg làm tăng hàm

lượng GSH lần lượt so với lô chứng bệnh, có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Riêng lô

cao EtOAc 100 mg/kg và acid protocatechuic cũng làm tăng hàm lượng GSH so với

lô chứng bệnh tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). GSH

giữa các lô thử nghiệm với cao Bí kỳ nam và các chất đều khác biệt không có ý nghĩa

thống kê và cũng không khác biệt so với lô chứng dương NAC 100 mg/kg cũng như

lô sinh lý (p > 0,05). Kết quả cho thấy cao chiết Bí kỳ nam và các chất có tác động

chống oxy hóa, bảo vệ thận tương tự như thuốc đối chứng dương NAC và giúp GSH

trở về mức sinh lý bình thường. Ngoài ra, ở lô chuột uống cao cồn 50% liều 100

mg/kg có hàm lượng GSH thận cao hơn lô sinh lý, có ý nghĩa thống kê (p < 0,05); kết

quả này gợi ý cao chiết Bí kỳ nam có thể làm tăng tổng hợp GSH thận nói riêng và

cơ thể nói chung.

110

Bảng 3.25 Hàm lượng GSH thận trong khảo sát tác động bảo vệ thận in vivo của Bí kỳ nam

Lô (n = 10) GSH (nmol/mg)

Sinh lý 121,5 ± 5,5

Chứng bệnh 77,4 ± 10,5**

NAC 100 mg/kg 122,2 ± 10,4##

Cao cồn 50% 100 mg/kg 143,3 ± 6,4###*

Cao EtOAc 100 mg/kg 103,4 ± 10,7

Cao EtOAc 25 mg/kg 124,9 ± 9,6##

Catechin 10 mg/kg 126,0 ±10,0##

* p < 0,05 **p < 0,01 so với sinh lý; ##: p < 0,01 ###: p < 0,001 so với chứng bệnh

Acid protocatechuic 10 mg/kg 104,6 ± 10,6

3.7.2.6. Kết quả đại thể, vi thể thận

Kết quả khảo sát đại thể, vi thể thận của chuột ở các lô thử nghiệm được trình

bày trong Hình 3.27, Hình 3.28 và Bảng 3.26.

Kết quả phân tích đại thể cho thấy thận chuột ở lô sinh lý và các lô dùng chất

đối chứng dương hay mẫu thử có màu đỏ thẫm bình thường, không tổn thương và

không xung huyết. Ở lô chứng bệnh với cisplatin 16 mg/kg, thận nhạt màu, có những

chấm xung huyết.

Sinh lý Chứng bệnh NAC Cao cồn EtOAc 100 EtOAc 25 CAT AP

Hình 3.27 Đại thể thận chuột trong khảo sát tác động bảo vệ thận của Bí kỳ nam

Kết quả phân tích vi thể cho thấy cisplatin liều 16 mg/kg gây tổn thương thận

dẫn tới hoại tử ống thận gần – xa, rải rác trong các ống thận có các ống thận dãn rộng.

Các mẫu thử Bí kỳ nam và chất đối chiếu NAC làm giảm tổn thương thận rõ rệt so

với lô chứng bệnh.

111

Bảng 3.26 Vi thể thận chuột trong khảo sát tác động bảo vệ thận của Bí kỳ nam

Lô (n=6) Kết quả phân tích vi thể

Sinh lý 6/6 mẫu: Mô thận bình thường

6/6 mẫu: Hoại tử ống thận gần – xa. Rải rác Chứng bệnh trong các ống thận có các ống thận dãn rộng.

NAC 100 mg/kg 6/6 mẫu: Mô thận bình thường

Cao cồn 50% 100 mg/kg 6/6 mẫu: Mô thận bình thường

Cao EtOAc 100 mg/kg 6/6 mẫu: Mô thận bình thường

Catechin 10 mg/kg 6/6 mẫu: Mô thận bình thường

Acid protocatechuic 10 mg/kg 6/6 mẫu: Mô thận bình thường

Sinh lý (Mô thận bình thường) Chứng bệnh (Hoại tử và dãn ống thận) Chứng bệnh (Hoại tử và dãn ống thận)

Cao EtOAc 100 mg/kg (Mô thận bình thường)

NAC 100 mg/kg (Mô thận bình thường) Cao cồn 50% 100 mg/kg (Mô thận bình thường)

Acid protocatechuic (Mô thận bình thường)

Catechin (Mô thận bình thường) Hình 3.28 Vi thể thận chuột trong khảo sát tác động bảo vệ thận Bí kỳ nam (40X)

112

3.8. Độc tính bán trường diễn đường uống của cao cồn 50% Bí kỳ nam

Độc tính bán trường diễn của cao cồn 50% Bí kỳ nam được khảo sát trong vòng

60 ngày với 2 liều 100 và 200 mg cao/kg, so sánh với lô chuột sinh lý uống nước cất.

3.8.1. Tác động lên tình trạng chung, các cơ quan và trọng lượng chuột

Trong thời gian thử nghiệm, quan sát thấy chuột ở tất cả các lô dùng liều 100

và 200 mg/kg cao cồn 50% Bí kỳ nam không có biểu hiện bất thường và không có

chuột nào chết. Kết quả quan sát đại thể các cơ quan gan và thận chuột, không nhận

thấy sự khác biệt giữa lô sinh lý và hai lô sử dụng cao thử (Hình 3.29). Không có bất

thường về màu sắc, hình thái gan chuột ở các lô cao thử so với lô sinh lý. Thận chuột

của các lô có màu đỏ, nhẵn, không có biểu hiện tổn thương hay xung huyết. Không

có sự thay đổi đáng kể về trọng lượng chuột giữa các lô dùng cao cồn 50% Bí kỳ nam

và lô sinh lý trong suốt 60 ngày thử nghiệm (p > 0,05) (Bảng 3.27).

Cao BKN 200 mg/kg

Sinh lý

Cao BKN 100 mg/kg Hình 3.29 Hình ảnh gan và thận chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn của Bí kỳ nam Bảng 3.27 Trọng lượng chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn

Lô

Tuần

Ngày

(n = 6 - 8)

1

2

3

4

5

6

7

8

60

31.99

34.66

36.39

37.76

38.37

39.37

39.83

41.23

41.80

Sinh lý

± 0.38

± 0.49

± 1.01

± 1.04

± 1.02

± 1.28

± 1.37

± 1.23

± 1.27

Cao cồn 50%

31.87

33.79

36.06

37.32

38.06

39.16

39.61

40.47

41.66

100 mg/kg

± 0.42

± 0.85

± 0.96

± 0.99

± 1.05

± 1.44

± 1.33

± 1.26

± 1.23

Cao cồn 50%

31.62

32.92

34.65

36.40

37.01

37.97

39.19

40.36

41.16

200 mg/kg

± 0.29

± 0.83

± 1.10

± 0.80

± 0.88

± 1.26

± 1.3

± 1.06

± 1.01

3.8.2. Tác động lên chỉ số huyết học và sinh hóa

Tác động lên hồng cầu: Ảnh hưởng của cao cồn 50% Bí kỳ nam lên hồng cầu

được thể hiện trong Bảng 3.28. Sau 30 và 60 ngày thử nghiệm, không có sự khác

113

nhau có ý nghĩa về chỉ số hồng cầu giữa lô sinh lý và lô dùng cao thử liều 100 mg/kg.

Ở lô dùng cao thử liều 200 mg/kg, có sự khác biệt số lượng hồng cầu và Hb sau 30

ngày điều trị, Hb và nồng độ Hb trung bình hồng cầu sau 60 ngày so với lô sinh lý (p

< 0,05). Tuy nhiên, các chỉ số hồng cầu của cả 2 lô cao cồn 50% đều trong giới hạn

bình thường của chuột.

Chỉ số Sinh lý Sinh lý

Số lượng hồng cầu (RBC) (1012/L) Số lượng huyết sắc tố (Hb) (g/dL)

Khối hồng cầu (HCT) (%)

Bảng 3.28 Tác động của cao cồn 50% Bí kỳ nam lên các chỉ số hồng cầu trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn 30 ngày Cao 100 mg/kg 8,28 ± 0,56 13,50 ± 0,87 46,34 ± 0,98 52,65 ± 1,82 16,31 ± 0,44 60 ngày Cao 100 mg/kg 9,17 ± 0,20 15,14 ± 0,34 44,33 ± 1,07 47,43 ± 0,72 16,38 ± 0,25 Cao 200 mg/kg 9,32 ± 0,15* 15,35 ± 0,27* 49,20 ± 0,55 52,86 ± 0,41 16,49 ± 0,21 Cao 200 mg/kg 9,40 ± 0,35 14,60 ± 0,44* 43,50 ± 1,33 48,28 ± 0,54 16,23 ± 0,3 9,68 ± 0,31 16,25 ± 0,42 46,70 ± 1,11 48,23 ± 0,55 16,77 ± 0,14 8,48 ± 0,18 14,36 ± 0,34 47,39 ± 1,27 55,94 ± 1,35 16,95 ± 0,18

30,4 ± 0,73 31,06 ± 0,39 31,20 ± 0,33 34,77 ± 0,14 34,36 ± 0,25 33,59 ± 0,36*

* : p < 0,05 so với lô sinh lý

Thể tích trung bình hồng cầu (MCV) (fL) Lượng hemoglobin trung bình hồng cầu (MCH) (pg) Nồng độ Hemoglobin trung bình hồng cầu (MCHC) (g/dL) Độ phân bố hồng cầu (RDW) (%) 14,86 ± 0,21 14,6 ± 0,30 14,99 ± 0,37 12,48 ± 0,23 12,19 ± 0,22 12,98 ± 0,23

Tác động lên bạch cầu : Tác động của cao cồn 50% Bí kỳ nam lên chỉ số bạch

cầu được trình bày trong Bảng 3.29. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về

các chỉ số bạch cầu giữa chuột dùng cao cồn 50% Bí kỳ nam ở cả 2 liều 100, 200

mg/kg và chuột lô sinh lý sau 30 và 60 ngày thử nghiệm.

Tác động lên tiểu cầu: Tác động của cao cồn 50% Bí kỳ nam lên chỉ số tiểu cầu

được trình bày trong Bảng 3.30 cho thấy cao thử không tác động lên các chỉ số tiểu

cầu sau 30 và 60 ngày thử nghiệm.

114

Bảng 3.29 Tác động của cao cồn 50% Bí kỳ nam lên các chỉ số bạch cầu trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn

30 ngày

Chỉ số Sinh lý Sinh lý

Cao 100 mg/kg 7,96 ± 0,74 5,19 ± 2,13 76,84 ± 3,01 17,98 ± 1,72 0,39 ± 0,14 6,31 ± 0,71 1,43 ± 0,15 Số lượng bạch cầu (WBC) (109/L) Tỷ lệ bạch cầu trung tính (%) Tỷ lệ bạch cầu Lympho (%) Tỷ lệ bạch cầu Mono (%) Số lượng bạch cầu trung tính Số lượng bạch cầu Lympho (109/L) Số lượng bạch cầu Mono (109/L) Cao 200 mg/kg 9,55 ± 0,58 5,60 ± 1,66 80,74 ± 2,36 13,66 ± 1,04 0,50 ± 0,16 7,71 ± 0,55 1,34 ± 0,14 10,88 ± 0,68 13,97 ± 4,11 75,00 ± 3,91 11,02 ± 3,87 1,48 ± 0,38 8,13 ± 0,58 1,28 ± 0,49 7,70 ± 0,84 4,88 ± 0,95 77,03 ± 2,16 18,10 ± 2,73 0,43 ± 0,10 6,05 ± 0,74 1,31 ± 0,17 60 ngày Cao 100 mg/kg 9,94 ± 0,80 18,71 ± 4,88 65,01 ± 3,29 16,25 ± 3,41 1,54 ± 0,41 7,40 ± 0,55 1,51 ± 0,19

Cao 200 mg/kg 11,28 ± 1,46 13,06 ± 2,65 79,06 ± 2,50 7,88 ± 1,95 1,52 ± 0,44 8,99 ± 1,27 0,74 ± 0,13 Bảng 3.30 Tác động của cao cồn 50% Bí kỳ nam lên các chỉ số tiểu cầu trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn 30 ngày

Chỉ số Sinh lý Sinh lý

Số lượng tiểu cầu (PLT) (109/L) Thể tích trung bình tiểu cầu (MPV) (fL) Khối tiểu cầu (PCT) (%) Độ phân bố tiểu cầu (PDW) (fL) 965,75 ± 88,41 2,90 ± 0,33 0,26 ± 0,02 17,38 ± 0,23 Cao 100 mg/kg 926,88 ± 56,80 2,63 ± 0,18 0,24 ± 0,02 16,94 ± 0,11 Cao 200 mg/kg 888,00 ± 76,6 2,40 ± 0,38 0,20 ± 0,02 17,11 ± 0,33 60 ngày Cao 100 mg/kg 611,63 ± 41,34 2,14 ± 0,14 0,12 ± 0,01 17,30 ± 0,20 Cao 200 mg/kg 660,63 ± 28,13 2,50 ± 0,15 0,17 ± 0,01 17,78 ± 0,23 604,83 ± 29,43 2,33 ± 0,17 0,14 ± 0,01 17,40 ± 0,21

115

3.8.3. Tác động lên chỉ số chức năng gan, thận

Ảnh hưởng của cao cồn 50% Bí kỳ nam lên các chỉ số sinh hóa được thể hiện

trong Bảng 3.31. Trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn, các chỉ số chức năng

gan của chuột dùng cao thử liều 100 mg/kg trong 30, 60 ngày và ở liều 200 mg/kg

trong 30 ngày, đều nằm trong giới hạn bình thường của chuột và không khác biệt so

với lô chứng sinh lý (p > 0,05). Cao cồn 50% Bí kỳ nam dùng đường uống liều 200

mg/kg trong 60 ngày liên tiếp có thể làm tăng hàm lượng AST và ALT so với lô sinh

lý (lần lượt là 3,2 và 3,9 lần, p < 0,05). Khoảng 50% chuột dùng cao thử liều 200

mg/kg có chỉ số ALT và AST trong giới hạn bình thường của chuột. Về chức năng

thận, cao cồn 50% Bí kỳ nam liều uống 100 và 200 mg/kg trong 30 và 60 ngày thử

nghiệm không làm thay đổi chỉ số chức năng thận như ure và creatinin huyết.

Bảng 3.31 Tác động của cao cồn 50% Bí kỳ nam lên các chỉ số chức năng gan

và thận trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn

30 ngày

Chỉ số Sinh lý Sinh lý

AST (U/L)

ALT (U/L)

Ure (mmol/L)

Creatinin (µmol/L) 104,63 ± 11,47 46,28 ± 7,43 4,84 ± 0,45 35,04 ± 1,05 Cao 100 mg/kg 86,29 ± 4,38 46,09 ± 4,54 4,94 ± 0,4 37,14 ± 1,64 Cao 200 mg/kg 109,28 ± 10,88 49,58 ± 7,51 4,70 ± 0,32 36,40 ± 0,84 60 ngày Cao 100 mg/kg 65,40 ± 4,29 53,75 ± 3,11 5,13 ± 0,43 43,45 ± 1,08 Cao 200 mg/kg 226,66 ± 56,08* 230,94 ± 72,59* 6,20 ± 0,75 39,9 ± 1,03

69,93 ± 9,29 59,07 ± 7,26 5,77 ± 0,5 41,87 ± 0,88 * : p < 0,05 so với lô sinh lý

3.8.4. Tác động lên cấu trúc vi thể gan, thận

Chỉ có 1/6 mẫu gan chuột dùng cao thử liều 100 mg/kg có dấu hiệu viêm gan

tối thiểu với viêm quanh khoảng cửa, hoại tử quanh tĩnh mạch trung tâm và tiểu thùy

(Hình 3.30).

116

Mô gan bình thường (Sinh lý) Mô gan bình thường

Mô gan bình thường Hoại tử quanh khoảng cửa và tĩnh mạch trung tâm

Hình 3.30 Hình ảnh vi thể gan chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn (HE, 40X)

Sau 60 ngày thử nghiệm, hình ảnh vi thể thận ở chuột dùng cao thử liều 100 và

200 mg/kg cho thấy viêm thận, tương tự như lô sinh lý. Hầu hết các mẫu lát cắt thận

chuột có hiện tượng thấm nhập nhiều lymphô bào, tương bào trong mô kẽ và quanh

ống thận, bể thận kèm rải rác có các ống thận bị phá hủy (Hình 3.31).

Viêm thận, bể thận mạn tính (Sinh lý)

Viêm thận, bể thận mạn tính Viêm thận, bể thận mạn tính (Cao cồn 50% 200 mg/kg) (Cao cồn 50% 100 mg/kg) Hình 3.31 Hình ảnh vi thể thận trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn của cao cồn 50% Bí kỳ nam (HE, 40X)

117

Chương 4. BÀN LUẬN

4.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ ĐỊNH DANH LOÀI BÍ KỲ NAM

Nền y học cổ truyền đã được hình thành trên thế giới từ rất lâu đời cho đến nay

vẫn được quan tâm và ưa chuộng nhờ vào ưu điểm kinh tế, dễ tìm và dễ sử dụng. Với

khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có nguồn dược liệu phong phú và đa dạng, có

bề dày kinh nghiệm trong việc sử dụng cây thuốc để chữa bệnh, là kho tàng giúp phát

triển nghiên cứu tạo ra các sản phẩm từ thiên nhiên phục vụ công tác chăm sóc sức

khỏe và phát triển kinh tế. Một trong những loài dược liệu quý đã được biết đến và

sử dụng trong dân gian là Bí kỳ nam. Bí kỳ nam được tìm thấy phân bố ở các tỉnh

như Kontu, Gia Lai, Đắk Lắk, Lâm Đồng và Vườn quốc gia Phú Quốc (Kiên Giang).

Từ xa xưa, dược liệu này đã được sử dụng chữa viêm gan, vàng da, đau nhức gân

xương, bong gân, thấp khớp, đau bụng, tiêu chảy… bằng cách sắc hoặc nấu cao uống

[5]. Tuy nhiên, đến nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về phân tích thực vật, đánh giá

tác động dược lý cũng như tính an toàn của Bí kỳ nam ở Việt Nam và trên thế giới.

Việc nhận diện và định danh chính xác những nguyên liệu có nguồn gốc thực

vật rất quan trọng giúp đảm bảo tính an toàn trong sử dụng điều trị và hỗ trợ điều trị.

Các đặc điểm thực vật học bao gồm đặc điểm hình thái bên ngoài, đặc điểm giải phẫu

là cơ sở cho việc nhận biết, định danh và kiểm nghiệm các loại dược liệu. Nghiên cứu

đã thu thập dược liệu Bí kỳ nam tại Vườn quốc gia Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang, tiến

hành phân tích, mô tả chi tiết các đặc điểm hình thái thực vật của dược liệu bao gồm

thân, rễ, lá, thân củ, cấu tạo giải phẫu và đặc điểm bột dược liệu. Dược liệu thu hái

có đặc điểm hình thái bên ngoài tương đồng với mô tả trong các tài liệu của tác giả

Võ Văn Chi [5] và Huxley [123]. Cho đến nay, các đặc điểm giải phẫu cũng như đặc

điểm bột dược liệu thân củ Bí kỳ nam chưa có tài liệu nào đề cập cả ở Việt Nam và

trên thế giới. Những mô tả về hình thái bên ngoài của Bí kỳ nam cũng còn khái quát

và thiếu hình ảnh, do đó khó cho việc nhận biết và định danh loài. Bên cạnh đó, hình

thái bên ngoài của Bí kỳ nam thuộc chi Hydnophytum thường gây nhầm lẫn với các

loài thuộc chi Myrmecodia, cùng nhóm cây tổ kiến (ant-plants), họ Cà phê. Vì vậy,

lần đầu tiên các đặc điểm giải phẫu và bột dược liệu của Bí kỳ nam được báo cáo,

118

góp phần cung cấp cơ sở dữ liệu về thực vật học giúp nhận diện, định danh và kiểm

nghiệm vi học của loài dược liệu này. Trong các trường hợp dược liệu như các loài

mọc hoang trong rừng, việc thu thập không thực hiện được với tất cả bộ phận của cây

hoặc đối với các nguyên liệu đã qua xử lý hay sơ chế, nguyên liệu bị thay thế hay pha

trộn ngẫu nhiên hoặc cố ý bằng những loài tương tự thì việc nhận diện truyền thống

dựa vào đặc điểm hình thái sẽ gặp trở ngại. Vì vậy, phương pháp bổ sung giúp xác

định chính xác loài thực vật dựa trên hệ gen (ADN) đặc thù đã được ứng dụng và phát

triển. Phương pháp này sử dụng kỹ thuật mã vạch ADN (barcode). Theo nguyên tắc,

một trình tự ADN từ một vùng gen tiêu chuẩn được chiết tách từ một mẫu mô nhỏ

của dược liệu cần nhận diện, được khuyếch đại bằng phản ứng PCR. Các sản phẩm

PCR với cặp mồi đặc hiệu được phân tích bằng diện di gel, giải trình tự và so sánh

với một thư viện trình tự của các cây dược liệu đã biết. So sánh sự tương đồng của

trình tự ADN giữa mẫu cần nhận diện và trình tự của dược liệu đã biết tên, từ đó xác

định được tên của loài dược liệu cần nhận diện. Đối với thực vật, nhiều vùng gen mã

hóa và không mã hóa như atpF–atpH, matK, rbcL, rpoB, rpoC1, psbK–psbI và trnH–

psbA đã được xem là những ứng cử viên cho phương pháp ADN mã vạch. Giữa

những ứng cử viên hàng đầu cho phương pháp ADN mã vạch ở thực vật, gen rbcL đã

được chứng minh cho khả năng phân biệt và ứng dụng cao [150]. Bí kỳ nam là dược

liệu mọc hoang trong rừng Phú Quốc, thường được thu hái không có hoa, quả hay hạt

giúp định danh dược liệu. Do đó, hướng tiếp cận định danh loài dựa trên đặc điểm

mã vạch ADN đã được sử dụng hỗ trợ cho các đặc điểm hình thái và cấu tạo giải phẫu

thực vật. Kết quả phân tích mã vạch ADN của dược liệu thu hái cho thấy mức độ

tương đồng giữa trình tự đoạn rbcL của mẫu nghiên cứu và của loài Hydnophytum

formicarum Jack. (mã X81099.1) trên ngân hàng gen là 99% [171]. Kết quả này giúp

khẳng định mẫu nghiên cứu là loài Hydnophytum formicarum Jack., họ Cà phê

(Rubiaceae) với tên gọi Bí kỳ nam. Phương pháp phân tích ADN là phương pháp

nhanh, đạt tiêu chuẩn, mang tính khách quan, giúp các nhà khoa học trong việc định

danh các loài, phát hiện loài mới, phân loại, đánh giá đa dạng di truyền và quan hệ di

truyền các loài [211]. Hiện nay, có rất ít trình tự mã vạch của cây dược liệu Việt Nam

119

được công bố. Điều này cho thấy sự cần thiết xây dựng một thư viện tham khảo trình

tự của các cây dược liệu Việt Nam giúp kiểm tra định danh cũng như độ tinh khiết

của các nguyên liệu từ thực vật. Đây là lần đầu tiên dữ liệu mã vạch ADN được báo

cáo đối với loài Bí kỳ nam của rừng quốc gia Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang, hỗ trợ việc

định danh và kiểm nghiệm dược liệu.

Việc đánh giá chất lượng dược liệu đóng vai trò quan trọng trước khi tiến hành

chiết xuất và khảo sát các tác động của một loại dược liệu. Các dược liệu cần được

đánh giá các thông số cơ bản về độ ẩm, độ tro toàn phần, độ tro không tan trong acid,

định tính sơ bộ các hợp chất hóa thực vật. Trong điều kiện bảo quản bình thường, tất

cả dược liệu đều có chứa một lượng nước nhất định. Tỉ lệ phần trăm của lượng nước

trong dược liệu được gọi là độ ẩm (hay thủy phần) của dược liệu. Độ ẩm đóng vai trò

trong quá tình bảo quản dược liệu. Để tránh hiện tượng ẩm mốc, hoạt chất trong dược

liệu bị biến đổi thì dược liệu cần có độ ẩm không quá 13%, đó là độ ẩm an toàn với

đa số dược liệu [1]. Ngoài ra, độ ẩm cũng cần thiết trong việc tính kết quả định lượng

hay hiệu suất chiết của hoạt chất trong dược liệu. Xác định độ tro toàn phần là xác

định các hàm lượng chất vô cơ không bay hơi có trong dược liệu. Tro không tan trong

acid hydrocloric là phần chất vô cơ không bị hòa tan trong acid hydrocloric, thường

là silic oxid. Tro không tan trong acid thường nói lên mức độ lẫn đất, cát của dược

liệu. Các loại cây khác nhau, sinh trưởng ở những vùng khác nhau có thành phần vô

cơ khác nhau. Dược liệu Bí kỳ nam đã được đánh giá các tiêu chuẩn chất lượng theo

Dược điển Việt Nam V [4] cho thấy dược liệu có độ ẩm trung bình 13%, độ tro toàn

phần trung bình 9,6% và độ tro không tan trong acid là 0,7%, đạt các tiêu chuẩn chất

lượng đối với đa số dược liệu. Các phản ứng định tính cho thấy dược liệu có sự hiện

diện của acid hữu cơ, các nhóm hợp chất flavonoid, saponin, tannin, triterpernoid và

các hợp chất khử. Sự hiện diện của các thành phần hóa thực vật gợi ý đóng góp vai

trò trong các hoạt tính sinh học của dược liệu. Kết quả này phù hợp với báo cáo trước

đây của tác giả Prachayasittikul và cộng sự (2008) về sự hiện diện của các hợp chất

polyphenol trong dịch chiết từ thân củ Bí kỳ nam [222]. Tác giả Senawong và cộng

sự (2013) cũng đã báo cáo dịch chiết cồn giàu phenol và chiết xuất acid sinapinic của

120

thân củ Bí kỳ nam thể hiện hoạt tính ức chế enzym HDAC dẫn đến ức chế tăng trưởng

của các dòng tế bào ung thư được điều hòa bằng kích thích quá trình apoptosis [248].

Thành phần polyphenol (hợp chất stigmasterol) cũng được ghi nhận hiện diện trong

các loài thuộc chi Myrmecodia, nhóm cây tổ kiến [114]. Hàm lượng polyphenol toàn

phần của thân củ Bí kỳ nam trong nghiên cứu được xác định dựa trên phương pháp

Folin - Ciocalteu tương đương 58,8 ± 1,7 mg pyrogallol trong 1 g bột dược liệu. Đây

là lần đầu tiên các thông số về chất lượng được báo cáo đối với dược liệu Bí kỳ nam,

có thể góp phần đánh giá và xây dựng các chuyên luận về loài dược liệu này.

4.2. CAO TOÀN PHẦN, CAO PHÂN ĐOẠN BÍ KỲ NAM VÀ CÁC HOẠT

TÍNH SINH HỌC IN VITRO

Các cao toàn phần và hoạt tính sinh học in vitro

Nhiều phương pháp chuẩn bị mẫu phục vụ nghiên cứu sàng lọc hoạt tính dược

liệu được thực hiện, tùy thuộc vào mục đích sử dụng, song đa phần thường áp dụng

theo nguyên tắc trong đó từng dược liệu được chiết bằng 4 dung môi có độ phân cực

khác nhau, lấy 4 cao chiết phục vụ nghiên cứu sàng lọc [7]. Dược liệu thân củ Bí kỳ

nam được chiết xuất với 4 dung môi có độ phân cực khác nhau thu các cao toàn phần

gồm cao cồn 96%, cao cồn 70%, cao cồn 50% và cao nước với hiệu suất chiết lần

lượt theo thứ tự: cao cồn 50% (26,1%) > cao cồn 70% (21,5%) > cao cồn 96%

(18,4%) > cao nước (14,4%). Kết quả khảo sát hàm lượng polyphenol toàn phần dựa

trên phương pháp Folin - Cioacalteu cho thấy, so với cao nước, hàm lượng polyphenol

chiếm khá lớn trong các cao cồn của Bí kỳ nam, từ 70 - 80% khối lượng cao. Có thể

giả thuyết vai trò quan trọng của các hợp chất polyphenol trong hoạt tính sinh học

của Bí kỳ nam.

Hàm lượng polyphenol toàn phần thường đi kèm với hoạt tính chống oxy hóa

của các dược liệu thuộc nhóm cây Tổ kiến [20]. Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp

chất polyphenol đã được báo cáo thông qua khả năng trung hòa gốc tự do đáng kể

dựa trên cơ chế nhường hydro nhờ sự hiện diện của các nhóm hydroxyl và khả năng

khử ion kim loại [314]. Các cao toàn phần Bí kỳ nam đã được đánh giá hoạt tính

chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là

121

chất tạo ra gốc tự do được dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác

dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Chất nghiên cứu như các hợp chất

polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa sẽ phản ứng và nhường hydro cho thuốc thử

DPPH, thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH [7]. Thông số đánh giá được sử

dụng để biểu thị hoạt tính chống oxy hóa của một chất là giá trị IC50 (inhibition

concentration), nồng độ có khả năng làm giảm 50% gốc tự do. Theo phân loại về khả

năng chống oxy hóa dựa vào giá trị IC50 bằng phương pháp DPPH, hoạt tính chống

oxy hóa sẽ được phân thành 5 loại: nếu hợp chất hoặc dịch chiết có giá trị IC50 < 50

µg/ml được xem có hoạt tính mạnh, 50 – 100 µg/ml: có hoạt tính, 101 – 250 µg/ml:

hoạt tính trung bình, 250 – 500 µg/ml: hoạt tính yếu và > 500 µg/ml: không có hoạt

tính [172]. Kết quả của nghiên cứu cho thấy cả bốn cao toàn phần Bí kỳ nam có giá

trị IC50 từ 18 – 35 µg/ml, vì vậy các cao này được xem có hoạt tính chống oxy hóa

mạnh. So sánh giá trị IC50 giữa các cao toàn phần Bí kỳ nam, thứ tự hoạt tính chống

oxy hóa lần lượt là cao cồn 50% > cao cồn 96% > cao cồn 70% > cao nước. Kết quả

nghiên cứu cũng phù hợp với các báo cáo của tác giả Prachayasittikul và cộng sự

(2008) [222], Ahmad và cộng sự (2010) [20] về hoạt tính chống oxy hóa của cao Bí

kỳ nam. Prachayasittikul và cộng sự (2008) [222] đã báo cáo hoạt tính chống oxy hóa

của cao ethyl acetat của Bí kỳ nam thể hiện hoạt tính trung hòa gốc tự do mạnh

(DPPH) với giá trị IC50 là 8,4 μg/mL. Ahmad và cộng sự (2010) đã ghi nhận cao

methanol của Bí kỳ nam thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh với giá trị IC50 là

22,4 μg/mL (DPPH).

Ngoài khả năng đánh bắt gốc tự do, các hợp chất polyphenol còn thể hiện khả

năng phá vỡ chuỗi phản ứng peroxyd hóa lipid màng tế bào [136] nhờ đặc điểm cấu

trúc và khả năng tương tác với phospholipid màng, thâm nhập vào lớp lipid màng

giúp các hợp chất này trở thành chất ổn định màng và có khả năng ức chế quá trình

peroxyd hóa lipid hiệu quả [293]. Peroxyd hóa lipid là sự thoái hóa oxy hóa của lipid.

Đó là quá trình các gốc tự do lấy điện tử từ lipid của màng tế bào, hình thành sản

phẩm oxy hóa của lipid hay lipid peroxyd, dẫn đến tổn thương tế bào [96]. Sự cho

điện tử hoặc hydro của các hợp chất polyphenol góp phần vào quá trình bẻ gãy chuỗi

122

phản ứng và ức chế peroxyd hóa lipid [164]. Nghiên cứu đã đánh giá hoạt tính chống

oxy hóa, ức chế peroxyd hóa lipid của các cao Bí kỳ nam thông qua phương pháp

định lượng malonyl dialdehyd (MDA). MDA là sản phẩm cuối cùng và được xem là

chất chỉ thị của quá trình peroxyd hóa lipid tế bào [96]. Một phân tử MDA sinh ra

phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở

bước sóng 532 nm. Hàm lượng MDA sinh ra càng thấp chứng tỏ chất thử có hoạt tính

chống oxy hóa và ức chế peroxyd hóa lipid càng mạnh. Kết quả nghiên cứu cho thấy

giá trị IC50 xác định bằng phương pháp MDA của các cao nước, cao cồn 50%, cao

cồn 70%, cao cồn 96% Bí kỳ nam lần lượt là 266,1 µg/ml, 116,9 µg/ml, 108,1 µg/ml

và 97,5 µg/ml; các cao cồn thể hiện hoạt tính ức chế peroxyd hóa lipid mạnh hơn

đáng kể so với cao nước. Kết quả này phù hợp với hàm lượng lớn của polyphenol

toàn phần trong các cao chiết cồn Bí kỳ nam. Lần đầu tiên dược liệu Bí kỳ nam được

đánh giá về khả năng ức chế peroxyd hóa lipid tế bào.

Nhiều nghiên cứu đã Các gốc tự do gây stress oxy hóa là một trong những

nguyên nhân gây ung thư do cơ chế gây tổn thương ADN, thúc đẩy apoptosis và gia

tăng đột biến [289]. Nhiều dược liệu chứa hợp chất polyphenol có hoạt tính chống

oxy hóa đã thể hiện khả năng kháng ung thư [70], [98], [107]. Nghiên cứu đã khảo

sát tác động của các cao toàn phần Bí kỳ nam đối với sự tăng trưởng của các dòng tế

bào khác nhau bao gồm: tế bào ung thư phổi người (NCI-H460), tế bào ung thư vú

người (MCF-7), tế bào ung thư cổ tử cung người (HeLa), tế bào ung thư cơ vân người

(RD), tế bào ung thư gan người (HepG2), tế bào biểu mô thận heo (LLC-PK1) và tế

bào biểu mô thận khỉ (Vero). Kết quả cho thấy so với mẫu chứng paclitaxel 10 µM,

sau 24 giờ xử lý, cao nước Bí kỳ nam không thể hiện hoạt tính ức chế tăng trưởng đối

với các tế bào ở tất cả nồng độ thử nghiệm trong khi các cao cồn biểu hiện hoạt tính

độc tế bào, ức chế sự tăng trưởng của các tế bào Hela, MCF-7, NCI-H460 ở nồng độ

từ 500 – 1000 µg/ml, làm giảm tỷ lệ sống của tế bào theo thứ tự: Hela > MCF-7 >

NCI-H460. Đối với tế bào Hela và MCF-7, giá trị IC50 của các cao cồn Bí kỳ nam lần

lượt là 400 – 600 µg/ml. Hoạt tính tác động lên sự tăng trưởng tế bào của các cao cồn

Bí kỳ nam có thể liên quan với thành phần polyphenol, nhóm chất có hàm lượng lớn

123

trong cao. Kết quả ức chế tăng trưởng của các tế bào ung thư của cao cồn Bí kỳ nam

phù hợp với các nghiên cứu của tác giả Senawong và cộng sự (2013), Abdullah và

cộng sự (2010). Senawong và cộng sự (2013) đã báo cáo tác động ức chế của cao cồn

96% Bí kỳ nam đối với các tế bào Hela, HT29, HCT116, MCF-7 với giá trị IC50 >

3000 µg/ml [248]. Abdullah và cộng sự (2010) cũng ghi nhận hợp chất flavonoid (7,

3', 5'-trihydroxyflavanon (3HFD)) phân lập từ Bí kỳ nam có tác động hoạt hóa

apoptosis tế bào MCF-7 qua cơ chế tăng biểu hiện Bax [15]. Đối với các tế bào

HepG2, LLC-PK1 và Vero, các cao Bí kỳ nam trong nghiên cứu không thể hiện tác

động ức chế tăng trưởng tế bào, gợi ý khả năng bảo vệ của Bí kỳ nam đối với các

dòng tế bào này. Tương tự các báo cáo của tác giả Darwis và cộng sự (2014) [67],

Senawong và cộng sự (2013) [248] cho thấy cao cồn 96% Bí kỳ nam không ảnh

hưởng đáng kể đối với sự tăng trưởng của tế bào Vero. Dịch chiết methanol của một

loài thuộc chi Myrmecodia là M. platytyrea cùng nhóm cây tổ kiến cũng được báo

cáo không làm ảnh hưởng tế bào thận khỉ Vero [114]. Lần đầu tiên, cao dược liệu

thân củ Bí kỳ nam được khảo sát và báo cáo về tác động đối với các dòng tế bào NCI-

H460, RD, HepG2 và LLC-PK1.

Các cao phân đoạn và chất phân lập

Dựa trên kết quả về hiệu suất chiết, hàm lượng polyphenol toàn phần, hoạt tính

sinh học in vitro và các ưu điểm về độ an toàn trong sử dụng, tiết kiệm chi phí trong

sản xuất quy mô công nghiệp, cao cồn 50% từ thân củ Bí kỳ nam được lựa chọn để

chiết xuất khối lượng lớn, phân tách các cao phân đoạn tiếp theo, tiến hành phân lập

chất cũng như đánh giá các tác động dược lý in vitro và in vivo. Cao cồn 50% thu

được ở dạng đặc, màu vàng nâu, vị cay đắng, mùi thơm đặc trưng của dược liệu. Khảo

sát chất lượng cho thấy cao có độ ẩm trung bình là 7,3 ± 0,1%, độ tro toàn phần trung

bình 6,4 ± 0,1%, độ tro không tan trong acid 0,8 ± 0,1%, có sự hiện diện của

polyphenol với hàm lượng polyphenol toàn phần tương đương 679,0 mg pyrogallol/g

cao. Cao cồn 50% Bí kỳ nam cũng được kiểm nghiệm về độ vô khuẩn cho kết quả

không có các vi khuẩn Escheriachia coli, Salmonella spp., Staphylococcus aureus và

Pseudomonas aeruginosa. Các kết quả cho thấy cao cồn 50% Bí kỳ nam có thể sử

124

dụng để tiến hành nghiên cứu làm thuốc. Đây là lần đầu tiên các chỉ tiêu chất lượng

được đánh giá trên cao chiết từ dược liệu Bí kỳ nam. Các kết quả này đóng góp dữ

liệu khoa học cho việc xây dựng tiêu chuẩn hóa của cao dược liệu.

Cao cồn 50% từ thân củ Bí kỳ nam được chiết xuất phân bố lỏng – lỏng thu

được các cao phân đoạn gồm cao ethyl acetat, cao n-butanol và cao nước. Kết quả

nghiên cứu cho thấy cao EtOAc có hàm lượng polyphenol cao nhất, hoạt tính chống

oxy hóa mạnh nhất với giá trị IC50 là 5,6 µg/ml (phương pháp DPPH), đồng thời thể

hiện khả năng ức chế peroxy hóa lipid gấp 3 và 3000 lần so với cao n-butanol và cao

nước (phương pháp MDA). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Prachayasittkul

và cộng sự (2008), trong đó, cao EtOAc sở hữu hoạt tính bắt giữ gốc tự do mạnh nhất

với giá trị IC50 là 8,40 µg/ml (DPPH) [222].

Cao phân đoạn EtOAc được phân lập và định danh chất tại Bộ môn dược liệu,

khoa Dược, Đại học Y dược TP.HCM. Từ cao phân đoạn này, bằng các phương pháp

sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh, sắc ký cột cổ điển, sắc ký rây phân tử, phân tích

phổ, hai hợp chất BK1, BK2 đã được phân lập, tinh chế và xác định công thức là

(2R,3S)-5,7,3’,4’-tetrahydroxyflavan-3-ol hay còn gọi là (+)-catechin và acid 3,4-

dihydroxy benzoic hay còn gọi là acid protocatechuic. Theo các tài liệu báo cáo về

Bí kỳ nam, đây là lần đầu tiên hai hợp chất catechin và acid protocatechuic được phân

lập từ loài H. formicarum. Kết quả nghiên cứu góp phần làm tiền đề cho các nghiên

cứu dược lý tiếp theo.

Catechin là một hợp chất polyphenol – flavanol thuộc nhóm flavonoid thường

hiện diện trong nhiều loại quả, rượu và trà. Tên hợp chất catechin có nguồn gốc

từ catechu, một loại nước ép tannic hoặc chiết xuất đun sôi của Mimosa

catechu (Acacia catechu Lf) [49]. Catechin có bốn đồng phân, hai trong số các đồng

phân có cấu hình trans được gọi là catechin và hai loại còn lại có cấu hình cis được

gọi là epicatechin. Hầu hết các đồng phân trans của catechin có dấu (+) – catechin,

những đồng phân cis có dấu (-) – catechin. Bên cạnh đó, còn có epigallocatechin

gallate (EGCG) là ester của epigallocatechin và acid gallic; đây là catechin có nhiều

nhất trong trà, có vai trò quan trọng trong hóa trị ung thư [227]. Các catechin đã được

125

báo cáo về nhiều đặc tính có lợi cho sức khỏe con người như chống ung thư, chống

béo phì, trị đái tháo đường, bệnh tim mạch, chống nhiễm trùng, bảo vệ gan, thận và

bảo vệ thần kinh [42], [125].

Acid protocatechuic là một acid phenolic có cấu trúc tương tự acid gallic, acid

cafeic, acid vanillic và acid syringic là những hợp chất chống oxy hóa mạnh đã được

biết rõ [133]. Acid protocatechuic là một trong những thành phần hóa thực vật có

hoạt tính sinh học của các dược liệu đã được sử dụng trong y học cổ truyền như Bụp

giấm (Hibiscus sabdariffa L.) [24], Bạch quả (Ginkgo biloba L.) [83], John's wort

(Hypericum perforatum L.) [132]. Hợp chất này cũng được tìm thấy trong nhiều loài

gia vị như Đại hồi (Illicium verum), Tía tô đất (Melissa officinalis L.), Hương thảo

(Rosmarinus officinalis L.), Quế (Cinnamomum aromaticum) [118]. …

4.3. TÁC ĐỘNG DƯỢC LÝ BẢO VỆ GAN CỦA BÍ KỲ NAM

Quan điểm quốc tế trong phát triển thuốc ngày nay đã có những thay đổi nhanh

chóng. Khi dân số thế giới liên tục già hóa, các bệnh liên quan đến lối sống, môi

trường và điều kiện sống, các bệnh mãn tính ngày càng phổ biến, ngày càng có nhiều

người quan tâm đến chất lượng cuộc sống tập trung vào việc phòng ngừa bệnh tật, sự

phát triển thuốc vì vậy cũng chuyển hướng sang điều trị các bệnh mãn tính như các

bệnh về gan, thận, ung thư, lão hóa và các bệnh liên quan đến lối sống.

Gan là một trong những cơ quan quan trọng nhất trong cơ thể, là trung tâm

chuyển hóa các chất dinh dưỡng và đào thải các chất được chuyển hóa [235]. Nhiều

loại bệnh gan xuất phát từ những nguyên nhân khác nhau như tổn thương gan do chất

độc, do thuốc, viêm gan do vi rut, lạm dụng rượu, bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu

[307]. Các loại bệnh gan cũng là vấn đề sức khỏe nghiêm trọng trên toàn thế giới.

Đáng chú ý, các thuốc nguồn gốc tổng hợp có tác dụng điều trị hạn chế và đôi khi có

các tác dụng phụ nghiêm trọng. Trị liệu tự nhiên (naturopathy) đã và đang mang lại

hiệu quả trong việc điều trị các bệnh về gan [263]. Nhiều nghiên cứu đã báo cáo về

các dược liệu có tác động bảo vệ gan với khoảng 170 hoạt chất thuộc các nhóm

flavanoid, phenol, coumarin, curcuminoid, lignan, tinh dầu, terpernoid được phân lập

từ khoảng 110 cây thuộc 55 họ thực vật [260], [68], [225]. Các hợp chất hóa thực vật

126

đã được báo cáo có tác động bảo vệ gan hiệu quả như silymarin từ cây Kế sữa

(Silybum marianum L.) [290], andrographolid và neoandrographolid từ Xuyên tâm

liên (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees), picrosid và kutkosid từ Hồ hoàng liên

(Picrorrhiza kurroa Royle), phyllanthin và glycyrrhizin từ Diệp hạ châu (Phyllanthus

niruri L.), glycyrrhizin từ Cam thảo (Glycyrrhiza glabra), curcumin từ Nghệ

(Curcuma longa) [102], [185]. Vai trò của các hợp chất hóa thực vật cũng được nhấn

mạnh trọng việc quản lý bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD) nhờ vào hoạt

tính chống oxy hóa, kháng viêm, những yếu tố chủ yếu trong cơ chế bệnh sinh của

NAFLD [35]. Các công thức tự nhiên với sự phối hợp của các thành phần hợp chất

và dẫn xuất có hoạt tính đem lại sự đa dạng về tác động trị liệu, cũng là phương pháp

điều trị phù hợp với sự không đồng nhất của các tế bào ung thư gan, nguyên nhân gây

ra hầu hết các trường hợp thất bại trong điều trị bằng y học hiện đại [157]. Vì vậy, y

học tự nhiên là một cách tiếp cận toàn diện để hỗ trợ điều trị các bệnh về gan [307].

Với thành phần các hợp chất polyphenol đã được phân lập và hoạt tính chống oxy

hóa mạnh đã được báo cáo của dược liệu Bí kỳ nam trong nước và trên thế giới, gợi

ý tiềm năng bảo vệ gan của dược liệu này trong phòng ngừa các tổn thương do các

chất độc gan gây ra.

Các mô hình nghiên cứu in-vitro và in-vivo thường được sử dụng để đánh giá

các tác động dược lý của dược liệu trong phòng ngừa và điều trị các bệnh về gan. Các

tác nhân hóa học thường được sử dụng trong các mô hình gây tổn thương gan bao

gồm carbon tetrachlorid (CCl4), paracetamol, acryl amid, adriamycin, rượu, thuốc

chống nhiễm trùng… [124]. Tại gan, các tác nhân này chuyển thành chất chuyển hóa

độc hại và can thiệp vào các đại phân tử gây rối loạn chức năng lipid, tổn thương

ADN và stress oxy hóa dẫn đến phá hủy tế bào gan. Mô hình tổn thương gan do tác

nhân CCl4 là mô hình đặc trưng của tổn thương gan do chất ngoại sinh. Mô hình này

được lựa chọn sử dụng để đánh giá tác động độc tính tại gan cũng như tác động phòng

ngừa, bảo vệ gan của các dược liệu nhờ vào cơ chế gây tổn thương gan của CCl4 đã

được chứng minh với sự hình thành, tích lũy các gốc tự do tricloromethyl (•CCl3),

tricloromethyl peroxyl (•OOCCl3) trong nhu mô gan, gây bão hòa hệ thống chống

127

oxy hóa phòng thủ của cơ thể, tấn công các acid béo không bão hòa, gây peroxyd hóa

màng tế bào và tổn thương mô gan [71]. Liều duy nhất của CCl4 có thể đạt nồng độ

đỉnh trong 3 giờ. Trong vòng 24 giờ, CCl4 gây ra thay đổi các chỉ số sinh hóa và mô

học của tế bào gan. Việc ức chế hình thành các gốc tự do được xem là điểm mấu chốt

trong việc bảo vệ chống lại tổn thương do CCl4 gây ra tại gan. Do đó, mô hình này

được sử dụng trong việc đánh giá các tác động dược lý của dược phẩm và các sản

phẩm tự nhiên có hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan.

Các mô hình nghiên cứu dược lý in vitro sử dụng các dòng tế bào là lựa chọn

để sàng lọc và đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất tiềm năng với ưu điểm

cho kết quả nhanh, tính lặp lại cao, chi phí thấp, lượng mẫu sử dụng nhỏ phù hợp với

các hợp chất phân lập tự nhiên và tuân thủ nguyên tắc 3R về y đức, đồng thời có thể

thiết lập cơ chế tác động ở mức độ tế bào và phân tử [19]. Dòng tế bào ung thư gan

người như HepG2 đã được đề xuất trong các mô hình in vitro thay thế cho tế bào gan

người bình thường nhờ lợi thế tiềm năng của tế bào ung thư có thể kể đến như là một

dòng tế bào bất tử, có sẵn với số lượng lớn; dễ duy trì vì có thể bảo quản lạnh và hoạt

động của enzym chuyển hóa thuốc không giảm trong quá trình nuôi cấy, như đã xảy

ra trong nuôi cấy tế bào gan nguyên phát ở người [79]. Dòng tế bào HepG2 sở hữu

nhiều đặc điểm sinh hóa và hình thái của tế bào gan bình thường [47]. Tế bào HepG2

cũng cho thấy tỷ lệ tương đồng khoảng 81,3% so với tế bào gan người mới phân lập

[115]. Nghiên cứu đã khảo sát tác động dược lý bảo vệ gan của cao cồn 50%, cao

phân đoạn EtOAc và các chất phân lập gồm catechin, acid protocatechuic từ thân củ

Bí kỳ nam trên mô hình in vitro mô phỏng tình trạng tổn thương tế bào gan HepG2

do CCl4 2 mM gây ra trong thời gian xử lý là 24 giờ và mật độ nuôi cấy tế bào là 1 x

105 tế bào/ml. Tác nhân CCl4 2 mM đã gây tình trạng stress oxy hóa, tổn thương tế

bào gan HepG2 biểu hiện qua tác động làm giảm đáng kể tỷ lệ sống của tế bào, giảm

hàm lượng GSH đồng thời làm tăng đáng kể hoạt tính LDH ngoại bào so với mẫu

chứng sinh lý. Glutathion (GSH) là một trong những chất chống oxy hóa sinh học

không enzym, có lượng lớn trong gan. GSH giúp loại bỏ các gốc tự do và duy trì thiol

protein màng, đóng vai trò như chất nền cho glutathion peroxidase và glutathion

128

transferase. Mức độ giảm của GSH liên quan đến tăng peroxyd hóa lipid và stress

oxy hóa. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh vai trò của stress oxy hóa trong

cơ chế gây tổn thương gan do CCl4 với biểu hiện suy giảm hàm lượng GSH nội bào

do tăng gốc tự do và tăng peroxyd hóa lipid [51], [190], [232]. Việc giải phóng LDH

ra môi trường ngoại bào có thể được hiểu là sự tổn thương màng tế bào hoặc chết tế

bào [71]. Kết quả này phù hợp với các công bố trước đây của các tác giả Đỗ Thị Hồng

Tươi và cộng sự (2014) [13], Krithika và cộng sự (2009) [143], Pareek và cộng sự

(2013) [210].

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc điều trị dự phòng với các cao chiết cồn 50%,

cao EtOAc và các chất phân lập của Bí kỳ nam thể hiện tác động phòng ngừa oxy

hóa, bảo vệ tế bào gan HepG2 qua việc gia tăng đáng kể tỷ lệ sống của tế bào, tăng

hàm lượng GSH, đồng thời ngăn ngừa hoại tử tế bào làm giảm đáng kể lượng LDH

ngoại bào so với mẫu chứng bệnh CCl4 2 mM. Trong đó, cao cồn 50% Bí kỳ nam ở

nồng độ 100 và 200 µg/ml cho tác động phòng ngừa tình trạng tăng sinh gốc tự do và

hoại tử tế bào gan HepG2 tốt nhất, tương tự tác động của chất đối chứng dương

silymarin ở nồng độ 100 µg/ml. Kết quả này phù hợp với hàm lượng polyphenol toàn

phần cao và hoạt tính chống oxy hóa in vitro mạnh của cao cồn Bí kỳ nam. Tác động

phòng ngừa tổn thương do CCl4 gây ra đối với tế bào gan HepG2 của cao Bí kỳ nam

được so sánh với mẫu chứng dương silymarin nồng độ 100 μg/ml. Silymarin là một

flavonoid thực vật hiện diện trong Kế sữa (Silybum marianum), một loài cây có nguồn

gốc từ khu vực Địa Trung Hải, thuộc họ Asteraceae. Cây được đặc trưng bởi các

nhánh gai và nhựa cây màu trắng đục. Silymarin là một hỗn hợp các flavolignan trong

đó chiếm phần lớn là silybin (50% - 70%), silydianin và silychristin [290]. Các công

trình nghiên cứu đã chứng minh silymarin vừa có khả năng bảo vệ vừa có khả năng

tái tạo tế bào gan. Cơ chế tác động của silymarin có thể kể đến 4 cơ chế: (1) silymarin

có khả năng trung hòa các gốc tự do, ức chế peroxyd hóa lipid và tăng hàm lượng

GSH; (2) silymarin có khả năng điều hòa tính thấm màng tế bào, giúp ổn định màng

dưới sự tác động của chất độc ngoại sinh; (3) silymarin có khả năng tăng cường tổng

hợp ARN ribosom, giúp sự tổng hợp protein, thúc đẩy phục hồi các tế bào gan bị tổn

129

thương và kích thích sự phát triển các tế bào gan mới; (4) silymarin ức chế sự biến

đổi tế bào hình sao thành tổ chức xơ, giảm sự hình thành các sợi collagen đưa đến xơ

gan [226]. Nhờ vào hoạt tính bảo vệ gan và cơ chế tác động đã được biết rõ, silymarin

thường được lựa chọn là chất đối chứng dương trong nhiều nghiên cứu đánh giá tác

động bảo vệ gan của các dược liệu đối với tác nhân gây độc gan như CCl4 [12], [38],

[39], [103], [290].

Khả năng phòng ngừa oxy hóa, bảo vệ gan của cao Bí kỳ nam có thể gợi ý với

sự hiện diện của các hợp chất polyphenol được phân lập từ dược liệu này như catechin

và acid protocatechuic hay butin, butein, isoliquiritigenin hay stigmasterol [222]. Đối

với hợp chất catechin, hoạt tính chống oxy hóa của hợp chất này đã được chứng

minh qua hai cơ chế: cơ chế trực tiếp – trung hoà gốc tự do và cơ chế gián tiếp –

tăng các enzym chống oxy hóa, sản xuất các enzym giải độc pha II [42]. Grzesik

và cộng sự (2018) đã so sánh hoạt tính chống oxy hóa của catechin với các chất chống

oxy hóa tự nhiên và tổng hợp khác bao gồm cả các chất chống oxy hóa nội bào cho

thấy các hợp chất catechin có khả năng trung hoà ABTS tốt hơn cả GSH [108]. Các

hợp chất catechin cũng đã được báo cáo về hoạt tính ngăn ngừa sự hình thành dạng

oxy hóa của GSH, giảm peroxy hóa lipid và độc tế bào gan HepG2 bởi stress oxy hóa

do H2O2 gây ra [178], [179]; hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm, giảm xơ hóa gan

gây ra bởi CCl4 [162], [281].

Sự hiện diện của acid protocatechuic trong một số dược liệu đã được chứng

minh có khả năng đánh bắt gốc tự do và chống oxy hóa bằng cách giảm peroxy hóa

lipid, tăng bắt giữ gốc tự do và khôi phục hàm lượng GSH thông qua hoạt hóa yếu tố

điều hoà nhân Nrf2, giảm LDH ngoại bào trong các tế bào bị stress oxy hóa và ức chế

nồng độ ROS nội bào [134], [266], [252]. Hoạt tính chống oxy hóa của acid

protocatechuic đã được đánh giá bằng nhiều phương pháp bao gồm phương pháp

DPPH, ABTS+, trung hòa gốc superoxid và hydroxyl, hoạt tính ion sắt và đồng, so

với chất chống oxy hóa mạnh Trolox hay BHT (Butylated Hydroxy Toluen). So với

Trolox, acid protocatechuic thể hiện hoạt tính chống oxy hóa hiệu quả hơn ở mức độ

in vitro. Vì vậy, acid protocatechuic được dùng trong công nghiệp thực phẩm và dược

130

phẩm như chất chống oxy hóa tự nhiên [159]. Acid protocatechuic chiết xuất từ một

số dược liệu đã được ghi nhận về hoạt tính bảo vệ gan, thận nhờ vào cấu trúc

polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa như báo cáo của tác giả Liu và cộng sự (2002)

[161], Lee và cộng sự (2009) [153]. Butein là một flavonoid đã được chiết xuất từ

các loài như Butea frondosa, Viguiera multiflora (Nutt.), Baeria chrysostoma (F. and

M.), Cosmos sulphureus, Dahlia variabilis, Coreopsis maritima, Coreopsis gigantea.

Butein được báo cáo như một chất chống oxy hóa mạnh, ức chế peroxid hóa lipid và

LDL bằng cách trung hòa các gốc tự do và thải sắt. Ngoài ra, butein thể hiện các hoạt

tính chống viêm, ức chế yếu tố hoại tử khối u TNF-a, ức chế cyclooxygenase 2, ức

chế sản xuất oxit nitric và Inos, gây ra apoptosis ở các tế bào ác tính như HL-60 và

B16 [222]. Stigmasterol được biết là một hợp chất hóa thực vật phân lập từ đậu nành

và một số loài thực vật khác, có hoạt tính chống oxy, ức chế đáng kể hoạt động khử

HMG-CoA [222]. Isoliquiritigenin được tìm thấy lần đầu tiên trong tự nhiên vào năm

1953 từ Dahlia variabilis (Compositae) và cũng được phân lập từ các loài

Glycyrrhiza glabra, Sinofranchetia chinensis và Broussonetia paccorifera cho thấy

có các hoạt tính sinh học của bao gồm tác dụng đối với tim mạch, chống kết tập tiểu

cầu, vận mạch, chống oxy hóa, chống ung thư và ức chế TNF-α [222].

Tác động bảo vệ gan, phòng ngừa tổn thương do CCl4 gây ra của Bí kỳ nam

được khẳng định trên mô hình in vivo gây tổn thương gan chuột nhắt. Tổn thương

gan thường được chẩn đoán đầu tiên bởi các dấu hiệu sinh hóa như alanin

aminotransferase (ALT) và aspartat aminotransferase (AST). Nồng độ cao của các

enzym này trong huyết thanh được coi là các chỉ số liên quan đến độc tính gan [259].

ALT là chỉ số sinh học thường xuyên nhất của nhiễm độc gan. ALT đóng vai trò quan

trọng trong chuyển hóa acid amin, xúc tác cho quá trình chuyển nhóm amino từ alanin

sang α-ketoglutarat để tạo ra glutamat và pyruvat. So với AST, chỉ số enzym này

được xem là đặc hiệu hơn để phát hiện các bất thường về gan vì ALT chủ yếu được

cho quá trình chuyển đổi của một nhóm amino từ aspartat thành α-ketoglutarat tạo

ra oxaloacetat và glutamat. Ngoài gan, AST cũng được tìm thấy trong các cơ quan

tìm thấy ở gan. AST là một loại enzym gan khác hỗ trợ sản xuất protein, xúc tác

131

khác như tim, cơ, não và thận [259]. Enzym lactat dehydrogenase (LDH) hỗ trợ sản

xuất năng lượng, xúc tác sự chuyển đổi giữa pyruvat và lactat với sự phối hợp của

NADH và NAD+. Tổn thương màng tế bào làm giải phóng và tăng hàm lượng LDH

ngoại bào. Mức độ cao của enzym này giúp phát hiện tình trạng hoại tử tế bào gan

[259]. GSH, MDA đã được biết là các chỉ dấu cho tình trạng stress oxy hóa, peroxyd

hóa lipid tế bào [96], [190]. Tác nhân CCl4 0,2% tiêm phúc mô ở liều 10 ml/kg thể

trọng gây stress oxy hóa, tổn thương gan, làm tăng các chỉ số enzym gan (AST, ALT),

tăng nồng độ LDH, giảm hàm lượng GSH và tăng lượng MDA gan. Kết quả này phù

hợp với cơ chế tác động của CCl4 và kết quả của các nghiên cứu đã thực hiện trên mô

hình gây tổn thương gan in vivo với tác nhân CCl4 [113], [310], [308], [316]. Nghiên

cứu cho thấy sử dụng dự phòng cao cồn 50% Bí kỳ nam liều 100 mg/kg, cao phân

đoạn EtOAc liều 100 mg/kg, các chất catechin và acid protocatechuic liều 10 mg/kg

trong 14 ngày trước khi tiêm CCl4 0,2% có tác động phòng ngừa stress oxy hóa, tổn

thương gan do CCl4 gây ra thông qua khả năng khôi phục hoạt tính enzym gan (AST,

ALT), LDH và giảm stress oxy hóa. Tác động phòng ngừa tổn thương gan do CCl4

gây ra của cao Bí kỳ nam tương tự như chất đối chứng dương silymarin 100 mg/kg.

Nhiều bằng chứng đã chứng minh mối quan hệ phụ thuộc giữa stress oxy hóa

và viêm trong cơ chế của nhiều loại bệnh lý [148], [176]. Các gốc tự do sinh ra trong

quá trình tổn thương do stress oxy hóa sẽ làm tăng biểu hiện các gen tiền viêm bằng

cách kích hoạt dòng dẫn truyền tín hiệu nội bào. Mặt khác, trong quá trình viêm, các

tế bào thực bào như bạch cầu trung tính và đại thực bào được kích thích, tạo ra một

lượng lớn các ROS/RNS, các gốc tự do này có thể khuếch tán khỏi tế bào thực bào,

gây stress oxy hóa và tổn thương mô. Sự tương tác chặt chẽ của stress oxy hóa và

viêm do đó tạo ra một vòng tuần hoàn thúc đẩy cơ chế bệnh sinh của các bệnh gan.

Vì vậy, liệu pháp chống oxy hóa riêng lẻ đôi khi không mang lại kết quả thỏa mãn

trong một số thử nghiệm lâm sàng. Điều này đã được gọi là hiện tượng nghịch lý

chống oxy hóa (antioxidant paradox) [45]. Một số nhà nghiên cứu đề xuất rằng chính

sự phụ thuộc lẫn nhau phức tạp và chặt chẽ giữa stress oxy hóa và viêm là nguyên

nhân dẫn đến hiệu quả chưa như mong muốn của điều trị chống oxy hóa [158]. Ví

132

dụ, một chất chống oxy hóa, có thể làm giảm con đường stress oxy hóa nhưng làm

trầm trọng thêm tín hiệu viêm có khả năng thất bại trong việc điều trị các bệnh về

gan. Sự tương tác của stress oxy hóa và viêm cho thấy tầm quan trọng đối với việc

lựa chọn các chất chống oxy hóa vừa có khả năng ngăn chặn quá trình oxy hóa đồng

thời có tác động giảm viêm. Trong cơ chế gây độc gan do tác nhân CCl4 đã được báo

cáo về vai trò của cytokin TNF-α [76]. Đây là một cytokin tiền viêm được tiết bởi các

bạch cầu đơn nhân và các đại thực bào trong tổn thương gan thận cấp và mạn, đồng

thời có thể kích hoạt sản sinh các cytokin gây viêm khác bằng cách thu hút các bạch

cầu trung tính [320]. Kết quả nghiên cứu cho thấy chỉ số TNF-α ở lô tiêm CCl4 0,2%

cao hơn đáng kể so với lô chứng sinh lý chứng tỏ gây ra tình trạng viêm. Các lô điều

trị dự phòng với chất chứng dương silymarin, cao chiết Bí kỳ nam hay các chất

catechin, acid protocatechuic đều làm giảm đáng kể nồng độ TNF-α, thể hiện khả

năng phòng ngừa tình trạng tổn thương gan do viêm. Tác động phòng ngừa tình trạng

viêm do CCl4 gây ra của các cao Bí kỳ nam tương tự chất đối chứng dương silymarin

liều 100 mg/kg. Nhiều dược liệu và hợp chất từ dược liệu cũng đã được chứng minh

hiệu quả phối hợp giữa tác động chống oxy hóa và kháng viêm trong điều trị các bệnh

về gan như berberin [75], curcumin [91], acid lipoic [105] hay epigallocatechin gallat

[130]. Tác động bảo vệ gan in vivo của Bí kỳ nam còn được khẳng định trên hình ảnh

đại thể và vi thể gan chuột. Các tổn thương như viêm nhu mô gan, hoại tử tiểu thùy

ghi nhận ở gan chuột tiêm CCl4 0,2% giảm rõ rệt ở các lô điều trị dự phòng với

silymarin, các cao Bí kỳ nam, catechin hoặc acid protocatechuic.

Kể từ khi được phát hiện, protein Nrf2 đã nhanh chóng được biết đến như bộ

điều khiển của mạng lưới điều hòa gen cân bằng oxy hóa khử nội môi [167]. Nrf2

được kích hoạt thông qua con đường Keap1/Nrf2/ARE. Trong điều kiện bình thường,

Nrf2 được giữ trong phức hợp, liên kết với Keap1. Keap1 đóng vai trò thúc đẩy sự

thoái hóa Nrf2. Nrf2 thể hiện thời gian bán hủy ngắn 13 - 21 phút [247], [140]. Quá

trình này dẫn đến duy trì Nrf2 ở mức thấp, cơ bản. Nhiều gốc cystein trong chuỗi acid

amin của Keap1 cho phép hoạt động như một cảm biến, phát hiện những thay đổi của

trạng thái oxy hóa tế bào. Khi xảy ra tình trạng gia tăng các gốc tự do nội bào hoặc

133

sự hiện diện của các tác nhân kích hoạt sẽ làm giảm hoạt động của phức hợp và giải

phóng Nrf2 (thời gian bán hủy kéo dài 100 - 200 phút dưới tác động của stress oxy

hóa). Nrf2 xâm nhập vào nhân, liên kết với yếu tố đáp ứng chống oxy hóa ARE dẫn

đến tăng biểu hiện của các gen chống oxy hóa và giải độc, giúp bảo vệ tế bào khỏi

tổn thương do stress oxy hóa [37], [140]. Kích hoạt Nrf2 đã được ghi nhận ở các tế

bào bao gồm tế bào nhu mô gan và cả các tế bào hình sao, tế bào Kupffer. Nhiều loại

gen mục tiêu của Nrf2 được biểu hiện ở gan. Vai trò bảo vệ của sự kích hoạt Nrf2

trong cơ chế bệnh học của nhiều loại bệnh gan đã được nghiên cứu và ghi nhận như:

viêm gan virut, nhiễm độc gan do thuốc (acetaminophen) hay hóa chất (CCl4), viêm

gan nhiễm mỡ do rượu, viêm gan nhiễm mỡ không do rượu, viêm gan ứ mật, xơ gan

hay ung thư biểu mô gan. Một nghiên cứu cho thấy kích hoạt Nrf2 ngăn ngừa stress

oxy hóa và tích tụ acid béo tự do trong gan do rượu gây ra bằng cách tăng các gen

liên quan đến bảo vệ chống oxy hóa và giảm các gen liên quan đến quá trình tạo lipid

[303]. Một nghiên cứu khác xác nhận rằng tiền xử lý với sulforaphan có thể làm giảm

tổn thương gan thông qua kích hoạt con đường truyền tín hiệu Nrf2/ARE, làm giảm

stress oxy hóa và duy trì các hoạt động bình thường của Na+-K+-ATPase và Ca2+-

ATPase [63]. Shen và cộng sự (2018) đã chứng minh con đường chống oxy hóa

Keap1-Nrf2 được kích hoạt trong giai đoạn đầu của nhiễm độc gan do

acetaminophen, đóng vai trò bảo vệ ngăn ngừa tổn thương gan cấp tính do

acetaminophen gây ra [251]. Ngoài ra, tác giả Shin và cộng sự (2013) đã ghi nhận sự

kích hoạt Nrf2 cần thiết cho quá trình tái tạo gan thông qua giảm stress oxy hóa và

tăng sinh tế bào gan [253]. Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã và đang chứng minh vai

trò của con đường hoạt hóa tín hiệu protein Nrf2 trong quá trình viêm thông qua cơ

chế ức chế sản xuất các cytokin và chemokin gây viêm cũng như hạn chế sự kích hoạt

của NF-ƙB. Một số hợp chất nguồn gốc thực vật đã được chứng minh không chỉ là

chất chống oxy hóa tốt mà còn có tác động chống viêm mạnh thông qua cảm ứng

protein Nrf2 như curcumin của củ nghệ, isothiocyanate từ bông cải xanh, cần tây và

các loại rau khác hay anthocyanin từ quả nho [21]. Một ví dụ điển hình về chất kích

hoạt Nrf2 được FDA phê chuẩn và sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh viêm như bệnh

134

đa xơ cứng (Multiple sclerosis, MS) là dimethyl fumarate. Biệt dược Tecfidera®

(Biogen) được sử dụng hiệu quả làm giảm nhiều dạng xơ cứng ở nhiều bệnh nhân

[93]. Kết quả của nghiên cứu cho thấy biểu hiện protein Nrf2 tăng đáng kể khi có sự

hiện diện của chất đối chứng silymarin hay cao chiết cồn 50% Bí kỳ nam, gợi ý có sự

kích hoạt của con đường phòng thủ Nrf2 trong cơ chế phòng ngừa oxy hóa, bảo vệ

gan của Bí kỳ nam. Con đường điều hòa stress oxy hóa thông qua kích hoạt yếu tố

Nrf2 cũng đã được báo cáo là cơ chế chính cho hoạt tính chống oxy hóa của chất đối

chứng dương silymarin [271]. Báo cáo của Harvey và cộng sự (2009) [116] đã chứng

minh Nrf2 điều chỉnh cân bằng GSH nội môi bằng cách ảnh hưởng đến quá trình tổng

hợp mới (de novo). Điều này có thể giải thích cho khả năng tăng hàm lượng GSH của

cao chiết Bí kỳ nam và chất đối chứng dương silymarin. Khả năng kích hoạt Nrf2 của

cao chiết Bí kỳ nam gợi ý nhờ sự hiện diện của các hợp chất polyphenol đã được phân

lập như catechin, acid protocatechuic, butein, stigmasterol hay β-sitosterol. Nghiên

cứu của Jing và cộng sự (2018) đã chứng minh con đường truyền tín hiệu chống oxy

hóa Nrf2 bảo vệ gan được kích hoạt bởi catechin, chống lại hội chứng tắc nghẽn

xoang gan (Hepatic sinusoidal obstruction syndrome – HSOS) do monocrotalin gây

ra [130]. Các hợp chất catechin từ trà xanh thể hiện tác động chống oxy hóa và kháng

viêm thông qua con đường tín hiệu Nrf2 và NF-κB, giúp kiểm soát các bệnh thoái

hóa thần kinh [86]. Nghiên cứu của Vari và cộng sự (2011) đã lần đầu tiên chứng

minh acid protocatechuic cải thiện tiềm năng chống oxy hóa nội sinh của đại thực

bào bằng cơ chế hoạt hóa Nrf2 [291]. Con đường kích hoạt Nrf2 cũng đóng vai trò

trong khả năng ngăn ngừa apoptosis do lipoprotein gây ra của acid protocatechuic

[291], [292]. Yang và cộng sự (2011) đã ghi nhận hợp chất flavonoid butein cảm ứng

cộng sự (2015) [317] đã báo cáo về các phytosterin như β-sitosterol, campesterol và

tổng hợp glutathion chống stress oxy hóa thông qua trung gian Nrf2 [312]. Zhang và

stigmasterol chống lại stress oxy hóa do 4-nitrophenol thông qua việc tăng các enzym

giải độc/chống oxy hóa nhờ trung gian Nrf2.

Đây là lần đầu tiên tác động phòng ngừa stress oxy hóa, bảo vệ gan in vitro, in

vivo của cao dược liệu Bí kỳ nam, một loài thuộc chi Hydnophytum, nhóm cây tổ

135

kiến, họ Cà phê được báo cáo. Tác động phòng ngừa tổn thương gan do CCl4 gây ra

của cao cồn 50% liều 100 mg/kg Bí kỳ nam tương tự như silymarin liều 100 mg/kg.

Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào cả Việt Nam và trên thế giới đề cập đến tác

động dược lý bảo vệ gan của các loài thuộc chi Hydnophytum cũng như Myrmecodia,

là hai chi lớn nhất của nhóm cây tổ kiến.

4.4. TÁC ĐỘNG DƯỢC LÝ BẢO VỆ THẬN CỦA BÍ KỲ NAM

Mặc dù thường được coi là bệnh đi kèm của các bệnh đái tháo đường hoặc tăng

huyết áp, bệnh thận có rất nhiều nguyên nhân phức tạp. Quan trọng, bệnh thận có tác

động gián tiếp đến tỷ lệ mắc bệnh và tử vong toàn cầu bằng cách gia tăng nguy cơ

liên quan đến ít nhất năm bệnh đe dọa tử vong nghiêm trọng như: tim mạch, đái tháo

đường, tăng huyết áp, nhiễm vi rút suy giảm miễn dịch ở người (HIV) và sốt rét.

Nghiên cứu Gánh nặng bệnh tật toàn cầu (GBD) năm 2015 ước tính rằng 1,2 triệu ca

tử vong do bệnh tim mạch có liên quan trực tiếp đến việc giảm mức lọc cầu thận.

Nghiên cứu GBD 2015 cũng ước tính, trong năm 2015 có 1,2 triệu người chết vì suy

thận, tăng 32% kể từ năm 2005. Năm 2010, ước tính có 2,3 - 7,1 triệu người mắc

bệnh thận giai đoạn cuối tử vong không được điều trị bằng phương pháp lọc máu mạn

tính. Ngoài ra, mỗi năm, khoảng 1,7 triệu người được cho là chết do tổn thương thận

cấp. Nhìn chung, ước tính có khoảng 5 - 10 triệu người tử vong hàng năm vì bệnh

thường chi hơn 2 - 3% ngân sách chăm sóc sức khỏe hàng năm cho việc điều trị

bệnh thận giai đoạn cuối, mặc dù số người nhận điều trị này chiếm dưới 0,03%

tổng dân số. Năm 2010, 2,62 triệu người được lọc thận trên toàn thế giới và nhu

cầu lọc thận được dự đoán sẽ tăng gấp đôi vào năm 2030. Vào năm 2015, tại Hoa

Kỳ, chi phí của Medicare cho bệnh thận mạn tính và giai đoạn cuối tương ứng hơn

64 tỷ và 34 tỷ đô [326].

thận. Bệnh thận liên quan đến gánh nặng kinh tế lớn. Các quốc gia có thu nhập cao

Stress oxy hóa và viêm đã được báo cáo đóng vai trò quan trọng trong cơ chế

bệnh sinh của nhiều loại bệnh thận từ suy thận cấp đến suy thận mạn [53], [193]. Một

số dược liệu có hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm đã chứng minh tác động bảo vệ

thận hiệu quả như Lô hội (Aloe barbadensis) [61], Nghệ (Curcuma longa) [294],

136

Bạch quả (Ginkgo biloba) [182], Mao Vĩ Lông (Aerva lanata (Linn.) [29], Đậu dầu

(Pongamia pinnata) [255], Cành dâu (Ramulus mori) [297]… Bí kỳ nam với các

thành phần polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa mạnh gợi ý tiềm năng bảo vệ thận

của loài dược liệu này.

Cisplatin [cis-diaminedichloroplatinum(II)] là hợp chất platinum được sử dụng

rộng rãi để điều trị các loại ung thư như ung thư buồng trứng, ung thư tinh hoàn ung

thư đầu, cổ, cổ tử cung và ung thư phổi không phải tế bào nhỏ [90]. Hạn chế chính

của việc sử dụng cisplatin trên lâm sàng là xu hướng gây độc thận và độc tai nghiêm

trọng. Ước tính có khoảng 30% bệnh nhân điều trị với cisplatin có biểu hiện tăng

nồng độ creatinin huyết thanh và giảm độ lọc cầu thận, phản ánh tình trạng nhiễm

độc thận. Những triệu chứng này có thể xảy ra sớm nhất là 10 ngày sau khi bắt đầu

hóa trị với cisplatin. Khoảng 50 – 60 % bệnh nhân hóa trị ung thư bị tổn thương thận

cấp có liên quan đến tăng tỷ lệ tử vong [90], [236]. Độc tính trên thận cũng được xem

là tác dụng phụ chính quyết định việc cân nhắc lựa chọn các thuốc chống ung thư như

cisplatin. Cho đến nay, stress oxy hóa, viêm và quá trình apoptosis đã được chứng

minh là các cơ chế chính liên quan đến độc tính trên thận do cisplatin gây ra [135].

Sự tích tụ cisplatin trong các mô thận dẫn đến stress oxy hóa gây tổn thương viêm

biểu mô ống thận lan tỏa đến các vi mạch thận, cản trở lưu lượng máu do gây tổn

thương thiếu máu cục bộ và giảm tốc độ lọc cầu thận. Để hạn chế độc tính trên thận

do cisplatin gây ra, một số chất đã được sử dụng. Một số thử nghiệm lâm sàng đã

thực hiện bởi Nhóm chăm sóc ung thư thuộc Tổ chức Dược lâm sàng Châu Âu đã sử

dụng mannitol và furosemid (thuốc lợi tiểu thẩm thấu và lợi tiểu quay) trong việc

giảm lưu giữ cisplatin ở thận và do đó, giảm thiểu độc tính mô thận [149]. Tuy nhiên

phương pháp này cho thấy đáp ứng hạn chế trên lâm sàng, trong khi độc tính trên

thận vẫn chưa được loại bỏ. Vì vậy, nhu cầu cần thiết đối với việc phát triển các sản

phẩm có khả năng bảo vệ thận trong trường hợp hóa trị ung thư với cisplatin. Một số

hợp chất hóa thực vật và cao chiết dược liệu đã được báo cáo về tiềm năng bảo vệ

thận trên các mô hình in vitro, in vivo chống lại độc tính do cisplatin gây ra, có thể kể

đến như cao chiết cồn của Trâm bầu (Combretum micranthum) [142], hợp chất

137

ginsenoside Rb3 từ lá của Sâm (Panax quonthefolius) [306]; ginsenoside Rh4 và Rk3

từ Nhân sâm (Panax ginseng) [34], hesperidin trong trái cây họ Cam quýt [240];

isoliquiritigenin từ loài Glycyrrhiza [151]…

Tế bào phôi thai thận người (Human embryonic kidney, HEK 293) là dòng tế

bào được phân lập năm 1973 từ môi trường nuôi cấy tế bào phôi thai thận người bình

thường. Các tế bào HEK 293 đã được sử dụng rộng rãi để sản xuất protein ở cấp độ

nghiên cứu trong nhiều năm và gần đây, năm sản phẩm trị liệu được sản xuất bằng

các tế bào HEK 293 đã được FDA và Cơ quan y tế châu Âu (EMA) phê duyệt sử

dụng [78]. HEK 293 được xem là một mô hình tốt trong khảo sát in vitro về thận vì

khả năng dễ lưu trữ, sinh trưởng và phát triển, thể hiện nhiều chức năng chuyên biệt

của tế bào thận người và có khả năng thay đổi các phân tử protein giống như người

để thể hiện các hoạt động sinh học [169], [279].

Nghiên cứu bước đầu xây dựng mô hình in vitro mô phỏng tình trạng tổn thương

tế bào thận HEK 293 với tác nhân cisplatin dựa trên các thông số về mật độ nuôi cấy

tế bào, nồng độ cisplatin và thời gian nuôi cấy. Trong xây dựng mô hình in vitro mô

phỏng tình trạng độc tính nói chung và tổn thương tế bào thận nói riêng, việc xác định

các thông số liên quan đến điều kiện nuôi cấy và tác nhân gây độc đóng vai trò quan

trọng, đảm bảo gây được tình trạng tổn thương ở mức độ phù hợp để khảo sát được

tác động của mẫu thử. Nghiên cứu đã lựa chọn các thông số nhằm đảm bảo tỷ lệ làm

giảm tế bào sống so với mẫu sinh lý đạt từ 30% trở lên đồng thời đảm bảo sự tuyến

tính giữa khả năng ức chế tăng trưởng tế bào và nồng độ cisplatin sử dụng. Theo

hướng dẫn về khảo sát độc tính in vitro của Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm

Hoa Kỳ (FDA - Food and Drug Administration), một mẫu thử làm tỷ lệ tế bào sống

giảm từ 30% trở lên so với mẫu chứng sinh lý được xem là có độc tính trên tế bào

[324]. Từ kết quả thu được, mô hình in vitro mô phỏng tình trạng tổn thương tế bào

thận HEK 293 được lựa chọn với các thông số gồm mật độ nuôi cấy tế bào là 2 x 105

tế bào/ml, thời gian xử lý 24 giờ với cisplatin nồng độ 25 µM. So với các báo cáo

trước đây nồng độ cisplatin sử dụng từ 15 - 100 µM [160], [175],[319], nồng độ

cisplatin được lựa chọn trong nghiên cứu là 25 µM phù hợp với các báo cáo của Mi

138

và cộng sự (2018) [175] hay Zhou và cộng sự (2019) [319]. Về thời gian xử lý, hầu

hết các báo cáo đều cho thấy thời gian xử lý thích hợp là 24 giờ, tương tự như mô

hình của nghiên cứu. Tổn thương tế bào thận HEK 293 gây ra bởi cisplatin 25 µM

được khẳng định qua tình trạng hoại tử tế bào (tăng 19,1% hoạt tính LDH ngoại bào)

và tăng sinh gốc tự do (giảm 69,5% GSH nội bào) so với mẫu sinh lý (p < 0,01).

Những kết quả thu được hoàn toàn phù hợp với cơ chế gây độc tính trên thận của

cisplatin liên quan chặt chẽ với tình trạng tăng sinh gốc oxy tự do (ROS) và gây hoại

tử tế bào thận đã được báo cáo [111], [135]. Sự thay đổi hình dạng của tế bào HEK

293 do tác động của cisplatin cũng thể hiện rõ trên hình ảnh hiển vi điện tử cho thấy

các tế bào có hiện tượng co rút, có độ bám dính kém và số lượng tế bào giảm rõ rệt.

Nghiên cứu đã sử dụng mô hình mô phỏng tình trạng tổn thương tế bào thận

HEK 293 với cisplatin 25 µM để đánh giá tác động phòng ngừa oxy hóa, bảo vệ thận

in vitro của Bí kỳ nam. Kết quả cho thấy cao cồn 50% Bí kỳ nam thể hiện tác động

phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng, hoại tử tế bào và stress oxy hóa do cisplatin gây

ra, bảo vệ tế bào thận HEK 293 tốt nhất. Tác động của cao cồn 50% Bí kỳ nam không

khác biệt đáng kể so với mẫu chứng dương N-acetyl cystein nồng độ 1000 µM. N-

acetyl cystein (NAC) là tiền chất của glutathion, đã được sử dụng làm thuốc tiêu chất

nhầy trong bệnh xơ nang trong hơn 40 năm qua [122]. Vào những năm 1970, NAC được sử dụng để điều trị ngộ độc acetaminophen [89]. Cho đến năm 1980, NAC đã

được sử dụng cho những bệnh nhân bị bệnh mãn tính với tình trạng giảm glutathion

trong stress oxy hóa (như bệnh gan do rượu) [280], [197]. Trong một nghiên cứu ca,

Nisar và cộng sự [189] đã báo cáo trường hợp ở phụ nữ 52 tuổi bị suy thận cấp sau

khi dùng cisplatin 150 mg để điều trị ung thư thực quản, nồng độ BUN và creatinin

trong huyết thanh tăng từ 12 và 0,7 mg/dL lên 24 và 1,8 mg/dL, vào ngày thứ 5 sau

khi dùng cisplatin. Bệnh nhân đã được điều trị bằng NAC (140 mg/kg trọng lượng cơ

thể tiếp theo là 70 mg/kg mỗi 4 giờ trong 4 ngày) và hai ngày sau đó, chức năng thận

bắt đầu cải thiện và sau 10 ngày, creatinin huyết thanh của bệnh nhân đã giảm đến

0,8 mg/dL. Vai trò của NAC trong cải thiện độc tính của cisplatin thông qua cơ chế

trực tiếp trung hòa các gốc tự do đã được báo cáo [166], [189], tăng hoạt tính các

139

enzym chống oxy hóa và GSH đồng thời ức chế sự hình thành MDA cũng được đề

cập trong nghiên cứu của Ma và cộng sự (2017) [168], Chao và cộng sự (2016) [59].

NAC cũng được báo cáo như chất bảo vệ hóa trị nhờ ức chế apoptosis do cisplatin

gây ra thông qua con đường tín hiệu caspase [304]. Ngoài tác dụng chống oxy hóa,

NAC còn có tác dụng kháng viêm và điều hòa miễn dịch [201], [184], [85].

Tác động bảo vệ thận của Bí kỳ nam được khẳng định trên mô hình in vivo gây

tổn thương thận chuột nhắt bằng tiêm phúc mô cisplatin liều duy nhất 16 mg/kg. Kết

quả cho thấy cisplatin làm tăng đáng kể nồng độ urea và creatinin huyết, các chỉ dấu

cho thấy tình trạng giảm độ lọc cầu thận và tổn thương thận. Ure là chất có nguồn

gốc từ sự thoái hoá protein bởi gan. Được lọc bởi cầu thận, một số ure được hấp thu

lại bởi các ống thận và được bài tiết qua nước tiểu. Đo hàm lượng ure trong máu giúp

đánh giá chức năng thận. Creatinin là một sản phẩm thoái hóa của phosphocreatin,

nguồn năng lượng chính được tìm thấy trong cơ. Sự hình thành creatinin không đòi

hỏi phải có enzym và không bị ảnh hưởng bởi chế độ ăn uống. Creatinin được thải

trừ thường xuyên bởi thận và chỉ còn một phần nhỏ trong máu. Nếu chức năng thận

bị suy giảm, nồng độ creatinin huyết sẽ tăng bất thường. Cisplatin liều 16 mg/kg cũng

làm tăng đáng kể hoạt tính LDH và nồng độ TNF-α chứng tỏ có sự tổn thường màng

tế bào dẫn đến sự rò rỉ của các chất trong tế bào, trong đó có LDH và gây tình trạng

viêm ở chuột. Kết quả này phù hợp với các bằng chứng khoa học cho thấy cisplatin

gây tăng rò rỉ LDH từ tế bào gan, thận và các tế bào ung thư [263]. Cisplatin liều

duy nhất 16 mg/kg cũng làm giảm đáng kể hàm lượng GSH thận, phù hợp với cơ chế

gây độc thận của cisplatin thông qua stress oxy hóa với sự gia tăng sản xuất ROS và

giảm các chất chống oxy hóa nội bào [111], [168[, [189]. Việc điều trị dự phòng với

các cao chiết Bí kỳ nam, các chất catechin, acid protocatechuic hay NAC đã cải thiện

đáng kể nồng độ urea, creatinin huyết, hoạt tính LDH do cisplatin gây ra, cho thấy

tiềm năng bảo vệ thận của Bí kỳ nam. Cao cồn 50% Bí kỳ nam chứng tỏ tác động

chống stress oxy hóa do cisplatin gây ra thông qua khôi phục đáng kể hàm lượng

GSH thận, thậm chí cao hơn so với lô sinh lý. Kết quả này gợi ý cao chiết Bí kỳ nam

có thể làm tăng sinh tổng hợp GSH thận nói riêng và cơ thể nói chung.

140

Tác động phòng ngừa, bảo vệ thận, cải thiện độc tính do cisplatin gây ra thông

qua điều hòa stress oxy hóa đã được ghi nhận ở các hợp chất catechin, acid

protocatechuic hay butein, là các hợp chất đã được phân lập từ Bí kỳ nam. Một báo

cáo của tác giả Fatima và cộng sự (2016) cho thấy việc điều trị kết hợp

epigallocatechin gallate và Coenzym Q10 thể hiện hiệu quả trong việc ngăn ngừa độc

thận do cisplatin gây ra qua trung gian stress oxy hóa, viêm và hoại tử tế bào [87].

Yamabe và cộng sự (2015) đã chứng minh acid protocatechuic từ mướp đắng

(Momordica charantia, Cucurbitaceae) thể hiện tác động bảo vệ thận chống lại độc

tính của cisplatin [309]. Sutariya và cộng sự (2017) đã ghi nhận tác động chống độc

tính thận do cisplatin của butein bằng cách ức chế stress oxy hóa [275].

Các tác giả Ramesh và Reeves (2002) đã báo cáo vai trò của cytokin tiền viêm

TNF-α trong cơ chế gây độc thận của cisplatin [231]. Báo cáo của các tác giả này cho

thấy TNF-α đóng vai trò trung tâm trong mạng lưới kích hoạt của các chemokin và

cytokin tiền viêm. Các chất ức chế sản xuất TNF- α (GM6001, pentoxifylline) ngăn

ngừa kích hoạt mạng lưới cytokin, giúp cải thiện rối loạn chức năng thận và giảm tổn

thương cấu trúc thận do cisplatin gây ra. TNF-α có thể là kết quả hoặc là nguyên nhân

của stress oxy hóa do độc tính thận của cisplatin. Stress oxy hóa do cisplatin làm tăng

sản xuất TNF-α do quá trình gây tổn thương tế bào biểu mô thận tạo ra các phân tử

liên quan đến tổn thương DAMPS dẫn đến thu hút các bạch cầu đến nơi tổn thương

và gia tăng sản xuất các cytokin và chemokin gây viêm. Ngược lại, TNF-α cũng có

thể làm tăng oxy hóa stress thông qua làm tăng nhạy cảm của các các bạch cầu làm

tăng đáp ứng và tăng sản xuất các ROS [112]. Cao cồn 50% Bí kỳ nam cũng cải thiện

đáng kể nồng độ TNF-α. Điều này gợi ý khả năng phòng ngừa tổn thương thận do

cisplatin gây ra của Bí kỳ nam có thể thông qua cơ chế kháng viêm bên cạnh cơ chế

chống oxy hóa.

Tác động bảo vệ thận in vivo của Bí kỳ nam được khẳng định trên hình ảnh đại

thể và vi thể thận chuột. Hình ảnh đại thể, vi thể cho thấy thận chuột ở lô dùng

cisplatin có màu nhạt và hiện tượng hoại tử ống thần gần – xa, rải rác có các ống thận

141

dãn rộng, trong khi thận chuột ở các lô còn lại đều có màu đỏ thẫm, không có dấu

hiệu tổn thương hay xung huyết, các mô thận đều bình thường.

Kết quả nghiên cứu bằng phương pháp lai miễn dịch protein Western blot, cho

thấy biểu hiệu của protein Nrf2 ở các mẫu tế bào HEK 293 xử lý với chất chứng

dương NAC hay cao cồn 50% Bí kỳ nam gia tăng đáng kể. Kết quả này gợi ý sự tham

gia của yếu tố điều hoà phiên mã Nrf2 trong cơ chế phòng ngừa oxy hóa, bảo vệ tế

bào thận của Bí kỳ nam. Con đường kích hoạt yếu tố phiên mã Nrf2 đã được chứng

minh đóng vai trò quan trọng trong nhiều bệnh thận khác nhau từ suy thận cấp đến

bệnh thận mạn và đã có những thử nghiệm trị liệu dựa trên Nrf2 ở người [191].

Pedruzzi và cộng sự (2015) báo cáo về tình trạng stress oxy hóa và viêm hệ thống ở

bệnh nhân chạy thận do giảm điều hòa Nrf2 [213]. Phân tích microarray trên thận

chuột sau thiếu máu cục bộ bước đầu cho thấy Nrf2 là chất điều chỉnh chính của đáp

ứng chống stress trong suy thận cấp. Ở chuột bị thiếu hụt gen Nrf2 đã dẫn đến chức

năng thận kém hơn sau tổn thương do thiếu máu cục bộ hoặc tiêm cisplatin [163].

Các nghiên cứu thực nghiệm trên tế bào thận và mô hình động vật, cũng như một số

dữ liệu ở người, cho thấy sự kích hoạt Nrf2 mang lại lợi ích trong các bệnh về thận

bao gồm tổn thương thận cấp [23], [33], [163], bệnh thận mạn tính [237], [213], bệnh

thận đái tháo đường, bệnh thận đa nang và tăng huyết áp [191], [241]. Cơ chế kích

hoạt con đường Nrf2 đã được ghi nhận trong tác động bảo vệ thận, cải thiện độc tính

do cisplatin gây ra của nhiều hợp chất hóa thực vật như curcumin [282], [286],

lycopen [238], epigallocatechin [239], acid glycyrrhizic [302], quercetin [244],

resveratrol [203], [288]… Con đường kích hoạt Nrf2 cũng được ghi nhận trong cơ

chế chống stress oxy hóa của chất chứng dương NAC [55], [128], [152], [315]. Định

hướng nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có hoạt tính kích hoạt con đường Nrf2/ARE

đang được quan tâm trong nghiên cứu điều trị và hỗ trợ điều trị các bệnh về thận. Một

thành phẩm từ dịch chiết ethanol của cây Ngũ vị tử (Schisandra sphenanthera), viên

Wuzhi, với thành phần quan trọng nhất là schisantherin đã chứng minh khả năng

chống độc tính trên thận do cisplatin bằng cách kích hoạt các phản ứng bảo vệ qua

trung gian yếu tố Nrf2 [129]. Một thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên nhãn mở gần đây

142

được thực hiện ở một nhóm bệnh nhân nhỏ cho thấy việc điều trị bằng Cystone® (một

thành phẩm trị liệu từ thảo dược, có cơ chế tác động điều hòa stress oxy hóa thông

qua con đường tín hiệu Nrf2) kết hợp với hóa trị liệu cisplatin đã cải thiện chức năng

thận mà không ảnh hưởng đến tác dụng chống ung thư của cisplatin [81].

Đây là lần đầu tiên, tác động phòng ngừa oxy hóa, bảo vệ thận in vitro, in vivo

của dược liệu Bí kỳ nam được báo cáo. Cho đến nay chưa có nghiên cứu nào trong

và ngoài nước đề cập đến tác động bảo vệ thận của các loài dược liệu thuộc nhóm cây

tổ kiến. Kết quả nghiên cứu gợi ý tiềm năng tiến hành các nghiên cứu về tác động

bảo vệ thận của các loài cùng chi Hydnophytum hay cùng nhóm cây tổ kiến và tiềm

năng phát triển các sản phẩm thiên nhiên từ dược liệu trong hỗ trợ điều trị các bệnh

về thận.

Mối tương quan sinh, bệnh lý giữa gan và thận

Gan và thận là hai cơ quan quan trọng nhất để duy trì cân bằng nội môi và điều

hòa trao đổi chất trong cơ thể. Hai cơ quan có những chức năng riêng nhưng có mối

tương quan hợp tác và bù trừ cho nhau trong một số chức năng. Trong chuyển hóa

glucose và năng lượng, gan đóng vai trò chính tạo glucose mới khi cơ thể đói và dự

trữ năng lượng dạng glycogen khi no, trong khi tế bào ống thận gần có khả năng tạo

glucose tối đa khoảng 20% lượng glucose của cơ thể. Insulin là yếu tố điều hòa quan

trọng nhất của chuyển hóa glucose ở tất cả cơ quan trong cơ thể ngoại trừ quá trình

tạo glucose trong tế bào ống thận. Hơn 50% lượng insulin phóng thích từ tế bào β

tuyến tụy gắn với thụ thể ở gan. Insulin được phân hủy ở ống thận gần sau khi hoàn

thành vai trò sinh hóa ở các cơ quan, sau đó được lọc qua cầu thận. Vì vậy, khi gan

tổn thương sẽ gây tăng đường huyết sau ăn (đái tháo đường do gan) vì giảm hấp thu

glucose, tổng hợp glycogen ở gan và hạ đường huyết khi đói do thiếu tổng hợp mới

glucose. Tổn thương thận có khuynh hướng làm giảm nồng độ glucose huyết tương

và gây hạ đường huyết khi đói ở bệnh nhân đái tháo đường ngay cả khi đang điều trị

hạ đường huyết [299]. Việc thải các chất ngoại sinh khỏi cơ thể là chức năng kết hợp

của gan và thận: các chất tan trong nước được thải khỏi cơ thể thận bằng các con

đường gồm lọc qua cầu thận, tái hấp thu ở ống thận gần và bài tiết ở ống thận xa qua

143

các chất vận chuyển anion/cation và các kênh (độ thanh thải thận); mặt khác, các chất

tan trong dầu thường được chuyển hóa qua hệ thống enzym P450 trong gan và được

bài tiết vào ruột qua ống mật (độ thanh thải gan), một số chất kết hợp với sulfat hoặc

glucuronat ở gan; các chất tan trong nước còn lại sẽ bài tiết qua thận. Vì vậy, liều và

khoảng cách liều cần điều chỉnh ở bệnh nhân suy gan và/hoặc suy thận dựa vào bản

chất hóa học của thuốc và giai đoạn tổn thương của các cơ quan này [299]. Gan và

thận cùng có vai trò nội tiết, sản xuất erythropoietin (EPO): tế bào mô tủy thận có

nhiệm vụ sản xuất EPO ở người lớn, do đó thiếu máu thận xảy ra trong tổn thương

thận do không sản xuất đủ EPO gây ra bởi xơ hóa mô thận. Mặt khác, gan giữ khả

năng sản xuất bổ sung bù EPO khi thận bị tổn thương [299]. Hội chứng gan thận

(Hepatorenal syndrome) là tình trạng suy thận cấp xuất hiện ở bệnh nhân bệnh gan

mạn tính, suy gan tiến triển và tăng áp lực tĩnh mạch cửa; đặc trưng bởi suy giảm

chức năng thận, co mạch tại thận, trong khi ngược lại, giãn mạch ngoài thận gây giảm

trở kháng tuần hoàn hệ thống và hạ huyết áp [17]. Hội chứng này thường gặp ở bệnh

nhân xơ gan tiến triển, cũng có thể xuất hiện trên nền viêm gan do rượu hoặc suy gan

cấp. AKI xảy ra ở 25 - 50% bệnh nhân xơ gan nhập viện sau một đợt mất bù cấp tính

[219]. Bên cạnh đó, nhiều bằng chứng cho thấy NAFLD và CKD có cùng cơ chế gây

bệnh phổ biến và mục tiêu điều trị tiềm năng như dùng các chất chống oxy hóa, hay

điều chỉnh các yếu tố phiên mã điều hoà các con đường chuyển hóa lipid, viêm và xơ

hóa [101]. Suy gan, suy thận là biến chứng của nhiều bệnh mạn tính như: đái tháo

đường, tim mạch, xơ gan [192]. Rối loạn chức năng thận và gan thường xuất hiện

cùng nhau, có thể một phần do tình trạng suy đa cơ quan ở bệnh nhân mắc bệnh

nghiêm trọng hoặc do sự thất bại trong điều trị của từng cơ quan độc lập [43]. Do mối

tương quan sinh - bệnh lý nên trong chiến lược điều trị giữa bệnh gan và bệnh thận

có sự ảnh hưởng và tương quan hỗ trợ lẫn nhau.

Tiềm năng của các chất chống oxy hóa tự nhiên trong điều trị ung thư

Bên cạnh tác động hỗ trợ bảo vệ gan, thận, các hợp chất hóa thực vật chống oxy

hóa tự nhiên còn được chú trọng trong điều trị ung thư nhờ khả năng giết tế bào khối

u và bảo vệ các tế bào lành mạnh khỏi tổn thương gây ra do hóa trị liệu [70]. Các sản

144

phẩm hoặc các dẫn chất tự nhiên chiếm khoảng 60% các tác nhân hóa trị liệu ung thư

được chấp thuận bởi FDA bao gồm vincristin, vinblastin và Taxol [70], [187]. Quá

trình gây ung thư trải qua nhiều bước trong đó bước khởi đầu khi tiếp xúc với tác

nhân gây bệnh thường dẫn đến tăng sản xuất ROS. Sự hình thành các tế bào ung thư

thường phụ thuộc vào các đột biến gen liên quan đến sự điều hòa chu trình tế bào,

quá trình apoptosis và/hoặc các con đường tín hiệu của yếu tố tăng trưởng, có thể gây

ra bởi đột biến ADN qua trung gian ROS [70]. Vì vậy các chất chống oxy hóa đóng

vai trò quan trọng trong hóa trị liệu ung thư. Sự tương tác giữa các chất chống oxy

hóa và tế bào ung thư có thể xảy ra tối thiểu bởi một trong ba cách: thứ nhất (phòng

ngừa): các chất chống oxy hóa có thể bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do ROS gây ra

[183], [274]; thứ 2 (chống lại độc tính do hóa trị liệu): hóa trị thường làm tăng sản

xuất ROS dẫn đến stress oxy hóa ở các tế bào ung thư và các mô khác, làm mất cân

bằng nội môi tế bào, dẫn đến độc tính; do đó, phương pháp kết hợp các chất chống

oxy hóa với hóa trị liệu có thể cải thiện độc tính và tăng đáp ứng lâm sàng với hóa trị

liệu [98]; thứ ba (các phân tử kháng ung thư mới): những bằng chứng gần đây cho

thấy các hợp chất chống oxy hóa từ dược liệu có thể sử dụng để loại bỏ tế bào ung

thư [107], [246].

4.5. ĐỘC TÍNH CẤP VÀ ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN ĐƯỜNG UỐNG

CỦA CAO BÍ KỲ NAM

Tính an toàn của trị liệu hóa thực vật đang trở nên ngày càng được quan tâm khi

WHO khuyến khích việc sử dụng y học cổ truyền một cách thích hợp, đồng thời FDA

và WHO cũng nhấn mạnh vai trò chứng minh tính an toàn của các loài dược liệu

thông qua những nghiên cứu được thực hiện dựa trên cơ sở khoa học [300]. Mục đích

chính của việc đánh giá tính an toàn của bất kỳ dược liệu nào là xác định tính chất,

tầm quan trọng của các tác dụng phụ có thể xảy ra và thiết lập mức độ phơi nhiễm

mà tác dụng này quan sát được [287].

Độc tính cấp được xem là nghiên cứu cung cấp thông tin ban đầu về tác động

độc hại của một chất mà qua đó chúng ta có thể điều chỉnh liều sử dụng cho một hợp

chất mới hay giúp xác định liều trong các nghiên cứu trên động vật, cũng là cơ sở để

145

phân loại và dán nhãn một hợp chất hoặc sản phẩm thuốc mới [99]. Mặc dù Bí kỳ

nam từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền ở Việt Nam và các nước nhưng

đến nay chưa có tài liệu nghiên cứu trong và ngoài nước nào đánh giá về tính an toàn

của dược liệu này. Do đó, nghiên cứu đã tiến hành đánh giá độc tính cấp của cao cồn

50% Bí kỳ nam trên mô hình động vật là chuột nhắt Swiss albino. Trong nghiên cứu

này, chuột nhắt được sử dụng vì dữ liệu khoa học đã ghi nhận liều độc tính thu được

ở chuột thích hợp hơn để dự đoán các tác động gây độc trên người [300]. Kết quả cho

thấy với nồng độ tối đa của cao cồn 50% Bí kỳ nam có thể qua kim cho uống là 500

mg/ml, thể tích uống 0,2 ml/10 g trọng lượng chuột (liều 10 g cao/kg thể trọng, tương

đương 32,3 g dược liệu khô/kg thể trọng chuột), trong 72 giờ khảo sát và kéo dài đến

14 ngày, không có chuột nào chết và không ghi nhận bất kỳ biểu hiệu độc tính nào,

chứng tỏ cao cồn 50% Bí kỳ nam liều 10 g cao/kg thể trọng không gây độc tính cấp

đường uống.

Đối với các chất dùng trong điều trị hoặc hỗ trợ điều trị bệnh mãn tính, cần được

đánh giá độc tính với liều lặp đi lặp lại (nghiên cứu độc tính bán trường diễn) vì việc

sử dụng hằng ngày có thể dẫn đến tích tụ tác động dần dần trong cơ thể ở các mô và

cơ quan. Nghiên cứu độc tính bán trường diễn rất hữu ích trong việc đánh giá các tác

động của cao chiết lên các cơ quan đích, các thông số huyết học hoặc sinh hóa. Các

thông số này rất cần thiết trong việc thiết lập sự an toàn cho người, đặc biệt trong phát

triển dược phẩm. Nghiên cứu đã khảo sát độc tính bán trường diễn đường uống của

cao cồn 50% Bí kỳ nam trên chuột nhắt Swiss albino. Kết quả khảo sát tác động dược

lý của cao cồn 50% Bí kỳ nam đã cho thấy cao thể hiện tác động bảo vệ gan, thận với

liều uống 100 mg/kg ở chuột vì vậy, liều uống 100 mg/kg cao cồn 50% có thể được

chọn để ngoại suy liều điều trị ở người. Độc tính bán trường diễn của cao Bí kỳ nam

đã được đánh giá ở liều sử dụng hàng ngày 100 mg/kg tương ứng với liều ước tính ở

người và ở liều 200 mg/kg (gấp hai lần liều điều trị ước tính) để kiểm tra các dấu hiệu

độc hại có thể xảy ra, trong thời gian 60 ngày sử dụng liên tiếp. Theo Hướng dẫn thử

nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu của Bộ Y tế (2015)

[3], thử nghiệm độc tính bán trường diễn nên kéo dài trong khoảng thời gian gấp 4

146

lần thời gian điều trị. Cao cồn 50% Bí kỳ nam đã thể hiện tác động bảo vệ gan, thận

sau 2 tuần điều trị, vì vậy, nghiên cứu độc tính bán trường diễn đã đánh giá độc tính

tích lũy có thể gây ra bởi liều uống lặp đi lặp lại trong vòng 60 ngày trên mô hình

chuột nhắt. Các thông số được đánh giá bao gồm tỷ lệ tử vong, chỉ số trọng lượng cơ

thể, các thông số huyết học, sinh hóa và mô học. Tỷ lệ tử vong là một tiêu chí quan

trọng đầu tiên trong đánh giá độc tính [31]. Kết quả khảo sát trong 60 ngày cho thấy

trong suốt thời gian thử nghiệm, không có bất kỳ tử vong hoặc thay đổi hành vi bất

thường nào được ghi nhận ở cả 2 nhóm điều trị sử dụng cao cồn 50% liều 100 mg/kg

và 200 mg/kg so với lô sinh lý. Bên cạnh tỷ lệ tử vong, chỉ số trọng lượng cơ thể cũng

là dấu hiệu phản ánh tình trạng tổn thương có thể xảy ra khi tiếp xúc với các chất độc

hại. Trong 60 ngày thử nghiệm, trọng lượng cơ thể chuột tăng dần bình thường và

không có sự khác biệt đáng kể về trọng lượng cơ thể trung bình giữa tất cả các nhóm.

Kết quả này có thể phản ánh tình trạng sức khỏe của chuột trong các lô thử nghiệm

không bị ảnh hưởng bởi cao chiết Bí kỳ nam.

Phân tích các thông số huyết học thường được sử dụng để đánh giá mức độ độc

tính của các chất bao gồm các chiết xuất từ thực vật. Hệ thống tạo máu là quá trình

hình thành các tế bào máu, là một trong những mục tiêu dễ bị tổn thương, nằm trong

tủy xương nơi xảy ra quá trình sản sinh hồng cầu. Hệ thống này là một chỉ số quan

trọng về trạng thái sinh lý và bệnh lý ở cả người và động vật [44]. Kết quả nghiên

cứu cho thấy cao cồn 50% Bí kỳ nam liều uống 100 mg/kg không gây bất kỳ thay đổi

đáng kể về các chỉ số hồng cầu trong cả quá trình thử nghiệm 30 và 60 ngày. Ở liều

200 mg/kg sau khi sử dụng liên tiếp 30 ngày có sự gia tăng số lượng hồng cầu, số

lượng huyết sắc tố và nồng độ hemoglobin trung bình hồng cầu sau 60 ngày so với lô

sinh lý. Sự gia tăng các chỉ số hồng cầu ở liều cao 200 mg/kg được cho là do sự kích

thích nhẹ hoạt động erythropoietin bởi chiết xuất thực vật. Trong điều kiện sinh lý

bình thường, sự gia tăng hồng cầu và các thành phần liên quan được cho là do tăng

hoạt động của erythropoietin trong các tế bào gốc của động vật. Erythropoietin là một

loại hormon glycoprotein do thận sản xuất, kích hoạt các tế bào gốc trong tủy xương

để hình thành các tế bào hồng cầu. Kích thích tổng hợp erythropoietin trực tiếp hoặc

147

gián tiếp bởi các chất bao gồm các chất chuyển hóa thứ cấp thực vật đã được báo cáo

[195], [221]. Ví dụ, các chất chống oxy hóa flavonoid và terpen được phát hiện trong

chiết xuất từ lá của loài Veronia lasiopus đã được báo cáo kích thích sản xuất

erythropoietin [180]. Tuy nhiên, các thông số hồng cầu của 2 lô dùng cao cồn 50%

Bí kỳ nam trong nghiên cứu đều nằm trong giới hạn tham chiếu của chuột [269]. Cả

2 liều 100 và 200 mg/kg của cao cồn 50% Bí kỳ nam đều không làm thay đổi các chỉ

số bạch cầu và tiểu cầu so với lô sinh lý.

Vai trò của chức năng gan và thận rất quan trọng đối với sự sống của động

vật. Chức năng của chúng được đo lường bằng phân tích sinh hóa huyết thanh, điều

rất quan trọng trong đánh giá độc tính của các chất ngoại sinh. Kết quả nghiên cứu

cho thấy cao cồn 50% Bí kỳ nam liều 100 mg/kg không làm thay đổi các chỉ số men

gan trong thời gian thử nghiệm 30 và 60 ngày so với lô sinh lý. Có sự gia tăng đáng

kể ALT và AST của chuột dùng cao ở liều 200 mg/kg sau 60 ngày sử dụng liên tiếp

cho thấy cần lưu ý theo dõi chức năng gan khi sử dụng liều cao của các cao chiết

dược liệu trong thời gian dài liên tục vì gan là nơi chuyển hóa chính của hầu hết các

chất (cả chất có tác dụng điều trị hay gây độc) nên gan là nơi dễ bị ảnh hưởng nhất.

Tuy nhiên sự gia tăng này của enzym gan không gây thay đổi nào trên hình ảnh vi

thể gan chuột ghi nhận trong nghiên cứu. Xét nghiệm máu thông thường kiểm tra

chức năng của thận thông qua đo nồng độ ure và creatinin huyết thanh. Cao cồn 50%

Bí kỳ nam ở cả 2 liều 100 và 200 mg/kg không gây ra bất kỳ thay đổi nào về chỉ số

ure, creatinin khi so sánh với lô sinh lý. Mô học của thận chuột cũng không ghi nhận

sự thay đổi so với lô sinh lý.

Đây là lần đầu tiên các dữ liệu liên quan đến tính an toàn của dược liệu Bí kỳ

nam được báo cáo. Kết quả của nghiên cứu độc tính bán trường diễn gợi ý cao cồn

50% Bí kỳ nam liều 100 mg/kg là tương đối an toàn và có thể sử dụng cho mục đích

nghiên cứu điều trị.

148

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Sau quá trình thực hiện, nghiên cứu đã hoàn thành các nội dung nghiên cứu và

đạt được tất cả các mục tiêu đề ra ban đầu.

Mô tả đặc điểm thực vật, mã vạch ADN, định danh loài Bí kỳ nam, khảo

sát thành phần hóa thực vật, tiêu chuẩn độ ẩm, độ tro của dược liệu

Nghiên cứu đã mô tả các đặc điểm thực vật của loài Bí kỳ nam được thu hái tại

đảo Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang, bao gồm các đặc điểm hình thái bên ngoài như đặc

điểm thân, củ, rễ, lá; đặc điểm giải phẫu thân, rễ, lá và đặc điểm bột thân củ của dược

liệu. Nghiên cứu đã phân tích mã vạch ADN giúp định danh dược liệu thu hái là loài

Hydnophytum formicarum Jack., họ Cà phê (Rubiaceae). Đây là lần đầu tiên các đặc

điểm về cấu tạo giải phẫu, thành phần bột thân củ và đặc điểm mã vạch ADN của

dược liệu này được ghi nhận và báo cáo. Kết quả của nghiên cứu đóng góp dữ liệu

mới về loài Bí kỳ nam thu hái tại Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang.

Dược liệu được xác định đạt chất lượng về các tiêu chuẩn độ ẩm (13,0 ± 0,1),

độ tro toàn phần (9,6 ± 0,4) và độ tro không tan trong acid (0,7 ± 0,03); đồng thời các

phản ứng định tính cho thấy có sự hiện diện của polyphenol trong dược liệu.

Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật cho thấy dược liệu Bí kỳ nam

có sự hiện diện của các nhóm hợp chất gồm flavonoid, acid hữu cơ, hợp chất khử,

saponin, tannin và triterpenoid. Đây là những hợp chất có hoạt tính sinh học tiềm

năng.

Các cao toàn phần, các cao phân đoạn và chất phân lập từ Bí kỳ nam

Dược liệu thân củ Bí kỳ nam được chiết xuất với các dung môi có độ phân cực

khác nhau thu được các cao toàn phần gồm cao cồn 96%, cao cồn 70%, cao cồn 50%

và cao nước; trong đó, cao cồn 50% cho hiệu suất chiết cao nhất (26,1%). Các cao

cồn Bí kỳ nam thể hiện hoạt tính chống oxy hóa in vitro mạnh thông qua khả năng

đánh bắt gốc tự do (IC50 < 25 µg/ml) và giảm peroxy hóa lipid tế bào.

Các cao cồn toàn phần thể hiện hoạt tính độc đối với các tế bào ung thư gồm tế

bào ung thư cổ tử cung Hela, tế bào ung thư vú MCF-7 và tế bào ung thư phổi người

NCI-H460 với giá trị IC50 lần lượt là 400 – 600 μg/ml, đồng thời không gây độc đối

149

với các tế bào gan người HepG2, tế bào thận heo LLC-PK1 và tế bào thận khỉ Vero

ở nồng độ từ 100 – 500 μg/ml. Lần đầu tiên tác động của cao chiết Bí kỳ nam được

báo cáo đối với các dòng tế bào NCI-H460, RD-A, HepG2, LLC-PK1 và Vero.

Cao cồn 50% Bí kỳ nam có màu vàng nâu, vị cay đắng, mùi thơm đặc trưng của

dược liệu, đạt các tiêu chuẩn chất lượng về độ ẩm (7,3 ± 0,1), độ tro toàn phần (6,4 ±

0,1), độ tro không tan trong acid (0,8 ± 0,1) và độ vô khuẩn. Các kết quả này đóng

góp dữ liệu khoa học cho chuyên luận về loài Bí kỳ nam. Cao cồn 50% được chiết

xuất thành các phân đoạn EtOAc, n-butanol và nước.

Cao phân đoạn EtOAc có hiệu suất chiết, hàm lượng polyphenol cao (365,4 ±

5,9 mg pyrogallol/g cao) và hoạt tính chống oxy hóa in vitro mạnh (IC50 = 5,6 µg/ml),

được lựa chọn để chiết tách, phân lập chất. Bằng các kỹ thuật sắc ký, phân tích phổ,

hai hợp chất đã được phân lập gồm (+)-catechin [(2R,3S)-5,7,3’,4’-

tetrahydroxyflavan-3-ol] và acid protocatechuic (acid 3,4-dihydroxy benzoic). Lần

đầu tiên, hai hợp chất (+)-catechin và acid protocatechuic được phân lập từ loài Bí kỳ

nam. Đây là các polyphenol tự nhiên có hoạt tính sinh học chống oxy hóa và kháng

viêm tốt.

Tác động phòng ngừa tổn thương gan, thận in vitro, in vivo của Bí kỳ nam

Cao chiết cồn 50% từ thân củ Bí kỳ nam, cao phân đoạn EtOAc và các chất

catechin, acid protocatechuic thể hiện khả năng bảo vệ tế bào gan HepG2 ở mức độ

in vitro chống lại độc tính do tác nhân CCl4 2 mM gây ra trong 24 giờ và khả năng

bảo vệ tế bào thận HEK 293 chống lại độc tính thận do cisplatin 25 μM gây ra.

Ở mức độ in vivo, cao chiết Bí kỳ nam và các chất catechin, acid protocatechuic

thể hiện khả năng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan chuột nhắt với CCl4

liều 10 ml/kg và bảo vệ thận trên mô hình gây tổn thương thận chuột nhắt với cisplatin

liều 16 mg/kg trong vòng 14 ngày.

Tác động bảo vệ gan, thận của cao chiết Bí kỳ nam gợi ý thông qua cơ chế kích

hoạt protein điều hoà phiên mã Nrf2 giúp chống oxy hóa, kháng viêm và ngăn ngừa

hoại tử. Các tác động này của Bí kỳ nam được cho là có liên quan đến sự hiện diện

của các hợp chất polyphenol như catechin và acid protocatechuic.

150

Lần đầu tiên, các kết quả về tác động dược lý bảo vệ gan, thận in vitro, in vivo

của dược liệu Bí kỳ nam, thuộc chi Hydnophytum được báo cáo, giúp cung cấp dữ

liệu khoa học và gợi ý tiềm năng của dược liệu này trong nghiên cứu, phát triển các

sản phẩm thiên nhiên hỗ trợ điều trị các bệnh gan, thận.

Tính an toàn của cao cồn 50% Bí kỳ nam

Trên mô hình chuột nhắt trắng, trong thời gian 72 giờ và kéo dài đến 14 ngày,

cao cồn 50% Bí kỳ nam không gây độc tính cấp đường uống với liều duy nhất cho

chuột uống là 10 g cao/kg thể trọng (tương đương 32,3 g dược liệu khô/kg).

Cao cồn 50% Bí kỳ nam liều 100 mg/kg không gây độc, không làm ảnh hưởng

đến các chỉ số huyết học cũng như chức năng gan, thận chuột trong vòng 60 ngày sử

dụng liên tiếp.

KIẾN NGHỊ

Kết quả thu được của nghiên cứu cho thấy cao chiết cồn 50% từ thân củ Bí kỳ

nam có thể được sử dụng trong phòng và/hoặc điều trị tổn thương gan, thận do stress

oxy hóa. Để kế thừa và phát triển những kết quả thu được từ nghiên cứu, các hướng

nghiên cứu tiếp theo được kiến nghị bao gồm:

- Nghiên cứu tác động bảo vệ gan hoặc thận của Bí kỳ nam trên mô hình thực

nghiệm với các tác nhân khác như acetaminophen, rượu, gentamycin, cyclosporin A,

vancomyin hay tia xạ.

- Nghiên cứu tác động của Bí kỳ nam trên các mô hình bệnh lý khác do stress

oxy hóa, có liên quan đến con đường hoạt hóa tín hiệu protein Nrf2/ARE như thoái

hóa thần kinh, tim mạch, đái tháo đường.

- Nghiên cứu ứng dụng dược liệu Bí kỳ nam trong hỗ trợ điều trị các bệnh mãn

tính.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN

1. Mai Nguyen Ngoc Trac, Pham Thu Ha, Do Thi Hong Tuoi (2020), “Subacute oral

toxicity evaluation of the ethanolic extract of Hydnophytum formicarum Jack. tubers

in Phu Quoc, Viet Nam”, MedPharmRes, vol 4 (1), 1-6.

2. Mai Nguyen Ngoc Trac, Truong Thi Dep, Tran Thi Van Anh, Do Thi Hong Tuoi

(2019), “Botanical, genetic characteristics and preliminary screening of the

phytochemical constituents of Hydnophytum formicarum Jack. in Phu Quoc forest,

Vietnam”, MedPharmRes, vol 3(2), 8-14.

3. Mai Nguyễn Ngọc Trác, Nguyễn Hoàng Quân, Huỳnh Thị Kim Loan, Đỗ Thị Hồng

Tươi (2017), “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và tác động trên sự tăng trưởng tế

bào in vitro của Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack.)”, Tạp chí Y học Thành

phố Hồ Chí Minh, 21(6), 175-180.

4. Mai Nguyễn Ngọc Trác, Phạm Thu Hà, Nguyễn Phương Dung, Đỗ Thị Hồng Tươi

(2017), “Khảo sát tác động bảo vệ gan của cao cồn 50% từ Bí kỳ nam (Hydnophytum

formicarum Jack.) trên mô hình chuột nhắt trắng gây tổn thương gan bằng

cyclophosphamide”, Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 21(6), 131-137.

5. Mai Nguyễn Ngọc Trác, Nguyễn Ngọc Anh Thơ, Nguyễn Phương Dung, Đỗ Thị

Hồng Tươi (2017), “Khảo sát tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan in vivo của cao

cồn 50% từ thân củ Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack. tubers) trên mô

hình gây tổn thương gan chuột bằng CCl4”, Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh,

21(2), 16-22.

6. Mai Nguyễn Ngọc Trác, Đỗ Thị Hồng Tươi (2016), “Khảo sát độc tính cấp và tác

động kháng viêm, giảm đau in vivo của cao cồn 50% từ thân củ Bí kỳ nam

(Hydnophytum formicarum Jack. rhizomes)”, Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh

(2016), 20(2), 204-209.

7. Mai Nguyễn Ngọc Trác, Nguyễn Ngọc Anh Thơ, Trần Thị Vân Anh, Đỗ Thị Hồng

Tươi (2015), “Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa in vitro và khả năng độc tế bào ung

thư gan HepG2 của cao chiết Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack.)”, Tạp

chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 19 (3), 38-44.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Bộ môn dược liệu (2014). Phương pháp nghiên cứu dược liệu. NXB ĐH Y

Dược TP Hồ Chí Minh.

2. Bộ Y tế (1996). Hướng dẫn nghiên cứu, đánh giá tính an toàn và hiệu lực thuốc Y học cổ truyền. Quyết định số 371/BYT-QĐ ngày 12 tháng 3 năm 1996 của Bộ trưởng Bộ Y tế, Hà Nội

3. Bộ Y tế (2015). Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu. Quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27/10/2015.

4. Bộ Y tế (2018). Dược điển Việt Nam 5, NXB Y học PL 9.6, 9.7, 9.8. 5. Võ Văn Chi (1991). Cây thuốc An Giang, Ủy ban khoa học - Kỹ thuật An Giang. 6. Đỗ Trung Đàm (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc, NXB Y

học, Hà Nội, tr. 11-137

7. Đoàn Thị Nhu, Đỗ Trung Đàm, Phạm Duy Mai, Nguyễn Thượng Dong, Nguyễn Thị Thu Hương (2006). Phương pháp nghiên cứu tác động dược lý của thuốc từ dược thảo, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật.

8. Nguyễn Phương Hạnh, Nguyễn Hữu Toàn Phần & Nguyễn Thị Diệu Thuần (2015),"Iridoid constituents from the ant plant Hydnophytum formicarum", Vietnam Journal of Chemistry, 53 (2e), 127-130.

9. Hà Hoàng Kiệm (2010). Thận học lâm sàng, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 10. Hoàng Ngọc Sâm, Trần Ngọc Hải, Hà Văn Long & Nguyễn Văn Trung (2018),"Đa dạng thực vật quý hiếm tại Vườn quốc gia Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang", Tạp chí khoa học và công nghệ lâm nghiệp số 4, 106–117. 11. Vũ Thanh Thảo, Nguyễn Ngọc Phương, Lý Bội Ân và cs. (2017),"Tác dụng bảo vệ của dịch chiết Bacillus subtilis kp3 trên tế bào MCF-7 và HepG-2 bị stress oxi hóa", Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 21(1), 554-561. 12. Nguyễn Bảo Trân, Trần Quang Vinh, Nguyễn Ngọc Khôi (2011). Tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan của lá chùm ngây (Moringa oleifera Lam. Moringaceae), Tạp chí Dược học 5/2011, 421, 25-28.

13. Đỗ Thị Hồng Tươi, Lê Thị Thu Vân, Huỳnh Thị Kim Loan (2014),"Xây dựng mô hình in vitro mô phỏng tình trạng tổn thương tế bào gan bằng tác nhân CCl4 trên dòng tế bào HepG2", Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 18(1), 273-280.

14. Phí Thị Xuyến, Phạm Thị Nguyệt Hằng, Đỗ Thị Phương, Đỗ Quyên (2016),"Nghiên cứu tác dụng của lá sen ức chế tích tụ lipid do acid oleic trên tế bào Hepg2", Tạp chí Dược liệu, tập 21, số 1+2/2016.

TIẾNG ANH 15. Abdullah H., Pihie A. H. L., Hohmann J., & Molnár J. (2010),"A natural compound from Hydnophytum formicarium induces apoptosis of MCF-7 cells via up-regulation of Bax", Cancer cell international, 10(1), 14. 16. Abdullah N. S., Ahmad W. Y. W., & Sabri N. A. (2017). The Chemical Constituents From Young Tubers of Hydnophytum formicarum. Malaysian Journal of Analytical Sciences, 21(2), 291-297.

17. Adel A. A. (2019),"Epidemiology, Pathophysiology, and Management of

Hepatorenal Syndrome", Seminars in Nephrology, 39(1), 17-30.

18. Adeneye A., Olagunju J., Benebo A., et al. (2008),"Nephroprotective effects of the aqueous root extract of Harungana madagascariensis (L.) in acute and repeated dose acetaminophen renal injured rats", Int J Appl Res Nat Prod, 1(1), 6-14.

19. Ahmad F., & Tabassum N. (2012),"Experimental models used for the study of

antihepatotoxic agents", J Acute Dis., 1, 85-89.

20. Ahmad R., Mahbob E., Noor Z., et al. (2010),"Evaluation of antioxidant potential of medicinal plants from Malaysian Rubiaceae (subfamily Rubioideae)", African Journal of Biotechnology, 9(46), 7948-7954. 21. Ahmed S. M. U., Luo L., Namani A., Wang X. J., & Tang X. (2017),"Nrf2 signaling pathway: Pivotal roles in inflammation", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease, 1863(2), 585-597.

22. Ak P., & Levine A. J. (2010),"p53 and NF-κB: different strategies for responding to stress lead to a functional antagonism", The FASEB Journal, 24(10), 3643-3652.

23. Aleksunes L. M., Goedken M. J., Rockwell C. E., et al. (2010),"Transcriptional regulation of renal cytoprotective genes by Nrf2 and its potential use as a therapeutic target to mitigate cisplatin-induced nephrotoxicity", Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 335(1), 2-12.

24. Ali B. H., Wabel N. A., & Blunden G. (2005),"Phytochemical, pharmacological and toxicological aspects of Hibiscus sabdariffa L.: a review", Phytotherapy Research: An International Journal Devoted to Pharmacological and Toxicological Evaluation of Natural Product Derivatives, 19(5), 369-375.

25. Almaghrabi O. A. (2015),"Molecular and biochemical investigations on the effect of quercetin on oxidative stress induced by cisplatin in rat kidney", Saudi journal of biological sciences, 22(2), 227-231.

26. Amarowicz R., Pegg R., Rahimi-Moghaddam P., Barl B., & Weil J. (2004),"Free-radical scavenging capacity and antioxidant activity of selected plant species from the Canadian prairies", Food chemistry, 84(4), 551-562.

27. Ambade A., & Mandrekar P. (2012),"Oxidative stress and inflammation: essential partners in alcoholic liver disease", International journal of hepatology, 2012.

28. Amuthan A., Devi V., SHREEDHARA C. S., RAO V., & Lobo R. (2019),"Cytoprotective Activity of Neichitti (Vernonia cinerea) in Human Embryonic Kidney (HEK293) Normal Cells and Human Cervix Epitheloid Carcinoma (HeLa) Cells against Cisplatin Induced Toxicity: A Comparative Study. ", Journal of Clinical & Diagnostic Research, 13(2).

29. Anita A., & Retna A. M. (2013),"Review on the medicinial plant-Aerva lanata", Asian Journal of Biochemical and Pharmaceutical Research, 1(3), 215-224. 30. Apel K., & Hirt H. (2004),"Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction", Annu. Rev. Plant Biol., 55, 373-399. 31. Asare G. A., Gyan B., Bugyei K., et al. (2012),"Toxicity potentials of the nutraceutical Moringa oleifera at supra-supplementation levels", Journal of ethnopharmacology, 139(1), 265-272.

32. Asrani S. K., Devarbhavi H., Eaton J., & Kamath P. S. (2019),"Burden of liver

diseases in the world", Journal of hepatology, 70(1), 151-171.

33. Atilano-Roque A., Wen X., Aleksunes L. M., & Joy M. S. (2016),"Nrf2 activators as potential modulators of injury in human kidney cells", Toxicology reports, 3, 153-159.

34. Baek S. H., Piao X. L., Lee U. J., Kim H. Y., & Park J. H. (2006),"Reduction of cisplatin-induced nephrotoxicity by ginsenosides isolated from processed ginseng in cultured renal tubular cells", Biological & Pharmaceutical Bulletin, 29(10), 2051–2055.

35. Bagherniya M., Nobili V., Blesso C. N., & Sahebkar A. (2018),"Medicinal plants and bioactive natural compounds in the treatment of non-alcoholic fatty liver disease: A clinical review", Pharmacological research, 130, 213- 240.

36. Bahashwan S., Hassan M. H., Aly H., et al. (2015),"Crocin mitigates carbon tetrachloride-induced liver toxicity in rats", J Taibah Univ Med Sci, 10, 140– 149.

37. Baird L., & Dinkova-Kostova A. T. (2011),"The cytoprotective role of the

Keap1–Nrf2 pathway", Archives of toxicology, 85(4), 241-272.

38. Baradaran A., Samadi F., Ramezanpour S., & Yousefdoust S. (2019),"Hepatoprotective effects of silymarin on CCl4-induced hepatic damage in broiler chickens model", Toxicology reports, 6, 788-794.

39. Batool R., Khan M. R., & Majid M. (2017),"Euphorbia dracunculoides L. abrogates carbon tetrachloride induced liver and DNA damage in rats", BMC complementary and alternative medicine, 17(1), 223.

40. Bayard M., Holt J., & Boroughs E. (2006),"Nonalcoholic fatty liver disease",

Am Fam Physician, 73(11), 1961-1968.

41. Bellezza I., Giambanco I., Minelli A., & Donato R. (2018),"Nrf2-Keap1 signaling in oxidative and reductive stress", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research, 1865(5), 721-733.

42. Bernatoniene J., & Kopustinskiene D. M. (2018),"The role of catechins in

cellular responses to oxidative stress", Molecules, 23(4), 965.

43. Betrosian A. P., Agarwal B., & Douzinas E. E. (2007),"Acute renal dysfunction

in liver diseases", World journal of gastroenterology, 13(42), 5552–5559.

44. Birbrair A., & Frenette P. S. (2016),"Niche heterogeneity in the bone marrow",

Ann N Y Acad Sci, 1370, 82–96.

45. Bonner M. Y., & Arbiser J. L. (2014),"The antioxidant paradox: what are antioxidants and how should they be used in a therapeutic context for cancer", Future medicinal chemistry, 6(12), 1413-1422.

46. Borza C., Muntean D., Dehelean C., et al. (2013),"Oxidative stress and lipid peroxidation–a lipid metabolism dysfunction", Lipid metabolism. 47. Bouma M. E., Rogier E., Verthier N., Labarre C., & Feldmann G. (1989),"Further cellular investigation of the human hepatoblastoma-derived cell line HepG2: Morphology and immunocytochemical studies of hepatic- secreted proteins", In Vitro Cell Dev Biol, 25, 267–275.

48. Bradford M. (1976),"A Rapid and Sensitive Method for the Quantification of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding", Analytical biochemistry, 72 (1–2), 248–254.

49. Braicu C., Ladomery M. R., Chedea V. S., Irimie A., & Berindan-Neagoe I. (2013),"The relationship between the structure and biological actions of green tea catechins", Food chemistry, 141(3), 3282-3289.

50. Branca C., Ferreira E., Nguyen T. V., et al. (2017),"Genetic reduction of Nrf2 exacerbates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer’s disease.", Hum Mol Genet, 26, 4823-4835.

51. Burk R. F., Lane J. M., & Patel K. (1984),"Relationship of oxygen and glutathione in protection against carbon tetrachloride-induced hepatic microsomal lipid peroxidation and covalent binding in the rat. Rationale for the use of hyperbaric oxygen to treat carbon tetrachloride ingestion", The Journal of clinical investigation, 74(6), 1996–2001.

52. Burton G. J., & Jauniaux E. (2011),"Oxidative stress", Best practice & research

Clinical obstetrics & gynaecology, 25(3), 287-299.

53. Cachofeiro V., Goicochea M., De Vinuesa S. G., et al. (2008),"Oxidative stress and inflammation, a link between chronic kidney disease and cardiovascular disease: New strategies to prevent cardiovascular risk in chronic kidney disease", Kidney international, 74, S4-S9.

54. Cahill A., Cunningham C. C., & Adachi M. (2002),"Effects of alcohol and oxidative stress on liver pathology: the role of the mitochondrion", Alcohol Clin Exp Res., 26, 907–915.

55. Cai Z., Lou Q., Wang F., et al. (2015),"N-acetylcysteine protects against liver injure induced by carbon tetrachloride via activation of the Nrf2/HO-1 pathway", International journal of clinical and experimental pathology, 8(7), 8655.

56. Calkins M. J., Johnson D. A., Townsend J. A., et al. (2009),"The Nrf2/ARE pathway as a potential therapeutic target in neurodegenerative disease", Antioxidants & redox signaling, 11(3), 497-508.

57. Canbay A., Taimr P., Torok N., et al. (2003),"Apoptotic body engulfment by a human stellate cell line is profibrogenic", Laboratory investigation, 83(5), 655.

58. Cekmen M., Ilbey Y., Ozbek E., et al. (2009),"Curcumin prevents oxidative renal damage induced by acetaminophen in rats", Food and Chemical Toxicology, 47(7), 1480-1484.

59. Chao M. W., Chen C. P., Yang Y. H., et al. (2016),"N-acetylcysteine attenuates lipopolysaccharide-induced impairment in lamination of Ctip2-and Tbr1- expressing cortical neurons in the developing rat fetal brain", Scientific Reports, 6, 32373.

60. Chartoumpekis V., Dionysios, & Kensler T. W. (2013),"New player on an old field; the keap1/Nrf2 pathway as a target for treatment of type 2 diabetes and metabolic syndrome", Current diabetes reviews, 9.2, 137-145.

61. Chatterjee P., Mukherjee A., & Nandy S. (2012),"Protective effects of the aqueous leaf extract of Aloe barbadensis on gentamicin and cisplatin– induced nephrotoxic rats", Asian Pacific journal of tropical Biomedicine, 2(3), S1754-S1763.

62. Chen X., Guo C., & Kong J. (2012),"Oxidative stress in neurodegenerative

diseases", Neural regeneration research, 7(5), 376.

63. Chi X., Zhang R., Shen N., et al. (2015),"Sulforaphane reduces apoptosis and oncosis along with protecting liver injury-induced ischemic reperfusion by activating the Nrf2/ARE pathway", Hepatology international, 9(2), 321-329.

64. Chiu Y.-J., Chou S.-C., Chiu C.-S., et al. (2018),"Hepatoprotective effect of the ethanol extract of Polygonum orientale on carbon tetrachloride-induced acute liver injury in mice", journal of food and drug analysis, 26(1), 369- 379.

65. Chou T.-H., Ding H.-Y., Lin R.-J., Liang J.-Y., & Liang C.-H. (2010),"Inhibition of melanogenesis and oxidation by protocatechuic acid from Origanum vulgare (oregano)", Journal of Natural Products, 73(11), 1767-1774.

66. Ciulei (1964). Practical Manuals on the Industrial Utilization of Medicinal and

Aromatic plants, , University of Bucharest,Romania.

67. Darwis D., Hertiani T., & Samito E. (2014),"The effects of Hydnophytum formicarum ethanolic extract towards lymphocyte, vero and T47d cells proliferation in vitro", Journal of Applied Pharmaceutical Science, 4(6), 13. 68. Das S., Choudhury M. D., Mandal S. C., & Talukdar A. (2012),"Traditional knowledge of ethnomedicinal hepatoprotective plants used by certain ethnic communities of Tripura State", Indian Journal of Fundamental and Applied Life Sciences, 2(1), 84-97.

69. David S., & Hamilton J. P. (2010),"Drug-induced liver injury", US

gastroenterology & hepatology review, 6, 73.

70. De Giffoni de Carvalho J. T., da Silva Baldivia D., Leite D. F., et al. (2019),"Medicinal Plants from Brazilian Cerrado: Antioxidant and Anticancer Potential and Protection against Chemotherapy Toxicity", Oxidative medicine and cellular longevity, 2019.

71. Delgado-Montemayor C., Cordero-Pérez P., Salazar-Aranda R., & Waksman- Minsky N. (2015),"Models of hepatoprotective activity assessment", Medicina universitaria, 17(69), 222-228.

72. Denizot F., & Lang R. (1986),"Rapid colorimetric assay for cell growth and survival: modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability", Journal of immunological methods, 89(2), 271- 277.

73. Deshmukh P., Unni S., Krishnappa G., & Padmanabhan B. (2017),"The Keap1– Nrf2 pathway: promising therapeutic target to counteract ROS-mediated damage in cancers and neurodegenerative diseases", Biophysical reviews, 9(1), 41-56.

74. Ding G., Goor H. V., Ricardo S. D., Orlowski J. M., & Ramond J. R. (1997),"Oxidized LDL stimulates the expression of TGF-β and fibronectin in human glomerular epithelial cells", Kidney international, 51(1), 147-154.

75. Domitrović R., Jakovac H., & Blagojević G. (2011),"Hepatoprotective activity of berberine is mediated by inhibition of TNF-α, COX-2, and iNOS expression in CCl4-intoxicated mice", Toxicology, 280(1-2), 33-43. 76. Dong Y., Liu Y., Kou X., et al. (2016),"The protective or damaging effect of Tumor necrosis factor-α in acute liver injury is concentration-dependent", Cell & bioscience, 6(1), 8.

77. Doyle J. J., & Doyle J. L. (1990),"Isolation of plant DNA from fresh tissue.",

Focus,, 12, 13-15.

78. Dumont J., Euwart D., Mei B., Estes S., & Kshirsagar R. (2016),"Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives", Critical reviews in biotechnology, 36(6), 1110-1122. 79. Duthie S. J., Melvin W. T., & Burke M. D. (1994),"Bromobenzene detoxification in the human liver-derived HepG2 cell line", Xenobiotica, 24, 265–279.

80. Eidi A. A., Mortazavi P., Bazargan M., & Zaringhalam

J. (2012),"Hepatoprotective activity of cinnamon ethanolic extract against CCl4-induced liver injury in rats", EXCLI J., 11, 495–507.

81. El-Ghiaty M. A., Ibrahim O. M., Abdou S. M., & Hussein F. Z. (2014),"Evaluation of the protective effect of Cystone® against cisplatin- induced nephrotoxicity in cancer patients, and its influence on cisplatin antitumor activity", International urology and nephrology, 46(7), 1367- 1373.

82. Elliot W. R., & Jones D. L. (1980),"Encyclopaedia of Australian plants suitable

for cultivation".

83. Ellnain-Wojtaszek M. (1997),"Phenolic acids from Ginkgo biloba L. Part II. Quantitative analysis of free and liberated by hydrolysis phenolic acids", Acta poloniae pharmaceutica, 54(3), 229-232.

84. Elya B., Basah K., Mun'im A., et al. (2012),"Screening of α-Glucosidase Inhibitory Activity from Some Plants of Apocynaceae, Clusiaceae, Euphorbiaceae, and Rubiaceae", BioMed Research International, 281078.

resuscitation fluids on in

85. Ergin B., Guerci P., Zafrani L., et al. (2016),"Effects of N-acetylcysteine (NAC) supplementation renal microcirculatory oxygenation, inflammation, and function in a rat model of endotoxemia", Intensive care medicine experimental, 4(1), 29.

86. Farkhondeh T., Yazdi H. S., & Samarghandian S. (2019),"The Protective Effects of Green Tea Catechins in the Management of Neurodegenerative Diseases: A Review", Current drug discovery technologies, 16(1), 57-65.

87. Fatima S., Al-Mohaimeed N., Al-Shaikh Y., et al. (2016),"Combined treatment of epigallocatechin gallate and Coenzyme Q10 attenuates cisplatin-induced nephrotoxicity via suppression of oxidative/nitrosative stress, inflammation and cellular damage", Food and Chemical Toxicology, 94, 213-220. 88. Fazekas A. J., Burgess K. S., Kesanakurti P. R., et al. (2008),"Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well", Plos One, 3(7), e2802.

89. Flanagan R. J., & Meredith T. (1991),"Use of N-acetylcysteine in clinical toxicology", The American journal of medicine, 91(3), S131-S139. 90. Fukasawa H., Furuya R., Yasuda H., et al. (2014),"Anti-cancer agent-induced nephrotoxicity.", Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 14(7), 921– 927.

91. Galaly S., Ahmed O., & Mahmoud A. (2014),"Thymoquinone and curcumin prevent gentamicin-induced liver injury by attenuating oxidative stress, inflammation and apoptosis", J Physiol Pharmacol, 65(6), 823-832. 92. Gandolfi J. A., Wijeweera J., & Brendel K. (1996),"Use of precision-cut liver slices as an in vitro tool for evaluating liver function", Toxicol Pathol, 24 (1), 58-61.

93. Gao B., Doan A., & Hybertson B. M. (2014),"The clinical potential of influencing Nrf2 signaling in degenerative and immunological disorders", Clinical pharmacology: advances and applications, 6, 19.

94. Gao S., Chen T., Choi M. Y., et al. (2013),"Cyanidin reverses cisplatin-induced apoptosis in HK-2 proximal tubular cells through inhibition of ROS- mediated DNA damage and modulation of the ERK and AKT pathways," Cancer Letters, 333, 36–46.

95. García-González A., Gaxiola-Robles R., & Zenteno-Savín T. (2015),"Oxidative stress in patients with rheumatoid arthritis", Revista de Investigación Clínica, 67(1), 46-53.

96. Gaweł S., Wardas M., Niedworok E., & Wardas P. (2004),"Malondialdehyde (MDA) as a lipid peroxidation marker", Wiadomosci lekarskie (Warsaw, Poland: 1960), 57(9-10), 453-455.

97. Gay N. H., Phopin K., Suwanjang W., et al. (2018),"Neuroprotective effects of phenolic and carboxylic acids on oxidative stress-induced toxicity in human neuroblastoma SH-SY5Y cells", Neurochemical research, 43(3), 619-636. 98. Ghiringhelli F., Rebe C., Hichami A., & Delmas D. (2012),"Immunomodulation and anti-inflammatory roles of polyphenols as anticancer agents", Anti- Cancer Agents in Medicinal Chemistry (Formerly Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents), 12(8), 852-873.

99. Ghosh D., Mondal S., & Ramakrishna K. (2019),"Acute and sub-acute (30-day) toxicity studies of Aegialitis rotundifolia Roxb., leaves extract in Wistar rats: safety assessment of a rare mangrove traditionally utilized as pain antidote", Clinical Phytoscience, 5(1), 13.

100. Giasson B. I., Ischiropoulos H., Lee V. M.-Y., & Trojanowski J. Q. (2002),"The relationship between oxidative/nitrative stress and pathological inclusions in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases", Free Radical Biology and Medicine, 32(12), 1264-1275.

101. Giovanni M., Maurizio C., & Solomon C. (2016),"Fatty Liver and Chronic Kidney Disease: Novel Mechanistic Insights and Therapeutic Opportunities", Diabetes Care, 39(10), 1830-1845.

102. Girish C., & Pradhan S. C. (2008),"Drug development for liver diseases: focus on picroliv, ellagic acid and curcumin", Fundamental & clinical pharmacology, 22(6), 623-632.

103. González L. T., Minsky N. W., Espinosa L. E. M., et al. (2017),"In vitro assessment of hepatoprotective agents against damage induced by acetaminophen and CCl4", BMC complementary and alternative medicine, 17(1), 39.

104. Goodla L., Manubolu M., Pathakoti K., et al. (2019),"Protective Effects of Ammannia baccifera Against CCl4-Induced Oxidative Stress in Rats", International journal of environmental research and public health, 16(8), 1440.

105. Goraca A., Huk-Kolega H., Kowalczyk A., & Skibska B. (2015),"Anti- oxidative and anti-inflammatory effects of lipoic acid in rat liver", Advances in Hygiene & Experimental Medicine/Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej, 69.

106. Grauzdytė D., Pukalskas A., Viranaicken W., Kalamouni C. E., & Venskutonis P. (2018),"Protective effects of Phyllanthus phillyreifolius extracts against hydrogen peroxide induced oxidative stress in HEK293 cells", Plos One, 13(11).

107. Greenwell M., & Rahman P. K. S. M. (2015),"Medicinal plants: their use in anticancer treatment", International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 6(10), 4103–4112.

108. Grzesik M., Naparło K., Bartosz G., & Sadowska-Bartosz

I. (2018),"Antioxidant properties of catechins: Comparison with other antioxidants", Food chemistry, 241, 480-492.

109. Guguen-Guillouzo C., & Guillouzo A. (2010). General review on in vitro hepatocyte models and their applications. In Hepatocytes (pp. 1-40): Humana Press.

110. Gyurászová M., Kovalčíková A. G., Renczés E., et al. (2019),"Oxidative Stress in Animal Models of Acute and Chronic Renal Failure", Disease markers, 2019.

111. Hajian S., Rafieian-Kopaei M., & Nasri H. (2014),"Nephroprotective effects of antioxidants against cisplatin nephrotoxicity", J Nephropharmacol, 3(2), 39- 42.

112. Halliwell (2013),"The antioxidant paradox: less paradoxical now?", British

Journal of Clinical Pharmacology, 75(3), 637–644.

113. Hamed H., Gargouri M., Bellassoued K., et al. (2017),"Hepato-preventive Activity of Camel Milk Against CCl4-Induced Lesions In Mice", Res Rev Biosci, 12(2), 117.

114. Hamsar M., & Mizaton H. (2012),"Potential of ant-nest plants as an alternative cancer treatment", Journal of Pharmacy Research, 5(6), 3063-3066. 115. Hart S. N., Li Y., Nakamoto K., et al. (2010),"A comparison of whole genome gene expression profiles of HepaRG cells and HepG2 cells to primary human hepatocytes and human liver tissues", Drug Metabolism and Disposition, 38(6), 988-994.

116. Harvey C. J., Thimmulappa R. K., Singh A., Blake D. J., Ling G. et al. (2009). Nrf2-regulated glutathione recycling independent of biosynthesis is critical for cell survival during oxidative stress. Free radical biology & medicine, 46(4), 443–453.

117. Henryk D. (2006),"Nonalcoholic Fatty Liver Disease", Clinical hepatology:

Principles and practice of hepatobiliary diseases, 221-230.

118. Herrmann K. (1989),"Occurrence and content of hydroxycinnamic and hydroxybenzoic acid compounds in foods", Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 28 (4), 315–347.

119. Hertiani T., & Pratiwi S. (2015),"Hydnophytum formicarum Jack ethanol extract modulates quorum sensing-controlled pathogenicity in Pseudomonas aeruginosa", Pak. J. Pharm. Sci, 28(5), 1691-1697.

120. Hosohata K. (2016),"Role of oxidative stress in drug-induced kidney injury",

International journal of molecular sciences, 17(11), 1826.

121. Hu J., Han J., Li H., et al. (2018),"Human embryonic kidney 293 cells: a vehicle and biopharmaceutical manufacturing, structural biology,

for electrophysiology", Cells Tissues Organs, 205(1), 1-8.

122. Hurst G. A., Shaw P. B., & LeMaistre C. A. (1967),"Laboratory and clinical evaluation of the mucolytic properties of acetylcysteine", American Review of Respiratory Disease, 96(5), 962-970.

123. Huxley C. R. (1978),"The ant‐plants Myrmecodia and Hydnophytum (Rubiaceae), and the relationships between their morphology, ant occupants, physiology and ecology", New Phytologist, 80(1), 231-268.

124. Iqubal A., Iqubal M. K., & Haque S. E. (2016),"Experimental hepatotoxicity

inducing agents: A Review", IJPR, 6(11), 325.

125. Isemura M. in Human Health and Disease. In:

(2019). Catechin Multidisciplinary Digital Publishing Institute.

126. Jebb M., & Huxley C. R. (8 February 2009),"A Revision of the Ant-Plant Genus Hydnophytum (Rubiaceae)", National Botanic Gardens Glasnevin website., Retrieved 19 December 2016.

127. Jennen D. G., Magkoufopoulou C., Ketelslegers H. B., et al. (2010),"Comparison of HepG2 and HepaRG by whole-genome gene expression analysis for the purpose of chemical hazard identification", Toxicological sciences, 115(1), 66-79.

128. Ji L., Liu R., Zhang X. D., et al. (2010),"N-acetylcysteine attenuates phosgene- induced acute lung injury via up-regulation of Nrf2 expression", Inhalation toxicology, 22(7), 535-542.

129. Jin J., Li M., Zhao Z., et al. (2015),"Protective effect of Wuzhi tablet (Schisandra sphenanthera extract) against cisplatin-induced nephrotoxicity via Nrf2-mediated defense response", Phytomedicine, 22(5), 528-535.

130. Jing X., Zhang J., Huang Z., Sheng Y., & Ji L. (2018),"The involvement of Nrf2 antioxidant signalling pathway in the protection of monocrotaline-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in rats by (+)-catechin hydrate", Free radical research, 52(4), 402-414.

131. Jun M., Venkataraman V., Razavian M., et al. (2012),"Antioxidants for chronic

kidney disease", Cochrane Database of Systematic Reviews(10).

132. Jürgenliemk G., & Nahrstedt A. (2002),"Phenolic compounds from Hypericum

perforatum", Planta Medica, 68(01), 88-91.

133. Kakkar S., & Bais S. (2014),"A review on protocatechuic acid and its

pharmacological potential", ISRN pharmacology, 2014.

134. Kamilia A., Kirk H. B., Taijun Y., et al. (2012),"Characterization of Polymyxin B-Induced Nephrotoxicity: Implications for Dosing Regimen Design", Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 56(9), 4625-4629.

135. Karasawa T., & Steyger P. S. (2015),"An integrated view of cisplatin-induced

nephrotoxicity and ototoxicity.", Toxicology Letters, 237(3), 219–227.

136. Khalili R. M. A., Shafekh S. E., Norhayati A., et al. (2013),"Total phenolic content and in vitro antioxidant activity of winged bean (Psophocarpus tetragonolobus)", Pak J Nutr, 12(5), 416-422.

137. Kheradpezhouh E., Panjehshahin M.-R., Miri R., et al. (2010),"Curcumin protects rats against acetaminophen-induced hepatorenal damages and shows synergistic activity with N-acetyl cysteine", European journal of pharmacology, 628(1-3), 274-281.

138. Kim J., Cha Y.-N., & Surh Y.-J. (2010),"A protective role of nuclear factor- erythroid 2-related factor-2 (Nrf2) in inflammatory disorders", Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 690(1- 2), 12-23.

139. Klahr S. (2001),"Urinary tract obstruction", Semin Nephrol, 21, 133-145. 140. Kobayashi M., & Yamamoto M. (2006),"Nrf2-Keap1 regulation of cellular defense mechanisms against electrophiles and reactive oxygen species", Advances in enzyme regulation, 46, 113-140.

141. Kociba R. J. (1971),"Acute toxicologic and pathologic effects of cis- the male rat", Cancer in

diamminedichloroplatinum (NSC-119875) Chemother. Rep., 55, 1-8.

142. Kpemissi M., Eklu-Gadegbeku K., Veerapur V. P., & Negru M. (2019),"Nephroprotective activity of Combretum micranthum G. Don in cisplatin induced nephrotoxicity in rats: In-vitro, in-vivo and in-silico experiments", Biomedicine & Pharmacotherapy,, 116, 108961.

143. Krithika R., Mohankumar R., Verma R. J., et al. (2009),"Isolation, characterization and antioxidative effect of phyllanthin against CCl4-induced toxicity in HepG2 cell line", Chemico-biological interactions, 181(3), 351- 358.

144. Kruk J., Kubasik-Kladna K., & Y Aboul-Enein H. (2016),"The role oxidative stress in the pathogenesis of eye diseases: current status and a dual role of physical activity", Mini reviews in medicinal chemistry, 16(3), 241-257.

145. Kryston T. B., Georgiev A. B., Pissis P., & Georgakilas A. G. (2011),"Role of oxidative stress and DNA damage in human carcinogenesis", Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 711(1- 2), 193-201.

146. Kumar A., K Susmitha, Swathy B., Ramu E., & Venkatesh B. (2014),"A review on liver disorders and screening models of hepatoprotective agents", Int J Allied Med Sci Clin Res, 2, 136-150.

147. Kurts C., Panzer U., Anders H.-J., & Rees A. J. (2013),"The immune system and kidney disease: basic concepts and clinical implications", Nature Reviews Immunology, 13(10), 738.

148. Lam P., Cheung F., Tan H., et al. (2016),"Hepatoprotective effects of Chinese medicinal herbs: a focus on anti-inflammatory and anti-oxidative activities", International journal of molecular sciences, 17(4), 465.

149. Launay-Vacher V., Rey J.-B., Isnard-Bagnis C., Deray G., & Daouphars M. (2008),"Prevention of cisplatin nephrotoxicity: state of the art and recommendations from the European Society of Clinical Pharmacy Special Interest Group on Cancer Care", Cancer chemotherapy and pharmacology, 61(6), 903-909.

150. Ledford H. (2008), Botanical identities: DNA barcoding for plants comes a step

closer, Nature, 451(7179), 616.

151. Lee C. K., Son S. H., Park K. K., et al. (2008),"Isoliquiritigenin inhibits tumor growth and protects the kidney and liver against chemotherapy-induced toxicity in a mouse xenograft model of colon carcinoma", Journal of pharmacological sciences, 106(3), 444-451.

152. Lee D., Kook S. H., Ji H., et al. (2015),"N-acetyl cysteine inhibits H2O2- mediated reduction in the mineralization of MC3T3-E1 cells by down- regulating Nrf2/HO-1 pathway", BMB reports, 48(11), 636.

153. Lee J.-H., Lee H.-J., Lee H.-J., et al. (2009),"Rhus verniciflua Stokes prevents cisplatin-induced cytotoxicity and reactive oxygen species production in MDCK-I renal cells and intact mice", Phytomedicine, 16(2-3), 188-197.

154. Lee Y. X., Cho I. J., Kim J. W., et al. (2018),"Hepatoprotective effects of blue honeysuckle on CCl4-induced acute liver damaged mice", Food science & nutrition, 7(1), 322–338.

155. Lende A. B., Kshirsagar A. D., Deshpande A. D., et al. (2011),"Anti- inflammatory and analgesic activity of protocatechuic acid in rats and mice", Inflammopharmacology, 19(5), 255.

156. Levin R. A., Wagner W. L., Hoch P. C., et al. (2003),"Family‐level relationships of Onagraceae based on chloroplast rbcL and ndhF data", American Journal of Botany, 90(1), 107-115.

157. Li S., & Mao M. (2013),"Next generation sequencing reveals genetic landscape

of hepatocellular carcinomas", Cancer Letters, 340(2), 247-253.

158. Li S., Hong M., Tan H.-Y., Wang N., & Feng Y. (2016),"Insights into the role and interdependence of oxidative stress and inflammation in liver diseases", Oxidative medicine and cellular longevity, 2016.

159. Li X., Wang X., Chen D., & Chen S. (2011),"Antioxidant activity and mechanism of protocatechuic acid in vitro", Functional Foods in Health and Disease, 1(7), 232-244.

160. Lim J., Lee S. H., Cho S., et al. (2013),"4-methoxychalcone enhances cisplatin- induced oxidative stress and cytotoxicity by inhibiting the Nrf2/ARE- mediated defense mechanism in A549 lung cancer cells", Molecules and cells, 36(4), 340-346.

161. Liu C.-L., Wang J.-M., Chu C.-Y., Cheng M.-T., & Tseng T.-H. (2002),"In vivo protective effect of protocatechuic acid on tert-butyl hydroperoxide-induced rat hepatotoxicity", Food and Chemical Toxicology, 40(5), 635-641. 162. Liu J., Lu J. F., Wen X. Y., Kan J., & Jin C. H. (2015),"Antioxidant and protective effect of inulin and catechin grafted inulin against CCl4-induced liver injury.", International journal of biological macromolecules, 72, 1479- 1484.

163. Liu M., Grigoryev D. N., Crow M. T., et al. (2009),"Transcription factor Nrf2 is protective during ischemic and nephrotoxic acute kidney injury in mice", Kidney international, 76(3), 277-285.

164. Lobo V., Patil A., Phatak A., & Chandra N. (2010),"Free radicals, antioxidants and functional foods: Impact on human health.", Pharmacogn Rev., 4, 118– 126.

165. Lok A., & Tan H. (2009),"Tuberous, epiphytic, rubiaceous myrmecophytes of

Singapore", Nature in Singapore, 2, 231-236.

166. Luo J., Tsuji T., Yasuda H., et al. (2008),"The molecular mechanisms of the attenuation of cisplatin-induced acute renal failure by N-acetylcysteine in rats", Nephrology Dialysis Transplantation, 23(7), 2198-2205.

167. Ma Q. (2013),"Role of nrf2 in oxidative stress and toxicity", Annual review of

pharmacology and toxicology, 53, 401-426.

168. Ma Z.-N., Li Y.-Z., Li W., et al. (2017),"Nephroprotective effects of saponins from leaves of Panax quinquefolius against cisplatin-induced acute kidney injury", International journal of molecular sciences, 18(7), 1407. 169. Madhusudana S. N., Sundaramoorthy S., & Ullas P. T. (2010),"Utility of human embryonic kidney cell line HEK-293 for rapid isolation of fixed and street rabies viruses: comparison with Neuro-2a and BHK-21 cell lines", International Journal of Infectious Diseases, 14(12), e1067-e1071. 170. Magesh S., Chen Y., & Hu L. (2012),"Small Molecule Modulators of K eap1‐ N rf2‐ARE Pathway as Potential Preventive and Therapeutic Agents", Medicinal research reviews, 32(4), 687-726.

171. Manen J. F., & Natali A. (1995),"Comparison of the evolution of ribulose-1, 5- biphosphate carboxylase (rbcL) and atpB-rbcL noncoding spacer sequences in a recent plant group, the tribe Rubieae (Rubiaceae).", Journal of Molecular Evolution, 41 (6), 920-927.

172. Marjoni M., & Zulfisa A. (2017),"Antioxidant activity of methanol extract/fractions of senggani leaves (Melastoma candidum D. Don)", Pharm Anal Acta, 8(557), 2.

173. Massy Z. A., Guijarro C., O’Donnell M. P., et al. (1999),"The central role of nuclear factor-κB in mesangial cell activation", Kidney international, 56, S76-S79.

174. McGill M. R., Sharpe M. R., Williams C. D., et al. (2012),"The mechanism underlying acetaminophen-induced hepatotoxicity in humans and mice involves mitochondrial damage and nuclear DNA fragmentation", The Journal of clinical investigation, 122(4), 1574-1583.

175. Mi X., Hou J., Wang Z., Han Y., & Ren S. (2018),"The protective effects of maltol on cisplatin-induced nephrotoxicity through the AMPK-mediated PI3K/Akt and p53 signaling pathways", Scientific Reports, 8, 15922. 176. Mittal M., Siddiqui M. R., Tran K., Reddy S. P., & Malik A. B. (2014),"Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury", Antioxidants & redox signaling, 20(7), 1126-1167.

177. Moore K. L., Dalley A. F., & Agur A. M. (2013). Clinically oriented anatomy,

Lippincott Williams & Wilkins.

178. Murakami C., Hirakawa Y., Inui H., Nakano Y., & Yoshida H. (2002),"Effects of epigallocatechin 3-O-gallate on cellular antioxidative system in HepG2 cells", Journal of nutritional science and vitaminology, 48(2), 89-94. 179. Murakami C., Hirakawa Y., Inui H., NAKANO Y., & YOSHIDA H. (2002),"Effect of tea catechins on cellular lipid peroxidation and cytotoxicity in HepG2 cells", Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 66(7), 1559- 1562.

180. Muriithi N., Maina G., Maina M., et al. (2015),"Determination of hematological effects of methanolic leaf extract of Vernonia lasiopus in normal mice", J Blood Lymph, 5(139), 2.

181. Murphy M. P., Holmgren A., Larsson N.-G., et al. (2011),"Unraveling the biological roles of reactive oxygen species", Cell metabolism, 13(4), 361- 366.

182. Naidu M., Shifow A. A., Kumar K. V., & Ratnakar K. (2000),"Ginkgo biloba rats", gentamicin-induced nephrotoxicity in

ameliorates extract Phytomedicine, 7(3), 191-197.

redox‐mediated differential

183. Nair S., Li W., & KONG A. N. T. (2007),"Natural dietary anti‐cancer signaling chemopreventive compounds: mechanisms in cytoprotection of normal cells versus cytotoxicity in tumor cells 1", Acta Pharmacologica Sinica, 28(4), 459-472.

184. Nascimento M. M., Suliman M. E., Silva M., et al. (2010),"Effect of oral N- acetylcysteine treatment on plasma inflammatory and oxidative stress markers in peritoneal dialysis patients: a placebo-controlled study", Peritoneal Dialysis International, 30(3), 336-342.

185. Negi A. S., Kumar J., Luqman S., et al. (2008),"Recent advances in plant hepatoprotectives: a chemical and biological profile of some important leads", Medicinal research reviews, 28(5), 746-772.

186. Negrette-Guzman M., García-Niño W. R., Edilia E. T., et al. (2015),"Curcumin attenuates gentamicin-induced kidney mitochondrial alterations: possible role of a mitochondrial biogenesis mechanism", Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 1-16.

187. Newman D. J., & Cragg G. M. (2016),"Natural products as sources of new drugs from 1981 to 2014", Journal of Natural Products,, 79(3), 629–661. 188. Nguyen T., Nioi P., & Pickett C. B. (2009),"The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress", Journal of Biological Chemistry, 284(20), 13291-13295.

189. Nisar S., & Feinfeld D. A. (2002),"N-acetylcysteine as salvage therapy in

cisplatin nephrotoxicity", Renal failure, 24, 529–533.

190. Nishida K., Ohta Y., Kongo M., & Ishiguro I. (1996),"Response of endogenous reduced glutathione through hepatic glutathione redox cycle to enhancement of hepatic lipid peroxidation with the development of acute liver injury in mice intoxicated with carbon tetrachloride", Res Commun Mol Pathol Pharmacol., 93(2), 198-218.

191. Noel S., Hamad A. R., & Rabb H. (2015),"Reviving the promise of transcription factor Nrf2-based therapeutics for kidney diseases", Kidney international, 88(6), 1217-1218.

192. Nwose E. U., Obianke J., Richards R. S., Bwiti P. T., & Igumbor E. O. (2019),"Prevalence and correlations of hepatorenal functions in diabetes and cardiovascular disease among stratified adults", Acta bio-medica : Atenei Parmensis, 90(1), 97–103.

193. Oberg B. P., McMenamin E., Lucas F. L. E., et al. (2004),"Increased prevalence of oxidant stress and inflammation in patients with moderate to severe chronic kidney disease", Kidney international, 65(3), 1009-1016.

194. Ohkawa H., Ohishi N., & Yagi K. (1979),"Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction", Analytical biochemistry, 95(2), 351- 358.

195. Ohlsson A., & Aher S. M. (2009),"Early Erythropoietin for Preventing Red Blood Cell Transfusion in Preterm and/or Low Birth Weight Infants.", Journal of Dietary Supplements, 6, 227-251.

196. Okaiyeto K., Nwodo U., Mabinya L., & Okoh A. (2018),"A review on some medicinal plants with hepatoprotective effects", Pharmacognosy Reviews, 12(24), 186-199.

197. Okamoto A., Tanaka M., Sumi C., et al. (2016),"The antioxidant N-acetyl cysteine suppresses lidocaine-induced intracellular reactive oxygen species production and cell death in neuronal SH-SY5Y cells", BMC anesthesiology, 16(1), 104.

198. Okorie N. H., & al. e. (2019),"“Antioxidants Properties of Natural and Synthetic Chemical Compounds: Therapeutic Effects on Biological System", Acta Scientific Pharmaceutical Sciences, 3.6, 28-42.

199. Öktem F., Arslan M. K., Ozguner F., et al. (2005),"In vivo evidences suggesting the role of oxidative stress in pathogenesis of vancomycin-induced nephrotoxicity: protection by erdosteine", Toxicology, 215(3), 227-233.

200. Olinga P., & Schuppan D. (2013),"Precision-cut liver slices: a tool to model the

liver ex vivo", Journal of hepatology, 58(6), 1252-1253.

201. Omara F. O., Blakley B. R., Bernier

J., & Fournier M. (1997),"Immunomodulatory and protective effects of N-acetylcysteine in mitogen-activated murine splenocytes in vitro", Toxicology, 116(1-3), 219- 226.

202. Ortega A., Rámila D., Izquierdo A., et al. (2005),"Role of the Renin- Angiotensin System on the Parathyroid Hormone–Related Protein Overexpression Induced by Nephrotoxic Acute Renal Failure in the Rat", Journal of the American Society of Nephrology, 16(4), 939-949.

203. Osman A.-M. M., Telity S. A., Damanhouri Z. A., et

al. (2015),"Chemosensitizing and nephroprotective effect of resveratrol in cisplatin–treated animals", Cancer cell international, 15(1), 6.

204. Ou Z. L., Notiri Y., & Natori Y. (1999),"Gene expression of CC chemokines in experimental acute tubulointerstitial nephritis", J Lab Clin Med, 133, 41-47. 205. Ozbek E. (2012),"Induction of oxidative stress in kidney", International journal

of nephrology, 2012.

206. Ozougwu J. (2017),"Physiology of the liver", International Journal of Research

in Pharmacy and Biosciences, 4(8), 13-24.

207. Palani S., Kumar R., & Kumar B. (2009),"Effect of the ethanolic extract of Indigofera barberi (L.) in acute acetaminophen induced nephrotoxic rats", New Biotechnology(25), S14.

208. Palanivel M. G., Rajkapoor B., & Kumar R. S. (2008),"Hepatoprotective and antioxidant effect of Pisonia aculeata L. against CCl4-induced hepatic damage in rats", Scientia Pharmaceutica, 76, 203-206.

209. Parameswaran N., & Patial S. (2010),"Tumor necrosis factor-α signaling in

macrophages", Critical Reviews™ in Eukaryotic Gene Expression, 20(2).

210. Pareek A., Godavarthi, Issarani R., & Nagori B. P. (2013),"Antioxidant and hepatoprotective activity of Fagonia schweinfurthii (Hadidi) Hadidi extract in carbon tetrachloride induced hepatotoxicity in HepG2 cell line and rats", Journal of ethnopharmacology, 150(3), 973-981.

211. Parveen I., Gafner S., Techen N., Murch S. J., & Khan I. A. (2016),"DNA barcoding for the identification of botanicals in herbal medicine and dietary supplements: Strengths and Limitations", Planta Medica, 82(14),, 1225– 1235.

212. Pearson Education I. (2013),"Liver histology", PowerPoint® Lecture Slides prepared by Meg Flemming Austin Community College C H A P T E R 16 The Digestive System.

213. Pedruzzi L. M., Cardozo L. F., Daleprane J. B., et al. (2015),"Systemic inflammation and oxidative stress in hemodialysis patients are associated with down-regulation of Nrf2", Journal of nephrology, 28(4), 495-501.

214. Perazella M. A. (2012),"Onco-nephrology: renal toxicities of chemotherapeutic agents", Clinical Journal of the American Society of Nephrology, 7(10), 1713-1721.

215. Perše M., & Večerić-Haler Ž. (2018),"Cisplatin-induced rodent model of kidney injury: characteristics and challenges", BioMed Research International, 2018.

216. Pervin M., Unno K., Ohishi T., et al. (2018),"Beneficial effects of green tea catechins on neurodegenerative diseases", Molecules, 23(6), 1297. 217. Pessoa E. A., Convento M. B., Silva R. G., et al. (2009),"Gentamicin-induced preconditioning of proximal tubular LLC-PK1 cells stimulates nitric oxide production but not the synthesis of heat shock protein", Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 42(7), 614-620.

218. Pfaller W., & Gstraunthaler G. (1998),"Nephrotoxicity testing in vitro-what we know and what we need to know", Environ Health Perspect, 106 Suppl 2, 559-569.

219. Piano S., Rosi S., & Maresio G. (2013),"Evaluation of the Acute Kidney Injury Network criteria in hospitalized patients with cirrhosis and ascites", J Hepatol, 59, 482-489.

220. Pignatelli P., Menichelli D., Pastori D., & Violi F. (2018),"Oxidative stress and cardiovascular disease: new insights", Kardiol. Pol, 76, 713-722. 221. Polenakovic M., & Sikole A. (1996),"Is Erythropoietin a Survival Factor for Red Blood Cells?", Journal of the American Society of Nephrology, 7, 1178- 1182.

222. Prachayasittikul S., Buraparuangsang P., Worachartcheewan A., et al. (2008),"Antimicrobial and antioxidative activities of bioactive constituents from Hydnophytum formicarum Jack", Molecules, 13(4), 904-921. 223. Prachayasittikul S., Pingaew R., Yamkamon V., et al. (2012),"Chemical constituents and antioxidant activity of Hydnophytum formicarum Jack", International Journal of Pharmacology, 8(5), 440-444.

224. Prasad S. B., & Giri A. (1999),"Effect of cisplatin on the lactate dehydrogenase activity and its isozyme pattern in Dalton’s lymphoma bearing mice", Cytologia, 64, 259–267.

225. Priya V. (2010),"A review of hepatoprotective natural products", Recent

Research in Science and Technology, 2(11).

226. Radko L., & Cybulski W. (2007),"Application of silymarin in human and

animal medicine", Journal of Pre-Clinical and Clinical Research, 1(1).

227. Rady I., Mohamed H., Rady M., Siddiqui I. A., & Mukhtar H. (2018),"Cancer preventive and therapeutic effects of EGCG, the major polyphenol in green tea.", Egyptian Journal of Basic and Applied Sciences, 5(1), 1-23. 228. Rafieian-kopaei M. (2013),"Medicinal plants for renal injury prevention",

Journal of renal injury prevention, 2(2), 63.

229. Rahman I., Kode A., & Biswas S. K. (2006),"Assay for quantitative determination of glutathione and glutathione disulfide levels using enzymatic recycling method", Nature protocols, 1(6), 3159.

230. Raj V. P., Chandrasekhar R. H., Vijayan P., et al. (2010),"In vitro and in vivo hepatoprotective effects of the total alkaloid fraction of Hygrophila auriculata leaves", Indian journal of pharmacology, 42(2), 99.

231. Ramesh G., & Reeves W. B. (2002),"TNF-alpha mediates chemokine and cytokine expression and renal injury in cisplatin nephrotoxicity", The Journal of clinical investigation, 110(6), 835–842.

232. Ritesh K. R., Suganya A., Dileepkumar H. V., Rajashekar Y., & Shivanandappa T. A. (2015),"A single acute hepatotoxic dose of CCl4 causes oxidative stress in the rat brain", Toxicology reports, 2, 891–895.

233. Robin S., Sunil K., & Rana A. C. (2012),"Different models of hepatotoxicity

abs related liver diseases: a review", Int Res J Pharm, 3, 86-95.

234. Roglic G. (2016),"WHO Global report on diabetes: A summary", International

Journal of Noncommunicable Diseases, 1(1), 3.

235. Roy S. D., Das S., Shil D., & Dutta K. N. (2012),"Herbal hepatoprotective

agents: a review", World J. Pharma. Res, 1(2), 87-99.

236. Ruggiero A., Trombatore G., Triarico S., et al. (2013),"Platinum compounds in children with cancer: toxicity and clinical management", Anti-cancer drugs, 24(10), 1007-1019.

237. Ruiz S., Pergola P. E., Zager R. A., & Vaziri N. D. (2013),"Targeting the transcription factor Nrf2 to ameliorate oxidative stress and inflammation in chronic kidney disease", Kidney international, 83(6), 1029-1041. 238. Sahin K., Tuzcu M., Sahin N., Ali S., & Kucuk O. (2010),"Nrf2/HO-1 signaling pathway may be the prime target for chemoprevention of cisplatin-induced nephrotoxicity by lycopene", Food and Chemical Toxicology, 48(10), 2670– 2674.

239. Sahin K., Tuzcu M., & Gencoglu H. (2010),"Epigallocatechin-3-gallate activates Nrf2/HO-1 signaling pathway in cisplatin-induced nephrotoxicity in rats", Life Sciences, 87(7-8), 240–245.

240. Sahu B. D., Kuncha M., Sindhura G. J., & Sistla R. (2013),"Hesperidin attenuates cisplatin-induced acute renal injury by decreasing oxidative stress, inflammation and DNA damage", Phytomedicine, 20(5), 453-460. 241. Saito H. (2013),"Toxico-pharmacological perspective of the Nrf2-Keap1 defense system against oxidative stress in kidney diseases", Biochemical pharmacology, 85(7), 865-872.

242. Sakaguchi S., Takahashi S., Sasaki T., Kumagai T., & Nagata K. (2010),"Progression of alcoholic or non-alcoholic steatohepatitis; common metabolic aspects of innate immune system and oxidative stress", Drug metabolism and pharmacokinetics, 1011300126-1011300126.

243. Sakatsume M., Kadomura M., Sakata I., et al. (2001),"Novel glomerular lipoprotein deposits associated with apolipoprotein E2 homozygosity", Kidney international, 59(5), 1911-1918.

244. Sanchez-Gonzalez P. D., Lopez-Hernandez F. J., Perez-Barriocanal F., Morales A. I., & Lopez-Novoa J. M. (2011),"Quercetin reduces cisplatin nephrotoxicity in rats without compromising its anti-tumour activity", Nephrology Dialysis Transplantation, 26(11), 3484–3495.

245. Sanger S., Nicklen S., & Coulson A. R. (1977),"DNA sequencing with chain-

terminating inhibitors", Proc Natl Acad Sci U S A, 74 (12), 5463–5467.

246. Seca A., & Pinto D. (2018),"Plant secondary metabolites as anticancer agents: Successes in clinical trials and therapeutic application", International journal of molecular sciences, 19(1), 263.

247. Sekhar K. R., Rachakonda G., & Freeman M. L. (2010),"Cysteine-based regulation of the CUL3 adaptor protein Keap1", Toxicology and applied pharmacology, 244(1), 21-26.

248. Senawong T., Misuna S., Khaopha S., et al. (2013),"Histone deacetylase (HDAC) inhibitory and antiproliferative activities of phenolic-rich extracts derived from the rhizome of Hydnophytum formicarum Jack.: sinapinic acid acts as HDAC inhibitor", BMC complementary and alternative medicine, 13(1), 232.

249. Seung-Hoon S. B., Byong-kyu S., Nam J. K., Sun-Young C., & Jeong H. P. (2017),"Protective effect of ginsenosides Rk3 and Rh4 on cisplatin-induced acute kidney injury in vitro and in vivo", Journal of Ginseng Research, 41(3), 233-239.

250. Sheikh-Hamad D., Timmins K., & Jalali Z. (1997),"Cisplatin-induced renal toxicity: possible reversal by N-acetylcysteine treatment", Journal of the American Society of Nephrology, 8(10), 1640-1644.

251. Shen Z., Wang Y., Su Z., et al. (2018),"Activation of p62-keap1-Nrf2 antioxidant pathway in the early stage of acetaminophen-induced acute liver injury in mice", Chemico-biological interactions, 282, 22-28.

252. Shi G.-F., An L.-J., Jiang B., Guan S., & Bao Y.-M. (2006),"Alpinia protocatechuic acid protects against oxidative damage in vitro and reduces oxidative stress in vivo", Neuroscience Letters, 403(3), 206-210.

253. Shin S. M., Yang J. H., & Ki S. H. (2013),"Role of the Nrf2-ARE pathway in

liver diseases", Oxidative medicine and cellular longevity, 2013.

254. Shirakami Y., & Shimizu M. (2018),"Possible mechanisms of green tea and its

constituents against cancer", Molecules, 23(9), 2284.

255. Shirwaikar A., Malini S., & Kumari S. C. (2003),"Protective effect of Pongamia pinnata flowers against cisplatin and gentamicin induced nephrotoxicity in rats".

256. Shirwaikar A., Issac D., & Malini S. (2004),"Effect of Aerva lanata on cisplatin Journal of failure", acute renal

and gentamicin models of ethnopharmacology, 90(1), 81-86.

257. Shrivastava R., & Durand F. (1998). Prediction of the Benefit/Risk Ratio from in vitro data. In Korting HC, Schafer-Korting M (eds). The Benefit/Risk Ratio: A handbook for the rational use of potentially hazardous drugs (pp. 18): CRC Press LLC, Florida (Mỹ).

258. Simeonova R., Kondeva-Burdina M., Vitcheva V., & Mitcheva M. (2014),"Some in vitro/in vivo chemically-induced experimental models of liver oxidative stress in rats. ", BioMed Research International.

259. Singh A., Bhat T. K., & Sharma O. P. (2011),"Clinical Biochemistry of

Hepatotoxicity", J Clinic Toxicol, S4: 001.

260. Singh S., Thomas M. B., Singh S. P., & Bhowmik D. (2013),"Plants used in hepatoprotective remedies in traditional Indian medicine", Indian Journal of Research in Pharmacy and Biotechnology, 1(1), 58.

261. Singleton V. L., Orthofer R., & Lamuela-Raventós R. M. (1999),"Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of folin-ciocalteu reagent", Methods in enzymology, 299, 152-178.

262. Skorecki K., Green J., & Brenner B. M. (2005),"Chronic renal failure",

Harrisons Principles of Internal Medicine, 16(2), 1653.

263. Smith M. J., & Logan A. C. (2002),"Naturopathy", Med Clin North Am, 86,

173–184.

264. Sohn S.-I., Rim H.-K., Kim Y.-H., et al. (2011),"The ameliorative effect of 23- hydroxytormentic acid isolated from Rubus coreanus on cisplatin-induced nephrotoxicity in rats", Biological and Pharmaceutical Bulletin, 34(9), 1508- 1513.

265. Son Y., Cheong Y.-K., Kim N.-H., et al. (2011),"Mitogen-activated protein kinases and reactive oxygen species: how can ROS activate MAPK pathways?", Journal of signal transduction, 2011.

266. Sroka Z., & Cisowski W. (2003),"Hydrogen peroxide scavenging, antioxidant and anti-radical activity of some phenolic acids", Food and Chemical Toxicology, 41(6), 753-758.

267. Stepanenko A., & Dmitrenko V. (2015),"HEK293 in cell biology and cancer research: phenotype, karyotype, tumorigenicity, and stress-induced genome- phenotype evolution", Gene, 569(2), 182-190.

268. Su X., Li T., Liu Z., et al. (2018),"Licochalcone A activates Keap1-Nrf2 signaling to suppress arthritis via phosphorylation of p62 at serine 349", Free Radical Biology and Medicine, 115, 471-483.

269. Suckow M. A., Danneman P., Brayton C. (2001). The laboratory mouse; in:

Normative values, CRC Press Inc., USA.

270. Sundararajan R., Bharampuram A., & Koduru R. (2014),"A review on phytoconstituents for nephroprotective activity", Pharmacophore, 5(1), 160- 182.

271. Surai P. F. (2015),"Silymarin as a Natural Antioxidant: An Overview of the Current Evidence and Perspectives", Antioxidants (Basel, Switzerland), 4(1), 204–247.

272. Surekha Y., Lalit S., Rashmi S., Naveenkumar J., & Gadgoli C. H. (2010),"Studies on nephroprotective and nephrocurative activity of ethanolic extract of Picrorhiza kurroa Royle and Arogyawardhini bati in rats", International Journal of Pharmacy and Technology, 2(3), 472-489. 273. Surendran S., Eswaran M. B., Vijayakumar M., & Rao C. V. (2011),"In vitro and in vivo hepatoprotective activity of Cissampelos pareira against carbon- tetrachloride induced hepatic damage".

274. Surh Y.-J. (2008),"NF-kappa B and Nrf2 as potential chemopreventive targets of some anti-inflammatory and antioxidative phytonutrients with anti- inflammatory and antioxidative activities", Asia Pac J Clin Nutr, 17(Suppl 1), 269-272.

275. Sutariya B., & Saraf M. (2017). Effects of butein against cisplatin-induced nephrotoxicity and oxidative stress in mice. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 6(5), 1371-1375.

276. Tahrin Mahmood; Ping-Chang Yang (2012).Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal Medical Sciences 4(9): 429– 434

277. Tanaka T., Tanaka T., & Tanaka M. (2011),"Potential cancer chemopreventive activity of protocatechuic acid", Journal of Experimental & Clinical Medicine, 3(1), 27-33.

278. Thiesen L. C., Silva L. M. D., Santin J. R., et al. (2017),"Hepatoprotective effect of Maytenus robusta Reiss extract on CCl4-induced hepatotoxicity in mice and HepG2 cells.", Regul Toxicol Pharmacol., 86, 93-100.

279. Thomas P., & Smart T. G. (2005),"HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins", Journal of pharmacological and toxicological methods, 51(3), 187-200.

280. Thong-Ngam D., Samuhasaneeto S., Kulaputana O., & Klaikeaw N. (2007),"N- acetylcysteine attenuates oxidative stress and liver pathology in rats with non-alcoholic steatohepatitis", World journal of gastroenterology, 13(38), 5127–5132.

281. Tipoe G. L., Leung T. M., Liong E. C., et al. (2010),"Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) reduces liver inflammation, oxidative stress and fibrosis in carbon tetrachloride (CCl4)-induced liver injury in mice", Toxicology, 273(1-3), 45- 52.

282. Trujillo J., Chirino Y. I., Molina-Jijón E., et al. (2013),"Renoprotective effect of the antioxidant curcumin: Recent findings", Redox biology, 1(1), 448-456.

283. Tsai M.-T., Chen C.-Y., Pan Y.-H., et al. (2015),"Alleviation of carbon- tetrachloride-induced liver injury and fibrosis by betaine supplementation in chickens", Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2015. 284. Tu W., Wang H., Li S., Liu Q., & Sha H. (2019),"The Anti-Inflammatory and Anti-Oxidant Mechanisms of the Keap1/Nrf2/ARE Signaling Pathway in Chronic Diseases", Aging and disease, 10(3), 637.

285. Ueda J.-y., Tezuka Y., Banskota A. H., et al. (2002),"Antiproliferative activity of Vietnamese medicinal plants", Biological and Pharmaceutical Bulletin, 25(6), 753-760.

286. Ugur S., Ulu R., Dogukan A., et al. (2015),"The renoprotective effect of curcumin in cisplatin-induced nephrotoxicity", Renal failure, 37(2), 332-336. 287. Ugwah-Oguejiofor C. J., Okoli C. O., Ugwah M. O., et al. (2019),"Acute and sub-acute toxicity of aqueous extract of aerial parts of Caralluma dalzielii NE Brown in mice and rats", Heliyon, 5(1), e01179.

288. Valentovic M. A., Ball J. G., Brown J. M., et al. (2014),"Resveratrol attenuates cisplatin renal cortical cytotoxicity by modifying oxidative stress", Toxicology in Vitro, 28(2), 248-257.

289. Valko M., Leibfritz D., Moncol J., et al. (2007),"Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease", The international journal of biochemistry & cell biology, 39(1), 44-84.

290. Vargas-Mendoza N., Madrigal-Santillán E., Morales-González Á., et al. (2014),"Hepatoprotective effect of silymarin", World journal of hepatology, 6(3), 144.

291. Varì R., D'Archivio M., Filesi C., et al. (2011),"Protocatechuic acid induces antioxidant/detoxifying enzyme expression through JNK-mediated Nrf2 activation in murine macrophages", The Journal of nutritional biochemistry, 22(5), 409-417.

292. Varì R., Scazzocchio B., Santangelo C., et al. (2015),"Protocatechuic acid prevents oxLDL-induced apoptosis by activating JNK/Nrf2 survival signals in macrophages", Oxidative medicine and cellular longevity, 2015. 293. Veeru P., Kishor M. P., & Meenakshi M. (2009),"Screening of medicinal plants

for antioxidant activities", J Med Plant Res, 3, 608–612.

294. Venkatesan N., Punithavathi D., & Arumugam V. (2000),"Curcumin prevents adriamycin nephrotoxicity in rats", British journal of pharmacology, 129(2), 231-234.

295. Vijayan P., Prashanth H. C., Vijayaraj P., et al. (2003),"Hepatoprotective effect of the total alkaloid fraction of Solanum pseudocapsicum leaves.", Pharmaceutical biology, 41(6), 443-448.

296. Vomund S., Schäfer A., Parnham M., Brüne B., & von Knethen A. (2017),"Nrf2, the master regulator of anti-oxidative responses", International journal of molecular sciences, 18(12), 2772.

297. Wang C.-P., Wang Y., Wang X., et al. (2011),"Mulberroside a possesses potent uricosuric and nephroprotective effects in hyperuricemic mice", Planta Medica, 77(08), 786-794.

298. Wang Q., Chuikov S., Taitano S., et al. (2015),"Dimethyl fumarate protects neural stem/progenitor cells and neurons from oxidative damage through Nrf2-ERK1/2 MAPK pathway", International journal of molecular sciences, 16(6), 13885-13907.

299. Watanabe T. (2016). Physiological and Pathological Interactions Between Liver

and Kidney. In The Liver in Systemic Diseases: Springer, Tokyo.

300. WHO. (2002). Traditional Medicine: Growing Needs and Potential. WHO

Policy Perspectives on Medicines. In: World Health Organization Geneva.

301. Wong A. (2006),"The ethics of HEK 293", The national Catholic bioethics

quarterly, 6(3), 473-495.

302. Wu C. H., Chen A. Z., & Yen G. C. (2015),"Protective effects of glycyrrhizic acid and 18β-glycyrrhetinic acid against cisplatin-induced nephrotoxicity in BALB/c mice", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 63(4), 1200– 1209.

303. Wu K. C., Liu J., & Klaassen C. D. (2012),"Role of Nrf2 in preventing ethanol- induced oxidative stress and lipid accumulation", Toxicology and applied pharmacology, 262(3), 321-329.

304. Wu Y. J., Muldoon L. L., & Neuwelt E. A. (2005),"The chemoprotective agent through caspase

N-acetylcysteine blocks cisplatin-induced apoptosis signaling pathway.", J Pharmacol Exp Ther., 312, 424–431.

305. Xie Y., Nishi S., Iguchi S., et al. (2001),"Expression of osteopontin in gentamicin-induced acute tubular necrosis and its recovery process", Kidney international, 59(3), 959-974.

306. Xing J. j., Hou J. g., Ma Z. n., et al. (2019),"Ginsenoside Rb3 provides protective effects against cisplatin‐induced nephrotoxicity via regulation of AMPK‐/mTOR‐mediated autophagy and inhibition of apoptosis in vitro and in vivo", Cell proliferation, e12627.

307. Xiong F., & Guan Y.-S. (2017),"Cautiously using natural medicine to treat liver

problems", World journal of gastroenterology, 23(19), 3388.

308. Xu J. Y., Su Y. Y., Cheng J. S., et al. (2010),"Protective effects of fullerenol on carbon tetrachloride-induced acute hepatotoxicity and nephrotoxicity in rats", Carbon, 48(5), 1388-1396.

309. Yamabe N., Park J. Y., Lee S., et al. (2015),"Protective effects of protocatechuic acid against cisplatin-induced renal damage in rats", Journal of functional foods, 19, 20-27.

310. Yang C. L., Lin Y. S., Liu K. F., Peng W. H., & Hsu C. M. (2019). Hepatoprotective Mechanisms of Taxifolin on Carbon Tetrachloride-Induced Acute Liver Injury in Mice. Nutrients, 11(11), 2655.

311. Yang H., Jin X., Lam C. W. K., & Yan S.-K. (2011),"Oxidative stress and diabetes mellitus", Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 49(11), 1773-1782.

312. Yang Y. C., Lii C. K., Lin A. H., Yeh Y. W., Yao H. T. et al. (2011). Induction of glutathione synthesis and heme oxygenase 1 by the flavonoids butein and phloretin is mediated through the ERK/Nrf2 pathway and protects against oxidative stress. Free Radical Biology and Medicine, 51(11), 2073-2081.

313. Zeashan H., Amresh G., Singh S., & Rao C. V. (2009),"Hepatoprotective and antioxidant activity of Amaranthus spinosus against CCl4 induced toxicity", Journal of ethnopharmacology, 125(2), 364-366.

314. Zhang H., & Tsao R. (2016),"Dietary polyphenols, oxidative stress and antioxidant and anti-inflammatory effects", Current Opinion in Food Science, 8, 33-42.

315. Zhang L., Zhu Z., Liu Z., Zhu Z., & Hu Z. (2014),"Protective effect of N- acetylcysteine (NAC) on renal ischemia/reperfusion injury through Nrf2 signaling pathway", Journal of Receptors and Signal Transduction, 34:5, 396-400.

316. Zhang W. Y., Hu X. F., Wan N., et al. (2019),"Protective effect of the glucagon- like peptide-1 analogue liraglutide on carbon tetrachloride-induced acute liver injury in mice", Biochemical and biophysical research communications, 514(2), 386-392.

317. Zhang Y., Song M., Rui X., Pu S., Li Y., Li C. (2015), "Supplemental dietary phytosterin protects against 4-nitrophenol-induced oxidative stress and apoptosis in rat testes", Toxicol Rep, 2:664–676.

318. Zhang Y., Xu Y., & Qi Y. (2017),"Protective effects of dioscin against doxorubicin-induced nephrotoxicity via adjusting FXR-mediated oxidative stress and inflammation", Toxicology, 378, 53-64.

319. Zhou Y.-d., Hou J.-g., Yang G., et al. (2019),"Icariin ameliorates cisplatin- induced cytotoxicity in human embryonic kidney 293 cells by suppressing

ROS-mediated PI3K/Akt pathway", Biomedicine & Pharmacotherapy, 109, 2309-2317.

320. Zimmermann H. W., Seidler S., Gassler N., et al. (2011),"Interleukin-8 is activated in patients with chronic liver diseases and associated with hepatic macrophage accumulation in human liver fibrosis", Plos One, 6(6), e21381. 321. Zuckerman A. J., & Howard C. R. (2014). Hepatitis viruses of man, Academic

Press.

TRANG WEB 322. https://www.cactusjungle.com/plants/hydnophytum-formicarum/. Access on

10/01/2020.

323. http://www.era-edta.org/press/180626_Prevalence_Data_Project.pdf Access on

05 Nov 2019.

324. https://www.fda.gov/downloads/drugs/guidances/-ucm078932.pdf. Access on

20 July 2017.

325. https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0. Immunofluorescent Human

Embryonic Kidney 293 cells. Access on 19 July 2019

326. https://www.who.int/bulletin/volumes/96/6/17-206441/en/ Access on 05 Feb

2020.

327. https://www.who.int/gho/hiv/en/. Access on 09/07 2019. 328. https://alchetron.com/Hydnophytum-formicarum. Access on 02 Nov 2019. 329. http://phytoimages.siu.edu/imgs/benctan/r/Rubiaceae_Myrmecodia_tuberosa_

27292.html. Access on 02 Nov 2019.

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1. Hoạt tính chống oxy hóa của các cao toàn phần Bí kỳ nam (DPPH) ........... 1

PHỤ LỤC 2. Hoạt tính chống oxy hóa của các cao toàn phần Bí kỳ nam (MDA) ............ 2

PHỤ LỤC 3. Kiểm nghiệm độ vô khuẩn cao cồn 50% Bí kỳ nam ..................................... 3

PHỤ LỤC 4. Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) các cao phân đoạn Bí kỳ nam (DPPH) ... 4

PHỤ LỤC 5. Hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn Bí kỳ nam (MDA) ........... 5

PHỤ LỤC 6. Sắc kí đồ kiểm tra độ tinh khiết của BK1 và BK2 ........................................ 6

PHỤ LỤC 7. Phổ MS của BK1 ........................................................................................... 7

PHỤ LỤC 8. Phổ 13C- NMR của BK1 (MeOD, 125 MHz) ................................................ 8

PHỤ LỤC 9. Phổ 1H- NMR của BK1(MeOD, 500 MHz) .................................................. 9

PHỤ LỤC 10. Phổ COSY của BK1 (MeOD, 500 MHz) .................................................. 10

PHỤ LỤC 11. Phổ DEPT của BK1 (MeOD, 125 MHz) .................................................. 11

PHỤ LỤC 12. Phổ HMBC của BK1 (MeOD, máy 500 MHz) ......................................... 12

PHỤ LỤC 13. Phổ HSQC của BK1 (MeOD, máy 500 MHz) ......................................... 13

PHỤ LỤC 14. Phổ MS của BK2 ....................................................................................... 14

PHỤ LỤC 15. Phổ 13C- NMR của BK2 (MeOD, 125 MHz) ............................................ 15

PHỤ LỤC 16. Phổ 1H- NMR của BK2 (MeOD, 500 MHz) ............................................. 16

PHỤ LỤC 17. Phổ HMBC của BK2 (MeOD, máy 500 MHz) ......................................... 17

PHỤ LỤC 18. Phổ HSQC của BK2 (MeOD, máy 500 MHz) .......................................... 18

PHỤ LỤC 19. Sắc ký đồ của cao cồn 50% Bí kỳ nam (cao) và các chất BK1, BK2 ....... 19

PHỤ LỤC 20. Bảng kết quả khảo sát tác dụng của Bí kỳ nam bảo vệ tế bào gan HepG2

phòng ngừa ức chế tăng trưởng gây ra do CCl4 ................................................................ 20

PHỤ LỤC 21. Bảng kết quả khảo sát tác dụng của Bí kỳ nam bảo vệ tế bào gan HepG2

phòng ngừa tình trạng hoại tử gây ra do CCl4 ................................................................... 21

PHỤ LỤC 22. Bảng kết quả khảo sát tác dụng của Bí kỳ nam bảo vệ tế bào gan HepG2

phòng ngừa tình trạng tăng sinh gốc tự do gây ra do CCl4 ............................................... 22

PHỤ LỤC 23. Thể trọng chuột ở các lô thử nghiệm trong thử nghiệm khảo sát hoạt tính

bảo vệ gan in vivo của Bí kỳ nam ...................................................................................... 23

PHỤ LỤC 24. Hoạt tính ALT, AST trong thử nghiệm khảo sát hoạt tính bảo vệ gan ..... 25

PHỤ LỤC 25. Hàm lượng MDA, GSH, protein trong thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan in

vivo của Bí kỳ nam ............................................................................................................ 26

PHỤ LỤC 26. Đường chuẩn MDA, GSH, protein trong thử nghiệm khảo sát hoạt tính bảo

vệ gan in vivo ..................................................................................................................... 28

PHỤ LỤC 27. Nồng độ TNF-a chuẩn và độ hấp thu trong thử nghiệm khảo sát hoạt tính

bảo vệ gan in vivo trên mô hình gây độc gan chuột bằng CCl4 ........................................ 29

PHỤ LỤC 28. Nồng độ TNF-α trong thử nghiệm khảo sát hoạt tính bảo vệ gan in vivo trên

mô hình gây độc gan chuột bằng CCl4 .............................................................................. 30

PHỤ LỤC 29. Nồng độ LDH trong thử nghiệm khảo sát hoạt tính bảo vệ gan in vivo trên

mô hình gây độc gan chuột bằng CCl4 .............................................................................. 31

PHỤ LỤC 30. Kết quả phân tích mô gan trong thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan in vivo 32

PHỤ LỤC 31. Kết quả phân tích mô gan trong thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan in vivo 33

PHỤ LỤC 32. Kết quả phân tích mô gan trong thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan in vivo 34

PHỤ LỤC 33. Kết quả phân tích mô gan trong thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan in vivo 35

PHỤ LỤC 34. Kết quả phân tích mô gan trong thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan in vivo 36

PHỤ LỤC 35. Kết quả phân tích mô gan trong thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan in vivo 37

PHỤ LỤC 36. Kết quả phân tích mô gan trong thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan in vivo 38

PHỤ LỤC 37. Bảng kết quả khảo sát tác động của cisplatin sau 24 giờ tiếp xúc lên tỷ lệ

sống của tế bào thận HEK 293 khi nuôi cấy ở các mật độ khác nhau .............................. 39

PHỤ LỤC 38. Bảng kết quả khảo sát tác động của cisplatin sau 48 giờ tiếp xúc lên tỷ lệ

sống của tế bào thận HEK 293 khi nuôi cấy ở các mật độ khác nhau .............................. 40

PHỤ LỤC 39. Bảng kết quả khảo sát tác động của cisplatin sau 72 giờ tiếp xúc lên tỷ lệ

sống của tế bào thận HEK 293 khi nuôi cấy ở các mật độ khác nhau .............................. 41

PHỤ LỤC 40. Bảng kết quả khảo sát tác dụng của Bí kỳ nam bảo vệ tế bào thận HEK 293

phòng ngừa tình trạng hoại tử gây ra do cisplatin ............................................................. 42

PHỤ LỤC 41. Bảng kết quả khảo sát tác dụng của Bí kỳ nam bảo vệ tế bào thận HEK 293

phòng ngừa tình trạng stress oxy hóa gây ra do cisplatin ................................................. 43

PHỤ LỤC 42. Thể trọng chuột trong quá trình thử nghiệm hoạt tính bảo vệ thận in vivo

của Bí kỳ nam .................................................................................................................... 44

PHỤ LỤC 43. Nồng độ urea và creatinin huyết trong thử nghiệm tác động bảo vệ thận in

vivo của Bí kỳ nam ............................................................................................................ 46

PHỤ LỤC 44. Hàm lượng protein ở các lô chuột trong thử nghiệm hoạt tính bảo vệ thận in

vivo của Bí kỳ nam ............................................................................................................ 48

PHỤ LỤC 45. Nồng độ GSH trong quá trình thử nghiệm hoạt tính bảo vệ thận in vivo của

Bí kỳ nam .......................................................................................................................... 49

PHỤ LỤC 46. Độ hấp thu đường chuẩn của BSA và GSH trong quá trình thử nghiệm hoạt

tính bảo vệ thận in vivo...................................................................................................... 50

PHỤ LỤC 47. Nồng độ TNF-α trong thử nghiệm khảo sát hoạt tính bảo vệ thận in vivo trên

mô hình gây độc thận chuột bằng cisplatin ....................................................................... 51

PHỤ LỤC 48. Nồng độ LDH trong thử nghiệm khảo sát hoạt tính bảo vệ thận in vivo trên

mô hình gây độc thận chuột bằng cisplatin ....................................................................... 52

PHỤ LỤC 49. Kết quả vi thể mô thận trong khảo sát hoạt tính bảo vệ thận in vivo của Bí

kỳ nam - Lô sinh lý............................................................................................................ 53

PHỤ LỤC 50. Kết quả vi thể mô thận trong khảo sát hoạt tính bảo vệ thận in vivo của Bí

kỳ nam - Lô bệnh lý .......................................................................................................... 54

PHỤ LỤC 51. Kết quả vi thể mô thận trong khảo sát hoạt tính bảo vệ thận in vivo ........ 55

PHỤ LỤC 52. Kết quả vi thể mô thận trong khảo sát hoạt tính bảo vệ thận in vivo của Bí

kỳ nam - Lô cao cồn 50% 100 mg/kg ............................................................................... 56

PHỤ LỤC 53. Kết quả vi thể mô thận trong khảo sát hoạt tính bảo vệ thận in vivo của Bí

kỳ nam - Lô cao EtOAc 100 mg/kg .................................................................................. 57

PHỤ LỤC 54. Kết quả vi thể mô thận trong thử nghiệm khảo sát hoạt tính bảo vệ thận in

vivo - Lô catechin 10 mg/kg .............................................................................................. 58

PHỤ LỤC 55. Kết quả vi thể mô thận trong thử nghiệm khảo sát hoạt tính bảo vệ thận in

vivo - Lô acid protocatechuic 10 mg/kg ............................................................................ 59

PHỤ LỤC 56. Trọng lượng chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn ................ 60

PHỤ LỤC 57. Các chỉ số hồng cầu trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn ............. 62

PHỤ LỤC 58. Các chỉ số bạch cầu trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn .............. 64

PHỤ LỤC 59. Các chỉ số tiểu cầu trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn ............... 66

PHỤ LỤC 60. Nồng độ AST và ALT trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn .......... 68

PHỤ LỤC 61. Nồng độ urê và creatinin trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn ...... 69

PHỤ LỤC 62. Hình ảnh vi thể tế bào gan của các chuột lô sinh lý trong thử nghiệm độc

tính bán trường diễn .......................................................................................................... 70

PHỤ LỤC 63. Hình ảnh vi thể tế bào gan của các chuột lô EAHF 100 mg/kg trong thử

nghiệm độc tính bán trường diễn....................................................................................... 71

PHỤ LỤC 64. Hình ảnh vi thể tế bào gan của các chuột lô EAHF 200 mg/kg trong thử

nghiệm độc tính bán trường diễn....................................................................................... 72

PHỤ LỤC 65. Hình ảnh vi thể tế bào thận của các chuột lô sinh lý trong thử nghiệm độc

tính bán trường diễn .......................................................................................................... 73

PHỤ LỤC 66. Hình ảnh vi thể tế bào thận của các chuột lô EAHF 100 mg/kg trong thử

nghiệm độc tính bán trường diễn....................................................................................... 74

PHỤ LỤC 67. Hình ảnh vi thể tế bào thận của các chuột lô EAHF 200 mg/kg trong thử

nghiệm độc tính bán trường diễn....................................................................................... 75

PL1

PHỤ LỤC 1. Hoạt tính chống oxy hóa của các cao toàn phần Bí kỳ nam (DPPH)

10 20 30 40 50 60 70 80 Nồng độ (µg/ml) Cao nước

25 10 50 15 20 30 40 5 ODtrung bình 0,846 0,700 0,541 0,388 0,278 0,162 0,102 0,090 Nồng độ (µg/ml) Cao cồn 50%

25 10 50 15 20 30 40 5 ODtrung bình 0,651 0,629 0,589 0,531 0,393 0,265 0,097 0,078 Nồng độ (µg/ml) Cao cồn 70%

25 10 15 20 35 5 ODtrung bình 0,935 0,795 0,656 0,571 0,451 0,343 0,156 0,07 Nồng độ (µg/ml) Cao cồn 96% ODtrung bình 0,815 0,726 0,586 0,462 0,362 0,134

c d (a) cao nước; (b) cao cồn 50%; (c) cao cồn 70%; (d) cao cồn 96%

PL2

PHỤ LỤC 2. Hoạt tính chống oxy hóa của các cao toàn phần Bí kỳ nam (MDA)

50 100 400 Cao nước

80 20 10 100 500 200 0,574 0,567 0,366 0,173 0,125 40

100 10 80 20 40

100 10 20 40 80

Cao cồn 50% Cao cồn 70% Cao cồn 96% Nồng độ (µg/ml) ODtrung bình Nồng độ (µg/ml) ODtrung bình Nồng độ (µg/ml) ODtrung bình Nồng độ (µg/ml) ODtrung bình

150 60 0,624 0,594 0,588 0,542 0,446 0,372 0,218 150 60 0,612 0,586 0,531 0,466 0,417 0,352 0,21 150 60 0,641 0,613 0,517 0,487 0,324 0,291 0,18

a b

d c

(a) cao nước; (b) cao cồn 50%; (c) cao cồn 70%; (d) cao cồn 96%

PL3

PHỤ LỤC 3. Kiểm nghiệm độ vô khuẩn cao cồn 50% Bí kỳ nam

PL4

PHỤ LỤC 4. Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) các cao phân đoạn Bí kỳ nam (DPPH)

Nồng độ (µg/ml)

10

8

6

5 2,5

0,365 0,560 0,790 0,909 1,193

OD1

0,389 0,599 0,791 0,917 1,192

OD2

0,369 0,544 0,795 0,921 1,186

Cao etyl acetat

OD3

0,375 0,568 0,792 0,915 1,190

ODtrung bình

% HTCO Nồng độ (µg/ml)

80,93 64,83 46,13 35,83 12,93 20

10

15

25

30

0,264 0,429 0,645 0,906 1,174

OD1

0,266 0,424 0,708 0,900 1,124

OD2

0,292 0,421 0,699 0,877 1,144

Cao n-Butanol

OD3

0,274 0,425 0,684 0,894 1,147

OD trung bình

% HTCO

90,73 80,23 62,17 47,50 29,86

Nồng độ (µg/ml)

600

400

200

100

50

25

0,444 0,700 1,003 1,158 1,248 1,284

OD1

0,443 0,726 0,999 1,157 1,197 1,264

OD2

Cao nước

0,465 0,683 1,018 1,160 1,197 1,245

OD3

0,451 0,703 1,006 1,158 1,214 1,264

OD trung bình

% HTCO

76,27 55,77 31,1 18,77 14,23 10,13

c (a) cao EtOAc; (b) cao n-butanol; (c) cao nước

PL5

PHỤ LỤC 5. Hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn Bí kỳ nam (MDA)

[C] μg/ml 25 20 18 16 14 10 Cao etyl

acetat 0,395 0,460 0,520 0,582 0,635 0,756 OD532nm

[C] μg/ml 50 40 36 28 24 Cao n-

butanol 0,505 0,614 0,689 0,783 0,892 OD532nm

[C] μg/ml 4000 3000 2000 1500 1000 Cao nước 0,285 0,398 0,569 0,667 0,709 OD532nm

[C] μg/ml 20 16 12 6 4 Quercetin 0,346 0,418 0,487 0,650 0,696 OD532nm

a b

c (a) cao EtOAc; (b) cao n-butanol; (c) cao nước

PL6

PHỤ LỤC 6. Sắc kí đồ kiểm tra độ tinh khiết của BK1 và BK2

PL7

[M-H]-

[2M-H]-

[M+Na] +

PHỤ LỤC 7. Phổ MS của BK1

PL8

PHỤ LỤC 8. Phổ 13C- NMR của BK1 (MeOD, 125 MHz)

PL9

PHỤ LỤC 9. Phổ 1H- NMR của BK1(MeOD, 500 MHz)

PL10

PHỤ LỤC 10. Phổ COSY của BK1 (MeOD, 500 MHz)

PL11

PHỤ LỤC 11. Phổ DEPT của BK1 (MeOD, 125 MHz)

PL12

PHỤ LỤC 12. Phổ HMBC của BK1 (MeOD, máy 500 MHz)

PL13

PHỤ LỤC 13. Phổ HSQC của BK1 (MeOD, máy 500 MHz)

PL14

PHỤ LỤC 14. Phổ MS của BK2

PL15

PHỤ LỤC 15. Phổ 13C- NMR của BK2 (MeOD, 125 MHz)

PL16

PHỤ LỤC 16. Phổ 1H- NMR của BK2 (MeOD, 500 MHz)

PL17

PHỤ LỤC 17. Phổ HMBC của BK2 (MeOD, máy 500 MHz)

PL18

PHỤ LỤC 18. Phổ HSQC của BK2 (MeOD, máy 500 MHz)

PL19

PHỤ LỤC 19. Sắc ký đồ của cao cồn 50% Bí kỳ nam (cao) và các chất BK1, BK2

Cao BK1 BK2

PL20

PHỤ LỤC 20. Bảng kết quả khảo sát tác dụng của Bí kỳ nam bảo vệ tế bào gan

HepG2 phòng ngừa ức chế tăng trưởng gây ra do CCl4

Mẫu thử OD 570nm

Sinh lý 0,5157 0,5365 0,6895 0,5833 0,4985 0,7895

Chứng bệnh 0,3427 0,2609 0,4233 0,4702 0,5756 0,4903

Silymarin 100 µg/ml 0,6889 0,7169 0,6606 0,6183 0,6552 0,5926

Cao cồn 50% 100 µg/ml 0,9299 0,8901 0,6344 0,6174 0,717 0,7645

Cao cồn 50% 200 µg/ml 0,8517 0,9004 0,8069 0,5222 0,6999 0,932

Cao EtOAc 100 µg/ml 0,9329 0,6314 0,8621 0,8415 0,8608 0,7738

Cao EtOAc 200 µg/ml 0,9854 0,8300 0,8942 0,8521 0,7449 0,8077

Catechin 10 µΜ 0,8001 0,6643 0,7966 0,4725 0,6102 0,8254

Catechin 20 µΜ

0,8195 0,6125 0,8052 0,8322 0,5786 0,7812 Acid protocatechuic 10 µΜ 0,693 0,6866 0,6868 0,6797 0,6915 0,7582 Acid protocatechuic 20 µΜ 0,7218 0,6764 0,6859 0,7329 0,7784 0,729

PL21

PHỤ LỤC 21. Bảng kết quả khảo sát tác dụng của Bí kỳ nam bảo vệ tế bào gan

HepG2 phòng ngừa tình trạng hoại tử gây ra do CCl4

Mẫu thử OD 490nm

Sinh lý 0,3420 0,3325 0,3215 0,2970 0,2844 0,2745

Chứng bệnh 0,3597 0,3744 0,3542 0,4478 0,4260 0,4170

Silymarin 100 µg/ml 0,2794 0,2917 0,2972 0,2721 0,2805 0,2812

Cao cồn 50% 100 µg/ml 0,2426 0,2406 0,2422 0,2318 0,2319 0,2213

Cao cồn 50% 200 µg/ml 0,2367 0,2308 0,2347 0,2344 0,2277 0,2339

Cao EtOAc 100 µg/ml 0,2534 0,2464 0,2562 0,2666 0,2861 0,2656

Cao EtOAc 200 µg/ml 0,2418 0,2315 0,2365 0,2723 0,2589 0,2620

Catechin 10 µΜ 0,2339 0,2261 0,2239 0,2459 0,2341 0,2322

Catechin 20 µΜ

0,2397 0,2328 0,2495 0,2366 0,2266 0,2270 Acid protocatechuic 10 µΜ 0,2468 0,2449 0,2452 0,2524 0,2379 0,2395 Acid protocatechuic 20 µΜ 0,2501 0,2716 0,2454 0,2324 0,2266 0,2183

PL22

PHỤ LỤC 22. Bảng kết quả khảo sát tác dụng của Bí kỳ nam bảo vệ tế bào gan

HepG2 phòng ngừa tình trạng tăng sinh gốc tự do gây ra do CCl4

Mẫu thử Hàm lượng GSH (nM/mg protein)

Sinh lý 26,7 24,8 24,7 28,5 10,9 16,6

Chứng bệnh 11,6 12,1 13,1 8,3 9,3 17,7

Silymarin 100 µg/ml 25,2 23,1 30,8 25,8 25,0 22,7

Cao cồn 50% 100 µg/ml 20,6 53,2 20,1 27,3 22,9 26,4

Cao cồn 50% 200 µg/ml 17,0 44,1 34,7 19,6 20,4 43,7

Cao EtOAc 100 µg/ml 21,0 20,3 25,7 30,1 25,8 29,7

Cao EtOAc 200 µg/ml 22,9 18,6 29,7 27,5 18,5 22,3

Catechin 10 µΜ 18,6 21,8 19,5 25,8 23,3 25,1

Catechin 20 µΜ 18,5 31,2 31,8 38,5 19,9 23,6

Acid protocatechuic 10 µΜ 28,4 24,8 19,2 35,0 30,5 23,7

Acid protocatechuic 20 µΜ 22,7 26,7 23,0 34,4 26,9 22,5

PL23

PHỤ LỤC 23. Thể trọng chuột ở các lô thử nghiệm trong thử nghiệm khảo sát hoạt

tính bảo vệ gan in vivo của Bí kỳ nam

Sinh lý

Chứng bệnh

Silymarin 100 mg/kg

Cao cồn 50% 100 mg/kg

Cao EtOAc 100 mg/kg 3 24,5 21,5 22,9 24,1 23,7 24,0 24,3 26,6 23,7 23,4 20,7 23,0 24,9 20,5 24,7 21,0 20,8 22,2 21,2 20,9 20,0 22,9 21,5 20,1 23,9 22,4 21,0 21,9 20,8 24,2 25,5 22,3 24,1 22,0 5 26,5 23,9 25,7 24,1 26,5 28,1 26,7 30,1 25,1 26,1 23,5 25,4 26,6 22,2 26,5 23,1 22,1 24,3 24,8 24,1 22,5 23,5 24,3 22,3 24,9 25,9 26,7 24,4 23,7 27,4 27,6 26,2 25,9 24,8 STT 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 5.1 5.2 1 21,7 19,5 19,7 21,6 21,3 22,8 21,9 20,4 19,9 20,9 18,1 20,1 17,6 20,2 20,7 19,4 19,1 19,8 18,9 19,1 16,9 18,2 18,6 17,6 19,7 19,0 18,1 19,0 17,5 20,0 21,1 19,5 20,7 19,9 7 29,6 26,2 29,4 23,7 29,9 30,6 28,6 33,1 29,3 28,1 30,6 25,6 29,2 26,1 25,9 30,3 24,3 26,6 26,9 26,7 24,0 25,3 27,0 26,1 29,1 30,3 28,7 28,4 27,2 31,4 31,8 29,3 26,2 28,1 9 30,0 27,6 30,4 24,3 30,6 31,2 30,1 33,6 31,6 29,5 29,3 29,9 31,2 27,8 32,4 27,6 27,2 28,5 29,7 28,9 27,6 28,5 30,0 29,1 29,6 31,3 28,9 29,0 28,3 32,2 32,3 30,1 28,7 31,2 11 30,5 29,6 33,6 27,9 33,2 33,6 32,2 36,0 29,4 29,5 28,9 29,1 29,8 27,6 32,2 29,4 31,9 29,8 32,3 32,0 31,9 34,2 32,1 32,0 32,8 34,0 32,5 31,6 30,4 34,0 33,3 31,5 31,0 33,2 13 33,4 32,8 36,9 32,1 35,6 33,0 35,0 40,0 34,1 33,0 33,9 32,9 34,8 33,5 37,0 29,5 32,0 30,0 33,9 33,0 33,4 33,6 35,0 34,5 35,1 38,6 36,6 33,7 32,3 36,00 36,80 34,00 33,5 34,0

PL24

Cao EtOAc 25 mg/kg

Catechin 10 mg/kg

Aicd protocatechuic 10 mg/kg

27,6 29,2 28,5 27,4 30,1 26,1 28,9 29,2 27,8 30,9 29,1 25,9 27,6 31,0 30,6 29,8 29,1 26,5 28,5 26,9 27,9 26,5 28,6 26,3 27,9 29,4 28,5 30,6 29,8 30,2 28,9 32,6 30,3 30,9 31,0 28,9 31,0 31,2 29,8 31,7 31,2 27,9 29,8 32,4 31,3 32,6 29,9 29,7 29,9 29,4 30,2 28,9 31,3 29,0 29,4 32,4 31,0 32,3 31,1 33,0 31,6 30,8 31,4 32,9 33,2 30,1 32,4 34,2 32,4 34,6 34,1 29,9 31,8 32,8 33,2 32,9 33,1 31,9 32,4 34,0 32,1 30,6 32,9 31,0 29,9 31,8 33,3 34,2 25,4 34,0 33,0 32,9 33,1 33,7 34,3 32,4 34,1 34,5 33,9 35,0 36,2 32,0 33,2 34,9 34,5 33,1 33,6 32,9 31,9 35,1 33,0 32,9 32,6 33,4 33,4 34,8 32,1 36,0 34,8 36,0 26,1 26,2 25,6 24,3 26,4 23,9 27,0 25,4 24,8 27,1 25,7 24,1 24,7 26,2 27,1 26,3 25,1 23,9 24,2 27,3 25,4 22,8 24,6 23,5 23,8 24,1 23,9 25,1 26,3 25,3 23,1 24,7 21,9 22,2 24,3 21,3 22,0 23,1 21,9 22,0 24,7 22,8 20,9 21,1 23,2 22,6 24,1 22,8 21,5 23,3 21,7 23,1 22,9 22,8 21,6 20,6 19,5 21,2 23,4 20,9 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 20,4 21,0 18,5 19,2 21,2 19,4 20,0 22,0 19,2 17,5 21,0 19,9 19,0 17,5 21,1 20,0 20,5 19,2 18,4 20,2 18,1 20,6 18,6 19,9 19,4 18,4 18,7 18,7 20,6 19,8

PL25

PHỤ LỤC 24. Hoạt tính ALT, AST trong thử nghiệm khảo sát hoạt tính bảo vệ gan

in vivo của Bí kỳ nam

STT STT ALT (U/L)

Sinh lý Cao EtOAc 100 mg/kg

Cao EtOAc 25 mg/kg Chứng bệnh

Silymarin 100 mg/kg Catechin 10 mg/kg

Cao cồn 50% 100 mg/kg Acid protocatechuic 10 mg/kg

44,1 46,5 66,7 41,2 45,2 44,0 31,5 36,7 2401,0 1603,3 2861,8 947,3 941,0 2367,8 1607.0 1252,4 866,2 1948,9 385,2 1276,7 622,1 616,7 1589,7 273,8 43,6 1524,0 397,4 514,3 754,7 973,7 1324,5 750,1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 AST (U/L) 68,8 95,6 124,4 82,8 57,5 90,3 54.2 54,3 1542,9 702,7 1550,5 433,7 500,6 1324,3 878,4 678,0 605,0 698,0 184,1 556,2 190,1 231,2 656,5 112,7 64,0 413,8 146,0 153,2 340,0 407,1 669,7 251,2 AST ALT (U/L) (U/L) 5.1 696,8 175,5 5.2 984,7 1351,3 5.3 814,3 1449,6 5.4 276,1 126,9 5.5 689,0 1603,9 5.6 334,4 752,8 5.7 266,8 1257,2 5.8 367,8 581,6 6.1 806,9 1904,7 6.2 263,0 141,8 6.3 568,4 1353,6 6.4 652,5 1267,2 6.5 450,5 953,0 35,5 65,9 6.6 6.7 1316,5 1826,9 6.8 1126,7 2000,5 44,2 95,7 7.1 7.2 91,4 109,1 7.3 1208,7 2124,6 842,2 199,2 7.4 347,8 153,5 7.5 249,6 104,2 7.6 665,4 262,8 7.7 7.8 2020,2 3371,3 786,0 326,9 8.1 276,9 688,3 8.2 926,7 462,0 8.3 723,1 8.4 685,9 606,3 1068,3 8.5 560,3 284,9 8.6 887,8 354,7 8.7 648,1 448,5 8.8

PL26

PHỤ LỤC 25. Hàm lượng MDA, GSH, protein trong thử nghiệm hoạt tính bảo vệ

gan in vivo của Bí kỳ nam

STT Protein (mg/ml) GSH (nmol/ml) MDA (nmol/ml)

Sinh lý

Chứng bệnh

Silymarin 100 mg/kg

Cao cồn 50% 100 mg/kg

Cao EtOAc 100 mg/kg

1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 5.1 5.2 5.3 5.4 0,367 0,425 0,453 0,453 0,361 0,373 0,422 0,478 0,327 0,453 0,287 0,407 0,425 0,404 0,438 0,287 0,404 0,512 0,450 0,435 0,438 0,466 0,413 0,580 0,447 0,435 0,453 0,339 0,438 0,447 0,509 0,453 0,265 0,330 0,376 0,469 238,74 179,40 289,45 247,39 237,02 264,67 226,65 282,53 132,15 126,39 124,66 100,46 175,94 124,09 97,58 132,73 188,94 254,30 222,61 156,35 154,62 185,16 174,21 192,65 247,39 138,49 259,49 188,04 211,66 177,09 243,35 194,96 135,61 177,09 249,69 109,68 GSH (nmol/mg protein) 650,67 421,62 638,62 545,82 657,00 709,42 536,55 591,19 404,33 278,86 434,72 246,84 413,50 307,21 222,87 462,85 467,77 496,86 494,52 359,64 353,16 397,70 421,65 332,36 553,34 318,55 572,51 554,41 483,44 396,11 478,35 430,13 511,38 536,77 663,78 234,03 MDA (nmol/mg protein) 6,89 3,87 1,31 3,11 2,54 4,52 1,48 3,10 7,03 13,55 9,26 17,26 5,74 8,48 9,96 10,62 6,00 5,17 7,89 5,97 5,73 4,15 6,34 5,09 6,11 5,93 5,76 9,73 4,01 5,41 4,40 3,59 9,85 6,76 8,27 1,36 2,527 1,645 0,593 1,408 0,916 1,687 0,627 1,484 2,298 6,141 2,655 7,023 2,442 3,426 4,360 3,045 2,425 2,646 3,554 2,595 2,510 1,933 2,621 2,951 2,731 2,578 2,612 3,299 1,755 2,417 2,239 1,628 2,612 2,230 3,113 0,636

PL27

Cao EtOAc 25 mg/kg

Catechin 10 mg/kg

Aicd protocatechuic 10 mg/kg

0,373 0,425 0,398 0,472 0,450 0,435 0,330 0,506 0,395 0,493 0,493 0,475 0,438 0,459 0,490 0,425 0,481 0,336 0,469 0,425 0,469 0,333 0,524 0,503 0,438 0,524 0,410 0,401 5.5 5.6 5.7 5.8 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 7.1 7.2 7,3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 228,37 280,81 200,14 119,48 154,05 403,53 164,42 155,78 174,21 266,98 150,59 219,15 257,18 131,00 249,69 315,38 236,44 280,81 185,74 178,25 180,55 167,30 162,69 239,90 221,46 246,24 197,84 189,77 2,943 3,545 1,620 1,823 2,129 2,239 2,901 4,368 2,188 1,603 1,492 1,331 2,459 2,315 2,697 2,459 2,612 2,349 2,375 1,900 1,976 1,263 2,264 1,340 1,289 3,401 1,849 1,518 612,12 659,95 503,18 253,26 342,20 928,20 498,35 308,07 441,42 541,18 305,26 461,55 587,40 285,15 509,33 741,20 491,57 835,51 396,31 418,91 385,25 502,39 310,38 477,34 505,81 469,78 482,43 473,44 7,89 8,33 4,07 3,86 4,73 5,15 8,79 8,64 5,54 3,25 3,03 2,80 5,62 5,04 5,50 5,78 5,43 6,99 5,07 4,46 4,22 3,79 4,32 2,67 2,94 6,49 4,51 3,79

PL28

PHỤ LỤC 26. Đường chuẩn MDA, GSH, protein trong thử nghiệm khảo sát hoạt

tính bảo vệ gan in vivo

Đường chuẩn MDA

Nồng độ MDA (nmol/ml) 20 10 5 2,5 1,25 0,625 0,312 OD 2,361 1,282 0,641 0,286 0,169 0,117 0,082

Đường chuẩn GSH

Nồng độ GSH 9nmol/ml) 1000 800 500 200 100 50 25 12,5 6,25 3,125 OD 1,786 1,544 1,074 0,523 0,332 0,172 0,162 0,148 0,124 0,112

Đường chuẩn protein

Nồng độ protein (mg/ml) 1 0,5 0,25 0,0625 0,0312 0 OD 0,554 0,362 0,301 0,239 0,232 0,236

PL29

PHỤ LỤC 27. Nồng độ TNF-a chuẩn và độ hấp thu trong thử nghiệm khảo sát hoạt

tính bảo vệ gan in vivo trên mô hình gây độc gan chuột bằng CCl4

Nồng độ TNF-a Độ hấp thu

0,062 0

0,098 23,44

0,137 46,88

0,280 93,75

0,323 187,5

0,510 375

0,931 750

1,762 1500

2,958 3000

PL30

PHỤ LỤC 28. Nồng độ TNF-α trong thử nghiệm khảo sát hoạt tính bảo vệ gan in

vivo trên mô hình gây độc gan chuột bằng CCl4

Lô TNF-α (pg/ml) Lô TNF-α (pg/ml)

Cao EtOAc Sinh lý 100 mg/kg

Catechin Chứng bệnh 10 mg/kg

Acid Silymarin protocatechuic 100 mg/kg 10 mg/kg

373,9 643,9 455,7 285,7 828,5 681,2 213,0 347,5 383,0 384,8 603,9 529,4 473,9 438,5 355,7 387,5 380,3 892,1

Cao cồn 50%

100 mg/kg

278,5 139,4 161,2 117,5 108,5 380,3 1132,1 1083,0 1053,0 1147,5 1014,8 810,3 330,3 520,3 305,7 338,5 742,1 384,8 203,0 485,7 396,6 334,8 494,8 437,5

PL31

PHỤ LỤC 29. Nồng độ LDH trong thử nghiệm khảo sát hoạt tính bảo vệ gan in

vivo trên mô hình gây độc gan chuột bằng CCl4

Lô Lô

Sinh lý Cao EtOAc 100 mg/kg

Chứng bệnh Cao EtOAc 25 mg/kg

Silymarin 100 mg/kg Catechin 10 mg/kg

Cao cồn 50% 100 mg/kg Acid protocatechuic 10 mg/kg

LDH (U/L) 295.1 296.21 376.5 240.15 285.92 187.66 125.63 139.44 1890.32 1241.35 972.11 1143.66 1082.8 857.75 1260.21 1458.16 592.640 442.74 564.75 210.68 889.56 771.35 737.38 664.13 641.9 737.2 295.12 541.45 1035.66 822.93 690.44 368.9 LDH (U/L) 1669.67 556.55 1271.25 590.68 643.97 566.24 748.75 886.25 1216.44 1344.83 566.72 1301.2 941.07 1191.47 850.08 912.33 1554.43 948.14 574.18 885.91 1117.86 1388.62 1185.45 925.75 626.39 1241.35 731.49 932.46 1056.62 952.31 921.16 1097.22

PL32

PHỤ LỤC 30. Kết quả phân tích mô gan trong thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan in vivo Lô sinh lý

Chuột 1: mô gan bình thường Chuột 2: Mô gan bình thường

Chuột 3: Mô gan bình thường Chuột 4: Mô gan bình thường

Chuột 5: mô gan bình thường Chuột 6: Mô gan bình thường

PL33

PHỤ LỤC 31. Kết quả phân tích mô gan trong thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan in vivo Lô chứng bệnh

Chuột 2: viêm, hoại tử tiểu thùy Chuột 1: viêm, hoại tử tiểu thùy

Chuột 3: viêm quanh khoảng cửa Chuột 4: Viêm, hoại tử tiểu thùy

Chuột 6: viêm, hoại tử tiểu thùy Chuột 5: viêm, hoại tử tiểu thùy

PL34

PHỤ LỤC 32. Kết quả phân tích mô gan trong thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan in vivo Lô Silymarin 100 mg/kg

Chuột 1: viêm quanh khoảng cửa Chuột 2: mô gan bình thường

Chuột 4: mô gan bình thường Chuộ 3: mô gan bình thường

Chuột 5: Viêm quanh khoảng cửa Chuột 6: Mô gan bình thường

PL35

PHỤ LỤC 33. Kết quả phân tích mô gan trong thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan in vivo Lô cao cồn 50% 100 mg/kg

Chuột 1: Mô gan bình thường Chuột 2: Mô gan bình thường

Chuột 3: Mô gan bình thường Chuột 4: Mô gan bình thường

Chuột 5: viêm quanh khoảng cửa Chuột 6: Viêm quanh khoảng cửa

PL36

PHỤ LỤC 34. Kết quả phân tích mô gan trong thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan in vivo Lô cao EtOAc 100 mg/kg

Chuột 1: Viêm quanh khoảng cửa Chuột 2: Mô gan bình thường

Chuột 3: Viêm quanh khoảng cửa Chuột 4: Mô gan bình thường

Chuột 6: Mô gan bình thường Chuột 6 Mô gan bình thường

PL37

PHỤ LỤC 35. Kết quả phân tích mô gan trong thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan in vivo Lô catechin 10 mg/kg

Chuột 1: viêm TM trung tâm Chuột 2: viêm quanh khoảng cửa

Chuột 4: mô gan bình thường Chuột 3: mô gan bình thường

Chuột 6: mô gan bình thường Chuột 5: Mô gan bình thường

PL38

PHỤ LỤC 36. Kết quả phân tích mô gan trong thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan in vivo Lô protocatechuic 10 mg/kg

Chuột 2: Mô gan bình thường Chuột 1: Mô gan bình thường

Chuột 4: viêm quanh khoảng cửa Chuột 3: mô gan bình thường

Chuột 6: mô gan bình thường Chuột 5: mô gan bình thường

PL39

PHỤ LỤC 37. Bảng kết quả khảo sát tác động của cisplatin sau 24 giờ tiếp xúc lên

tỷ lệ sống của tế bào thận HEK 293 khi nuôi cấy ở các mật độ khác nhau

24 giờ

Mật độ tế bào Nồng độ cisplatin OD 540nm

0,194 0,2195 0,1288 0,2371 0 µM

0,1519 0,1589 0,1102 0,1842 12,5 µM

0,1582 0,1447 0,1104 0,187 25 µM 0,5 x 105 tế bào/ml 0,1303 0,1289 0,1184 0,1101 50 µM

0,1565 0,1158 0,1213 0,1615 100 µM

0,404 0,354 0,473 0,448 0 µM

0,296 0,386 0,300 0,319 12,5 µM

0,241 0,211 0,260 0,266 25 µM 1 x 105 tế bào/ml 0,140 0,104 0,227 0,273 50 µM

0,200 0,169 0,227 0,234 100 µM

0,8575 0,9113 0,8333 0,731 0 µM

0,5124 0,7663 0,6074 0,5809 12,5 µM

0,4202 0,5201 0,2445 0,4101 25 µM 2 x 105 tế bào/ml 0,378 0,431 0,277 0,281 50 µM

0,279 0,390 0,243 0,255 100 µM

PL40

PHỤ LỤC 38. Bảng kết quả khảo sát tác động của cisplatin sau 48 giờ tiếp xúc lên

tỷ lệ sống của tế bào thận HEK 293 khi nuôi cấy ở các mật độ khác nhau

48 giờ

Mật độ tế bào Nồng độ cisplatin OD 540nm

0,5436 0,3843 0,5401 0,5832 0 µM

0,172 0,1379 0,1991 0,2024 12,5 µM

0,1776 0,1836 0,1839 0,212 25 µM 0,5 x 105 tế bào/ml 0,1045 0,0978 0,1395 0,1204 50 µM

0,1606 0,1365 0,1319 0,1559 100 µM

1,3731 1,4127 1,5044 1,4126 0 µM

0,5324 0,6656 0,4817 0,5468 12,5 µM

0,3277 0,5606 0,2695 0,3953 25 µM 1 x 105 tế bào/ml 0,1975 0,2454 0,2427 0,3283 50 µM

0,309 0,3074 0,259 1,1986 100 µM

1,8349 2,2864 2,4819 2,4204 0 µM

0,9831 0,9759 0,9405 1,1564 12,5 µM

0,8566 0,7444 0,8847 0,8831 25 µM 2 x 105 tế bào/ml 0,7342 0,7479 1,0847 1,0027 50 µM

0,6732 0,8246 0,9616 0,6533 100 µM

PL41

PHỤ LỤC 39. Bảng kết quả khảo sát tác động của cisplatin sau 72 giờ tiếp xúc lên

tỷ lệ sống của tế bào thận HEK 293 khi nuôi cấy ở các mật độ khác nhau

72 giờ

Mật độ tế bào Nồng độ cisplatin OD 540nm

0,3221 0,5547 0,7002 0,7442 0 µM

0,1359 0,1593 0,1804 0,1109 12,5 µM

0,0854 0,122 0,0744 0,1063 25 µM 0,5 x 105 tế bào/ml 0,0738 0,0635 0,0633 0,6922 50 µM

0,0882 0,0712 0,0766 0,0893 100 µM

1,6313 1,4196 1,7703 1,6417 0 µM

0,4164 0,3062 0,2613 0,2127 12,5 µM

0,1564 0,0856 0,1048 0,0697 25 µM 1 x 105 tế bào/ml 0,1653 0,1998 0,1214 0,0845 50 µM

0,1497 0,1371 0,1273 0,0898 100 µM

2,3904 1,8195 1,4592 1,7327 0 µM

0,6985 0,6186 0,4802 0,3157 12,5 µM

0,1242 0,1175 0,2218 0,1067 25 µM 2 x 105 tế bào/ml 0,2289 0,232 0,1359 0,1416 50 µM

0,3356 0,2691 0,5607 0,1995 100 µM

PL42

PHỤ LỤC 40. Bảng kết quả khảo sát tác dụng của Bí kỳ nam bảo vệ tế bào thận

HEK 293 phòng ngừa tình trạng hoại tử gây ra do cisplatin

Mẫu thử OD 490nm

Sinh lý 0,6907 0,6887 0,7065 0,701 0,7712 0,7158

Bệnh lý (cisplatin) 0,8771 0,8347 0,8304 0,8451 0,8318 0,8697

NAC 0,6058 0,6428 0,6327 0,6271 0,6381 0,6415

Cao cồn 50% 100 µg/ml 0,7158 0,7286 0,7863 0,7253 0,8067 0,7327

Cao cồn 50% 200 µg/ml 0,7821 0,7813 0,7282 0,7308 0,7787 0,728

Cao EtOAc 100 µg/ml 0,6974 0,7587 0,7223 0,8689 0,777 0,7685

Cao EtOAc 200 µg/ml 0,7611 0,831 0,794 0,7174 0,7078 0,7119

Catechin 10 µΜ 0,8078 0,8138 0,8278 0,8045 0,8627 0,8097

Catechin 20 µΜ

0,7916 0,8027 0,8505 0,7974 0,7677 0,8056 Acid protocatechuic 10 µΜ 0,6777 0,7143 0,7371 0,7929 0,758 0,7192 Acid protocatechuic 20 µΜ 0,7178 0,7739 0,7794 0,7257 0,7242 0,7129

PL43

PHỤ LỤC 41. Bảng kết quả khảo sát tác dụng của Bí kỳ nam bảo vệ tế bào thận

HEK 293 phòng ngừa tình trạng stress oxy hóa gây ra do cisplatin

Mẫu thử OD 405nm

Sinh lý 0,1611 0,1602 0,1497 0,1599 0,1456 0,1645

Bệnh lý (cisplatin) 0,1107 0,1343 0,1202 0,1107 0,1162 0,1175

NAC 0,1214 0,1341 0,1729 0,147 0,1451 0,1596

Cao cồn 50% 100 µg/ml 0,1389 0,1296 0,1476 0,1504 0,1467 0,1488

Cao cồn 50% 200 µg/ml 0,1525 0,1483 0,1278 0,1205 0,1521 0,161

Cao EtOAc 100 µg/ml 0,1423 0,1257 0,1267 0,1263 0,1325 0,1255

Cao EtOAc 200 µg/ml 0,1421 0,1444 0,1244 0,1316 0,1241 0,1264

Catechin 10 µΜ 0,1215 0,1369 0,1519 0,1424 0,1207 0,1237

Catechin 20 µΜ

0,1215 0,1369 0,1519 0,1324 0,1207 0,1237 Acid protocatechuic 10 µΜ 0,1208 0,1299 0,1236 0,1276 0,1287 0,1392 Acid protocatechuic 20 µΜ 0,1247 0,1265 0,1322 0,1253 0,1247 0,1426

PL44

PHỤ LỤC 42. Thể trọng chuột trong quá trình thử nghiệm hoạt tính bảo vệ thận in

vivo của Bí kỳ nam

Lô

Sinh lý

Chứng bệnh

NAC 100 mg/kg

Cao cồn 50% 100 mg/kg

N7 30,9 36,4 31,5 24,9 37,3 32,8 33,6 35,7 23,8 35,6 35,6 33,6 32,8 33,5 34,6 33,3 32,6 37,2 33,6 36,4 30,8 26,6 30,9 34,4 32,0 31,2 33,3 33,1 35,4 38,7 32,4 34,0 36,7 35,8 29,9 35,7 38,6 32,4 31,7 33,3

N5 29,7 33,8 30,6 25,0 35,9 32,3 31,6 34,0 26,4 33,7 35,4 32,7 31,6 32,7 33,8 32,2 33,7 36,6 32,6 34,0 29,1 25,9 30,0 32,5 29,0 30,9 32,4 31,7 33,6 36,9 31,3 33,0 34,6 34,3 28,4 34,2 37,6 30,8 31,0 32,2

N1 24,0 30,1 27,0 24,5 27,8 27,2 27,9 29,0 24,8 28,5 29,0 26,6 26,0 28,1 28,6 28,2 32,5 29,7 25,9 29,7 22,1 19,5 23,5 24,0 20,5 23,2 24,7 22,0 24,5 28,6 25,6 26,6 28,2 27,8 22,6 26,7 30,5 24,3 25,5 24,0

N3 28,0 33,9 30 26,6 32,9 30,6 30,9 31,8 26,2 31,8 33,6 30,5 30,8 32,3 32,9 31,0 33,9 36,2 30,6 33,5 27,6 24,7 29,3 31,1 27,7 30,7 31,6 31,0 31,6 34,8 31,2 32,0 33,6 34,0 26,8 34,3 35,7 30,0 29,7 30,5

N9 32,0 37,5 31,1 24,5 37,9 33,5 34,3 37,7 22,3 36,0 36,5 34,2 33,5 33,8 35,4 34,7 31,8 37,8 34,8 37,2 30,5 27,1 31,1 35,5 33,1 31,8 33,9 32,6 35,7 40,2 32,8 34,5 37,4 36,7 30,2 35,8 40,9 32,9 33,2 33,4

N11 33,0 38,3 30,1 25,1 38,4 34,4 35,2 38,2 22,0 36,6 38,0 35,6 34,5 35,1 36,1 36,4 29,6 38,5 36,6 38,3 32,4 27,1 32,8 36,2 34,7 33,0 35,3 33,3 37,2 40,9 34,6 35,2 39,8 38,0 31,3 36,8 42,0 34,0 33,4 34,3

N12 34,1 40,0 29,6 25,0 39,5 35,7 36,3 40,3 22,6 37,7 36,6 33,8 33,7 34,5 35,3 35,0 28,5 37,4 35,2 37,1 30,7 25,6 31,2 37,0 33,3 30,6 34,2 31,7 36,2 39,5 31,9 34,1 37,7 36,3 29,1 36,2 40,8 34,0 32,8 33,6

N13 34,9 41,4 28,9 25,7 40,8 37,0 36,9 41,4 22,6 38,8 34,4 31,2 31,5 32,3 31,8 32,7 25,9 34,2 32,5 34,4 27,8 23,4 29,3 37,0 30,8 27,9 30,7 29,3 33,9 38,8 30,0 31,3 35,0 33,0 27,1 33,0 38,1 31,0 31,1 31,5

PL45

Cao EtOAc 100 mg/kg

Cao EtOAc 25 mg/kg

CA 10 mg/kg

AP 10 mg/kg

38,3 30,6 34,3 33,4 33,5 22,0 38,0 29,0 31,7 28,8 33,8 35,0 35,2 30,1 34,6 29,6 31,9 35,3 29,7 28,4 39,3 30,9 32,5 34,3 28,9 37,5 36,4 35,2 39,0 32,1 36,3 28,1 32,5 33,1 32,3 35,8 24,6 31,1 35,5 34,3

35,6 29,5 33,3 31,5 33,3 29,0 35,6 27,7 31,0 28,4 33,9 33,5 33,7 29,4 33,5 29,4 32,9 35,4 29,3 27,4 37,0 30,0 29,8 31,4 31,1 36,1 34,9 34,2 37,4 31,1 35,8 27,4 31,1 32,4 30,7 34,0 26,6 30,1 34,5 32,7

29,0 23,0 28,2 25,7 29,3 26,2 26,5 23,0 23,8 24,7 28,9 27,6 25,0 24,6 29,2 25,9 26,9 30,5 25,4 21,8 29,5 24,5 23,3 25,0 25,5 28,0 28,3 27,9 29,7 25,5 28,7 28,5 23,8 26,0 23,5 28,0 22,0 23,9 26,0 25,0

33,7 28,2 33,0 31,0 34,0 31,9 32,9 27,4 30,5 30,8 32,4 31,7 30,3 27,4 31,8 28,6 30,4 33,0 28,5 25,2 37,0 29,0 27,7 31,0 31,8 34,6 33,9 34,7 36,8 30,6 34,4 29,2 31,4 32,3 29,3 33,7 28,0 30,2 31,3 31,9

38,8 31,3 34,8 32,7 32,4 23,5 38,7 29,7 32,0 27,1 34,3 35,0 35,5 30,3 33,9 30,0 32,0 35,8 30,2 27,5 39,4 32,2 33,5 33,6 28,3 37,6 37,2 35,6 40,3 32,4 36,9 30,0 32,4 34,3 33,2 36,0 26,3 31,8 36,0 34,2

40,1 32,3 35,7 32,9 31,6 26,0 40,8 28,8 33,0 27,7 35,0 35,9 36,4 31,5 35,9 29,3 32,3 35,9 30,6 29,6 41,2 33,4 34,6 34,3 30,0 38,8 39,1 35,6 41,6 33,0 38,0 32,9 34,8 34,7 34,0 36,9 29,0 32,7 37,0 35,4

37,8 33,2 31,6 28,8 27,1 25,9 37,2 26,6 27,8 24,2 30,4 33,1 30,9 28,0 33,0 26,2 27,8 32,6 26,0 26,7 35,2 29,8 29,9 36,5 25,9 32,9 32,8 30,3 36,4 29,8 34,5 29,9 31,3 32,8 29,4 31,7 23,6 29,0 33,3 32,2

40,6 32,0 35,2 31,7 28,8 25,6 40,7 27,8 31,0 26,2 32,4 35,2 33,4 30,5 35,0 27,8 30,1 35,5 28,4 29,7 38,4 31,8 32,7 35,7 28,9 35,0 36,8 32,0 40,2 32,2 36,4 31,6 33,8 35,0 32,0 34,8 27,5 31,5 36,6 34,6

PL46

PHỤ LỤC 43. Nồng độ urea và creatinin huyết trong thử nghiệm tác động bảo vệ

thận in vivo của Bí kỳ nam

Lô Lô

Sinh lý Cao EtOAc 100 mg/kg

Chứng bệnh Cao EtOAc 25 mg/kg

NAC 100 mg/kg CA 10 mg/kg

AP 10 mg/kg Cao cồn 50% 100 mg/kg

Urea (mg/dL) 51,30 54,60 49,10 44,10 65,30 67,20 65,60 55,70 84,30 66,00 251,40 204,00 219,20 269,10 310,70 492,90 547,40 133,70 110,00 66,30 58,40 49,70 54,80 43,10 76,30 74,10 94,50 67,10 51,80 53,30 116,10 41,40 88,40 69,40 69,30 57,80 82,70 Creatinine (µmol/L) 0,07 0,08 0,09 0,12 0,09 0,11 0,09 0,11 0,14 0,13 0,51 0,60 0,47 0,62 0,67 1,71 2,82 0,26 0,19 0,16 0,14 0,10 0,13 0,09 0,12 0,19 0,16 0,17 0,12 0,14 0,16 0,14 0,17 0,16 0,17 0,15 0,18 Urea (mg/dL) 90,20 45,00 109,60 39,60 73,40 51,40 86,00 37,90 82,90 96,00 72,20 90,30 81,40 77,10 81,80 159,90 112,90 96,50 64,90 60,80 54,30 51,90 71,30 40,80 143,90 136,20 73,20 127,10 81,00 181,60 54,20 73,50 56,80 141,40 118,60 126,70 61,50 Creatinine (µmol/L) 0,14 0,08 0,29 0,12 0,18 0,11 0,17 0,15 0,21 0,14 0,17 0,21 0,17 0,13 0,16 0,30 0,31 0,17 0,15 0,09 0,13 0,17 0,12 0,08 0,35 0,32 0,17 0,19 0,16 0,31 0,11 0,14 0,16 0,24 0,25 0,40 0,17

PL47

143,20 103,40 48,40 0,31 0,18 0,12 59,60 75,50 82,60 0,15 0,15 0,22

PL48

PHỤ LỤC 44. Hàm lượng protein ở các lô chuột trong thử nghiệm hoạt tính bảo vệ

thận in vivo của Bí kỳ nam

Lô Lô Lô

Sinh lý CA 10 mg/kg Cao cồn 50% 100 mg/kg

Chứng bệnh Cao EtOAc 100 mg/kg AP 10 mg/kg

Protein (mg/ml) 1,18 1,26 1,05 0,92 0,84 1,10 1,04 0,96 1,02 0,72 1,04 1,09 1,07 1,14 1,15 1,21 1,06 1,14 1,25 0,99

NAC 100 mg/kg Cao EtOAc 25 mg/kg

Protein (mg/ml) 1,11 0,77 1,22 0,99 0,87 1,25 0,99 0,85 0,91 0,93 1,03 1,14 1,13 1,33 0,92 0,75 1,14 0,90 0,64 0,94 1,33 0,81 1,21 1,29 1,27 1,14 1,05 1,21 1,15 0,95 Protein (mg/ml) 1,26 1,18 1,13 1,11 1,07 1,21 1,29 1,28 0,91 1,28 1,07 1,16 1,09 0,96 1,14 1,03 1,12 0,92 1,04 1,06 1,15 1,30 1,26 1,29 1,24 0,88 0,99 1,10 1,19 0,66

PL49

PHỤ LỤC 45. Nồng độ GSH trong quá trình thử nghiệm hoạt tính bảo vệ thận in

vivo của Bí kỳ nam

Lô Lô Lô

Sinh lý CA 10 mg/kg Cao cồn 50% 100 mg/kg

Chứng bệnh Cao EtOAc 100 mg/kg AP 10 mg/kg

GSH (nmol/mg protein) 146,28 192,09 90,77 100,60 93,69 98,61 131,76 124,19 147,53 134,84 124,26 86,21 111,74 131,90 65,00 56,67 93,22 171,35 110,26 95,63

NAC 100 mg/kg Cao EtOAc 25 mg/kg

GSH (nmol/mg protein) 142,67 141,91 127,48 146,84 187,80 109,26 130,94 145,14 144,84 156,30 115,78 102,71 45,87 87,26 148,73 89,11 137,23 143,78 97,85 65,49 175,75 117,72 155,88 148,10 109,06 102,92 98,18 136,31 129,84 75,22 GSH (nmol/mg protein) 106,18 131,86 130,46 108,68 128,64 128,53 102,24 101,88 156,95 119,24 96,11 61,73 90,72 63,93 46,10 29,61 41,88 117,98 124,62 101,11 175,05 90,39 129,66 92,83 103,98 155,95 163,79 108,38 107,13 164,74

PL50

PHỤ LỤC 46. Độ hấp thu đường chuẩn của BSA và GSH trong quá trình thử

nghiệm hoạt tính bảo vệ thận in vivo

OD OD

Nồng độ GSH (nmol/ml) 200 100 50 12,5 6,25 3,125 0,502 0,308 0,222 0,161 0,141 0,110

Nồng độ BSA (mg/ml) 2 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 0,0312 0 0,532 0,36 0,274 0,241 0,202 0,194 0,185 0,195

PL51

PHỤ LỤC 47. Nồng độ TNF-α trong thử nghiệm khảo sát hoạt tính bảo vệ thận

in vivo trên mô hình gây độc thận chuột bằng cisplatin

Lô Lô Lô

Sinh lý Catechin 10 mg/kg Cao cồn 50% 100 mg/kg

Chứng bệnh Cao EtOAc 100 mg/kg Acid protocatechuic 10 mg/kg

TNF-α (pg/ml) 219,4 185,4 137,4 122,4 279,4 230,4 542,4 230,4 503,4 173,4 388,4 699,4 TNF-α (pg/ml) 158,4 148,4 200,4 521,4 298,4 209,4 264,4 536,4 415,4 258,4 210,4 430,4

NAC 100 mg/kg

TNF-α (pg/ml) 182,5 118,5 214,5 80,5 153,5 296,5 838,4 800,4 1194,4 1009,4 1230,4 697,4 130,4 388,4 502,4 245,4 307,4 200,4

PL52

PHỤ LỤC 48. Nồng độ LDH trong thử nghiệm khảo sát hoạt tính bảo vệ thận

in vivo trên mô hình gây độc thận chuột bằng cisplatin

Lô

Sinh lý

Cao cồn 50% 100 mg/kg

Catechin 10 mg/kg

Chứng bệnh

Cao EtOAc 100 mg/kg

Acid protocatechuic 10 mg/kg

LDH (U/L) 273,9 205,7 268,9 156,5 222,6 345,0 473,2 357,4 272,9 302,7 349,1 390,9 248,3 378,1 447,1 244,0 474,1 443,5 357,3 386,4

NAC 100 mg/kg

Cao EtOAc 25 mg/kg

LDH (U/L) 146,2 194,7 89,9 209,8 235,8 257,2 359,7 439,9 295,1 240,3 185,5 297,9 273,9 204,7 349,8 297,9 302,3 228,3 480,5 378,3 243,8 315,4 279,6 419,5 303,9 219,9 525,7 361,8 506,4 339,6

LDH (U/L) 139,5 237,2 109,9 221,6 157,3 146,7 169,9 108,4 171,2 179,8 754,3 389,4 525,7 406,4 492,4 538,5 456,5 501,7 525,3 563,7 180,7 56,6 185,5 290,1 214,3 242,7 296,7 166,3 258,9 393,1

PL53

PHỤ LỤC 49. Kết quả vi thể mô thận trong khảo sát hoạt tính bảo vệ thận in vivo của Bí kỳ nam - Lô sinh lý

Chuột 1: Mô thận bình thường Chuột 2: Mô thận bình thường

Chuột 3: Mô thận bình thường Chuột 4: Mô thận bình thường

Chuột 5: Mô thận bình thường Chuột 6: Mô thận bình thường

PL54

PHỤ LỤC 50. Kết quả vi thể mô thận trong khảo sát hoạt tính bảo vệ thận in vivo của Bí kỳ nam - Lô bệnh lý

Chuột 1: Hoại tử, dãn ống thận Chuột 2: Hoại tử, dãn ống thận

Chuột 3: Hoại tử, dãn ống thận Chuột 4: Hoại tử, dãn ống thận

Chuột 5: Hoại tử, dãn ống thận Chuột 6: Hoại tử, dãn ống thận

PL55

PHỤ LỤC 51. Kết quả vi thể mô thận trong khảo sát hoạt tính bảo vệ thận in vivo của Bí kỳ nam - Lô chứng dương NAC 100 mg/kg

Chuột 1: Mô thận bình thường Chuột 2: Mô thận bình thường

Chuột 3: Mô thận bình thường Chuột 4: Mô thận bình thường

Chuột 5: Mô thận bình thường Chuột 6: Mô thận bình thường

PL56

PHỤ LỤC 52. Kết quả vi thể mô thận trong khảo sát hoạt tính bảo vệ thận in vivo của Bí kỳ nam - Lô cao cồn 50% 100 mg/kg

Chuột 1: Mô thận bình thường Chuột 2: Mô thận bình thường

Chuột 3: Mô thận bình thường Chuột 4: Mô thận bình thường

Chuột 5: Mô thận bình thường Chuột 6: Mô thận bình thường

PL57

PHỤ LỤC 53. Kết quả vi thể mô thận trong khảo sát hoạt tính bảo vệ thận in vivo của Bí kỳ nam - Lô cao EtOAc 100 mg/kg

Chuột 1: Mô thận bình thường Chuột 2: Mô thận bình thường

Chuột 3: Mô thận bình thường Chuột 4: Mô thận bình thường

Chuột 5: Mô thận bình thường Chuột 6: Mô thận bình thường

PL58

PHỤ LỤC 54. Kết quả vi thể mô thận trong thử nghiệm khảo sát hoạt tính bảo vệ

thận in vivo - Lô catechin 10 mg/kg

Chuột 1: Mô thận bình thường Chuột 2: Mô thận bình thường

Chuột 3: Mô thận bình thường Chuột 4: Mô thận bình thường

Chuột 5: Mô thận bình thường Chuột 6: Mô thận bình thường

PL59

PHỤ LỤC 55. Kết quả vi thể mô thận trong thử nghiệm khảo sát hoạt tính bảo vệ

thận in vivo - Lô acid protocatechuic 10 mg/kg

Chuột 1: Mô thận bình thường Chuột 2: Mô thận bình thường

Chuột 3: Mô thận bình thường Chuột 4: Mô thận bình thường

Chuột 5: Mô thận bình thường Chuột 6: Mô thận bình thường

PL60

PHỤ LỤC 56. Trọng lượng chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn

của Bí kỳ nam

Lô Chuột Ngày 1 Ngày 8 Ngày 15 Ngày 22 Ngày 30 Ngày 38 Ngày 45 Ngày 52 Ngày 60

ý l h n i S

37,2 39,2 45,2 41,6 35,7 40,1 38,9 40,0 45,7 43,0 37,5 42,3 36,5 39,2 44,0 41,5 35,5 39,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 37,9 40,8 36,5 36,5 31,0 33,4 34,2 43,7 33,8 36,2 41,3 38,5 30,9 34,9 33,0 31,0 33,7 31,1 34,6 30,0 32,4 31,3 30,5 30,0 33,5 32,5 31,5 32,8 40,0 43,5 37,0 39,4 32,4 35,9 36,9 43,8 35,4 38,5 43,9 40,2 32,0 38,3 34,2 36,1 33,1 34,6 32,1 32,9 35,4 38,2 32,7 33,8 37,5 36,3 33,8 34,6

1,28 1,37 1,23

g k / g m 0 0 1 F H A E

38,9 41,8 39,6 39,4 31,2 35,6 36,0 44,4 38,9 34,4 41,3 37,5 46,0 42,0 44,5 39,8 38,0 31,2 42,1 36,8 Trung bình 31,99 34,66 36,39 37,76 38,37 39,37 39,83 41,23 41,80 1,04 1,27 42,0 42,0 32,7 40,2 30,1 37,8 37,8 35,6 43,9 39,5 33,4 40,4 33,2 38,8 34,1 35,7 SEM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 0,49 38,1 36,5 24,9 37,3 34,9 37,1 32,6 31,9 36,1 36,3 33,3 34,0 29,3 34,3 32,4 31,7 1,02 41,7 44,7 35,3 41,4 30,5 35,2 38,8 37,2 44,7 42,1 33,4 40,6 34,3 39,3 34,9 34,9 0,38 33,0 32,5 30,6 33,1 32,9 33,9 32,4 30,8 31,0 34,3 30,3 29,4 30,4 34,7 30,6 30,1 1,01 41,8 40,4 30,5 39,3 29,2 36,0 35,6 35,0 41,4 38,9 35,0 37,3 30,1 37,5 34,3 34,7 44,3 44,4 35,1 41,5 35,1 40,2 36,7 38,9 44,7 43,7 34,2 40,9 35,1 40,1 35,4 36,7 45,3 46,2 37,4 42,1 36,8 41,4 42,4 38,5 44,6 45,6 36,5 42,0 35,7 40,0 38,9 39,0

PL61

1,44 1,33 1,26

g k / g m 0 0 2 F H A E

Trung bình 31,87 33,79 36,06 37,32 38,06 39,16 39,61 40,47 41,66 1,23 0,99 41,0 37,8 34,0 32,7 35,8 39,3 33,0 35,0 40,2 37,9 35,4 34,8 37,2 29,7 37,8 40,8 0,42 32,8 32,7 30,7 30,6 32,5 32,4 31,1 31,3 30,0 31,0 31,6 30,3 32,8 30,6 31,4 34,2 0,85 36,4 34,8 32,6 23,9 33,6 37,4 31,0 32,5 34,0 34,8 32,3 31,3 33,5 28,5 33,3 37,1 0,96 39,0 36,4 33,8 23,2 33,8 41,6 31,1 34,0 37,6 38,2 34,2 33,8 34,7 29,2 34,3 39,6 1,05 42,0 37,0 35,5 36,2 30,9 41,7 34,2 35,4 41,1 40,2 36,2 35,4 36,8 30,5 38,5 40,5 41,3 40,6 37,1 37,6 40,1 30,5 38,6 41,2 43,5 42,7 38,5 39,5 42,3 34,5 41,5 42,5 42,0 42,7 37,9 38,2 41,2 31,4 40,9 41,2 43,8 43,5 38,5 39,7 44,2 36,2 42,2 40,4

31,62 32,92 34,65 36,40 37,01 37,97 39,19 40,36 41,16 1,01 0,88 0,29 1,06 1,10 0,83 1,26 0,80 1,30 SEM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Trung bình SEM

PL62

PHỤ LỤC 57. Các chỉ số hồng cầu trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn

Sau 30 ngày

Lô

Số lượng hồng cầu (RBC)

Độ phân bố HC (RDW)

ý l h n i S

Trung bình SEM

g k / g m 0 0 1 F H A E

Trung bình SEM

g k / g m 0 0 2 F H A E

8,3 8,7 7,8 9,2 8,0 9,1 8,6 8,2 8,48 0,18 7,71 8,53 10,8 9,90 7,96 7,82 5,46 8,02 8,28 0,56 9,98 9,05 8,76 9,50 9,13 9,15 9,84 9,11 9,32 0,15

Trung bình SEM

Số lượng huyết sắc tố (Hb) 13,8 14,8 12,8 15,8 13,7 15,2 14,0 14,8 14,36 0,34 13,6 14,1 16,0 15,4 13,4 13,4 7,9 14,2 13,50 0,87 15,5 14,3 14,5 16,5 15,0 15,5 16,2 15,3 15,35 0,27

Thể tích trung bình HC (MCV) 64,1 55,7 53,2 51,9 54,0 54,1 56,7 57,8 55,94 1,35 60,6 51,3 46,9 48,9 53,8 57,7 46,5 55,5 52,65 1,82 51,3 52,4 53,7 53,4 54,4 52,8 51,2 53,7 52,86 0,41

Lượng Hb trung bình HC (MCH) 16,7 17,0 16,5 17,1 17,1 16,8 16,4 18,0 16,95 0,18 17,6 16,5 14,7 15,6 16,8 17,1 14,5 17,7 16,31 0,44 15,5 15,8 16,6 17,4 16,4 16,9 16,5 16,8 16,49 0,21

Nồng độ Hb trung bình HC 26,1 30,5 31,0 33,0 31,6 31,0 28,9 31,1 30,40 0,73 29,1 32,2 31,4 31,8 31,3 29,7 31,1 31,9 31,06 0,39 30,3 30,2 30,9 32,5 30,2 32,1 32,1 31,3 31,20 0,33

15,6 15,5 14,2 14,5 14,3 15,2 15,3 14,3 14,86 0,21 13,9 14,6 13,2 14,7 14,3 15,8 15,6 14,7 14,60 0,30 15,0 14,4 15,4 14,7 13,7 14,4 17,2 15,1 14,99 0,37

Khối hồng cầu (HCT) 52,9 48,5 41,3 47,9 43,3 49,1 48,5 47,6 47,39 1,27 46,7 43,8 51,0 48,4 42,8 45,1 48,4 44,5 46,34 0,98 51,2 47,4 47,0 50,7 49,7 48,3 50,4 48,9 49,20 0,55

PL63

Sau 60 ngày

Lô

Số lượng hồng cầu (RBC)

Độ phân bố HC (RDW)

Khối hồng cầu (HCT)

ý l h n i S

Số lượng huyết sắc tố (Hb) 16,3 15,8 16,7 14,5 17,5 16,7

Thể tích trung bình HC (MCV) 50,0 48,5 47,3 49,6 46,7 47,3

Lượng Hb trung bình HC (MCH) 17,1 17,0 16,5 17,1 16,4 16,5

Nồng độ Hb trung bình HC 34,2 35,0 34,9 34,5 35,1 34,9

47,6 45,2 47,8 42,0 49,8 47,8

12,1 12,5 12,5 13,5 11,8 12,5

9,52 9,31 10,10 8,46 10,60 10,10

9,68

16,25

46,70

48,23

16,77

34,77

12,48

Trung bình SEM

g k / g m 0 0 1 F H A E

1,11 48,1 47,4 44,8 47,1 43,2 40,5 40,5 43,0

0,42 15,7 15,9 15,1 16,5 15,0 13,9 13,7 15,3

0,23 12,8 13,2 11,6 11,7 12,3 11,8 12,5 11,6

0,55 47,2 51,6 46,0 46,0 46,0 46,6 46,6 49,4

0,14 15,7 17,3 16,5 16,1 16,0 16,0 15,8 17,6

0,14 34,3 33,5 33,7 35,0 34,7 34,3 33,8 35,6

0,31 8,71 9,19 9,74 10,20 9,39 8,69 8,69 8,71

9,17

15,14

44,33

47,43

16,38

34,36

12,19

Trung bình SEM

g k / g m 0 0 2 F H A E

1,07 45,2 45,4 47,7 42,8 39,5 41,1 38,0 48,3

0,34 15,8 14,9 16,1 13,9 13,6 13,3 13,2 16,0

0,22 13,5 13,0 11,9 13,5 13,0 12,9 13,8 12,2

0,72 49,9 49,0 48,6 48,6 48,6 48,1 48,7 44,7

0,25 17,5 16,1 16,4 15,8 16,7 15,6 16,9 14,8

0,25 35,0 32,8 33,8 32,5 34,4 32,4 34,7 33,1

0,20 9,05 9,27 9,82 8,81 8,12 8,55 10,80 10,80

14,60

43,50

48,28

16,23

33,59

12,98

9,40

0,44

1,33

0,54

0,30

0,36

0,23

Trung bình SEM

0,35

PL64

PHỤ LỤC 58. Các chỉ số bạch cầu trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn

Sau 30 ngày

Lô

Số lượng bạch cầu

Tỷ lệ % bạch cầu trung tính

Tỷ lệ % bạch cầu Lympho

Tỷ lệ % bạch cầu Mono

Số lượng bạch cầu trung tính

Số lượng bạch cầu Lympho

Số lượng bạch cầu Mono

ý l h n i S

TB SEM

g k / g m 0 0 1 F H A E

TB SEM

g k / g m 0 0 2 F H A E

7,8 10,5 8,5 5,0 8,5 5,4 5,0 10,9 7,70 0,84 7,5 6,2 7,8 5,1 11,1 10,9 7,5 7,6 7,96 0,74 8,5 8,5 8,3 10,9 9,6 10,1 7,8 12,7 9,55 0,58

6,7 7,3 6,7 5,1 4,1 0,9 0,9 7,3 4,88 0,95 0,8 3,3 13,9 15,2 0,1 4,8 3,3 0,1 5,19 2,13 5,1 1,6 11,0 10,9 11,3 1,8 2,5 0,6 5,60 1,66

83,2 74,5 83,2 73,2 86 70,8 70,8 74,5 77,03 2,16 76,3 76,4 62,1 68,4 82,5 84,6 76,4 88,0 76,84 3,01 82,6 83,6 75,7 68,7 75,7 85,3 86,4 87,9 80,74 2,36

10,1 18,2 10,1 21,7 9,9 28,3 28,3 18,2 18,10 2,73 22,9 20,3 24 16,4 17,4 10,6 20,3 11,9 17,98 1,72 12,3 14,8 13,3 20,4 13,0 12,9 11,1 11,5 13,66 1,04

0,5 0,8 0,5 0,2 0,4 0,1 0,1 0,8 0,43 0,10 0,1 0,3 1,1 0,8 0 0,5 0,3 0 0,39 0,14 0,4 0,1 0,9 1,2 1,0 0,2 0,2 0,0 0,50 0,16

7,1 8,1 7,1 3,7 7,3 3,5 3,5 8,1 6,05 0,74 5,7 5,7 4,8 3,5 9,2 9,2 5,7 6,7 6,31 0,71 7,0 7,1 6,3 7,5 7,3 8,6 6,7 11,2 7,71 0,55

0,9 2 0,9 1,1 0,8 1,4 1,4 2,0 1,31 0,17 1,7 1,5 1,9 0,8 1,9 1,2 1,5 0,9 1,43 0,15 1,1 1,3 1,1 2,2 1,3 1,3 0,9 1,5 1,34 0,14

TB SEM

PL65

Sau 60 ngày

Lô Số lượng bạch cầu Tỷ lệ % bạch cầu trung tính Tỷ lệ % bạch cầu Lympho Tỷ lệ % bạch cầu Mono Số lượng bạch cầu trung tính Số lượng bạch cầu Lympho Số lượng bạch cầu Mono

ý l h n i S

TB SEM

g k / g m 0 0 1 F H A E

TB SEM

g k / g m 0 0 2 F H A E

10,3 9,8 10,8 14,1 9,5 10,8 10,88 0,68 11,3 7,7 14,6 7,8 9,9 8,5 10,4 9,3 9,94 0,80 17,0 6,7 8,6 9,3 17,3 8,1 13,5 9,7 11,28 1,46 7,6 34,2 12,0 8,4 9,6 12,0 13,97 4,11 32,7 5,4 35,3 8,6 36,3 16,9 5,0 9,5 18,71 4,88 6,8 17,9 5,8 1,9 23,2 14,0 19,9 15,0 13,06 2,65 67,3 62,2 82,3 70,5 85,4 82,3 75,00 3,91 54,0 78,9 61,0 73,3 60,9 52,9 70,4 68,7 65,01 3,29 90,6 68,7 76,6 87,2 73,4 80,3 77,0 78,7 79,06 2,50 25,1 3,6 5,6 21,1 5,1 5,6 11,02 3,87 13,3 15,7 3,8 18,1 2,5 30,2 24,6 21,8 16,25 3,41 2,6 13,4 17,6 10,9 3,4 5,7 3,1 6,3 7,88 1,95 0,80 3,35 1,30 1,20 0,91 1,30 1,48 0,38 3,70 0,40 2,15 0,70 2,53 1,40 0,50 0,90 1,54 0,41 0,95 1,20 0,50 0,20 4,02 1,13 2,69 1,46 1,52 0,44 6,9 6,1 8,9 9,9 8,1 8,9 8,13 0,58 6,1 6,1 8,9 5,7 9,2 9,5 7,3 6,4 7,40 0,55 15,4 4,6 6,6 8,1 12,7 6,5 10,4 7,6 8,99 1,27 2,60 0,35 0,61 3,00 0,48 0,61 1,28 0,49 1,50 1,20 0,55 1,40 1,17 2,06 2,16 2,00 1,51 0,19 0,44 0,90 1,50 1,00 0,58 0,46 0,42 0,61 0,74 0,13

TB SEM

PL66

PHỤ LỤC 59. Các chỉ số tiểu cầu trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn

sau 30 ngày

Lô Số lượng tiểu cầu (PLT) Khối tiểu cầu (PCT) Độ phân bố TC (PDW)

Sinh lý

Trung bình SEM

EAHF 100 mg/kg

Trung bình SEM

EAHF 200 mg/kg

Thể tích trung bình TC (MPV) 2,6 5,0 2,3 2,7 2,9 2,9 3,0 1,8 2,90 0,33 2,3 2,4 3,2 2,8 2,8 2,1 2,0 3,4 2,63 0,18 1,7 2,2 1,8 5,0 2,2 2,0 1,9 2,4 2,40 0,38 987,0 437,0 772,0 1107,0 1147,0 1004,0 1199,0 1073,0 965,75 88,41 932,0 752,0 745,0 1256,0 898,0 1012,0 912,0 908,0 926,88 56,80 1115,0 1148,0 634,0 615,0 833,0 1088,0 731,0 940,0 888,00 76,60 0,25 0,21 0,17 0,29 0,33 0,29 0,35 0,19 0,26 0,02 0,21 0,18 0,23 0,35 0,25 0,21 0,18 0,30 0,24 0,02 0,18 0,25 0,11 0,30 0,18 0,21 0,13 0,22 0,20 0,02 18,1 17,7 17,1 17,5 17,5 17,5 15,9 17,7 17,38 0,23 17,1 16,5 16,9 17,4 16,5 17,1 17,1 16,9 16,94 0,11 16,6 15,5 17,7 18,5 17,2 17,1 17,8 16,5 17,11 0,33 Trung bình SEM

PL67

Sau 60 ngày

Lô

Sinh lý

Trung bình SEM

EAHF 100 mg/kg

Trung bình SEM

EAHF 200 mg/kg

Thể tích trung bình TC (MPV) 2,2 2,4 2,8 1,8 2,0 2,8 2,33 0,17 1,8 2,3 1,8 2,3 3,0 1,9 2,0 2,0 2,14 0,14 2,4 2,3 3,3 2,3 3,0 2,1 2,4 2,2 2,50 0,15 Khối tiểu cầu (PCT) 0,16 0,15 0,15 0,10 0,11 0,15 0,14 0,01 0,11 0,17 0,11 0,15 0,17 0,08 0,08 0,12 0,12 0,01 0,14 0,13 0,18 0,22 0,21 0,12 0,17 0,17 0,17 0,01 Độ phân bố TC (PDW) 17,1 16,5 17,6 17,8 17,8 17,6 17,40 0,21 17,8 17,1 16,1 17,1 17,5 17,8 17,2 17,8 17,30 0,20 18,0 17,1 18,5 17,1 17,5 18,7 18,2 17,1 17,78 0,23 Trung bình SEM Số lượng tiểu cầu (PLT) 734,0 646,0 554,0 577,0 564,0 554,0 604,83 29,43 645,0 781,0 625,0 673,0 664,0 456,0 425,0 624,0 611,63 41,34 599,0 589,0 573,0 701,0 708,0 599,0 735,0 781,0 660,63 28,13

PL68

PHỤ LỤC 60. Nồng độ AST và ALT trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn

Sau 30 ngày Sau 60 ngày Lô

Sinh lý

Trung bình SEM

EAHF 100 mg/kg

Trung bình SEM

EAHF 200 mg/kg

Trung bình SEM AST 84,2 77,6 87,6 75,0 92,5 155,3 112,4 152,4 104,63 11,47 79,3 69,5 86,3 106,2 101,2 89,8 81,0 77,0 86,29 4,38 74,9 94,5 88,4 151,2 90,5 90,2 150,9 133,6 109,28 10,88 AST 44,1 55,3 96,7 53,6 73,2 96,7 69,93 9,29 44,7 81,0 66,3 53,1 76,5 73,7 66,1 61,8 65,40 4,29 393,6 121,7 479,2 94,8 129,0 177,9 61,1 356,0 226,66 56,08 ALT 35,8 49,6 78,4 46,5 65,7 78,4 59,07 7,26 39,8 56,1 54,7 42,7 63,0 63,9 51,3 58,5 53,75 3,11 367,3 364,3 476,1 35,2 44,8 60,1 31,1 468,6 230,94 72,59

ALT 31,6 34,0 43,5 31,8 53,0 95,2 38,7 42,4 46,28 7,43 42,1 40,1 63,0 63,5 49,1 29,5 49,9 31,5 46,09 4,54 40,3 36,1 37,5 44,1 47,8 35,6 99,3 55,9 49,58 7,51

PL69

PHỤ LỤC 61. Nồng độ urê và creatinin trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn

Sau 30 ngày Sau 60 ngày Lô Urée Créatinine Urée Créatinine

Sinh lý

Trung bình SEM

EAHF 100 mg/kg

Trung bình SEM

EAHF 200 mg/kg

33,8 32,5 35,9 34,9 31,5 34,0 41,1 36,6 35,04 1,05 36,0 42,8 42,1 36,6 41,6 32,9 35,1 30,0 37,14 1,64 36,0 39,9 33,0 33,8 37,2 38,3 35,0 38,0 36,40 0,84 4,5 6,6 6,3 5,2 4,5 3,1 5,3 3,2 4,84 0,45 4,1 6,5 6,0 5,0 6,2 3,8 4,0 3,9 4,94 0,40 4,9 6,2 3,7 5,2 4,0 3,5 4,9 5,2 4,70 0,32 Trung bình SEM 7,0 4,7 6,8 4,9 4,4 6,8 5,77 0,50 4,3 6,7 6,1 6,3 3,7 5,8 4,0 4,1 5,13 0,43 6,5 5,4 3,7 5,6 8,2 7,3 9,5 3,4 6,20 0,75 41,2 44,8 42,8 38,4 41,2 42,8 41,87 0,88 43,9 40,3 43,6 46,7 42,4 45,2 47,2 38,3 43,45 1,08 44,8 42,4 38,2 38,4 37,2 36,5 42,1 39,6 39,90 1,03

PL70

PHỤ LỤC 62. Hình ảnh vi thể tế bào gan của các chuột lô sinh lý trong thử nghiệm

độc tính bán trường diễn

Chuột 1: mô gan bình thường Chuột 2: mô gan bình thường

Chuột 4: mô gan bình thường

Chuột 3: mô gan bình thường

Chuột 5: mô gan bình thường Chuột 6: mô gan bình thường

PL71

PHỤ LỤC 63. Hình ảnh vi thể tế bào gan của các chuột lô EAHF 100 mg/kg trong

thử nghiệm độc tính bán trường diễn

Chuột 1: mô gan bình thường Chuột 2: mô gan bình thường

Chuột 3: mô gan bình thường Chuột 4: mô gan bình thường