Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu mối liên quan giữa 3 alen HLA lớp I với nguy cơ phản ứng có hại trên da nghiêm trọng của allopurinol ở người Kinh Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM TRẦN THU HÀ

NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN

GIỮA 3 ALEN HLA LỚP I VỚI NGUY CƠ

PHẢN ỨNG CÓ HẠI TRÊN DA NGHIÊM TRỌNG

CỦA ALLOPURINOL Ở NGƯỜI KINH

VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM TRẦN THU HÀ

NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN

GIỮA 3 ALEN HLA LỚP I VỚI NGUY CƠ

PHẢN ỨNG CÓ HẠI TRÊN DA NGHIÊM TRỌNG

CỦA ALLOPURINOL Ở NGƯỜI KINH

VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC

MÃ SỐ: 62720408

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS. TS. Phùng Thanh Hương

2. PGS. TS. Trần Quang Bình

HÀ NỘI, NĂM 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Phạm Trần Thu Hà, nghiên cứu sinh niên khóa 2017 chuyên ngành Hóa sinh

dược, Trường Đại học Dược Hà Nội, xin cam đoan:

1. Luận án này do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Phùng

Thanh Hương, Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Dược Hà Nội và PGS. TS. Trần

Quang Bình, Khoa Dinh dưỡng và Bệnh không lây nhiễm, Viện Dinh dưỡng Quốc

gia.

2. Luận án này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại

Việt Nam.

3. Các số liệu và thông tin trong luận án chính xác, khách quan, đã được chấp thuận

và xác nhận của các cơ sở nơi luận án triển khai thu thập số liệu.

4. Các kết quả công bố chung đã được cán bộ hướng dẫn và các đồng tác giả cho

phép sử dụng trong luận án.

Hà Nội, ngày 22 tháng 5 năm 2022

Nghiên cứu sinh

Phạm Trần Thu Hà

LỜI CẢM ƠN

Trong hành trình hơn 4 năm làm nghiên cứu sinh, tôi đã được nhận được sự

giúp đỡ tận tâm và chân thành của rất nhiều thầy cô, anh chị em, bạn bè, đồng nghiệp

và các thành viên trong gia đình.

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới

PGS. TS. Phùng Thanh Hương, Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Dược Hà Nội

và PGS. TS. Trần Quang Bình, Khoa Dinh dưỡng và Bệnh không lây nhiễm, Viện

Dinh dưỡng Quốc gia - hai người thầy đã luôn tận tâm hướng dẫn và khích lệ tôi trong

suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tinh thần trách nhiệm, kiến thức và sự nhiệt

tâm đối với học trò của thầy cô là tấm gương và động lực để tôi không ngừng cố gắng,

nỗ lực vượt qua những giai đoạn khó khăn nhất để hoàn thành luận án.

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô, các kỹ thuật viên

Bộ môn Hóa sinh đã luôn đồng hành và hỗ trợ tôi từ khi còn là học viên cao học của

Bộ môn tới ngày hôm nay.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội,

PGS. TS. Đỗ Hồng Quảng và các thầy cô Phòng Sau đại học đã luôn đồng hành

và giúp đỡ trong quá trình tôi học tập tại trường.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Bộ Y tế đã cấp kinh phí cho Đề tài cấp Bộ Y tế

“Khảo sát tần suất một số alen HLA lớp I trong cộng đồng người Kinh Việt Nam và

trong nhóm bệnh nhân sử dụng allopurinol” để tôi có cơ hội thực hiện luận án tiến sĩ.

Tôi chân thành cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Hoàng Anh và các anh/chị/em

trong Trung tâm Quốc gia về Thông tin thuốc và Theo dõi phản ứng có hại của

thuốc đã nhiệt tình hỗ trợ trong quá trình xây dựng và triển khai đề tài.

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Rosita Gabbianelli, TS.

Donatella Fedeli, TS. Laura Bordoni đã hết lòng hỗ trợ và tạo những điều kiện

thuận lợi nhất để tôi làm quen với công việc trong phòng thí nghiệm trong thời gian

tôi học tập trao đổi tại Đại học Camerino, Ý.

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, Hội sinh viên các Trường Đại học

Dược Hà Nội, Trường Đại học Hà Tĩnh, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ

Chí Minh đã hết lòng giúp đỡ trong giai đoạn thu mẫu cộng đồng.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể bác sĩ, điều dưỡng tại Trung tâm Dị ứng

– Miễn dịch Lâm sàng, Bệnh viện Bạch Mai và tập thể bác sĩ bác sĩ, y tá, điều

dưỡng tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh Thái Bình cùng tập thể cán bộ tại Trung tâm

kiểm soát bệnh tật tỉnh Thái Bình đã tạo điều kiện thuận lợi, nhiệt tình tham gia

quá trình thu mẫu bệnh nhân.

Tôi xin chân thành cảm ơn những người tình nguyện trong cộng đồng và

những bệnh nhân đã chấp thuận tham gia nghiên cứu và sẵn lòng chia sẻ thông tin

để tôi có thể có được những dữ liệu nghiên cứu giá trị.

Tôi xin trân trọng cảm ơn những ý kiến đóng góp chân thành và đầy tính xây

dựng của TS. Lê Nhật Minh, TS. Nguyễn Hải Hà, TS. Nguyễn Thị Đông, BS.

Trần Ngọc Phương Mai và tập thể cán bộ tại Khoa dinh dưỡng và Bệnh không

lây nhiễm, Viện Dinh dưỡng Quốc gia; tập thể cán bộ tại Phòng sinh học phân tử

ứng dụng, Trung tâm Nghiên cứu Y sinh học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.

Những ý kiến đóng góp quý báu đó đã giúp tôi triển khai và hoàn thiện luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn DS CKII. Nguyễn Thế Tin, TS. Mai Lệ Hoa và

toàn thể các cô chú, anh chị em đồng nghiệp tại Trung tâm đào tạo liên tục –

Trường Đại học Đại Nam đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt quá

trình làm nghiên cứu.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới tất cả những thành viên đã đồng

hành từ những ngày đầu triển khai đề tài và rất nhiều người thầm lặng đồng hành

giúp đỡ mà tôi không thể kể hết tên.

Sau cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, người thân, bạn bè đã

luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

iii

và hoàn thành luận án.

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ...................................................... ix

DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... xiii

DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... xv

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1

Chương 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3

1.1. Phản ứng có hại trên da nghiêm trọng của thuốc ........................................... 3

1.1.1. Khái niệm chung ............................................................................................... 3

1.1.2. Các týp SCARs đáng chú ý ............................................................................... 3

1.1.2.1. Hội chứng Stevens–Johnson và hoại tử biểu bì nhiễm độc ............................ 3

1.1.2.2. Hội chứng quá mẫn do thuốc ......................................................................... 4

1.1.2.3. Ban mụn mủ toàn thân cấp tính ..................................................................... 4

1.1.3. Dịch tễ phản ứng có hại trên da nghiêm trọng do allopurinol .......................... 5

1.1.4. Cơ chế phân tử của SCARs do allopurinol ....................................................... 8

1.2. Tổng quan về các alen HLA lớp I ................................................................... 10

1.2.1. Giới thiệu chung về siêu họ gen HLA ............................................................. 10

1.2.2. Danh pháp alen HLA ....................................................................................... 11

1.2.3. Đặc điểm của siêu họ gen HLA ....................................................................... 13

1.2.4. Vị trí, cấu trúc gen HLA lớp I ......................................................................... 15

1.2.4.1. Vị trí gen HLA lớp I...................................................................................... 15

1.2.4.2. Cấu trúc – chức năng gen HLA lớp I ........................................................... 15

1.3. Các nghiên cứu về alen HLA lớp I có liên quan với nguy cơ SCARs do

allopurinol ................................................................................................................ 18

1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới ........................................................................... 18

1.3.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam .......................................................................... 21

1.4. Các phương pháp phát hiện alen HLA lớp I liên quan tới SCARs do

allopurinol ................................................................................................................ 24

1.4.1. Các phương pháp phát hiện alen HLA lớp I liên quan tới nguy cơ SCARs do

allopurinol trên thế giới ............................................................................................. 24

1.4.2. Các phương pháp phát hiện alen HLA lớp I liên quan tới nguy cơ SCARs do

allopurinol tại Việt Nam ............................................................................................ 28

1.4.3. Phương pháp phát hiện alen HLA lớp I của luận án ........................................ 29

1.4.3.1. Phương pháp phát hiện alen HLA-A*33:03 và HLA-C*03:02 .................... 29

1.4.3.2. Phương pháp phát hiện alen HLA-B*58:01 ................................................ 32

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 33

2.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 33

2.1.1. Đối tượng trong nghiên cứu xây dựng, tối ưu hóa và thẩm định quy trình phát

hiện 3 alen HLA lớp I ................................................................................................ 33

2.1.2. Đối tượng trong nghiên cứu trên cộng đồng người Kinh Việt Nam ............... 34

2.1.3. Đối tượng trong nghiên cứu trên bệnh nhân sử dụng allopurinol ................... 35

2.1.3.1. Nhóm bệnh nhân dung nạp với allopurinol ................................................. 35

2.1.3.2. Nhóm bệnh nhân bị SCARs do allopurinol .................................................. 36

2.2. Nguyên liệu, trang thiết bị dùng trong nghiên cứu ....................................... 37

2.2.1. Nguyên liệu, hóa chất, vật tư tiêu hao dùng trong nghiên cứu ....................... 37

2.2.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu ....................................................................... 37

2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 38

2.3.1.Sơ đồ thiết kế nghiên cứu ................................................................................. 38

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu giải quyết mục tiêu 1 “Xây dựng và thẩm định quy

trình phát hiện 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02” .................. 39

2.3.2.1. Phương pháp tách chiết ADN ...................................................................... 39

2.3.2.2. Phương pháp xây dựng quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 ................. 39

2.3.2.3. Phương pháp xây dựng quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 ................. 42

2.3.2.4. Phương pháp xây dựng quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02 ................. 43

2.3.2.5. Phương pháp thẩm định các quy trình đã xây dựng .................................... 45

2.3.3. Phương pháp nghiên cứu giải quyết mục tiêu 2 “Xác định tần suất của 3 alen

HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02 trong cộng đồng người Kinh Việt

Nam”……………. .................................................................................................... 46

2.3.3.1. Phương pháp nghiên cứu chung .................................................................. 46

2.3.3.2. Phương pháp thu mẫu .................................................................................. 46

2.3.3.3. Phương pháp phát hiện 3 alen HLA lớp I và tính tần suất alen .................. 47

2.3.4. Phương pháp nghiên cứu giải quyết mục tiêu 3 “Đánh giá mối liên quan của 3

alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02 với nguy cơ phản ứng có hại trên

da nghiêm trọng khi dùng allopurinol ở bệnh nhân người Kinh Việt

Nam”…………….. ................................................................................................... 48

2.3.4.1. Phương pháp nghiên cứu chung .................................................................. 48

2.3.4.2. Phương pháp thu mẫu .................................................................................. 50

2.3.4.3. Phương pháp phát hiện 3 alen HLA lớp I .................................................... 52

2.4. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................... 52

2.5. Đạo đức nghiên cứu.......................................................................................... 53

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 54

3.1. Kết quả của mục tiêu 1 “Xây dựng và thẩm định quy trình phát hiện 3 alen

HLA-A*33:03, HLA-B*58:01, HLA-C*03:02” ...................................................... 54

3.1.1. Kết quả xây dựng và thẩm định quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 ....... 54

3.1.1.1. Kết quả thiết kế mồi và xây dựng các bước PCR của quy trình phát hiện alen

HLA-A*33:03….. ...................................................................................................... 54

3.1.1.2. Kết quả khảo sát điều kiện hoạt động của cặp mồi HLAAB1F/HLAAB1R sử

dụng cho phản ứng PCR bước 1 ............................................................................... 57

3.1.1.3. Kết quả khảo sát điều kiện hoạt động của 3 cặp mồi sử dụng cho các phản

ứng PCR bước 2 ...................................................................................................... 59

3.1.1.4. Kết quả thử nghiệm quy trình nested AS – PCR phát hiện alen HLA-A*33:03

với các mẫu chứng .................................................................................................... 63

3.1.1.5. Kết quả thẩm định quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 bằng phương pháp

giải trình tự Sanger ................................................................................................... 64

3.1.2. Kết quả xây dựng và thẩm định quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 ....... 65

3.1.2.1. Kết quả lựa chọn mồi ................................................................................... 65

3.1.2.2. Kết quả khảo sát điều kiện hoạt động của các cặp mồi ............................... 67

3.1.2.3. Kết quả thử nghiệm quy trình SSP – PCR phát hiện alen HLA-B*58:01 với

các mẫu chứng… ...................................................................................................... 71

3.1.2.4. Kết quả thẩm định quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 bằng phương pháp

giải trình tự Sanger ................................................................................................... 72

3.1.3. Kết quả xây dựng và thẩm định quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02 ....... 72

3.1.3.1. Kết quả thiết kế mồi và xây dựng các bước PCR của quy trình phát hiện alen

HLA-C*03:02….. ...................................................................................................... 72

3.1.3.2. Kết quả khảo sát điều kiện hoạt động của cặp mồi HLACB1F/HLACB1R sử

dụng cho phản ứng PCR bước 1 ............................................................................... 76

3.1.3.3. Kết quả khảo sát điều kiện hoạt động của 3 cặp mồi sử dụng cho các phản

ứng PCR bước 2 ...................................................................................................... 78

3.1.3.4. Kết quả thử nghiệm quy trình nested AS – PCR phát hiện alen HLA-C*03:02

với các mẫu chứng .................................................................................................... 83

3.1.3.5. Kết quả thẩm định quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02 bằng phương pháp

giải trình tự Sanger ................................................................................................... 84

3.2. Kết quả của mục tiêu 2 “Xác định tần suất của 3 alen HLA-A*33:03, HLA-

B*58:01, HLA-C*03:02 trong cộng đồng người Kinh Việt Nam” ...................... 85

3.2.1. Kết quả tóm tắt đặc điểm nhóm cộng đồng người Kinh Việt Nam ................ 85

3.2.2. Kết quả về tần suất cá thể mang alen, tần suất alen và đặc điểm phân bố của

các alen giữa 2 giới và 3 miền ................................................................................... 86

3.2.3. Kết quả về tần suất cá thể mang alen và tần suất tổ hợp các alen ................... 89

3.3. Kết quả của mục tiêu 3 “Đánh giá mối liên quan của 3 alen HLA-A*33:03,

HLA-B*58:01, HLA-C*03:02 với nguy cơ phản ứng có hại trên da nghiêm trọng

khi dùng allopurinol ở bệnh nhân người Kinh Việt Nam” ................................. 90

3.3.1. Kết quả tóm tắt đặc điểm của nhóm SCARs do allopurinol và nhóm dung nạp

với allopurinol ........................................................................................................... 90

3.3.2. Kết quả so sánh tần suất cá thể mang alen và tần suất alen giữa các nhóm nghiên

cứu…............. . .......................................................................................................... 95

3.3.3. Kết quả đánh giá mối liên quan giữa các alen với nguy cơ SCARs do

allopurinol…. .. ......................................................................................................... 99

vii

3.3.4. Kết quả đánh giá mối liên quan giữa các yếu tố không di truyền và di truyền

liên quan tới nguy cơ SCARs do allopurinol .......................................................... 102

Chương 4. BÀN LUẬN ......................................................................................... 109

4.1. Về kết quả mục tiêu 1 “Xây dựng và thẩm định quy trình phát hiện 3 alen

HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02” ................................................ 109

4.1.1. Về quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 ................................................... 109

4.1.2. Về quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 ................................................... 114

4.1.3. Về quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02 ................................................... 117

4.2. Về kết quả mục tiêu 2 “Xác định tần suất của 3 alen HLA-A*33:03, HLA-

B*58:01 và HLA-C*03:02 trong cộng đồng người Kinh Việt Nam” ................ 121

4.3. Về kết quả mục tiêu 3 “Đánh giá mối liên quan của 3 alen HLA-A*33:03,

HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02 với nguy cơ phản ứng có hại trên da nghiêm

trọng khi dùng allopurinol ở bệnh nhân người Kinh Việt Nam” ..................... 126

4.3.1. Về tần suất 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02 ở 2 nhóm

dung nạp với allopurinol và nhóm SCARs do allopurinol ...................................... 126

4.3.2. Về mối liên quan giữa từng alen/tổ hợp các alen HLA lớp I với nguy cơ SCARs

do allopurinol 129

4.3.3. Về mối liên giữa yếu tố di truyền và các yếu tố không di truyền khác với nguy

cơ SCARs do allpurinol .......................................................................................... 132

4.3.4. Về mức độ ảnh hưởng của yếu tố di truyền và chức năng thận với nguy cơ

SCARs do allopurinol ............................................................................................. 137

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 142

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ........................................... 145

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

viii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa đầy đủ tiếng Anh Nghĩa đầy đủ tiếng Việt

ADRs Adverse drug reactions Phản ứng có hại của thuốc

AFND Allele frequency net database Cơ sở dữ liệu tần suất alen

AGEP Acute generalized Ban mụn mủ toàn thân cấp

exanthematous pustulosis tính

AH Allopurinol hypersensitivity Quá mẫn với allopurinol

ALDEN Algorithm of drug causality for Bảng điểm xác định thuốc

epidermal necrolysis gây dị ứng trong hoại tử

thượng bì

APC Antigen presenting cell Tế bào trình diện kháng

nguyên

AS – PCR Allele specific Polymerase chain PCR với mồi đặc hiệu alen

reaction

AUC Area under the ROC Curve Diện tích dưới đường cong

ROC

cADRs Cutaneous adverse drug Phản ứng có hại của thuốc

reactions trên da

Complement factor B CFB Bổ thể B

CI Confidence Interval Khoảng tin cậy

CP Cytoplasmic part Vùng mã hóa phần đuôi nằm

trong bào tương

CPIC Clinical pharmacogenetics Tổ chức thực hành gen dược

implementation consortium trên lâm sàng

DIHS Drug induced hypersensitivity Hội chứng quá mẫn do thuốc

syndrome

DRESS Drug reaction with eosinophilia Phản ứng thuốc có tăng bạch

and systemic symptoms cầu ái toan và triệu chứng

toàn thân

ĐTNC Đối tượng nghiên cứu

E Exon Exon

eGFR Estimated glomerular filtration Mức lọc cầu thận ước tính

rate

HLA Human Leukocyte Antigen Kháng nguyên bạch cầu

người

HR Hazard ratio Tỷ số rủi ro

HSS Hypersensitivity syndrome Hội chứng quá mẫn

HW Hardy Weinberg Cân bằng Hardy Weinberg

I Intron Intron

LAMP Loop Mediated Isothermal Phương pháp khuếch đại

Amplification đẳng nhiệt xoay vòng

LD Linkage disequilibrium Mất cân bằng liên kết

MDRD Modification of Diet in Renal Thay đổi chế độ ăn uống

Disease trong bệnh thận

MHC Major Histocompatibility Phức hợp hòa hợp tổ chức

Complex chính

NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự gen thế hệ mới

NHANES National Health and Nutrition Khảo sát Sức khỏe và Dinh

Examination Survey dưỡng Quốc gia

NIS Nationwide Inpatient Sample Cơ sở dữ liệu bệnh nhân nội

trú toàn quốc

NPV Negative predictive value Giá trị tiên đoán âm tính

PBMCs Peripheral blood mononuclear Tế bào đơn nhân máu ngoại

cells vi

P-I Pharmacological interaction of Tương tác dược lý của thuốc

drugs with immune receptor với thụ thể miễn dịch

PPV Positive predictive value Giá trị tiên đoán dương tính

RCT Randomized controlled clinical Thử nghiệm lâm sàng đối

trial chứng ngẫu nhiên

RegiSCAR European Registry of Severe Cơ quan đăng ký châu Âu

Cutaneous Adverse Reactions về các phản ứng có hại trên

da nghiêm trọng của thuốc

RFLP – PCR Polymerase chain reaction – Phản ứng khuếch đại chuỗi –

Restriction Fragment Length Đa hình chiều dài đoạn cắt

Polymorphism giới hạn

ROC Receiver operating characteristic Đường cong ROC

ROR Reporting odds ratio Tỷ suất chênh ghi nhận

SBT Sequencing base typing Giải trình tự gen

SCARs Severe cutaneous adverse Phản ứng có hại trên da

reactions nghiêm trọng của thuốc

SJS Stevens–Johnson syndrome

SNP Single-nucleotide polymorphism Đa hình đơn nucleotid

SP Signal peptide Vùng mã hóa peptit tín hiệu

SSOP – PCR Sequence-specific Phản ứng khuếch đại chuỗi

Oligonucleotide Probes – với đầu dò oligonucleotid có

Polymerase chain reaction trình tự đặc hiệu

SSP – PCR Sequence-specific Primer – Phản ứng khuếch đại chuỗi

Polymerase chain reaction với mồi có trình tự đặc hiệu

TCR T-cell receptors Thụ thể của tế bào T

TEN Toxic epidermal necrolysis Hoại tử biểu bì nhiễm độc

TLS Tumor lysis syndrome Hội chứng tiêu khối u

TLTK Tài liệu tham khảo

TM Transmem-brane part Vùng mã hóa phần xuyên

màng

TNF Tumor necrosis factor Các yếu tố hoại tử u

ULD Uratelowering drug Thuốc làm giảm acid uric

ULDAEs Uratelowering drug adverse Phản ứng có hại của các

events thuốc làm giảm acid uric

UT Untranslated region Vùng không mã hóa

VIF Variance inflation factor Hệ số phóng đại phương sai

Whole exome sequencing

WES Giải trình tự toàn bộ hệ exon

WGS Whole genome sequencing Giải trình tự toàn bộ hệ gen

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

xii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Các nghiên cứu về alen HLA lớp I liên quan tới nguy cơ SCARs do

allopurinol trên thế giới .................................................................................... 18

Bảng 1.2. Các nghiên cứu về tần suất 3 alen HLA lớp I ở các nước trên thế giới ............... 21

Bảng 1.3. Các nghiên cứu về tần suất 3 alen HLA lớp I trong cộng đồng người Kinh

Việt Nam ......................................................................................................... 22

Bảng 1.4. Các nghiên cứu về alen HLA lớp I liên quan tới nguy cơ SCARs do

allopurinol tại Việt Nam ................................................................................... 23

Bảng 1.5. So sánh các phương pháp sử dụng để phát hiện alen HLA-B*58:01........ 26

Bảng 1.6. Nguyên tắc thêm mismatch trên mồi đặc hiệu alen .................................. 30

Bảng 3.1. Trình tự các cặp mồi của quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 ............ 57

Bảng 3.2. Thông số hoạt động của quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 ............. 62

Bảng 3.3. So sánh kiểu gen HLA-A của 7 mẫu chứng ADN và kết quả kiểu gen HLA-

A xác định bằng quy trình mới xây dựng ......................................................... 64

Bảng 3.4. Kết quả thẩm định quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 đã xây dựng bằng

phương pháp giải trình tự Sanger ........................................................................ 65

Bảng 3.5. Trình tự các cặp mồi của quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 ............ 67

Bảng 3.6. Thông số hoạt động của quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 ............. 70

Bảng 3.7. So sánh kiểu gen HLA-B của 6 mẫu chứng ADN và kết quả xác định bằng

quy trình mới xây dựng .................................................................................... 71

Bảng 3.8. Kết quả thẩm định quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 đã xây dựng bằng

phương pháp giải trình tự Sanger ....................................................................... 72

Bảng 3.9. Trình tự các cặp mồi của quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02 ........... 76

Bảng 3.10. Thông số hoạt động của quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02 ........... 82

Bảng 3.11. So sánh kiểu gen HLA-C của 10 mẫu chứng ADN và kết quả kiểu gen

HLA-C xác định bằng quy trình mới xây dựng ................................................ 84

Bảng 3.12. Kết quả thẩm định quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02 đã xây dựng

bằng phương pháp giải trình tự Sanger ............................................................ 85

Bảng 3.13. Đặc điểm nhóm cộng đồng người Kinh Việt Nam ................................. 85

xiii

Bảng 3.14. Tần suất cá thể mang alen và tần suất 3 alen HLA lớp I trong nhóm cộng

đồng người Kinh Việt Nam .............................................................................. 86

Bảng 3.15. So sánh tần suất cá thể mang alen giữa nam và nữ trong nhóm cộng đồng người

Kinh Việt Nam ................................................................................................... 87

Bảng 3.16. So sánh tần suất cá thể mang alen và tần suất alen của từng miền ......... 88

Bảng 3.17. Tần suất cá thể mang alen/tổ hợp các alen của từng phân nhóm ........... 89

Bảng 3.18. Đặc điểm của nhóm bệnh nhân SCARs do allopurinol và nhóm bệnh nhân

dung nạp với allopurinol .................................................................................. 91

Bảng 3.19. So sánh tần suất cá thể mang alen và tần suất alen trong nhóm SCARs do

allopurinol và nhóm dung nạp với allopurinol ...................................................... 96

Bảng 3.20. So sánh tần suất cá thể mang alen và tần suất alen trong nhóm dung nạp

với allopurinol và nhóm cộng đồng người Kinh Việt Nam ............................. 98

Bảng 3.21. Mối liên quan giữa từng alen/tổ hợp các alen HLA lớp I tới nguy cơ

SCARs do allopurinol .................................................................................... 100

Bảng 3.22. Mối liên quan giữa alen HLA-B*58:01 và HLA*C*03:02 và các týp

SCARs do allopurinol .................................................................................... 101

Bảng 3.23. Phân tích hồi quy đa biến các yếu tố liên quan với nguy cơ SCARs do

allopurinol ....................................................................................................... 103

Bảng 3.24. Phân tích ảnh hưởng của kiểu gen HLA-C*03:02 và chức năng thận với

nguy cơ SCARs do allopurinol ....................................................................... 104

Bảng 3.25. Phân tích ảnh hưởng của alen HLA-B*58:01 và chức năng thận với nguy

cơ SCARs do allopurinol ................................................................................ 106

Bảng 3.26. So sánh các giá trị của xét nghiệm sàng lọc alen nguy cơ .................... 107

Bảng 4.1. So sánh tần suất cá thể mang alen HLA-B*58:01 giữa cộng đồng người

Kinh Việt Nam và một số cộng đồng khác trên thế giới ................................ 122

xiv

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Mô hình tương tác dược lý "P-I" được đề xuất để giải thích cơ chế phân tử

của SCARs do allopurinol. ............................................................................... 10

Hình 1.2. Sơ đồ vùng gen HLA trên nhiễm sắc thể số 6 ........................................... 11

Hình 1.3. Danh pháp alen HLA ................................................................................. 12

Hình 1.4. Các HLA haplotype di truyền trong một gia đình theo định luật Menden ........... 14

Hình 1.5. Cấu trúc chung của gen HLA lớp I ............................................................ 16

Hình 1.6. Cấu trúc phân tử MHC lớp I ..................................................................... 17

Hình 1.7. Nguyên tắc thiết kế mồi đặc hiệu alen ...................................................... 31

Hình 1.8. Nguyên tắc của quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 bằng phương pháp SSP –

PCR .................................................................................................................. 32

Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu .......................................................................... 38

Hình 3.1. Vị trí gắn của cặp mồi HLAAB1F/HLAAB1R sử dụng ở phản ứng PCR

bước 1 của quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 .......................................... 55

Hình 3.2. Vị trí gắn của các mồi đặc hiệu alen sử dụng cho các phản ứng PCR bước

2 của quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 ................................................... 55

Hình 3.3. Sơ đồ quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 và cách đọc kết quả kiểu gen

HLA-A*33:03 ................................................................................................... 56

Hình 3.4. Điện di đồ khảo sát nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi HLAAB1F/ HLAAB1R -

quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 ............................................................ 57

Hình 3.5. Điện di đồ khảo sát số chu kỳ phản ứng của cặp mồi HLAAB1F/

HLAAB1R - quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 ...................................... 58

Hình 3.6. Điện di đồ khảo sát số chu kỳ và nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi

HLAA3AF/HLAA3303R - lần 3 ...................................................................... 60

Hình 3.7. Điện di đồ khảo sát số chu kỳ và nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi

HLAA3AF/HLAA2AR - lần 3 ......................................................................... 60

Hình 3.8. Điện di đồ khảo sát số chu kỳ và nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi

HLAA18AF/HLAA18AR - lần 3 ..................................................................... 61

Hình 3.9. Điện di đồ của 7 mẫu chứng thử nghiệm với quy trình phát hiện alen HLA-

A*33:03 đã xây dựng ........................................................................................ 63

Hình 3.10. Vị trí gắn của cặp mồi HLAB5801F/HLAB5801R trên khuôn ADN .... 66

Hình 3.11. So sánh các cặp mồi phát hiện alen HLA-B*58:01 đã công bố .............. 66

Hình 3.12. Sơ đồ quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 và cách đọc kết quả ........ 67

Hình 3.13. Điện di đồ khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các mồi – quy trình phát hiện alen

HLA-B*58:01 ................................................................................................... 68

Hình 3.14. Điện di đồ kết quả khảo sát nồng độ cặp mồi HLAB5801F/ HLAB5801R

– quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 ......................................................... 69

Hình 3.15. Điện di đồ kết quả khảo sát nồng độ MgCl2 – quy trình phát hiện alen HLA-

B*58:01 ............................................................................................................. 69

Hình 3.16. Điện di đồ của 6 mẫu chứng thử nghiệm với quy trình phát hiện alen HLA-

B*58:01 đã xây dựng ........................................................................................ 71

Hình 3.17. Vị trí gắn của cặp mồi HLACB1F/HLACB1R sử dụng ở phản ứng PCR

bước 1 ............................................................................................................... 73

Hình 3.18. Vị trí gắn của các mồi sử dụng cho các phản ứng PCR bước 2 .............. 74

Hình 3.19. Sơ đồ quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02 và cách đọc kết quả kiểu gen

HLA-C*03:02 ................................................................................................... 75

Hình 3.20. Điện di đồ khảo sát nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi HLACB1F/ HLACB1R

- quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02 .......................................................... 77

Hình 3.21. Điện di đồ khảo sát số chu kỳ của phản ứng PCR bước 1 ...................... 78

Hình 3.22. Điện di đồ khảo sát số chu kỳ và nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi

HLAC0302F/HLAC3CR - lần 3 ...................................................................... 79

Hình 3.23. Điện di đồ khảo sát số chu kỳ và nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi

HLAC2CF/HLAC3CR - lần 3 .......................................................................... 80

Hình 3.24. Điện di đồ gradient nhiệt của cặp mồi HLAC15CF/HLAC15CR .......... 81

Hình 3.25. Điện di đồ của 10 mẫu chứng thử nghiệm với quy trình phát hiện alen

HLA-C*03:02 đã xây dựng .............................................................................. 83

xvi

0 ĐẶT VẤN ĐỀ

Allopurinol là thuốc điều trị tăng acid uric máu được sử dụng rộng rãi trên thế

giới và Việt Nam do thuốc thường được dung nạp tốt, cho hiệu quả điều trị cao và chi

phí hợp lý [143]. Tuy nhiên, những phản ứng có hại trên da nghiêm trọng (Severe

cutaneous adverse reactions – SCARs) khi dùng allopurinol dù hiếm gặp nhưng

thường rất nghiêm trọng, có tỷ lệ tử vong cao từ 10% đến 50% tổng số bệnh nhân bị

phản ứng, những bệnh nhân may mắn sống sót cũng phải chịu nhiều di chứng suốt

đời [16], [40].

Châu Á – là khu vực được cho là có tỷ lệ cao SCARs do allopurinol. Điều này

được giải thích bởi khu vực châu Á có tần suất cao các alen HLA lớp I liên quan tới

nguy cơ SCARs do allopurinol, bao gồm alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01, HLA-

C*03:02 [44], [104]. Trong đó, alen HLA-B*58:01 được nghiên cứu nhiều nhất và

một số nước châu Á như Thái Lan, Đài Loan, Singapo đã tiến hành áp dụng sàng lọc

alen này trên lâm sàng để dự đoán và ngăn ngừa nguy cơ SCARs do allopurinol trước

khi kê đơn cho bệnh nhân [126].

Tại Việt Nam, theo kết quả báo cáo của cơ sở dữ liệu ADRs tự nguyện giai

đoạn 2010 − 2015, allopurinol là thuốc đứng thứ 3 trong các thuốc được báo cáo

nhiều nhất có liên quan tới týp SCARs nghiêm trọng nhất – hội chứng Stevens

Johnson (SJS)/ hoại tử biểu bì nhiễm độc (TEN) [101]. Tuy nhiên, sự liên quan giữa

yếu tố di truyền với nguy cơ SCARs do allopurinol mới chỉ được quan tâm trong

vòng vài năm trở lại đây với một số nghiên cứu thực hiện trên cỡ mẫu nhỏ, chưa có

nhóm chứng cộng đồng. Mặt khác, các nghiên cứu ở Việt Nam mới tập trung vào alen

HLA-B*58:01 mà chưa có nghiên cứu về 2 alen HLA-A*33:03, HLA-C*03:02, trong

khi 2 alen này có tần suất cao hơn HLA-B*58:01 trong cộng đồng người Kinh Việt

Nam [36]. Hơn nữa, phần lớn các nghiên cứu sử dụng bộ kit sẵn có với chi phí cao

hoặc thực hiện xét nghiệm gen ở phòng thí nghiệm nước ngoài. Do đó, các kết quả

nghiên cứu chưa thực sự góp phần thúc đẩy triển khai sàng lọc các alen HLA lớp I

trên thực hành lâm sàng ở Việt Nam như một biện pháp phòng tránh SCARs do

allopurinol.

Vì những lý do trên, Việt Nam cần có những nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn

để đánh giá mối liên quan của cả 3 alen HLA lớp I với nguy cơ SCARs do allopurinol

cũng như nghiên cứu về các quy trình xét nghiệm gen giúp phát hiện các alen này với

độ chính xác cao, tiến hành đơn giản với chi phí thấp để có thể áp dụng trên lâm sàng.

Chính vì vậy, luận án “Nghiên cứu mối liên quan giữa 3 alen HLA lớp I với

nguy cơ phản ứng có hại trên da nghiêm trọng của allopurinol ở người Kinh Việt

Nam” được thực hiện.

Kết quả của luận án có ý nghĩa khoa học trong việc cung cấp cơ sở dữ liệu về

tần suất các cá thể mang alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02 trong

cộng đồng người Kinh Việt Nam, đồng thời, làm sáng tỏ mối liên quan giữa các alen

HLA nói trên với nguy cơ SCARs do allopurinol ở người Việt Nam. Kết quả của luận

án là cơ sở dữ liệu và tài liệu tham khảo quan trọng hướng tới thay đổi trong thực

hành lâm sàng nhằm đảm bảo hiệu quả điều trị, đồng thời giảm thiểu phản ứng có hại

trên da nghiêm trọng do allopurinol.

Các mục tiêu cụ thể của luận án như sau:

1. Xây dựng và thẩm định quy trình phát hiện 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01

và HLA-C*03:02.

2. Xác định tần suất của 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02 trong

cộng đồng người Kinh Việt Nam.

3. Đánh giá mối liên quan của 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02

với nguy cơ phản ứng có hại trên da nghiêm trọng khi dùng allopurinol ở bệnh

nhân người Kinh Việt Nam.

1 Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Phản ứng có hại trên da nghiêm trọng của thuốc

1.1.1. Khái niệm chung

Theo Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization – WHO), phản ứng

có hại của thuốc (adverse drug reactions – ADRs) là những phản ứng có hại và không

mong muốn khi bệnh nhân sử dụng thuốc ở liều khuyến cáo với mục đích dự phòng,

chẩn đoán, điều trị hoặc điều chỉnh các chức năng sinh lý của cơ thể [140]. ADRs là

vấn đề phổ biến trong thực hành lâm sàng và là một trong những nguyên nhân bệnh

lý quan trọng.

Phản ứng có hại trên da nghiêm trọng (severe cutaneous adverse reactions –

SCARs) là loại ADR hiếm gặp nhưng rất nguy hiểm, đe dọa tính mạng và có thể để

lại di chứng suốt đời [40]. Các týp SCARs có mức độ nghiêm trọng khác nhau, từ

ban mụn mủ toàn thân cấp tính (acute generalized exanthematous pustulosis - AGEP);

phản ứng thuốc có tăng bạch cầu ái toan và triệu chứng toàn thân (drug reaction with

eosinophilia and systemic symptoms – DRESS) hay còn gọi là hội chứng quá mẫn do

thuốc (drug induced hypersensitivity syndrome – DIHS) hoặc hội chứng quá mẫn

(hypersensitivity syndrome – HSS); và dạng nghiêm trọng nhất là hội chứng Stevens–

Johnson (Stevens–Johnson syndrome – SJS) và hoại tử biểu bì nhiễm độc (toxic

epidermal necrolysis – TEN) với tỷ lệ tử vong là 10% – 50% số bệnh nhân mắc bệnh

[32], [117].

1.1.2. Các týp SCARs đáng chú ý

1.1.2.1. Hội chứng Stevens–Johnson và hoại tử biểu bì nhiễm độc

Hội chứng Stevens–Johnson (SJS) và hoại tử biểu bì nhiễm độc (TEN) là

những phản ứng có hại trên da nghiêm trọng rất được quan tâm vì tỷ lệ tử vong cao

từ 10% – 50% số bệnh nhân mắc bệnh [32], [117]. Các hội chứng này bắt đầu diễn ra

trong khoảng 4 – 28 ngày sau khi dùng thuốc. Phân loại hai thể này trên lâm sàng dựa

vào diện tích bề mặt da bị trợt loét: dưới 10% là SJS; ≥ 30% là TEN, và khoảng 10-

30% là hội chứng chồng lấp SJS/TEN. Khoảng 30% trường hợp SJS và TEN không

xác định được thuốc nguyên nhân; và 15% trường hợp không chắc chắn thuốc nguyên

nhân [115].

Đặc trưng của SJS/TEN là loét các hốc tự nhiên (từ 2 hốc trở lên, hay gặp ở

mắt và miệng) và có nhiều dạng tổn thương da: rộp bọng nước trên diện rộng, có thể

trợt loét bộc lộ hạ bì, dấu hiệu Nikolsky dương tính – hiện tượng bong biểu bì khi

dùng tay miết nhiều lần ở vùng da cách bọng nước 1,5 – 2 cm; có thể kèm theo tổn

thương gan, thận, nặng, thậm chí tử vong [10].

1.1.2.2. Hội chứng quá mẫn do thuốc

Hội chứng quá mẫn do thuốc (DRESS hay DiHS hoặc HSS) thường xuất hiện

sau khi dùng thuốc 2 – 6 tuần. Giai đoạn đầu của DRESS có các triệu chứng như sốt;

nổi hạch bạch huyết; các triệu chứng giống cúm; đau rát, hoặc ngứa, có thể xuất hiện

trước khi có trợt loét da 2 tuần [66]. Các triệu chứng da trên lâm sàng gồm phù mặt,

đỏ da bong vảy toàn thân, phù ngoại biên, ban xuất huyết, mụn mủ và đôi khi bao

gồm cả dấu hiệu niêm mạc khu trú [67].

Các dấu hiệu đặc trưng của hội chứng DRESS là kết quả sự thâm nhiễm bạch

cầu ái toan hoặc các tế bào lympho. Tổn thương ở gan quan sát được ở hơn 80% các

bệnh nhân: chủ yếu là tổn thương tế bào gan, đôi khi ứ mật, hoặc cả hai, suy gan tối

cấp (hiếm gặp). Tổn thương ở thận đặc trưng bởi viêm thận kẽ. Tổn thương ở phổi

xuất hiện ở 15% các trường hợp DRESS, biểu hiện gồm: khó thở, ho, viêm phổi tăng

bạch cầu ái toan, và trường hợp hiếm gặp có thể suy hô hấp. Tổn thương ở tim như

viêm cơ tim và viêm màng ngoài tim với các bất thường ở điện tâm đồ, hình ảnh chụp

CT hoặc các enzym tim, có thể nguy hiểm đến tính mạng [66]. Tổn thương nội tạng

hiếm gặp như thần kinh, cơ bắp, hội chứng thực bào máu hoặc tụy là các tiên lượng

xấu [41].

1.1.2.3. Ban mụn mủ toàn thân cấp tính

Ban mụn mủ toàn thân cấp tính (AGEP) được coi là ít nghiêm trọng hơn SJS,

TEN và hội chứng DRESS. AGEP khởi phát sau khi dùng thuốc 2 – 11 ngày. Các

triệu chứng ở da phát triển đồng thời với sốt cao và dày đặc các mụn mủ nhỏ (ban

đầu là vô khuẩn, không có nang) bùng phát trên một vùng rộng các hồng ban phù nề,

có thể dẫn đến đỏ da toàn thân [55].

Các vị trí đầu tiên xuất hiện mụn mủ là các vị trí dễ bị hăm (nách và háng),

thân mình, và cẳng tay. Trong giai đoạn đầu, tập hợp các mụn mủ có thể dẫn đến

dương tính với dấu hiệu Nikolsky’s, sự bong tróc bề mặt da. Sự tróc vẩy sau mụn mủ

chỉ quan sát được ở giai đoạn muộn. Dưới 20% các trường hợp AGEP, các mụn mủ

hoặc vết loét phát triển trên các niêm mạc, thường là niêm mạc miệng. Tổn thương

nội tạng (tổn thương gan, thận hay phổi) cũng được mô tả nhưng hiếm gặp [43], [55].

1.1.3. Dịch tễ phản ứng có hại trên da nghiêm trọng do allopurinol

Hơn 100 loại thuốc đã được báo cáo liên quan tới SCARs, trong đó có

allopurinol [111]. Kể từ năm 1960, allopurinol là thuốc chỉ định đầu tay của các bác

sỹ để điều trị các trường hợp tăng acid uric máu như bệnh gút và hội chứng tiêu khối

u (Tumor lysis syndrome - TLS), hoặc sỏi thận kèm tăng uric niệu. Allopurinol được

sử dụng rộng rãi nhờ hiệu quả điều trị tốt và giá thành rẻ. Thuốc thường được dung

nạp tốt, chỉ có khoảng 1 - 5% bệnh nhân báo cáo có phản ứng nhẹ như rối loạn tiêu

hóa, sốt nhẹ và/hoặc có phát ban. SCARs do allopurinol dù hiếm gặp, với tỷ lệ chỉ

khoảng 2,02/1000 người mắc mới mỗi năm, nhưng tỷ lệ tử vong với những thể nặng

như SJS/TEN có thể từ 10% – 50% trên tổng số bệnh nhân SCARs phải nhập viện do

allopuriol, những bệnh nhân sống sót cũng phải chịu những tổn thương nghiêm trọng

[40], [143].

Nhiều nghiên cứu quy mô lớn đã được thực hiện trên thế giới để đánh giá dịch

tễ SCARs do allopurinol. Trong một nghiên cứu giám sát SCARs được thực hiện ở

sáu quốc gia Áo, Pháp, Đức, Israel, Ý và Hà Lan (nghiên cứu EuroSCAR) trong thời

gian từ 04/1997 tới 12/2001 [49], tất cả các bệnh nhân gặp ADRs, bệnh nhân điều trị

ngoại trú và bệnh nhân nhập viện vì các triệu chứng SCARs được phát hiện từ khoảng

1800 bệnh viện, trên số lượng khoảng 100 triệu dân. Kết quả thu được 379 bệnh nhân

SCARs (134 trường hợp SJS, 109 trường hợp TEN, 136 trường hợp SJS/TEN chồng

lấp) và 1505 bệnh nhân nhóm chứng. Nghiên cứu cho thấy allopurinol là thuốc liên

quan nhiều nhất tới nguy cơ SJS hoặc TEN tại châu Âu và Israel (OR = 18,0) với số

bệnh nhân sử dụng allopurinol trong nhóm SCARs và nhóm chứng chiếm tỷ lệ lần

lượt là 17,4% và 1,9% [49]. Một phân tích hồi cứu dữ liệu từ tháng 01/2006 đến tháng

12/2015 tại Bệnh viện Đa khoa Penang - Malaysia đã ghi nhận 189 trường hợp

SCARs trong tổng số 614.747 người nhập viện (chiếm 0,03%) [83]. Phân tích cho

thấy allopurinol là tác nhân gây SCARs đứng thứ 2 (chiếm 18,9%) trong số 228 thuốc

được ghi nhận. Hơn nữa, allopurinol cũng là tác nhân chính gây các thể SCARs nặng

nhất, với 20,1% (31/154) tổng số trường hợp SJS, TEN và SJS/TEN chống lấp; 45,8%

(11/24) trường hợp DRESS [83]. Năm 2021, một nghiên cứu toàn quốc về SCARs

của Hàn Quốc đã tổng hợp cơ sở dữ liệu đa trung tâm, thu thập được 745 trường hợp

SCARs từ năm 2010 đến 2015 của 34 bệnh viện đa khoa, trong đó 384 trường hợp

SJS/TEN và 361 trường hợp DRESS, liên quan tới 149 loại thuốc trên thị trường. Kết

quả cho thấy allopurinol là thuốc nguyên nhân gây SCARs nhiều nhất tại Hàn Quốc,

chiếm tới 14,0% [61].

Mặc dù allopurinol là thuốc nguyên nhân hàng đầu gây SCARs, đặc biệt là các

thể nghiêm trọng nhất (SJS và TEN) ở nhiều quốc gia trên thế giới [49], [61], [83]

nhưng tỷ lệ mắc SCARs do allopurinol giữa các chủng tộc khác nhau có chênh lệch

lớn. Yang và các cộng sự đã thực hiện một nghiên cứu hồi cứu dân số toàn quốc sử

dụng Cơ sở dữ liệu Nghiên cứu Bảo hiểm Y tế quốc gia Đài Loan (Taiwan National

Health Insurance Research Database), bao gồm Hồ sơ Y tế chi tiết của hơn 23 triệu

người đăng ký tham gia bảo hiểm [143]. Dữ liệu được thu thập từ ngày 01/01/2005

đến ngày 31/12/2011, cho kết quả tỷ lệ mắc mới SCARs do allopurinol là 2,02/1.000

người/năm [143]. Trong khi đó, tỷ lệ mắc mới SCARs do allopurinol trong một

nghiên cứu thuần tập sử dụng dữ liệu Medicaid (Hoa Kỳ) của 5 bang California,

Florida, New York, Ohio và Pennsylvania (1999 – 2005) với khoảng 13 triệu dân

thấp hơn đáng kể với tỷ lệ 0,69/1.000 người/năm [69]. Năm 2016, Lu và các cộng sự

[84] đã sử dụng cơ sở dữ liệu bệnh nhân nội trú trên toàn Hoa Kỳ (Nationwide

Inpatient Sample -NIS) từ năm 2009 đến 2013 và phát hiện 606 trường hợp nhập viện

do SJS/TEN liên quan tới phản ứng có hại của các thuốc làm giảm acid uric

(uratelowering drug adverse events – ULDAEs), trong đó người châu Á và người da

đen chiếm đa số (với tỷ lệ lần lượt là 27% và 26%), tỷ lệ người da trắng chỉ chiếm

29%. Ngoài ra, số liệu còn cho thấy các trường hợp nhập viện do mắc SJS/TEN liên

quan tới các thuốc làm giảm acid uric (uratelowering drug - ULD) cao nhất ở người

châu Á (11,9%), sau đó đến người da đen (5%), và thấp nhất là người da trắng (1%).

Như vậy, số bệnh nhân mắc SJS/TEN do ULDAEs ở người châu Á cao gấp khoảng

12 lần so với người Mỹ da trắng. Trong khi đó, theo điều tra dân số Hoa Kỳ, nhóm

người châu Á lại có tỷ lệ thấp nhất (5%), tiếp theo là người da đen (12%) và cao nhất

là người da trắng (67%). Ngoài ra, từ dữ liệu Khảo sát Sức khỏe và Dinh dưỡng Quốc

gia (National Health and Nutrition Examination Survey – NHANES) từ năm 2009 –

2012, allopurinol chiếm 96,8% trong các thuốc ULD tại Hoa Kỳ. Tỷ lệ chủng tộc của

nhóm bệnh nhân sử dụng allopurinol tại Hoa Kỳ theo NHANES 2011 – 2012 cho

thấy người châu Á có tỷ lệ thấp nhất (chỉ chiếm 2%), người da đen là 13%, và cao

nhất là người da trắng 81%; nhưng tỷ lệ nhập viện tương ứng liên quan tới SCARs

do allopurinol ở người châu Á lại chiếm tỷ lệ cao nhất (32,6%), tiếp theo là người da

đen (5,7%) và thấp nhất là người da trắng (1,0%). Cơ sở dữ liệu NIS kết hợp nhiều

nhóm người gốc châu Á đa dạng tại Hoa Kỳ (ví dụ: người Trung Quốc, người da đỏ

gốc Á, người Philippines, người Việt Nam, người Hàn Quốc và người Nhật Bản) lại

thành một nhóm. Do đó, kết quả nghiên cứu được xem xét như ảnh hưởng trung bình

của các nhóm người châu Á tại Hoa Kỳ. Kết quả phân tích của nghiên cứu cho thấy,

người châu Á và người da đen có nguy cơ mắc SJS/TEN liên quan tới ULDAEs cao

hơn đáng kể so với người da trắng. Với tỷ lệ sử dụng phổ biến trên thị trường Hoa

Kỳ và mối liên quan chặt chẽ với SJS/TEN, nghiên cứu cho thấy cần thận trọng khi

sử dụng allopurinol ở người châu Á và người da đen tại quốc gia này [84].

Tại Việt Nam, một nghiên cứu thực hiện trên 60 bệnh nhân SJS/TEN điều trị

nội trú tại Trung tâm Dị ứng – Miễn dịch lâm sàng, bệnh viện Bạch Mai, từ 07/2013

đến 07/2014 ghi nhận allopurinol là thuốc đứng đầu trong danh sách 33 thuốc gây

SJS/TEN, chiếm 21,7% (13/60) các trường hợp điều trị tại tâm trung tâm này [2].

Một nghiên cứu khác tổng hợp từ cơ sở dữ liệu các báo cáo ADRs tự nguyện giai

đoạn từ năm 2010 đến 2015 cho thấy trong 28.698 báo cáo ghi nhận 136 trường hợp

về SJS và TEN. Các trường hợp SJS/TEN liên quan tới allopurinol là 11,03%

(15/136) đứng thứ 3 trong số các thuốc được báo cáo nhiều nhất, với ROR (95% CI)

= 4,2 (2,2 – 7,59 ) (tỷ suất chênh ghi nhận – Reporting odds ratio) [101].

Như vậy, với kết quả các nghiên cứu đã công bố, có thể thấy người Việt Nam

là một trong những chủng tộc người châu Á có nguy cơ cao mắc SCARs do

allopurinol [84]. Trên thực tế, allopurinol hiện là một trong những thuốc gây SCARs

nhiều nhất tại Việt Nam [2], [101]. Tuy nhiên, đây là một thuốc điều trị tăng acid uric

máu được chỉ định phổ biến ở nhiều nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam.

Chính vì vậy, Việt Nam cần có những nghiên cứu đánh giá các yếu tố nguy cơ liên

quan tới SCARs do allopurinol để hướng tới thay đổi trong thực hành lâm sàng, nhằm

đảm bảo hiệu quả điều trị và giảm thiểu các phản ứng có hại.

1.1.4. Cơ chế phân tử của SCARs do allopurinol

Theo phân loại của Rawlins và Thompson [107], SCARs là ADRs týp B – týp

không thể dự đoán trước, cơ chế bệnh học phân tử chưa được biết đầy đủ, liên quan

tới hoạt hóa miễn dịch với các triệu chứng lâm sàng tương ứng với các mức độ hoạt

hóa. Mối liên quan chặt chẽ giữa SCARs và kháng nguyên bạch cầu người (Human

Leukocyte Antigen - HLA), đặc biệt là HLA lớp I bắt đầu được phát hiện vào đầu

những năm 2000 với các công bố về mối liên quan giữa hội chứng quá mẫn do

abacavir ở người da trắng và cabamazepin ở người châu Á với 2 alen tương ứng là

HLA-B*57:01 [52], [87] và HLA-B*15:02 [30]. Các năm sau đó, nhiều nghiên cứu

sàng lọc hàng loạt các alen HLA lớp I cũng như các nghiên cứu gen dược đã tìm thấy

3 alen có liên quan tới nguy cơ SCARs do allopurinol: HLA-A*33:03, HLA-B*58:01,

và HLA-C*03:02 [34], [56], [62], [132]. Tuy nhiên, cơ chế bệnh học phân tử SCARs

do allopurinol liên quan tới các alen này còn chưa được hiểu rõ, và hiện chỉ có mô

hình tương tác dược lý của thuốc với thụ thể miễn dịch “P-I” (Pharmacological

interaction of drugs with immune receptor – “P-I”) được đề xuất để giải thích cơ chế

SCARs do allopurinol liên quan tới alen HLA-B*58:01 [16], [40], [138].

Về cơ bản, các phân tử HLA được biểu hiện bởi các alen HLA tham gia vào

phản ứng quá mẫn với thuốc trong giai đoạn trình diện kháng nguyên của các đáp

ứng miễn dịch qua trung gian tế bào T [99]. Allopurinol/oxypurinol (chất chuyển hóa

của allopurinol trong huyết tương) được các tế bào trình diện kháng nguyên (antigen

presenting cells – APCs) trình diện cho tế bào T mà không cần thông qua quá trình

xử lý kháng nguyên nội bào [108], [127].

Để tìm hiểu cơ chế bệnh sinh SCARs do allopurinol, Yun và các cộng sự [150]

đã thực hiện một thử nghiệm bằng cách sử dụng các tế bào đơn nhân máu ngoại vi

(peripheral blood mononuclear cells – PBMCs) thu được từ bệnh nhân và phát hiện

allopurinol/oxypurinol có tương tác không cộng hóa trị – tương tác dược lý “P-I” với

HLA-B*58:01 (protein được biểu hiện bởi alen HLA-B*58:01) trong túi F của rãnh

liên kết peptid, dẫn tới kích hoạt các tế bào T đặc hiệu.

Trong SCARs do allopurinol, tế bào T đặc hiệu với allopurinol cũng đã được

phát hiện nhưng các tế bào T này có tính đặc hiệu kháng nguyên alen thấp (low

allotype specific) [149], [150]. Trong khi đó, oxypurinol – chất chuyển hóa của

allopurinol trong huyết tương được cho là chất có vai trò chính gây khởi phát hầu hết

các đáp ứng miễn dịch bởi các tế bào T “phụ thuộc HLA-B*58:01” (HLA-B*58:01-

restricted T-cell). Tế bào T “phụ thuộc HLA-B*58:01” là nhóm các tế bào T có thụ

thể đặc hiệu khác nhau (T-cell receptors – TCR) nhưng cùng nhận diện oxypurinol

thông qua “phức hợp đặc hiệu giữa oxypurinol và HLA-B*58:01” – phức hợp được

hình thành bởi liên kết không cộng hóa trị hay tương tác dược lý “P-I” [149], [150].

Bên cạnh đó, kết quả nhiều nghiên cứu cho thấy sự nhận diện của tế bào T đặc

hiệu oxypurinol cũng thông qua tương tác không cộng hóa trị “P-I” giữa TCR với

“phức hợp oxypurinol – HLA-B*58:01” [31], [80]. Phân tích đột biến R97V (thay

thế acid amin Arg ở vị trí 97 bằng Val) – vị trí liên quan tới rãnh gắn kháng nguyên

của phân tử HLA-B*58:01, làm giảm hoạt hóa tế bào T. Các mô hình sàng lọc ảo in

silico cho thấy rãnh gắn kháng nguyên của HLA-B*58:01 có vai trò như một vị trí

lắp ghép của oxypurinol. Các mô hình này cho thấy ở nồng độ cao, oxypurinol có thể

tích hợp với “peptid rãnh” của HLA – trên bề mặt tế bào, làm thay đổi cấu trúc của

peptid – tạo thành những kháng nguyên mới được nhận diện bởi các TCR [31], [149],

[150]. Sau khi allopurinol, đặc biệt là oxypurinol được nhận diện bởi nhóm tế bào T

“phụ thuộc HLA-B*58:01”, dòng thác tín hiệu miễn dịch được khởi phát, dẫn đến sự

gia tăng của tế bào T – CD8 và nhiều tế bào miễn dịch khác, đồng thời hàng loạt các

cytokin gây viêm được giải phóng và kết quả là hình thành các týp SCARs khác nhau

trên lâm sàng, tùy thuộc các tế bào miễn dịch và các cytokin liên quan [5], [40], [148]

(Hình 1.1).

Hình 1.1. Mô hình tương tác dược lý "P-I" được đề xuất để giải thích cơ chế

Allopurinol/oxypurinol – chất chuyển hóa của nó được trình diện trực tiếp với TCR mà không cần qua quá

trình xử lý nội bào. Allopurinol/oxypurinol liên kết với HLA-B*58:01 bằng liên kết không cộng hóa trị. Tương

tác giữa TCR và phức hợp oxypurinol – HLA-B*58:01 là tương tác dược lý “P-I”. SJS/TEN, hội chứng Stevens-

Johnson/hoại tử biểu bì nhiễm độc; DRESS, phản ứng thuốc có tăng bạch cầu ái toan và các triệu chứng toàn

thân; AGEP, ban mụn mủ toàn thân cấp tính; APC, tế bào trình diện kháng nguyên; P-I, mô hình tương tác

dược lý.

phân tử của SCARs do allopurinol [16], [99].

1.2. Tổng quan về các alen HLA lớp I

1.2.1. Giới thiệu chung về siêu họ gen HLA

HLA là siêu họ gen mã hóa phức hợp hòa hợp tổ chức chính (Major

Histocompatibility Complex - MHC) hay còn được gọi là kháng nguyên bạch cầu

người (Human Leucocyte Antigen - HLA) trải dài khoảng 4 Mbp trên nhánh ngắn của

nhiễm sắc thể số 6 (6p21.1 – 6p21.3). Siêu họ gen HLA này chỉ chiếm khoảng 0,1%

chiều dài bộ gen người nhưng lại chứa khoảng 0,6% tổng số gen người đã được xác

định. Do đó, có thể nói HLA là hệ thống gen có mật độ gen dày đặc nhất trong bộ gen

người [18].

Siêu họ gen HLA được chia làm 3 lớp, với thứ tự từ tâm động (centromere)

đến đầu mút (telomere) lần lượt là lớp II, lớp III và lớp I (Hình 1.2). Mỗi lớp chứa

nhiều gen mã hóa cho các protein tham gia vào hoạt động của hệ miễn dịch, bao gồm:

▪ HLA lớp I: được phân thành nhiều týp. Trong đó, 3 týp chính HLA-A, HLA-B,

HLA-C liên quan nhiều nhất đến các phản ứng thuốc, chứa các gen mã hóa cho

chuỗi nặng α của các phân tử MHC lớp I “cổ điển”. Các týp HLA lớp I khác gồm

HLA-E, HLA-G, HLA-F [7], [8].

▪ HLA lớp II: gồm các týp HLA-DR, HLA-DP, và HLA-DQ chứa các gen mã hóa

cho chuỗi nặng α và chuỗi nhẹ β của phân tử MHC lớp 2. Một số gen HLA lớp II

khác mã hóa các protein hỗ trợ quá trình xử lý và trình diện kháng nguyên [7], [8].

▪ HLA lớp III: nằm giữa HLA lớp I và HLA lớp II, không chứa gen mã hóa cho các

phân tử MHC mà mã hóa các thành phần bổ thể và các cytokin như chất bổ thể B

(Complement factor B – CFB) và nhóm các yếu tố hoại tử u (Tumor necrosis

factor – TNF) – có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch [7], [8].

HLA nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6, tại vị trí 6p21 – 21.3, gồm 3 lớp HLA lớp I, lớp II và lớp

III. HLA lớp I có 3 týp chính HLA-A, HLA-B, HLA-C liên quan nhiều nhất đến phản ứng dị ứng thuốc.

Hình 1.2. Sơ đồ vùng gen HLA trên nhiễm sắc thể số 6 [98]

1.2.2. Danh pháp alen HLA

Các alen HLA được đặt tên thông qua hệ thống danh pháp HLA gồm các danh

mục chi tiết và được áp dụng rộng rãi. Mỗi alen HLA có một danh pháp duy nhất chứa

các bộ số, phân tách nhau bằng dấu hai chấm “:”, độ dài danh pháp alen HLA phụ

thuộc vào trình tự alen HLA và alen HLA liên quan gần nhất của nó. Tất cả các alen

có danh pháp gồm ít nhất 4 chữ số, tương ứng với 2 bộ số đầu tiên (2 field); tên gọi

dài hơn chỉ được thêm khi cần thiết (Hình 1.3) [154].

Hình 1.3. Danh pháp alen HLA [154]

Ý nghĩa của từng bộ số trong danh pháp alen HLA cụ thể như sau [90], [154]:

▪ Bộ số đầu tiên trước dấu “:” (field 1): chỉ alen HLA được phân nhóm bằng kỹ

thuật huyết thanh. Alen HLA có độ phân giải ở bộ số đầu tiên được gọi là mức độ

phân giải thấp (1 field) [128].

▪ Bộ số thứ hai (field 2): chỉ nhóm alen, là số thứ tự mà trình tự ADN của alen HLA

được xác định. Các alen HLA khác nhau ở 2 bộ số đầu tiên sẽ khác nhau về một

nucleotid hoặc nhiều hơn dẫn tới sự khác nhau trong trình tự acid amin của chuỗi

protein được biểu hiện [128].

Các phương pháp xác định alen HLA có độ phân giải từ bộ số thứ hai đến bộ số

thứ 4 được gọi là mức độ phân giải cao với các mức độ tương ứng từ 2 - 4 field

[128]. Các nghiên cứu về mối liên quan giữa các alen HLA với nguy cơ phản ứng

có hại của thuốc chỉ quan tâm tới mức độ phân giải 2 field (cấu trúc protein HLA

được biểu hiện bởi alen HLA tương ứng) [44].

▪ Bộ số thứ 3 (field 3): phân biệt các alen HLA chỉ khác nhau bởi thay thế các

nucleotid tương đồng (hay còn gọi là các thay thế im lặng/không mã hóa) trong

vùng trình tự mã hóa.

▪ Bộ số thứ 4 (field 4): Phân biệt các alen HLA chỉ khác nhau bởi đa hình trình tự

trong các vùng intron, hoặc ở vùng không mã hóa liền kề đầu 5’ và vùng không

mã hóa liền kề đầu 3’ của gen HLA (5’ and 3’ flank regions).

Ngoài dãy số duy nhất ứng với mỗi alen HLA, khi cần thiết, hậu tố có thể được

thêm vào biểu thị trạng thái biểu hiện của alen HLA đó. Các hậu tố trong danh pháp

alen HLA là những chữ cái viết hoa, bao gồm:

▪ Hậu tố N – “Null”: được thêm vào danh pháp của alen HLA đã được chứng minh

không biểu hiện gen.

▪ Hậu tố L – “Low”: được thêm vào danh pháp của alen HLA đã được chứng minh

có tỷ lệ biểu hiện gen trên bề mặt tế bào thấp hơn so với mức bình thường.

▪ Hậu tố S – “Secreted”: được thêm vào danh pháp của alen HLA biểu hiện các

protein dạng phân tử hòa tan mà không biểu hiện trên bề mặt tế bào.

▪ Hậu tố C – “Cytoplasm”: được thêm vào danh pháp của alen HLA biểu hiện các

protein có mặt trong bào tương mà không biểu hiện trên bề mặt tế bào.

▪ Hậu tố A – “Aberrant”: được thêm vào danh pháp của alen HLA còn nghi ngờ về

khả năng có biểu hiện protein hay không.

▪ Hậu tố Q – “Questionable”: được thêm vào danh pháp của alen HLA có biểu hiện

đáng ngờ do đột biến tìm thấy ở những alen HLA này có thể ảnh hưởng tới mức

độ biểu hiện bình thường của các alen HLA khác [128].

1.2.3. Đặc điểm của siêu họ gen HLA

Siêu họ gen HLA là hệ thống gen phức tạp nhất trong bộ gen người, với những

đặc điểm nổi bật [7], [8]:

▪ Mật độ gen dày đặc (cứ khoảng ~ 15 kb lại xuất hiện một locus trên toàn bộ chiều

dài vùng gen), với tỷ lệ cao các gen có vai trò trực tiếp hoặc gián tiếp trong hoạt

động miễn dịch bẩm sinh hoặc miễn dịch thu được [119].

▪ Là các gen giàu GC (> 60%) [7].

▪ Chiều dài đoạn trình tự đặc trưng cho gen ngắn (< 1 kb). Vùng đa hình đặc trưng

của các alen HLA lớp I tập trung tại exon 2 và exon 3, kích thước đoạn exon 2 –

exon 3 ~ 900 bp [7].

▪ Mỗi alen HLA của một cá thể có thể chứa tới 50 – 60 đa hình đơn nucleotid (single-

nucleotid polymorphism – SNP). Các SNP liên kết với nhau tạo thành các cụm

(block) hay còn gọi là các “motif trình tự” khác nhau. Các “motif trình tự” này

ghép nối với nhau tạo thành một alen HLA, hay nói cách khác, mỗi alen HLA của

một cá thể thực chất chính là một tổ hợp phức tạp của nhiều SNP. Số lượng alen

của mỗi týp HLA là tổng số tổ hợp của các “motif trình tự” [7], [20]. Theo thống

kê của Robinson J. và các cộng sự, tính đến 2020, cơ sở dữ liệu HLA IPD-

IMGT/HLA đã ghi nhận mỗi týp HLA có thể có vài nghìn alen HLA đa hình khác

nhau, ví dụ: týp HLA-A có 5266 alen, týp HLA-B có 6537 alen và týp HLA-C có

5140 alen [110]. Số lượng các alen HLA mới được phát hiện mỗi năm vẫn liên tục

tăng lên cho thấy sự đa hình rất phức tạp của siêu họ gen này [154].

▪ Các gen HLA liên kết chặt chẽ với nhau tạo thành các HLA haplotype và các HLA

haplotype này được di truyền từ bố mẹ cho con theo bộ đơn bội (theo định luật di

truyền của Menden). Ví dụ: hai anh em ruột sẽ có 25% cơ hội có kiểu gen HLA

giống hệt nhau, 50% cơ hội có kiểu gen đơn bội giống nhau và 25% có HLA

haplotype khác nhau hoàn toàn (Hình 1.4). Sự kết hợp ngẫu nhiên của các týp

HLA khác nhau để tạo thành một HLA haplotype là rất lớn, nhưng một số HLA

haplotype nhất định được tìm thấy có tần suất cao hơn so với xác suất ngẫu nhiên

ở một số quần thể. Hiện tượng này được gọi là mất cân bằng liên kết (linkage

disequilibrium – LD). Ví dụ HLA-A1, B8, DR17 là kiểu HLA haplotype phổ biến

nhất của người da trắng, với tần suất 5% [7], [28].

Các kiểu HLA haplotype và các kiểu gen từ dữ liệu kiểu hình của một gia đình: Kiểu hình HLA của người cha

là HLA-A1, HLA-A3; HLA-B7, HLA-B8; HLA-DR15, HLA-DR17; kiểu gen là A1, B8, DR17/A3, B7, DR15.

Kiểu hình HLA của người mẹ là HLA-A2, HLA-A29; HLA-B44, HLA-B44; HLA-DR4, HLA-DR7; kiểu gen là

A2, B44, DR4/A29, B44, DR7. Các HLA haplotype của người cha được ký hiệu lần lượt là A1, B8, DR17 ("a")

và A3, B7, DR15 ("b"); và các HLA haplotypes của người mẹ là A2, B44, DR4 ("c") và A29, B44, DR7 ("d").

Hình 1.4. Các HLA haplotype di truyền trong một gia đình theo định luật Menden [28]

1.2.4. Vị trí, cấu trúc gen HLA lớp I

Gen HLA lớp I được chia thành 3 týp chính, bao gồm HLA-A, HLA-B và HLA-

C, được quan tâm và nghiên cứu nhiều nhất do có liên quan với nguy cơ mắc nhiều

bệnh di truyền, hiện tượng đào thải ở bệnh nhân ghép tạng [7], [28] và phản ứng có

hại của thuốc [42], [44].

1.2.4.1. Vị trí gen HLA lớp I

▪ Gen HLA-A nằm trên nhiễm sắc thể số 6, tại vị trí 6p22.1, trải dài từ nucleotid

Vị trí của gen HLA lớp I trên nhiễm sắc thể số 6 lần lượt như sau [160]:

▪ Gen HLA-B nằm trên nhiễm sắc thể số 6, tại vị trí 6p22.33, trải dài từ nucleotid

31321649 đến nucleotid 31324989, có chiều dài 3341 bp.

▪ Gen HLA-C nằm trên nhiễm sắc thể số 6, tại vị trí 6p22.33, trải dài từ nucleotid

31236526 đến nucleotid 31239907, có chiều dài 3382 bp.

29909037 đến nucleotid 29913661, có chiều dài 4625 bp.

1.2.4.2. Cấu trúc – chức năng gen HLA lớp I

▪ Cấu trúc của gen HLA lớp I

Ba týp HLA-A, HLA-B, HLA-C của HLA lớp I có cấu trúc chung là chuỗi ADN

gồm 8 đoạn exon được xen kẽ bởi các intron. Mỗi đoạn exon của HLA lớp I đảm

o Exon 1 mã hóa trình tự mở đầu của protein tương ứng;

o Exon 2, 3, 4 mã hóa lần lượt miền α1, 2, và 3;

o Exon 5 mã hóa phần xuyên màng;

o Exon 6, 7, 8 mã hóa phần đuôi nằm trong bào tương.

nhiệm một chức năng riêng biệt (Hình 1.5) [20]:

Đa hình tập trung chủ yếu ở exon 2 và exon 3. α1, α2, α3 mã hóa miền α1, α2, α3. CP (Cytoplasmic part) mã

hóa phần đuôi nằm trong bào tương. UT (Untranslated region): vùng không mã hóa. E: exon. I: intron. SP

(Signal peptide): mã hóa peptid tín hiệu. TM (Transmem-brane part) mã hóa phần xuyên màng.

Hình 1.5. Cấu trúc chung của gen HLA lớp I [20]

▪ Chức năng của gen HLA lớp I và protein HLA tương ứng

Những chuỗi peptid được biểu hiện bởi gen HLA lớp I tạo thành chuỗi nặng α

của phân tử MHC I trưởng thành và xác định kiểu hình của phân tử HLA (ví dụ như

phân tử HLA- A1 hay HLA- A2). Chuỗi nặng α liên kết không cộng hóa trị với chuỗi

nhẹ β2 microglobulin – gen mã hóa chuỗi nhẹ β2 nằm trên nhiễm sắc thể số 15 (Hình

1.6) [153].

Việc phân định được cấu trúc 3 chiều của phân tử HLA-A2 năm 1987 [19] là

mấu chốt để hiểu được mối quan hệ cấu trúc – chức năng của các phân tử MHC lớp

I. Nghiên cứu mang tính bước ngoặt này cho thấy các phân tử MHC lớp I có cấu trúc

gồm 2 vùng xoắn α (α-helical region) trùm lên 8 sợi gấp nếp β, tạo thành rãnh peptid

của phân tử MHC lớp I – “rãnh gắn kháng nguyên” (Hình 1.6). Vùng gen mã hóa cho

“rãnh gắn kháng nguyên” (exon 2 – exon 3) của gen HLA lớp I có tính đa hình cao,

các alen đa hình khác nhau của gen HLA lớp I thường do vùng này của gen tạo nên

[19], [20], [94]. Các alen đa hình của gen HLA lớp I có thể tạo ra các peptid khác

nhau từ 1 đến 20 acid amin. Chuỗi peptid “rãnh gắn kháng nguyên” của phân tử MHC

lớp I liên kết với kháng nguyên thông qua tương tác với từng acid amin trong đoạn

peptid rãnh, vì vậy, bất kỳ sự thay đổi acid amin nào của các alen HLA đa hình cũng

ảnh hưởng tới tính đặc hiệu của liên kết giữa phân tử MHC lớp I và kháng nguyên

được trình diện [13], [47].

Phân tử MHC I gồm 2 phần: chuỗi nặng α liên kết không cộng hóa trị với chuỗi nhẹ β2 microglobulin. Gen

HLA lớp I mã hóa chuỗi nặng α nằm trên nhiễm sắc thế số 6; gen mã hóa chuỗi nhẹ β2 nằm trên nhiễm sắc

thể số 15. Chuỗi nặng α chia thành 4 phần: miền α1, α 2, và α3 nằm ngoài tế bào, phần xuyên màng với phần

đuôi nằm trong bào tương. Rãnh gắn kháng nguyên nằm giữa miền α1, 2 có tính đa hình cao.

Hình 1.6. Cấu trúc phân tử MHC lớp I [153]

Các phân tử MHC lớp I xuất hiện trên bề mặt hầu hết các tế bào có nhân, làm

nhiệm vụ trình diện kháng nguyên cho các tế bào T – CD8+ (tế bào T độc). Nếu

kháng nguyên được trình diện bởi các phân tử MHC lớp I là những đoạn peptid thoái

hóa từ các protein cũ của tế bào chủ sẽ được các tế bào miễn dịch nhận diện là “tự

thân” (self). Trong khi đó, nếu một tế bào bị nhiễm bệnh, các peptid lạ gắn với phân

tử MHC lớp I sẽ được thụ thể trên bề mặt tế bào T – CD8+ (TCR) nhận diện “không

phải ta” (nonself) và kích thích phản ứng miễn dịch để tiêu diệt tế bào bị nhiễm bệnh

[33]. Bên cạnh việc tạo ra các peptid có khả năng trình diện kháng nguyên giúp bảo

vệ cơ thể, các alen HLA lớp I đa hình cũng có sự liên quan mật thiết tới tính nhạy cảm

và khả năng kháng bệnh cũng như những phản ứng có hại khi dùng thuốc. Chính vì

vậy, ngoài các lĩnh vực cấy ghép, khả năng kháng bệnh, hay bệnh liên quan tới di

truyền, gen HLA lớp I còn rất được quan tâm nghiên cứu trong lĩnh vực gen dược

[21], [33], [44].

1.3. Các nghiên cứu về alen HLA lớp I có liên quan với nguy cơ SCARs do

allopurinol

1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới

Mối liên quan giữa những alen HLA lớp I đa hình và nguy cơ SCARs do

allopurinol đã được nghiên cứu rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới như Đài Loan,

Thái Lan, Nhật Bản, Hồng Kông, Ý, Bồ Đào Nha …[27], [34], [46], [56], [62], [131],

[132] (Bảng 1.1).

Bảng 1.1. Các nghiên cứu về alen HLA lớp I liên quan tới nguy cơ SCARs do

allopurinol trên thế giới

Tỷ lệ alen nguy cơ

Týp SCAR

OR

Giá trị p

Dân tộc

TLTK

95% khoảng tin cậy

Alen HLA nguy cơ

Nhóm bệnh

Nhóm chứng

SJS/TEN DRESS

51/51 20/135

580,3

[56]

8,1 x 10-18

SJS/TEN

7/54

27/27

348,3

[131]

1,61 x 10

-13

HLA- B*58:01

SJS/TEN DRESS

19/19

4/30

123,5

[27]

p < 10

-4

Đài loan Thái lan Hồng Kong

34,4 – 9780,9 19,2 – 6336,9 12,8 – 1195,1

SJS/TEN DRESS

10/36

6/986

62,8

[132]

Nhật bản

21,2 – 185,8

5,388 -12

x 10

HLA- B*58:01

SJS/TEN DRESS

19/31

20/62

[82]

p < 10

-6

34 – 187

SJS/TEN

16/25

1/23

39,11

5,9 x 10-4

[46]

4,49 – 340,51

Châu Âu Bồ Đào Nha

SJS/TEN

3/7

6/115

13,625

0,248

[34]

22/25

7/57

82,1

9,39x10-11

[62]

SJS/TEN

DRESS

2,774 – 69,448 15,8 – 426,5

SJS/TEN

34/51 24/135

9,3

2,2x10-4

[56]

HLA- A*33:03

SJS/TEN

8/36

78/986

3,32

0,0077

[132]

Hàn quốc Đài loan Nhật bản

SJS/TEN DRESS

2/7

0/115

∞

0,0011

[34]

1,46 – 7,54 10,115 – ∞

SJS/TEN

48/51 19/135

97,7

1,4x10-19

[56]

Đài loan

Tỷ lệ alen nguy cơ

Týp SCAR

OR

Giá trị p

Dân tộc

Alen HLA nguy cơ

95% khoảng tin cậy

TLTK

Nhóm bệnh

Nhóm chứng

SJS/TEN DRESS

23/25

15/57

20,5

3,31x10-6

[62]

Hàn quốc

∞

SJS/TEN DRESS

2/7

0/115

0,0011

[34]

HLA- C*03:02

5,4- 78,6 10,115 -∞

SJS/TEN DRESS

10/36

0/234

[132]

Nhật bản

5,303 x 10-10

Từ Bảng 1.1, có thể thấy, trong 3 alen HLA lớp I, alen HLA-B*58:01 được

quan tâm và nghiên cứu nhiều nhất. Các nghiên cứu ở nhiều nước châu Á và châu Âu

đều ghi nhận mối liên quan giữa alen này với nguy cơ SCARs do allopurinol. Tuy

nhiên, tỷ số OR được ghi nhận ở các nước châu Á (ngoại trừ Nhật Bản) cao hơn rõ

rệt so với tỷ số OR ghi nhận ở các nước châu Âu. Các nước như Bồ Đào Nha, Nhật

Bản ghi nhận tỷ số OR thấp đều là những nước có tần suất alen HLA-B*58:01 thấp

trong cộng đồng (1,96% và 0,6%). Ngoài ra, từ phân tích tổng hợp năm 2016 [141]

với 21 nghiên cứu trên thế giới, bao gồm 551 bệnh nhân bị cADRs do allopurinol,

2370 bệnh nhân dung nạp với allopurinol và 9592 người tình nguyện khỏe mạnh một

lần nữa khẳng định alen HLA-B*58:01 là chỉ dấu có độ nhạy và độ đặc hiệu cao (lần

lượt là 93% và 89%) để phát hiện nguy cơ SCARs do allopurinol, đặc biệt ở người

gốc châu Á. Điều này được lý giải bởi tần suất alen HLA-B*58:01 cao nhất ở các

quần thể người châu Á (11 – 20%) [104]. Năm 2016, một nghiên cứu bệnh – chứng

thực hiện bởi Chau Y.N và cộng sự trên 146 bệnh nhân cADRs do allopurinol và 285

bệnh nhân dung nạp đã cho thấy yếu tố di truyền có vai trò chính trong nguy cơ gây

SCARs do allopurinol [95]. Điều này thể hiện ở OR của những bệnh nhân suy giảm

chức năng thận giai đoạn cuối (eGFR < 30 mL/phút/1,76 m2) và âm tính với alen

HLA-B*58:01 là 3,82 (95% CI: 1,8 – 8,3; p < 0,001) thấp hơn nhiều so với OR của

nhóm bệnh nhân có chức năng thận bình thường nhưng có mang dị hợp tử của alen

HLA-B*58:01 là 15,25 (95% CI: 8,4 – 27,7; p < 0,001); ngoài ra, khi so sánh AUC

của đường cong ROC giữa 2 nhóm cho thấy alen HLA-B*58:01 có khả năng tiên đoán

nguy cơ SCARs do allopurinol tốt hơn so với yếu tố chức năng thận [95].

Đặc biệt, một nghiên cứu can thiệp thực hiện tại Đài Loan trên gần 3000 bệnh

nhân lần đầu tiên được chỉ định allopurinol. Các bệnh nhân này được xét nghiệm sàng

lọc alen HLA-B*58:01 và từ đó bác sĩ điều chỉnh thuốc thay thế cho những bệnh nhân

có kết quả dương tính với alen HLA-B*58:01. Kết quả của nghiên cứu can thiệp này

là không có trường hợp SCARs nào trong số gần 3000 bệnh nhân tham gia nghiên

cứu [71]. Năm 2013, CPIC (Clinical pharmacogenetics implementation consortium –

Tổ chức thực hành gen dược trên lâm sàng) đã đưa ra khuyến cáo bổ sung chống chỉ

định dùng allopurinol đối với bệnh nhân mang alen HLA-B*58:01 [51]. Hiện nay,

nhiều bệnh viện của Đài Loan, Thái Lan, Singapore… đã áp dụng xét nghiệm alen

HLA trước khi dùng thuốc để ngăn ngừa nguy cơ dị ứng thuốc [126].

Ngoài alen HLA-B*58:01, hai alen HLA-A*33:03 và HLA-C*03:02 cũng được

chứng minh có liên quan đến nguy cơ SCARs do allopurinol (Bảng 1.1). Theo các

nghiên cứu này, các nhóm tác giả cho rằng sự liên quan giữa 2 alen HLA-A*33:03 và

HLA-C*03:02 với nguy cơ SCARs do allopurinol có thể do mất cân bằng liên kết

(linkage disequilibrium - LD) với alen HLA-B*58:01, hay nói cách khác tần suất 2

alen HLA-A*33:03 và HLA-C*03:02 di truyền cùng alen HLA-B*58:01 cao hơn so

với tần suất ngẫu nhiên [34]. Nghiên cứu của Kang [62] và Hung S.I [56] cũng đưa

ra báo cáo tương tự: dữ liệu từ quần thể nghiên cứu của Kang và Hung cho thấy có

sự mất cân bằng liên kết giữa HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02 (0,98%) [62], trong

khi haplotype phổ biến trong quần thể nghiên cứu là A*33:03 - C*03:02 - B*58:01

(17,2%) [56]. Tuy nhiên, khác với alen HLA-B*58:01, dữ liệu cũng như các nghiên

cứu về 2 alen HLA-A*33:03 và HLA-C*03:02 vẫn còn rất hạn chế, nên vẫn cần có

những nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn để đánh giá mối liên quan giữa 2 alen này với

nguy cơ SCARs do allopurinol.

Từ các công bố trên, có thể thấy, nghiên cứu về các alen HLA lớp I liên quan

tới nguy cơ SCARs do allopurinol đã được thế giới quan tâm từ lâu và không chỉ

dừng ở việc chứng minh mối liên quan giữa các alen HLA đa hình này với nguy cơ

SCARs do allopurinol, mà đã tiến tới áp dụng xét nghiệm sàng lọc alen HLA*58:01

trên lâm sàng để dự đoán và ngăn ngừa nguy cơ SCARs do allopurinol cho người

bệnh.

Bên cạnh đó, do tần suất của các alen HLA lớp I ở các chủng tộc khác nhau là

khác nhau nên nhiều nước trên thế giới đã sàng lọc hàng loạt alen HLA để xác định

tần suất các alen HLA trong cộng đồng, làm cơ sở dữ liệu cho nghiên cứu về mối liên

quan giữa các alen HLA với nguy cơ bệnh tật nói chung và phản ứng thuốc nói riêng.

Kết quả một số nghiên cứu cho thấy 3 alen HLA lớp I: HLA-B*58:01, HLA-A*33:03

và HLA-C*03:02 có tần suất cao ở người châu Á (Bảng 1.2) [155], hay nói cách khác

người châu Á có nguy cơ cao mắc SCARs do allopurinol [155].

Bảng 1.2. Các nghiên cứu về tần suất 3 alen HLA lớp I ở các nước trên thế giới [155]

Alen

n

Tần suất alen (%)

HLA-A*33:03

HLA-B*58:01

HLA-C*03:02

Quốc gia – dân tộc Đài loan – Hán Thái lan Ấn độ Trung Quốc- Hán Hàn quốc Đức Kenya Brazil Đài loan- Hán Thái lan Ấn độ Trung Quốc –Hán Hàn quốc Đức Kenya Brazil Đài loan – Hán Thái lan Ấn độ Trung Quốc – Hán Hàn quốc Đức Kenya Brazil

504 142 71 284 485 8862 2161 108 504 142 71 284 485 8862 2179 108 504 142 71 284 485 8862 2152 108

11,8 12,7 6,1 11,5 16,3 0,044 1,16 3,0 10,6 7,7 6,8 8,9 6,5 0,081 4,68 2,2 10,5 8,1 4,5 8,7 10,8 0,38 1,12 0

Phương pháp sàng lọc SSOP – PCR SSOP – PCR SSOP – PCR SSOP – PCR SSOP – PCR SBT SBT SSOP – PCR SSOP – PCR SSOP – PCR SSOP – PCR SSOP – PCR SSOP – PCR SBT SBT SSOP – PCR SSOP – PCR SSOP – PCR SSOP – PCR SSOP – PCR SSOP – PCR SBT SBT SSOP – PCR

SSOP – PCR: Sequence-specific Oligonucleotide Probes Polymerase chain reaction (PCR với đầu dò

oligonucleotid có trình tự đặc hiệu)

SBT: Sequencing base typing (Giải trình tự gen)

1.3.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam

Cho đến nay, Việt Nam mới có 2 nghiên cứu về sự phân bố của các alen HLA

lớp I trong quần thể người Kinh Việt Nam (Bảng 1.3).

Bảng 1.3. Các nghiên cứu về tần suất 3 alen HLA lớp I trong cộng đồng người

Kinh Việt Nam [36], [11]

Alen

Khu vực thu mẫu

n

Tần suất alen (%)

HLA-A*33:03

HLA-B*58:01

HLA-C*03:02

Phương pháp sàng lọc SSOP – PCR NGS SSOP – PCR NGS SSOP – PCR NGS

Miền Bắc Miền Nam Miền Bắc Miền Nam Miền Bắc Miền Nam

170 101 170 101 170 101

11,5 10,89 6,5 8,4 6,8 8,9

SSOP – PCR: Sequence-specific Oligonucleotide Probes – Polymerase chain reaction (PCR với đầu dò

oligonucleotid có trình tự đặc hiệu).

NGS: Next Generation Sequencing (Giải trình tự gen thế hệ mới).

Nghiên cứu đầu tiên của nhóm tác giả Bạch Khánh Hòa [11] thực hiện trên

170 người Kinh ở Hà Nội cho kết quả tần suất 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01,

HLA-C*03:02 lần lượt là 11,5%, 6,5%, 6,8%. Nghiên cứu thứ hai của nhóm tác giả

Đỗ Đức Minh [36] thực hiện trên 101 người Kinh tại miền Nam Việt Nam cho kết

quả tần suất 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01, HLA-C*03:02 lần lượt là 10,89%,

8,4%, 8,9%. Như vậy, hai nghiên cứu này đều cho thấy 3 alen HLA-A*33:03, HLA-

B*58:01 và HLA-C*03:02 (đã được nhiều nghiên cứu trên thế giới chứng minh có

liên quan tới nguy cơ SCARs do allopurinol) xuất hiện với tần suất đáng kể trong

cộng đồng người Kinh Việt Nam. Tuy nhiên, cả hai nghiên cứu kể trên đều thực hiện

trên cỡ mẫu nhỏ, với phạm vi thu mẫu nhỏ.

Bên cạnh đó, ở Việt Nam, các nghiên cứu về mối liên quan giữa nguy cơ ADRs

của thuốc nói chung với các alen đa hình của gen HLA lớp I chỉ mới được quan tâm

nghiên cứu trong khoảng vài năm gần đây. Mối liên quan giữa alen đa hình HLA lớp

I với nguy cơ SCARs do allopurinol bắt đầu được nghiên cứu vào năm 2015 và các

nghiên cứu mới tập trung vào alen HLA-B*58:01 (Bảng 1.4). Công bố đầu tiên của

Đỗ Thị Quỳnh Nga và cộng sự [3] đã sử dụng quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01

bằng phương pháp PCR với mồi có trình tự đặc hiệu (Sequence-specific Primer –

Polymerase chain reaction – SSP – PCR) theo công bố của Sita V. [121] và thử

nghiệm trên 22 bệnh nhân SCARs do allopurinol, cho kết quả 95,5% số bệnh nhân

mang alen HLA-B*58:01. Tuy nhiên cỡ mẫu của nghiên cứu còn quá nhỏ và chưa so

sánh với nhóm chứng dung nạp với allopurinol cũng như nhóm chứng cộng đồng để

đánh giá được nguy cơ SCARs do allopurinol liên quan tới alen này [3].

Bảng 1.4. Các nghiên cứu về alen HLA lớp I liên quan tới nguy cơ SCARs do

allopurinol tại Việt Nam

Tỷ lệ alen nguy cơ

Týp SCAR

OR

Giá trị p

TLTK

Alen HLA nguy cơ

95% khoảng tin cậy

Nhóm bệnh

Nhóm chứng

Không có thông tin

21/22

[3]

SJS/TEN

11/13

[134]

SJS/TEN

10/10

6/112

171

20 – 7889

[14]

p < 10

-4

HLA- B*58:01

SJS/TEN DRESS

7/7

9/128

188,68

[1]

p < 10

-3

DRESS

75/81

6/74

141,7

[97]

p < 10

-4

SJS/TEN SJS/AGEP

9,99 – 3562,05 43,61 – 460,22

Không có thông tin

29/31

29/395

147

45 – 746

[37]

p < 10

-4

Một công bố khác của nhóm tác giả Trần Thị Huyền [134] cũng cho thấy sự

hiện diện của alen HLA-B*58:01 với tỷ lệ cao ở nhóm bệnh nhân SCARs do

allopurinol, chiếm tới 84,6%. Tiếp theo đó, năm 2019, một báo cáo về cADRs do

allopurinol tại Việt Nam, trong đó 10 bệnh nhân SCARs và 112 bệnh nhân dung nạp

được thu nạp; kết quả cho thấy nguy cơ bị SCARs do allopurinol ở bệnh nhân mang

alen HLA-B*58:01 tăng gấp 171 lần so với các bệnh nhân không có alen này (OR =

171; 95% CI: 20 – 7889; p < 0,0001) [14]. Ngoài ra, Đỗ Duy Anh và các cộng sự đã

thực hiện nghiên cứu trên 7 bệnh nhân SCARs, 23 bệnh nhân dị ứng da nhẹ do

allopurinol và 128 bệnh nhân dung nạp với allopurinol; kết quả cho thấy 100% bệnh

nhân SCARs mang alen HLA-B*58:01 với OR = 188,68 (95% CI: 9,99 – 3562,05, p

< 0,001); đồng thời nghiên cứu không tìm thấy mối liên quan giữa alen này với phản

ứng da nhẹ do allopurinol [1]. Năm 2020, hai nghiên cứu bệnh – chứng độc lập của

hai nhóm tác giả Đỗ Đức Minh [37] và Nguyễn Văn Đĩnh [97] cũng cho thấy mối

liên quan chặt chẽ giữa alen HLA-B*58:01 với nguy cơ SCARs do allopurinol; với

cỡ mẫu bệnh – chứng và OR của 2 nghiên cứu lần lượt là 31 bệnh nhân SCARs – 395

bệnh nhân dung nạp, OR = 147 (95% CI: 45 – 746; p < 0,0001) và 81 bệnh nhân

SCARs – 120 bệnh nhân dung nạp, OR = 141,7 (95% CI: 43,6 – 460,23; p < 0,0001).

Có thể thấy, ở Việt Nam, các nghiên cứu mới chỉ tập trung vào mối liên quan

giữa alen HLA-B*58:01 với nguy cơ SCARs do allopurinol mà chưa có nghiên cứu

nào về mối liên quan của 2 alen HLA-A*33:03 và HLA-C*03:02 với nguy cơ SCARs

do allopurinol; trong khi đó, theo Bạch Khánh Hòa [11] và Đỗ Đức Minh [36], tần

suất của 2 alen này trong cộng đồng người Kinh Việt Nam cao hơn đáng kể so với

alen HLA-B*58:01. Hơn nữa, các nghiên cứu bệnh – chứng mới chỉ so sánh nguy cơ

SCARs do allopurinol giữa nhóm bệnh nhân SCARs và nhóm bệnh nhân dung nạp

với allopurinol mà chưa so sánh với nhóm cộng đồng.

1.4. Các phương pháp phát hiện alen HLA lớp I liên quan tới SCARs do

allopurinol

1.4.1. Các phương pháp phát hiện alen HLA lớp I liên quan tới nguy cơ SCARs

do allopurinol trên thế giới

Những bằng chứng về sự liên quan của các alen HLA lớp I và nguy cơ SCARs

do allopurinol cho thấy nguy cơ này hoàn toàn có thể được dự báo và ngăn ngừa bằng

xét nghiệm phát hiện alen HLA trước khi kê đơn allopurinol cho bệnh nhân. Nhiều

phương pháp khác nhau đã được sử dụng để xây dựng các quy trình phát hiện các

alen HLA lớp I. Kết quả các quy trình sau khi xây dựng hầu hết đều được thẩm định

lại bằng phương pháp giải trình tự Sanger - tiêu chuẩn vàng trong xác định kiểu gen

[8], [98]. Trong 3 alen HLA lớp I đã được phát hiện có liên quan tới nguy cơ SCARs

do allopurinol là HLA-B*58:01, HLA-A*33:03 và HLA-C*03:02, alen HLA-B*58:01

được đặc biệt quan tâm và có nhiều nghiên cứu về quy trình phát hiện alen này bằng

nhiều phương pháp khác nhau (Bảng 1.5), nhưng chưa có công bố nào về phương

pháp phát hiện đặc hiệu 2 alen HLA-A*33:03 và HLA-C*03:02.

Trong các phương pháp đã được sử dụng để xây dựng quy trình phát hiện alen

HLA-B*58:01, phương pháp PCR với đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction

Fragment Length Polymorphism Polymerase chain reaction – RFLP – PCR) [86] và

phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt xoay vòng (Loop Mediated Isothermal

Amplification – LAMP ) [74] chỉ cần sử dụng máy luân nhiệt thường quy và có thời

gian thực hiện ngắn (1 – 2 giờ). Tuy nhiên, phương pháp RFLP – PCR xác định alen

HLA-B*58:01 gián tiếp thông qua sự liên kết di truyền với SNP rs9263726 (SNP của

gen nhạy cảm với bệnh vảy nến - psoriasis susceptibility 1 candidate 1- PSORS1C1)

[86] mới được thử nghiệm với số lượng mẫu khá nhỏ (27 mẫu). Hơn nữa, sự liên kết

di truyền giữa rs9263726 với alen HLA-B*58:01 giữa các dân tộc rất khác nhau, ví

dụ SNP rs9263726 A > G có liên kết di truyền chặt chẽ với HLA-B*58:01 ở người

Nhật nhưng không có sự liên kết di truyền ở người Úc [137]. Do đó, phương pháp

này cần được thẩm định lại với cỡ mẫu lớn hơn trước khi áp dụng cho các chủng tộc

khác. Về phương pháp LAMP để phát hiện alen HLA-B*58:01 do Kwok và cộng sự

[74] công bố có nhiều ưu điểm như độ nhạy cao, có thể đọc kết quả bằng mắt thường

trong trường hợp cần đọc nhanh kết quả mà không có máy điện di; nhưng hạn chế

chính của phương pháp này là khó thiết kế các cặp mồi đặc hiệu với các alen có trình

tự ADN tương tự nhau (ví dụ HLA-B*58:01 và HLA-B*57:01) đồng thời bị giới hạn

về nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn ADN (do phản ứng diễn ra trong điều kiện

đẳng nhiệt 67oC). Chính vì vậy, hai phương pháp này khó áp dụng rộng rãi trên lâm

sàng.

Quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 bằng phương pháp SSP – PCR do tác

giả Sita V. và cộng sự [121] công bố được thử nghiệm trên 200 mẫu ADN của người

Thái Lan và thu được kết quả 19/200 mẫu dương tính với alen HLA-B*58:01. Thẩm

định bằng bộ kit SSP – PCR thương mại, quy trình đã xây dựng có độ nhạy là 100%,

độ đặc hiệu > 99,9%, giá trị tiên đoán dương (Positive predictive value – PPV) và giá

trị tiên đoán âm (Negative predictive value – NPV) là 100%. Phương pháp SSP –

PCR có nhiều ưu điểm với độ nhạy, độ đặc hiệu, PPV, NPV cao, thời gian xét nghiệm

ngắn, thực hiện đơn giản và giúp hạ chi phí xét nghiệm từ ~ 98,3 USD so với bộ kít

thương mại xuống còn ~ 32,77 USD (kể cả chi phí nhân công). Tuy nhiên, nếu áp

dụng phương pháp này với chủng tộc khác có tần suất alen HLA-B*57:01 (là alen có

trình tự ADN tương tự với HLA-B*58:01) cao hơn so với người Thái Lan, ví dụ như

chủng tộc người Kinh Việt Nam thì có thể tăng khả năng dương tính giả (tần suất của

alen HLA-B*57:01 ở người Việt Nam và người Thái Lan lần lượt là 2,9% và 1,8%

[155]).

Bảng 1.5. So sánh các phương pháp sử dụng để phát hiện alen HLA-B*58:01 [98]

Thời

Chi phí

Hạn chế của

Vùng

gian

Phương

thuốc

Nguyên tắc

TLTK

phương pháp

phát hiện

làm xét

pháp

thử/mẫu

nghiệm

33,77

Thiết kế mồi đặc hiệu với alen HLA-B*58:01. Cặp mồi được thiết kế để

USD

phát hiện được sự đa hình ở đầu 3’ tận cùng của mồi. Sản phẩm PCR sau

SSP –

đó được điện di trên gel agarose chứa chất nhuộm màu (ví dụ: ethidium

(kể cả

Khả năng dương tính giả cao

Exons 2 - 3

2 giờ

[121]

PCR

bromid). Chất nhuộm màu sẽ gắn với sản phẩm PCR và giúp hiện hình sản

chi phí

với HLA-B*57:01

nhân

phẩm PCR dưới tia cực tím, cho biết có mặt (hoặc không có mặt các sản

công)

phẩm PCR của alen HLA-B*58:01).

Phát hiện alen HLA-B*58:01 gián tiếp thông qua SNP rs9263726

PSORS1C1 (SNP di truyền liên kết với alen HLA-B*58:01). Một cặp mồi

Áp dụng cho hệ gen của

RFLP –

rs9263726

Không

được thiết kế để khuếch đại đoạn gen chứa . Sản phẩm PCR sau đó được

người Nhật, cần thẩm định

PCR

PSORS1C1

4 giờ

có thông

[86]

ủ với enzym cắt giới hạn đặc hiệu FokI với đoạn trình tự chứa SNP

lại phương pháp với các

tin

rs9263726. Sau đó, các sản phẩm được điện di trên gel để xác định tính đa

chủng tộc khác

hình.

Dựa trên sự tổng hợp thay thế chuỗi tự xoay vòng khi ADN được đặt

Độ phân giải cao. Độ nhạy

trong môi trường đẳng nhiệt (67oC), thực hiện nhờ enzym kéo dài chuỗi

HLA-

cao, khả năng dương tính giả

LAMP

60 phút

6,4 USD

[74]

ADN polymerase và 2 cặp mồi có trình tự đặc hiệu với alen HLA-

B*58:01

cao. Cần được xử lý thêm

B*58:01.

bằng các phương pháp khác

Cần liên tục cập nhật trình tự

RT-PCR

“Đầu dò Taqman” là những đoạn oligonucleotid sợi đơn dài khoảng 20 –

HLA-

(TaqMan

30 base, có trình tự bổ sung với một đoạn trình tự đặc hiệu trên alen HLA-

2,5 giờ

~ 2 USD

để tránh sai sót nếu đa hình

[151]

B*58:01

probe)

B*58:01, gồm có 2 đầu: đầu 5’ gắn chất phát huỳnh quang, gọi là

Thời

Chi phí

Phương

Vùng

gian

Hạn chế của

Nguyên tắc

thuốc

TLTK

pháp

phát hiện

làm xét

phương pháp

thử/mẫu

nghiệm

“reporter”. Đầu 3’ gắn chất hấp phụ huỳnh quang phát ra từ reporter, gọi

nằm trong trình tự mồi hoặc

là “quencher”. Khi phản ứng PCR chưa diễn ra, các đầu dò Taqman còn

đầu dò

nguyên cấu tạo ban đầu nên không phát huỳnh quang khi có ánh sáng kích

thích. Khi phản ứng PCR diễn ra, các đầu dò Taqman bắt cặp bổ sung với

Cần liên tục cập nhật trình

trình tự đặc hiệu trên khuôn ADN bị enzym Taq polymerase cắt bỏ để kéo

RT-PCR

HLA-

tự để tránh sai sót nếu đa

dài chuỗi bổ sung tạo ra các reporter tự do, rời xa quencher và phát huỳnh

(TaqMan

1 giờ

1,5 USD

[63]

B*58:01

hình nằm trong trình tự mồi

quang khi nhận được ánh sáng kích thích. Số lượng reporter tự do hay

probe)

hoặc đầu dò

cường độ huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng sản phẩm PCR được tạo

thành.

Thiết kế mồi đặc hiệu với alen HLA-B*58:01 để khuếch đại alen HLA-

B*58:01 và sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang SYBR để phát hiện sản

Cần liên tục cập nhật trình

phẩm PCR theo thời gian thực. Thuốc nhuộm SYBR có ái lực mạnh với

tự để tránh sai sót nếu đa

RT-PCR

sợi đôi ADN và có khả năng chèn vào giữa sợi đôi ADN, dẫn đến khi nhận

hình nằm trong trình tự mồi

HLA-

(SYBR)

được ánh sáng kích thích làm các sợi đôi ADN này có thể phát ánh sáng

2 giờ

3,8 USD

hoặc đầu dò

[96]

B*58:01

huỳnh quang. Khi có sự hiện diện của sản phẩm PCR, thuốc nhuộm SYBR

Nguy cơ dương tính giả cao

chèn vào và tập trung trên các sợi đôi ADN dẫn tới phát tín hiệu huỳnh

hơn so với TaqMan probe

quang mạnh khi gặp ánh sáng kích thích, tỷ lệ thuận với số lượng sản phẩm

RT-PCR

PCR được tạo thành.

PSORS1C1: Psoriasis susceptibility 1 candidate 1 - gen nhạy cảm với bệnh vảy nến.

Phương pháp được sử dụng phổ biến nhất hiện nay để xây dựng quy trình phát

hiện alen HLA-B*58:01 là phản ứng khuếch đại chuỗi theo thời gian thực (real-time

PCR) [63], [96], [151]. Các quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 bằng phương pháp

real-time PCR đều có chi phí thuốc thử thấp (từ 1,5 – 3,8 USD/mẫu), thực hiện trong

thời gian ngắn (1 – 2,5 giờ), với độ chính xác cao (độ nhạy, độ đặc hiệu ~ 100%).

1.4.2. Các phương pháp phát hiện alen HLA lớp I liên quan tới nguy cơ SCARs

do allopurinol tại Việt Nam

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về phương pháp phát hiện các alen HLA lớp I liên

quan tới nguy cơ SCARs do allopurinol chưa được quan tâm nghiên cứu mà đa phần sử

dụng các bộ kit thương mại phát hiện alen HLA-B*58:01 bằng phương pháp SSP – PCR,

real-time PCR hoặc giải trình tự gen [1], [37], [134] với chi phí cao. Tính tới nay, ở Việt

Nam mới có ba công bố về quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01. Năm 2015, nhóm

nghiên cứu của Đỗ Thị Quỳnh Nga [3] đã khảo sát quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01

bằng phương pháp SSP – PCR với 22 bệnh nhân dị ứng với allopurinol người Việt Nam

sử dụng cặp mồi và chu trình nhiệt touchdown của Sita V. [121]. Tuy nhiên, nhóm tác giả

mới thực hiện trên cỡ mẫu khá nhỏ và cũng chưa tiến hành thẩm định lại với một phương

pháp chuẩn khác để tính độ nhạy, độ đặc hiệu của quy trình. Năm 2017, nhóm tác giả

Nguyễn Văn Đĩnh và cộng sự đã sử dụng phương pháp real-time PCR với chất nhuộm

huỳnh quang SYBR để xây dựng quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 [96]. Quy trình

cũng dựa trên cặp mồi đặc hiệu với HLA-B*58:01 của Sita V. [121] và điều chỉnh trình tự

mồi ngược (bỏ 2 nucleotid ở đầu 3’ và 2 nucleotid đầu 5’) để tăng tính đặc hiệu. Quy trình

được thử nghiệm trên 119 mẫu và thẩm định lại với các phương pháp Luminex

SSOP/SSP/SBT, cho kết quả độ nhạy, độ đặc hiệu, NPV và PPV là 100%. Quy trình có

thời gian xét nghiệm nhanh ~ 2 giờ và chi phí thuốc thử thấp ~ 3,8 USD/mẫu. Hạn chế

chung của các quy trình sử dụng phương pháp real-time PCR [63], [96], [151] là chi phí

thiết bị đắt tiền, thường gấp 10 – 20 lần so với máy luân nhiệt thường quy. Vì vậy, mặc dù

chi phí mẫu thử thấp nhưng khó áp dụng rộng rãi tại những bệnh viện tuyến dưới ở những

nước đang phát triển như Việt Nam.

Ngoài ra, năm 2020, nhóm tác giả Nguyễn Văn Đĩnh đã dựa trên một số công bố

[26], [39], [86] để nghiên cứu phát hiện gián tiếp alen HLA-B*58:01 thông qua 1 chỉ dấu

là SNP rs9263726 ở người Việt Nam dựa trên sự liên kết di truyền giữa 2 locus này [97].

Quy trình sử dụng phương pháp RFLP – PCR, thực hiện theo mô tả của Maekawa và Vidal

[86], [137]. Trước tiên, vùng ADN chứa SNP rs9263726 được khuếch đại đặc hiệu. Sau

đó, sản phẩm PCR được ủ với enzym cắt giới hạn FokI và đọc kết quả bằng điện di. Quy

trình được thử nghiệm trên 81 bệnh nhân SCARs do allopurinol, 120 bệnh nhân dung nạp

và được thẩm định lại bằng phương pháp real-time PCR. Nghiên cứu cho thấy SNP

rs9263726 có liên kết chặt chẽ với alen HLA-B*58:01 ở người Việt Nam và có khả năng

dùng để dự đoán cá thể mang alen này ở người Việt Nam, với độ nhạy và độ đặc hiệu

100%. Ưu điểm chính của phương pháp RFLP – PCR là chi phí thấp. Tuy nhiên, hạn chế

chính của phương pháp này là sử dụng enzym cắt giới hạn – thường yêu cầu nghiêm ngặt

về điều kiện hoạt động và bảo quản để đưa ra kết quả chính xác nên khó áp dụng trong xét

nghiệm lâm sàng. Bên cạnh đó, phương pháp mới thử nghiệm trên nhóm bệnh nhân

SCARs là nhóm có tần suất mang alen HLA-B*58:01 cao nên cần được kiểm tra lại trên

cộng đồng với cỡ mẫu lớn hơn để phát hiện sai số.

Như vậy, ngoài alen HLA-B*58:01, 2 alen HLA-A*33:03 và HLA-C*03:02 cũng

đã được chứng minh có mối liên quan với nguy cơ SCARs do allopurinol sau các nghiên

cứu sàng lọc hàng loạt gen [34], [56], [62]. Tuy nhiên, cho tới nay, cả trên thế giới và tại

Việt Nam chưa có một công bố nào về quy trình phát hiện đặc hiệu cho 2 alen này mà mới

chỉ dừng lại ở các công bố sàng lọc hàng loạt gen với các bộ kit thương mại sử dụng

phương pháp SSP – PCR, SSOP – PCR, giải trình tự Sanger hay hiện đại nhất là giải trình

tự gen thế hệ mới (Next Generation Sequencing – NGS) có chi phí cao và tốn nhiều thời

gian xét nghiệm [11], [34], [36], [62]…Vì vậy, nếu muốn áp dụng xét nghiệm gen HLA

trong thực hành lâm sàng thì cần quy trình xét nghiệm đơn giản, đặc hiệu cho alen mục

tiêu, cho kết quả nhanh, chính xác và có hiệu quả kinh tế hơn.

1.4.3. Phương pháp phát hiện alen HLA lớp I của luận án

1.4.3.1. Phương pháp phát hiện alen HLA-A*33:03 và HLA-C*03:02

Qua tổng quan tài liệu về gen HLA lớp I và các phương pháp phát hiện alen

HLA lớp I, luận án lựa chọn phương pháp PCR lồng đặc hiệu alen (Nested Allele

specific PCR – nested AS – PCR) để xây dựng quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03

và HLA-C*03:02.

Do các gen HLA lớp I có tính đa hình rất phức tạp với số lượng lớn SNP nên

rất khó để khuếch đại trực tiếp một alen HLA mục tiêu bằng một phản ứng PCR [7],

[20]. Vùng exon 2 – exon 3 hay còn gọi là vùng đa hình của HLA lớp I tập trung phần

lớn các SNP của một alen HLA lớp I, đây cũng là vùng có trình tự đặc trưng cho từng

týp HLA lớp I [20]. Vì vậy, phương pháp nested – PCR (PCR lồng) được áp dụng, sử

dụng một cặp mồi để khuếch đại đặc hiệu vùng exon 2 – exon 3 của týp HLA lớp I

mục tiêu [20]. Sản phẩm PCR thu được sẽ sử dụng để thực hiện các phản ứng PCR

tiếp theo nhằm phát hiện alen HLA mục tiêu [20], [89].

Bên cạnh đó, luận án sử dụng các mồi đặc hiệu alen (Allele specific primer)

cũng nhằm mục đích tăng tính đặc hiệu của các mồi. Mồi đặc hiệu alen là mồi có

nucleotid ở đầu 3’ bắt cặp bổ sung với nucleotid tại vị trí SNP của alen mục tiêu [45],

[145] và được thêm 1 nucleotid không bắt cặp bổ sung với nucleotid trên khuôn ADN

(mismatch) tại vị trí thứ 3 (hoặc vị trí thứ 2) kể từ tận cùng nucleotid đầu 3’ của mồi

của để tăng tính đặc hiệu. Nguyên tắc thêm mismatch được thể hiện ở Bảng 1.6 [145].

Phương pháp PCR với mồi đặc hiệu alen (Allele specific PCR – AS – PCR) có thể

phân biệt kiểu gen đồng hợp tử/dị hợp tử bằng cách thiết kế 3 mồi; trong đó, một mồi

chung (xuôi/ngược), hai mồi còn lại (ngược/xuôi) là mồi đặc hiệu alen đặc hiệu với

từng alen. Tiến hành phản ứng PCR song song ở 2 giếng riêng biệt. Dựa vào sự xuất

hiện của sản phẩm PCR ở mỗi giếng để kết luận sự có mặt/không của alen mục tiêu

và phân biệt kiểu gen đồng hợp tử/dị hợp tử [145] (Hình 1.7).

Bảng 1.6. Nguyên tắc thêm mismatch trên mồi đặc hiệu alen [145]

SNP W (A/T) được sử dụng làm ví dụ để thiết kế mồi đặc hiệu alen. Mồi đặc hiệu alen cho các kiểu SNP khác

được thiết kế tương tự. Hai phản ứng PCR được thực hiện song song ở 2 giếng khác nhau. Giếng 1 thực hiện

phản ứng PCR với cặp mồi 1 – khuếch đại đặc hiệu alen A gồm: mồi xuôi AS  đặc hiệu cho alen A và mồi

ngược chung. Mồi xuôi AS  được thêm mismatch là nucleotid A ở vị trí thứ 2 kể từ nucleotid tận cùng đầu 3’

của mồi. Giếng 2 thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi 2 – khuếch đại đặc hiệu alen T gồm: mồi xuôi AS 

đặc hiệu cho alen T và mồi ngược chung. Mồi xuôi AS  được thêm mismatch là nucleotid G ở vị trí thứ 3 kể

từ nucleotid tận cùng đầu 3’ của mồi. Kiểu gen của mẫu thử ADN được xác định dựa vào sản phẩm PCR xuất

hiện ở các giếng: trường hợp 1 và trường hợp 2 - sản phẩm PCR chỉ xuất hiện ở một trong 2 giếng thì kiểu

gen của mẫu thử là đồng hợp tử (A/A hoặc T/T); trường hợp 3 - sản phẩm PCR xuất hiện ở cả 2 giếng thì kiểu

gen của mẫu thử là dị hợp tử (A/T).

Hình 1.7. Nguyên tắc thiết kế mồi đặc hiệu alen [37]

Ngoài ra, luận án còn sử dụng chu trình nhiệt touchdown để thực hiện các phản

ứng PCR. Nguyên tắc chính của chu trình nhiệt touch down PCR (TD – PCR) là giảm

dần nhiệt độ ở giai đoạn bắt cặp của mồi vào khuôn ADN trong 10 – 20 chu kỳ đầu,

bắt đầu từ nhiệt độ cao hơn nhiệt độ bắt cặp tối ưu của mồi khoảng 10oC. Khi bắt đầu

ở nhiệt độ cao hơn so với nhiệt độ bắt cặp tối ưu, các mồi sẽ ưu tiên bắt cặp với trình

tự đặc hiệu và giảm khả năng bắt cặp với các trình tự không mong muốn khác. Các

chu kỳ đầu tiên của quá trình khuếch đại đóng vai trò quyết định trong việc tạo ra sản

phẩm PCR mong muốn, do đó bằng cách giảm dần nhiệt độ bắt cặp 0,5oC mỗi chu

kỳ (hoặc 2 – 5oC sau mỗi 5 chu kỳ) sẽ giúp loại bỏ nguy cơ tạo ra các sản phẩm PCR

không đặc hiệu. Ví dụ: nhiệt độ bắt cặp tối ưu của mồi với khuôn là 55oC thì nhiệt độ

bắt cặp của chu trình nhiệt bắt đầu từ 65oC trong 5 chu kỳ đầu, giảm xuống còn 60oC

ở 5 chu kỳ tiếp theo và 55oC ở 20 chu kỳ cuối [73].

1.4.3.2. Phương pháp phát hiện alen HLA-B*58:01

Từ tổng quan tài liệu, luận án lựa chọn phương pháp PCR với mồi có trình tự

đặc hiệu (SSP – PCR) để xây dựng quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01. Trong

cùng 1 giếng phản ứng, một cặp mồi có trình tự bổ sung với đoạn trình tự ADN đặc

hiệu của alen HLA-B*58:01 và một cặp mồi đóng vai trò nội kiểm (khuếch đại các

gen luôn được biểu hiện trong tế bào để tránh trường hợp âm tính giả, ví dụ như cặp

mồi nội kiểm ACTB) được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR. Dựa vào kết quả

điện di để kết luận mẫu thử ADN dương tính/âm tính với alen HLA-B*58:01 (Hình

1.8) [121].

Hình 1.8. Nguyên tắc của quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01 bằng phương pháp

Quy trình PCR một bước sử dụng 2 cặp mồi trong cùng một giếng phản ứng. Mẫu thử ADN dương tính/âm

tính với alen HLA-B*58:01 tùy thuộc vào sự xuất hiện của các sản phẩm điện di. Trường hợp 1: chỉ có sản

phẩm PCR của cặp mồi nội kiểm xuất hiện thì mẫu thử ADN âm tính với alen HLA-B*58:01. Trường hợp 2:

sản phẩm PCR của cả 2 cặp mồi đều xuất hiện thì mẫu thử ADN dương tính với alen HLA-B*58:01.

SSP – PCR [121]

2 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng trong nghiên cứu xây dựng, tối ưu hóa và thẩm định quy trình

phát hiện 3 alen HLA lớp I

Các mẫu ADN được sử dụng để xây dựng, tối ưu hóa và thẩm định quy trình

phát hiện 3 alen HLA lớp I, cụ thể như sau:

▪ Với quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03: sử dụng 7 mẫu ADN đã được xác

định kiểu gen HLA-A bằng bộ kit Lifecodes HLA SSOP (Immucor, Mỹ), do Phòng

Gen dược học và Y học cá thể hóa, Khoa Y, Bệnh viện Ramathibodi, Trường Đại

học Mahidol, Thái Lan cung cấp [116] (phụ lục 12). Trong đó, 2 mẫu là chứng

dương (mẫu ADN dương tính với alen HLA-A*33:03) và 5 mẫu là chứng âm (mẫu

ADN âm tính với alen HLA-A*33:03).

▪ Với quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01: sử dụng 6 mẫu chứng ADN đã được

xác định kiểu gen HLA-B bằng phương pháp giải trình tự Sanger với bộ kit

BigDyeTMTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (ThermoFisher Scientific,

Waltham, USA) và máy giải trình tự tự động ABITM3500 analyzer (Applied

Biosystems, Massachusetts, USA) do Phòng sinh học phân tử ứng dụng, Trung

tâm Nghiên cứu Y sinh học, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp [3] (phụ

lục 13). Trong đó, 1 mẫu là chứng dương alen HLA-B*58:01 và 5 mẫu là chứng

âm alen HLA-B*58:01.

▪ Với quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02: sử dụng 10 mẫu chứng ADN đã được

xác định kiểu gen HLA-C bằng bộ kit Lifecodes HLA SSOP (Immucor, Mỹ, do

Phòng Gen dược học và Y học cá thể hóa, Khoa Y, Bệnh viện Ramathibodi,

Trường Đại học Mahidol, Thái Lan cung cấp [116] (phụ lục 12). Trong đó 4 mẫu

là chứng dương alen HLA-C*03:02 và 6 mẫu là chứng âm alen HLA-C*03:02.

▪ Để thẩm định các quy trình đã xây dựng: sử dụng 100 mẫu ADN chưa biết kiểu

gen HLA. Trong đó 48 mẫu ADN của các bệnh nhân SCARs do allopurinol và 58

mẫu ADN của đối tượng nghiên cứu (ĐTNC) nhóm cộng đồng.

2.1.2. Đối tượng trong nghiên cứu trên cộng đồng người Kinh Việt Nam

Đối tượng nghiên cứu là người dân tộc Kinh Việt Nam, thỏa mãn các tiêu

chuẩn lựa chọn và không có các tiêu chuẩn loại trừ sau:

▪ Tiêu chuẩn lựa chọn: dân tộc Kinh (có cả bố, mẹ, ông bà nội ngoại đều dân tộc

Kinh); tuổi 18 – 25; các đối tượng không có quan hệ huyết thống (cha mẹ ruột,

anh/chị/em ruột, ông bà nội và ông bà ngoại); chấp thuận tham gia nghiên cứu.

▪ Tiêu chuẩn loại trừ: có quê quán không thuộc vùng lấy mẫu (Ví dụ: lấy mẫu ở

miền Bắc nhưng đối tượng có quê quán thuộc miền Trung hoặc miền Nam); đang

mắc các bệnh cấp tính.

▪ Số lượng mẫu nghiên cứu

Cỡ mẫu tính toán dựa trên tần suất của từng alen HLA lớp I (HLA-A*33:03,

HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02) trong cộng đồng người Kinh Việt Nam theo số liệu

đã công bố của Bạch Khánh Hòa [11]. Công thức tính cỡ mẫu theo khuyến cáo của

WHO cho các nghiên cứu dịch tễ học [85].

n = Z2

(1-/2) p (1-p)/ d2

Trong đó:

- Z(1-/2) = 1,96, với =0,05 ứng với độ tin cậy 95%;

- p: Tần suất ước đoán của từng alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-

C*03:02 trong cộng đồng người Kinh Việt Nam [11];

- d: Độ dao động của tần suất phát hiện so với tần suất thực với d = 0,02 nếu p

< 0,1 hoặc d = 0,05 nếu 0,1 < p < 0,3 [85];

- n: Cỡ mẫu tối thiểu cần đạt được

Căn cứ công thức trên, tính được cỡ mẫu cần đạt để ước tính tỷ lệ cho từng

alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02 lần lượt là 157, 584 và 609. Như

vậy, cỡ mẫu tối thiểu cần đạt để ước tính tỷ lệ cho cả 3 alen là 609. Tiến hành thu

mẫu thuận tiện được 810 mẫu, chia đều tại ba miền Bắc, Trung, Nam (270 mẫu mỗi

miền).

▪ Địa điểm, thời gian thu mẫu: tiến hành lấy mẫu tại ba trường đại học ở ba miền

(Trường Đại học Dược Hà Nội, Trường Đại học Hà Tĩnh, Trường Đại học Y Dược

Thành phố Hồ Chí Minh). Thời gian từ tháng 4/2018 đến tháng 6/2018.

2.1.3. Đối tượng trong nghiên cứu trên bệnh nhân sử dụng allopurinol

2.1.3.1. Nhóm bệnh nhân dung nạp với allopurinol

Đối tượng nghiên cứu là những bệnh nhân được chỉ định sử dụng allopurinol,

thỏa mãn các tiêu chuẩn lựa chọn và không có các tiêu chuẩn loại trừ sau:

▪ Tiêu chuẩn lựa chọn: bệnh nhân người Kinh Việt Nam; các bệnh nhân không có

quan hệ huyết thống (cha mẹ ruột, anh/chị/em ruột, ông bà nội và ông bà ngoại);

bệnh nhân đã bắt đầu dùng allopurinol theo kê đơn của bác sĩ trong vòng ít nhất

ba tháng trước đó; chấp thuận tham gia nghiên cứu

▪ Tiêu chuẩn loại trừ: bệnh nhân có bất kỳ phản ứng có hại trên da nào trong vòng

ba tháng sử dụng allopurinol.

▪ Số lượng mẫu nghiên cứu

Do Việt Nam chưa có nghiên cứu nào đánh giá mối liên quan của cả 3 alen

HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02 với nguy cơ SCARs do allopurinol

nên cỡ mẫu được tính toán dựa trên tần suất cá thể mang alen HLA-A*33:03, HLA-

B*58:01 và HLA-C*03:02 trong nhóm dung nạp với allopurinol theo công bố của

Hung S. I [56]. Công thức tính cỡ mẫu theo khuyến cáo của WHO cho các nghiên

cứu bệnh – chứng [85].

n = {𝐙𝟏−/𝟐 √𝟐𝐩𝐪 + 𝐙𝟏− √(𝐩𝟏𝐪𝟏 + 𝐩𝟐𝐪𝟐)}𝟐 / (𝐩𝟏−𝐩𝟐)𝟐

Trong đó:

- Z1-/2 = 1,96 với mức ý nghĩa thống kê  = 0,05;

- Z1- = 1,96 với lực kiểm định 95% khi  = 0,05;

- p1: Tần suất cá thể mang alen trong nhóm dung nạp với allopurinol;

q1=1 – p1

- p2: Tần suất cá thể mang alen trong nhóm SCARs do allopurinol; q2 = 1–p2

- p = (p1 + p2)/2; q = 1 – p

P2 1−P2

P1 1−P1

- OR = ( ) / ( )

- n: Cỡ mẫu tối thiểu cần đạt được cho mỗi nhóm

Với p1 là tần suất cá thể mang alen HLA-A*33:03 (18%), HLA-B*58:01 (15%)

và HLA-C*03:02 (14%) trong nhóm dung nạp với allopurinol và OR tương ứng của

từng alen khi so sánh nguy cơ giữa nhóm SCARs và nhóm dung nạp với allopurinol

lần lượt là 9,3; 580,3 và 97,7 [56], thay vào công thức tính được cỡ mẫu tối thiểu của

từng alen cho mỗi nhóm SCARs và nhóm dung nạp với allopurinol cần để ước tính

tỷ lệ cho từng alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02 lần lượt là 28, 7

và 8.

Cân đối thời gian thu mẫu và chi phí, tiến hành thu mẫu thuận tiện nhóm dung

nạp với allopurinol. Trên thực tế, luận án thu được 183 bệnh nhân dung nạp với

allopurinol.

Bên cạnh đó, để mở rộng thêm đánh giá nguy cơ SCARs do allopurinol từ

cộng đồng chưa sử dụng allopurinol, toàn bộ 810 ĐTNC đã thu thập từ cộng đồng ở

mục tiêu 1 được dùng làm nhóm đối chứng cộng đồng.

▪ Địa điểm, thời gian thu mẫu: tiến hành lấy mẫu tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh Thái

Bình. Thời gian từ tháng 4/2019 đến tháng 11/2019.

2.1.3.2. Nhóm bệnh nhân bị SCARs do allopurinol

▪ Tiêu chuẩn lựa chọn: bệnh nhân người Kinh Việt Nam, được ít nhất 2 bác sỹ

chuyên khoa tại Trung tâm Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai

thăm khám và chẩn đoán độc lập. Các týp SCARs được phân loại theo tiêu chí

của hệ thống các nghiên cứu RegiSCAR (Cơ quan đăng ký châu Âu về các phản

ứng có hại trên da nghiêm trọng của thuốc - European Registry of Severe

Cutaneous Adverse Reactions [156]) ([4], [10], [15], [23], [112]). Thuốc là

nguyên nhân gây SCARs được xác định bằng Thang điểm xác định thuốc gây dị

ứng trong hoại tử thượng bì (Algorithm of drug causality for epidermal necrolysis

– ALDEN) cho týp SJS/TEN [115], và bằng Thang điểm Naranjo cho các týp

SCARs khác [93]. Những bệnh nhân được chẩn đoán SCARs do allopurinol (điểm

ALDEN ≥ 4 và/hoặc điểm Naranjo ≥ 5) được đưa vào nghiên cứu.

o Bệnh nhân chấp thuận tham gia nghiên cứu.

▪ Tiêu chuẩn loại trừ: bệnh nhân được chẩn đoán một trong các bệnh sau: ban da

tự miễn, hồng ban đa dạng, ban da do nhiễm khuẩn, viêm mạch, vảy nến thể mủ

hoặc bệnh nhân đang ghép tủy.

▪ Số lượng mẫu nghiên cứu

Cỡ mẫu được tính toán tương tự như đã trình bày ở mục 2.1.3.1.

Cân đối thời gian thu mẫu và chi phí, tiến hành thu mẫu thuận tiện nhóm

SCARs do allopurinol. Trên thực tế, nghiên cứu thu được 100 bệnh nhân SCARs do

allopurinol.

▪ Địa điểm, thời gian thu mẫu: tiến hành lấy mẫu tại Trung tâm Dị ứng – Miễn

dịch lâm sàng, Bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội. Thời gian từ tháng 12/2017 đến

tháng 2/2020.

2.2. Nguyên liệu, trang thiết bị dùng trong nghiên cứu

2.2.1. Nguyên liệu, hóa chất, vật tư tiêu hao dùng trong nghiên cứu

▪ Nguyên liệu, vật tư tiêu hao dùng để lấy mẫu máu: bông, cồn sát trùng, garô, bơm

tiêm; ống nghiệm 3 ml tráng EDTA.

▪ Nguyên liệu, vật tư tiêu hao dùng để thực hiện phản ứng PCR xác định kiểu gen

HLA của đối tượng nghiên cứu: kit tách chiết ADN E.Z.N.A.® Tissue DNA Kit

(Omega Bio-tek, Mỹ); dung môi Isopropanol 99% (IBI Scientific, Mỹ); dung môi

Ethanol 99% (Merk, Mỹ); PCR master mix 2x (Promega, Mỹ); nước không

nuclease (Promega, Mỹ); dung dịch đệm TBE10X (Thermofisher, Mỹ); MgCl2

50Mm (Thermofisher, Mỹ); dung dịch nhuộm ADN Redsafe 20,000x (Intron, Hàn

Quốc ); thang ADN 100 bp (Invitrogen, Mỹ); thạch agarose (BioBasic, Canada);

mồi PCR (IDT, Mỹ).

2.2.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu

▪ Tủ an toàn sinh học Esco AC2-4E8 (ESCO, Singapo), tủ lạnh 4oC (Toshiba, Nhật

Bản), tủ lạnh – 20oC (Toshiba, Nhật Bản), tủ lạnh – 80oC (Toshiba, Nhật Bản).

▪ Máy minispin Z130M (Hermle, Đức), máy Vortex (Scientific Industries Inc, Mỹ),

máy ly tâm 5424R (Eppendorf, Mỹ), máy NanoDrop 2000 (Thermofisher, Mỹ),

máy PCR gradient Veriti™ Thermal Cycler (Applied Biosystems, Mỹ), máy PCR

Thermal Cycler 2720 (Applied Biosystems, Mỹ), máy điện di Mupid – 2 plus

(Optima, Nhật Bản), máy chụp ảnh gel Geldoc (Bio Rad, Mỹ).

▪ Lò vi sóng SANYO EM- G7560 V/W (Nhật Bản).

▪ Bộ pipet 1000, 200, 20, 10, 2, 1 µl (Eppendorf, Đức).

2.3. Phương pháp nghiên cứu

810 người Kinh Việt Nam

Bệnh nhân người Kinh Việt Nam

Mẫu ADN đã biết kiểu gen

trong cộng đồng

sử dụng allopurinol

HLA-A, HLA-B, HLA-C

2.3.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Xây dựng quy trình

Khám lâm sàng

Thiết kế/ lựa chọn mồi

Khảo sát thông số hoạt động

Cận lâm sàng

của quy trình

183 bệnh nhân

100 bệnh nhân

dung nạp với

SCARs do

allopurinol

Khai thác thông tin

Tuổi, giới, tiền sử bệnh, tiền sử dị

Tuổi, giới, tiền sử bệnh, tiền

ứng, bệnh mắc kèm, thông tin sử

sử dị ứng, bệnh mắc kèm

dụng thuốc

100 ADN

mẫu chưa

biết kiểu gen

Tách ADN

Thẩm định quy trình

(Giải trình tự Sanger)

Xác định tần suất alen, tần suất cá thể mang alen, tổ hợp các alen

Độ nhạy, độ đặc hiệu, hệ số

HLA-A*33:03, HLA-B*58:01, HLA-C*03:02

Cohen’s kappa

Đánh giá mối liên quan giữa từng alen, tổ hợp các alen

và các yếu tố khác với nguy cơ SCARs do allopurinol

ở người Kinh Việt Nam

KẾT LUẬN

Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu giải quyết mục tiêu 1 “Xây dựng và thẩm định quy

trình phát hiện 3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02”

Xây dựng, tối ưu hóa quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03, HLA-C*03:02 tại Khoa

Dinh dưỡng và Bệnh không lây nhiễm, Viện Dinh dưỡng Quốc gia. Xây dựng, tối ưu hóa quy

trình phát hiện alen HLA-B*58:01 tại Phòng Sinh học phân tử ứng dụng, Trung tâm Nghiên

cứu Y sinh học, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương.

2.3.2.1. Phương pháp tách chiết ADN

▪ ADN tổng số từ máu toàn phần được tách chiết bằng bộ kit ADN E.Z.N.A.® Tissue DNA

Kit (Omega Bio-tek, Mỹ) theo quy trình của nhà sản xuất.

▪ 5 µL ADN tổng số được nhuộm bằng Redsafe sau đó chạy điện di trên gel trong 30 phút

để đánh giá độ nguyên vẹn của ADN. Sau quá trình điện di, ảnh chụp gel thu được 1 băng

duy nhất, đậm, sáng màu, ADN được coi là nguyên vẹn.

▪ Kiểm tra hàm lượng và độ tinh sạch của ADN bằng máy Nanodrop 2000

spectrophotometer (Thermofisher, Mỹ), đo độ hấp thụ UV ở 260 nm, tỷ số hấp thụ

A260/280 và A260/230. Các mẫu ADN đạt yêu cầu chất lượng với giới hạn chấp nhận là

1,6 – 2,0 đối với A260/A280 và 1,5 – 2,0 đối với A260/A230.

▪ Các mẫu ADN đạt yêu cầu chất lượng được lưu trong ống eppendorf đã tiệt khuẩn có ghi

code tương ứng trên cả nắp và thân ống bằng bút chuyên dụng. Các mẫu ADN được bảo

quản ở - 80oC cho tới khi làm xét nghiệm.

▪ Các ống mẫu ADN được lưu trữ theo danh sách từng nhóm đối tượng nghiên cứu, sắp xếp

theo số thứ tự code từ nhỏ đến lớn vào các hộp lưu trữ, tối đa 90 mẫu/hộp để thuận tiện

cho quá trình tìm mẫu cũng như tránh nhầm lẫn mẫu trong quá trình xét nghiệm.

2.3.2.2. Phương pháp xây dựng quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03

a) Nguyên tắc chung: xây dựng quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03 bằng phương pháp

PCR lồng đặc hiệu alen (Nested Allele specific PCR – nested AS – PCR) gồm 2 bước

PCR như sau:

▪ Bước 1: Thiết kế cặp mồi đặc hiệu khuếch đại vùng exon 2 – exon 3 của gen HLA-A. Sử

dụng sản phẩm PCR thu được ở bước 1 làm khuôn cho phản ứng PCR ở bước 2.

▪ Bước 2: Thiết kế mồi đặc hiệu alen (Allele specific primer) có thêm 1 nucleotid không bổ

sung với khuôn ADN (mismatch), sử dụng chu trình nhiệt touchdown để tăng tính đặc

hiệu. Thực hiện đồng thời 3 phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho alen HLA-A*33:03,

cặp mồi đặc hiệu cho hai alen HLA-A*29:01 và HLA-A*31:01 (có trình tự ADN tương tự

với alen HLA-A*33:03) và cặp mồi đặc hiệu cho nhóm 18 alen HLA-A còn lại đã được

công bố trong cộng đồng người Kinh Việt Nam [11]. Sản phẩm PCR được điện di trên gel

agarose. Dựa vào sự xuất hiện của các sản phẩm PCR ở mỗi giếng để phát hiện và phân

biệt thể đồng hợp tử/dị hợp tử của alen HLA-A*33:03.

b) Phương pháp thiết kế mồi

Trước hết, tiến hành so sánh trình tự của 21 alen HLA-A trong cộng đồng người Kinh

Việt Nam theo công bố của Bạch Khánh Hòa [11] bằng chức năng so sánh trình tự các alen

tham chiếu tại cơ sở dữ liệu IPD-IMGT/HLA [159] và so sánh trình tự của các mồi đã công

bố [105], [135] để lựa chọn các vị trí nucleotid và SNP phù hợp nhằm thiết kế mồi cho quy

trình phát hiện alen HLA-A*33:03.

Từ các vị trí nucleotid đã lựa chọn, sử dụng công cụ tin sinh học Primer3 v0.4.0 [157]

hoặc điều chỉnh mồi đã công bố trước đó [105], [135] để thiết kế cặp mồi khuếch đại đặc hiệu

vùng exon 2 – exon 3 của gen HLA-A. Từ các SNP đã lựa chọn, sử dụng công cụ tin sinh học

BatchPrimer3 v1.0 [158] để thiết kế mồi đặc hiệu alen hoặc bổ sung mismatch mạnh [145]

trong trường hợp phản ứng PCR trên thực nghiệm xuất hiện dương tính giả.

Kiểm tra các thông số (số lượng nucleotid, tỷ lệ GC, nhiệt độ nóng chảy, khả năng tự

bắt cặp giữa các mồi, khả năng tự bắt cặp bổ sung ở đầu 3’ của mỗi mồi) và độ đặc hiệu của

tất cả các mồi vừa thiết kế bằng công cụ tin sinh học Primer – BLAST [161]. Các cặp mồi đã

thiết kế sau đó được tổng hợp bởi Công ty IDT (Coralville, Iowa, Mỹ).

c) Khảo sát các thông số hoạt động của quy trình nested AS – PCR phát hiện alen HLA-

A*33:03

▪ Phản ứng PCR bước 1:

Luận án sử dụng 4 mẫu ADN ngẫu nhiên (đánh số từ 1 – 4) để thực hiện khảo sát điều

kiện hoạt động của cặp mồi HLAAB1F/HLAAB1R. Thành phần phản ứng có tổng thể tích

20 µl, bao gồm: 2 µl ADN (20 ng/µl), 10 µl PCR Master mix 2x, 1 µl mỗi mồi (10 pM/µl), và

6 µl nước không nuclease. Tiến hành khảo sát với các nhiệt độ bắt cặp và số chu kỳ phản ứng

khác nhau để lựa chọn chu trình nhiệt tối ưu, cụ thể như sau:

o Khảo sát nhiệt độ bắt cặp: 95oC – 3 phút; 28 chu kỳ (95oC – 3 phút, dãy nhiệt độ

63oC/65oC/67oC – 30 giây, 72oC – 60 giây); 72oC – 7 phút; giữ ở 25oC.

o Khảo sát số chu kỳ phản ứng: 95oC – 3 phút; với 24/26/28 chu kỳ (95oC – 3 phút,

63oC – 30 giây, 72oC – 60 giây); 72oC – 7 phút; giữ ở 25oC.

▪ Phản ứng PCR bước 2:

Luận án sử dụng 5 mẫu chứng ADN đã biết kiểu gen HLA-A, bao gồm 4 mẫu chứng

dương A*33:03/33:03, A*33:03/02:03, A*33:03/11:01, A*33:03/02:07 và 1 mẫu chứng âm

A*11:01/29:01 để thực hiện phản ứng PCR bước 1, thu được sản phẩm PCR đặc hiệu có kích

thước 992 bp. Lấy 1 µl sản phẩm PCR của mỗi mẫu pha loãng 100 lần. Sau đó, sản phẩm

PCR pha loãng của mỗi mẫu được sử dụng làm khuôn cho 3 phản ứng PCR với 3 cặp mồi ở

bước 2. Phản ứng PCR của mỗi cặp mồi được thực hiện ở các ống nghiệm khác nhau. Các

phản ứng PCR ở bước 2 sử dụng chu trình nhiệt touchdown để tăng tính đặc hiệu của các cặp

mồi.

Thành phần phản ứng tương ứng của mỗi cặp mồi có tổng thể tích 20 µl, bao gồm: 1

µl sản phẩm PCR bước 1 pha loãng 100 lần, 10 µl PCR Master mix 2x, 1 µl mỗi mồi (10

pM/µl), và 7 µl nước không nuclease. Khảo sát các thông số nhiệt độ bắt cặp, số chu kỳ phản

ứng để lựa chọn cùng 1 chu trình nhiệt touchdown cho 3 cặp mồi sử dụng ở bước 2, cụ thể

như sau:

o Khảo sát số chu kỳ và nhiệt độ bắt cặp – lần 1: 95oC – 3 phút; 5 chu kỳ (95oC – 30

giây, 70oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 5 chu kỳ (95oC – 30 giây, 67oC – 30 giây, 72oC

– 30 giây); 10 chu kỳ (95oC – 30 giây, 65oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 15 chu kỳ

(95oC – 30 giây, dãy nhiệt độ 54oC/56oC/58oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 72oC – 7

phút; và giữ ở 25oC.

o Khảo sát số chu kỳ và nhiệt độ bắt cặp – lần 2: 95oC – 3 phút; 5 chu kỳ (95oC – 30

giây, 70oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 5 chu kỳ (95oC – 30 giây, 67oC – 30 giây, 72oC

– 30 giây); 10 chu kỳ (95oC – 30 giây, 65oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 20 chu kỳ

(95oC – 30 giây), dãy nhiệt độ 54oC/56oC/58oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 72oC –

7 phút; và giữ ở 25oC.

o Khảo sát số chu kỳ và nhiệt độ bắt cặp – lần 3: 95oC – 3 phút; 5 chu kỳ (95oC – 30

giây, 67oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 5 chu kỳ (95oC – 30 giây, 65oC – 30 giây,

72oC – 30 giây); 10 chu kỳ (95oC – 30 giây, 63oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 20 chu

kỳ (95oC – 30 giây, dãy nhiệt độ 54oC/56oC/58oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 72oC

– 7 phút; và giữ ở 25oC.

2.3.2.3. Phương pháp xây dựng quy trình phát hiện alen HLA-B*58:01

a) Lựa chọn mồi

So sánh trình tự của 37 alen HLA-B trong cộng đồng người Kinh Việt Nam theo công

bố của Bạch Khánh Hòa và các cộng sự [11] bằng chức năng so sánh trình tự các alen tham

chiếu tại cơ sở dữ liệu IPD-IMGT/HLA [159] và so sánh trình tự các cặp mồi phát hiện alen

HLA-B*58:01 đã công bố [63], [96], [121], [151] để lựa chọn cặp mồi có thể phân biệt alen

HLA-B*58:01 với 36 alen HLA-B khác, đặc biệt là phân biệt được với alen HLA-B*57:01

(alen có trình tự ADN tương tự với HLA-B*58:01) và tiến hành khảo sát lựa chọn các thông

số hoạt động của quy trình để phát hiện alen HLA-B*58:01 bằng phương pháp SSP – PCR.

b) Khảo sát các thông số hoạt động của quy trình SSP – PCR phát hiện alen HLA-

B*58:01

Luận án sử dụng 3 mẫu ADN đã được xác định kiểu gen HLA-B, bao gồm 1 mẫu

chứng dương B*58:01/46:01 và 2 mẫu chứng âm B*40:01/40:06; B*46:01/55:02, để khảo

sát điều kiện hoạt động của các cặp mồi. Khảo sát các thông số hoạt động của quy trình cụ thể

như sau:

▪ Khảo sát nhiệt độ bắt cặp: Thành phần hỗn hợp phản ứng có tổng thể tích 15 µl bao gồm:

2 µl ADN (20 ng/µl), 7,5 µl PCR Master mix 2x, HLAB5801F và HLAB5801R mỗi mồi

1,5 µl (10 pM/µl), ACTBF và ACTBR mỗi mồi 0,3 µl (10 pM/µl) và 1,9 µl nước không

nuclease. Chu trình nhiệt: 95oC – 3 phút; 5 chu kỳ (95oC – 30 giây, 70oC – 30 giây, 72oC

– 30 giây); 5 chu kỳ (95oC – 30 giây, 67oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 10 chu kỳ (95oC –

30 giây, 65oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 20 chu kỳ (95oC – 30 giây, dãy nhiệt độ

53oC/55oC/57oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 72oC – 7 phút; và giữ ở 25oC.

▪ Khảo sát nồng độ cặp mồi HLAB5801F/HLAB5801R: Thành phần hỗn hợp phản ứng có

tổng thể tích 15 µl bao gồm: 2 µl ADN (20 ng/µl), 7,5 µl PCR Master mix 2x,

HLAB5801F và HLAB5801R mỗi mồi ở các nồng độ 0,9/1,2 µl (10 pM/µl), ACTBF và

ACTBR mỗi mồi 0,3 µl (10 pM/µl) và nước không nuclease vừa đủ. Chu trình nhiệt: 95oC

– 3 phút; 5 chu kỳ (95oC – 30 giây, 70oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 5 chu kỳ (95oC – 30

giây, 67oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 10 chu kỳ (95oC – 30 giây, 65oC – 30 giây, 72oC –

30 giây); 20 chu kỳ (95oC – 30 giây, 55oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 72oC – 7 phút; và

giữ ở 25oC.

▪ Khảo sát nồng độ MgCl2: Thành phần hỗn hợp phản ứng có tổng thể tích 15 µl bao gồm:

2 µl ADN (20 ng/µl), 7,5 µl PCR Master mix 2x, MgCl2 ở các nồng độ 0,3/0,45/0,6 µl (50

mM/µl) HLAB5801F và HLAB5801R mỗi mồi 1,2 µl (10 pM/µl), ACTBF và ACTBR

mỗi mồi 0,3 µl (10 pM/µl) và nước không nuclease vừa đủ. Chu trình nhiệt: 95oC – 3 phút;

5 chu kỳ (95oC – 30 giây, 70oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 5 chu kỳ (95oC – 30 giây, 67oC

– 30 giây, 72oC – 30 giây); 10 chu kỳ (95oC – 30 giây, 65oC – 30 giây, 72oC – 30 giây);

20 chu kỳ (95oC – 30 giây, 55oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 72oC – 7 phút; và giữ ở 25oC.

2.3.2.4. Phương pháp xây dựng quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02

a) Nguyên tắc chung: tương tự như quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03, xây dựng quy

trình phát hiện alen HLA-C*03:02 bằng phương pháp nested AS – PCR gồm 2 bước như

o Bước 1: Thiết kế cặp mồi đặc hiệu khuếch đại vùng exon 2 – exon 3 của các gen HLA-

C. Sử dụng sản phẩm PCR thu được ở bước 1 làm khuôn cho phản ứng PCR ở bước

o Bước 2: Thiết kế mồi đặc hiệu alen có thêm 1 nucleotid không bổ sung với khuôn

ADN (mismatch), sử dụng chu trình nhiệt touchdown để tăng tính đặc hiệu. Thực hiện

đồng thời 3 phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho alen HLA-C*03:02, cặp mồi đặc

hiệu cho hai alen HLA-C*03:03, HLA-C*03:04 (có trình tự ADN tương tự với alen

HLA-C*03:02) và cặp mồi đặc hiệu cho nhóm 15 alen HLA-C còn lại đã được công

bố trong cộng đồng người Kinh Việt Nam [11]. Sản phẩm PCR được điện di trên gel

agarose. Dựa vào sự xuất hiện của các sản phẩm PCR ở mỗi giếng để phát hiện và

phân biệt thể đồng hợp tử/dị hợp tử của alen HLA-C*03:02.

b) Phương pháp thiết kế mồi

Tương tự như nguyên tắc thiết kế mồi của quy trình phát hiện alen HLA-A*33:03, để

thiết kế mồi cho quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02, tiến hành so sánh trình tự của 15 alen

HLA-C trong cộng đồng người Kinh Việt Nam theo công bố của Bạch Khánh Hòa và các

cộng sự [11] bằng chức năng so sánh trình tự các alen tham chiếu tại cơ sở dữ liệu IPD-

IMGT/HLA [159] và so sánh trình tự các cặp mồi đã công bố [72], [105] để lựa chọn các vị

trí nucleotid và SNP phù hợp nhằm thiết kế mồi cho quy trình phát hiện alen HLA-C*03:02.

Từ vị trí các nucleotid và SNP đã lựa chọn, sử dụng công cụ tin sinh học Primer3

v0.4.0 [157], BatchPrimer3 v1.0 [158] và điều chỉnh các mồi đã công bố trước đó [72], [105]

để thiết kế mồi cho quy trình. Kiểm tra các thông số (số lượng nucleotid, tỷ lệ GC, nhiệt độ

nóng chảy, khả năng tự bắt cặp giữa các mồi, khả năng tự bắt cặp bổ sung ở đầu 3’ của mỗi

mồi) và độ đặc hiệu của tất cả các mồi vừa thiết kế bằng công cụ tin sinh học Primer – BLAST

[161]. Các cặp mồi đã thiết kế sau đó được tổng hợp bởi Công ty IDT (Coralville, Iowa, Mỹ).

c) Khảo sát các thông số hoạt động của quy trình nested AS – PCR phát hiện alen HLA-

C*03:02

▪ Phản ứng PCR bước 1:

Luận án sử dụng 4 mẫu ADN ngẫu nhiên (đánh số từ 1 – 4) để thực hiện khảo sát điều

kiện hoạt động của cặp mồi HLACB1F/HLACB1R. Thành phần phản ứng có tổng thể tích

20 µl, bao gồm: 2 µl ADN (20 ng/µl), 10 µl PCR Master mix 2x, 1 µl mỗi mồi (10 pM/µl), và

6 µl nước không nuclease. Tiến hành khảo sát với các nhiệt độ bắt cặp và số chu kỳ phản ứng

khác nhau để lựa chọn chu trình nhiệt tối ưu, cụ thể như sau:

o Khảo sát nhiệt độ bắt cặp: 95oC – 3 phút; 28 chu kỳ (95oC – 3 phút, dãy nhiệt độ

63oC/65oC/67oC – 30 giây, 72oC – 60 giây); 72oC – 7 phút; và giữ ở 25oC.

o Khảo sát số chu kỳ phản ứng: 95oC – 3 phút; với 26/28/30 chu kỳ (95oC – 3 phút,

63oC – 30 giây, 72oC – 60 giây); 72oC – 7 phút; và giữ ở 25oC.

▪ Phản ứng PCR bước 2:

Luận án sử dụng 5 mẫu ADN đã được xác định kiểu gen HLA-C, bao gồm 4 mẫu

chứng dương C*03:02/03:02, C*03:02/03:03, C*03:02/12:02, C*03:02/11:01, và 1 chứng

âm C*01:02/04:03, để thực hiện phản ứng PCR bước 1, thu được sản phẩm PCR đặc hiệu có

kích thước 912 bp. Lấy 1 µl sản phẩm PCR của mỗi mẫu pha loãng 100 lần. Sau đó, sản phẩm

PCR pha loãng của mỗi mẫu được sử dụng làm khuôn cho 3 phản ứng PCR với 3 cặp mồi ở

bước 2. Phản ứng PCR của mỗi cặp mồi được thực hiện ở các ống nghiệm khác nhau. Các

phản ứng PCR ở bước 2 sử dụng chu trình nhiệt touchdown để tăng tính đặc hiệu của các cặp

mồi.

Khảo sát các thông số thể tích ADN khuôn, nhiệt độ bắt cặp, số chu kỳ phản ứng để

lựa chọn cùng 1 chu trình nhiệt touchdown cho 3 cặp mồi sử dụng ở bước 2, cụ thể như sau:

o Khảo sát thể tích ADN khuôn, số chu kỳ và nhiệt độ bắt cặp – lần 1: Thành phần hỗn

hợp phản ứng tương ứng của mỗi cặp mồi có tổng thể tích 20 µl bao gồm: 0,5 µl sản

phẩm PCR bước 1 pha loãng 100 lần, 10 µl PCR Master mix 2x, 1 µl mỗi mồi (10

pM/µl), và 7,5 µl nước không nuclease. Khảo sát chu trình nhiệt: 95oC – 3 phút; 5

chu kỳ (95oC – 30 giây, 70oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 5 chu kỳ (95oC – 30 giây,

67oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 10 chu kỳ (95oC – 30 giây, 65oC – 30 giây, 72oC –

30 giây); 15 chu kỳ (95oC – 30 giây, dãy nhiệt độ 54oC/56oC/58oC – 30 giây, 72oC

– 30 giây); 72oC – 7 phút; và giữ ở 25oC.

o Khảo sát thể tích ADN khuôn, số chu kỳ và nhiệt độ bắt cặp – lần 2: Thành phần hỗn

hợp phản ứng tương ứng của mỗi cặp mồi có tổng thể tích 20 µl bao gồm: 1 µl sản

phẩm PCR bước 1 pha loãng 100 lần, 10 µl PCR Master mix 2x, 1 µl mỗi mồi (10

pM/µl), và 7 µl nước không nuclease. Khảo sát chu trình nhiệt: 95oC – 3 phút; 5 chu

kỳ (95oC – 30 giây, 70oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 5 chu kỳ (95oC – 30 giây, 67oC

– 30 giây, 72oC – 30 giây); 10 chu kỳ (95oC – 30 giây, 65oC – 30 giây, 72oC – 30

giây); 15 chu kỳ (95oC – 30 giây, dãy nhiệt độ 54oC/56oC/58oC – 30 giây, 72oC –

30 giây); 72oC – 7 phút; và giữ ở 25oC.

o Khảo sát thể tích ADN khuôn, số chu kỳ và nhiệt độ bắt cặp – lần 3: Thành phần hỗn

hợp phản ứng tương ứng của mỗi cặp mồi có tổng thể tích 20 µl bao gồm: 1 µl sản

phẩm PCR bước 1 pha loãng 100 lần, 10 µl PCR Master mix 2x, 1 µl mỗi mồi (10

pM/µl), và 7 µl nước không nuclease. Khảo sát chu trình nhiệt: 95oC – 3 phút; 5 chu

kỳ (95oC – 30 giây, 70oC – 30 giây, 72oC – 30 giây); 5 chu kỳ (95oC – 30 giây, 67oC

– 30 giây, 72oC – 30 giây); 10 chu kỳ (95oC – 30 giây, 65oC – 30 giây, 72oC – 30

giây); 20 chu kỳ (95oC – 30 giây, dãy nhiệt độ 54oC/56oC/58oC – 30 giây, 72oC –

30 giây); 72oC – 7 phút; và giữ ở 25oC.

2.3.2.5. Phương pháp thẩm định các quy trình đã xây dựng

Thẩm định quy trình bằng phương pháp giải trình tự Sanger tại Viện Công nghệ ADN

và Phân tích di truyền, thực hiện theo hợp đồng đã ký (Phụ lục 8).

▪ Tiến hành xét nghiệm các gen HLA-A, HLA-B, HLA-C trên 100 mẫu ADN chưa biết kiểu

gen HLA bằng các quy trình PCR đã xây dựng song song với phương pháp giải trình tự

Sanger. Việc giải trình tự vùng gen mục tiêu thực hiện theo quy trình và các cặp mồi được

mô tả bởi Peterson và cộng sự [105]. Sử dụng bộ kit BigDyeTMTerminator v3.1 Cycle

Sequencing Kit (ThermoFisher Scientific, Waltham, USA) và máy giải trình tự tự động

ABITM3500 analyzer (Applied Biosystems, Massachusetts, USA).

▪ Nguyên tắc giải trình tự Sanger gen HLA: vùng exon 2 – exon 3 của các gen HLA-A, HLA-

B và HLA-C được khuếch đại bằng các cặp mồi PCR tương ứng. Sản phẩm PCR được

tinh sạch và sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR giải trình tự với 4 mồi bao gồm 2 mồi

xuôi (vị trí gắn mồi ở intron 1 và intron 2) và 2 mồi ngược (vị trí gắn mồi ở intron 3 và

intron 2) [105].

▪ Từ kết quả thu được bằng 2 phương pháp, tính độ nhạy, độ đặc hiệu của quy trình đã xây

dựng và hệ số tương đồng kappa (Cohen’s kappa coefficient) giữa 2 phương pháp.

2.3.3. Phương pháp nghiên cứu giải quyết mục tiêu 2 “Xác định tần suất của 3 alen

HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02 trong cộng đồng người Kinh Việt

Nam”

2.3.3.1. Phương pháp nghiên cứu chung

▪ Phương pháp nghiên cứu: mô tả cắt ngang

▪ Các chỉ tiêu nghiên cứu

o Thông tin về nhân khẩu học: tuổi, giới, hộ khẩu thường trú, địa chỉ

o Các yếu tố nguy cơ: Tiền sử bệnh, tiền sử dị ứng, bệnh mắc kèm.

o Kiểu gen HLA lớp I của các đối tượng nghiên cứu: xác định sự có mặt hay không của

3 alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01, HLA-C*03:02 ở từng đối tượng nghiên cứu.

2.3.3.2. Phương pháp thu mẫu

▪ Tiến hành thu mẫu thuận tiện tại ba trường đại học thuộc 3 vùng Bắc, Trung, Nam, gồm

có trường Đại học Dược Hà Nội, Đại học Hà Tĩnh, Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí

Minh. Đây là những trường đại học uy tín ở 3 miền đất nước, do đó các sinh viên sẽ từ các

địa phương khác nhau trong mỗi vùng tập trung về, đảm bảo phạm vi lấy mẫu nghiên cứu;

đồng thời kiểm soát được nguồn gốc dân tộc Kinh của mỗi đối tượng nghiên cứu. Tại mỗi

trường, dùng công cụ máy tính để lựa chọn ngẫu nhiên một số lớp trong toàn bộ các khóa,

một số học sinh trong mỗi lớp.

▪ Thu thập các thông tin theo biểu mẫu.

▪ Quá trình lấy mẫu máu, bảo quản và vận chuyển mẫu:

o Thu 3 ml máu tĩnh mạch toàn phần vào ống nghiệm tráng chất chống đông EDTA.

Các ống mẫu được dán code tương ứng với phiếu thông tin của đối tượng nghiên cứu.

o Các mẫu máu được bảo quản và vận chuyển ở 4 - 8°C về Phòng sinh học phân tử

ứng dụng, Trung tâm Nghiên cứu Y sinh học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương trong

vòng 24 giờ.

o Tất cả mẫu máu được bảo quản ở -20oC tại Phòng sinh học phân tử ứng dụng, Trung

tâm Nghiên cứu Y sinh học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cho tới khi tách chiết

ADN.

2.3.3.3. Phương pháp phát hiện 3 alen HLA lớp I và tính tần suất alen

Triển khai xác định kiểu gen HLA-A, HLA-C của các mẫu nghiên cứu tại Khoa Dinh

dưỡng và Bệnh không lây nhiễm, Viện Dinh dưỡng Quốc gia. Triển khai xác định kiểu gen

HLA-B của các mẫu nghiên cứu tại Phòng Sinh học phân tử ứng dụng, Trung tâm Nghiên cứu

Y sinh học, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương.

Alen HLA-A*33:03 và alen HLA-C*03:02 được phát hiện và phân biệt thể đồng hợp

tử/dị hợp tử bằng phương pháp nested AS – PCR. Hai quy trình đều gồm 2 bước PCR. Phản

ứng PCR với bước 1 sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đặc hiệu vùng exon 2 – exon 3 của

gen HLA-A/HLA-C. Ở bước 2, thực hiện đồng thời 3 phản ứng PCR với 3 cặp mồi ở 3 giếng

khác nhau để phát hiện và phân biệt thể đồng hợp tử/dị hợp tử của alen HLA-A*33:03/HLA-

C*03:02. Mô tả chi tiết đã được trình bày trong phần 2.3.2.

Tần suất cá thể mang alen được tính bằng tổng số cá thể dương tính với alen đích chia

cho cỡ mẫu nhóm nghiên cứu: Tần suất cá thể mang alen = (a + b)/n.

Tần suất alen được tính bằng tổng số alen đích chia cho tổng số alen của nhóm nghiên

cứu: Tần suất alen = (2 x a + b)/2n.

Trong đó, a: là số cá thể mang đồng hợp tử của alen đích; b: là số cá thể mang dị hợp

tử của alen đích; n: cỡ mẫu nhóm nghiên cứu [109].

2.3.4. Phương pháp nghiên cứu giải quyết mục tiêu 3 “Đánh giá mối liên quan của 3

alen HLA-A*33:03, HLA-B*58:01 và HLA-C*03:02 với nguy cơ phản ứng có hại

trên da nghiêm trọng khi dùng allopurinol ở bệnh nhân người Kinh Việt Nam”

2.3.4.1. Phương pháp nghiên cứu chung

a) Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu bệnh – chứng, kết hợp hồi cứu, thu mẫu thuận tiện 2 nhóm

bệnh nhân: nhóm bệnh nhân dung nạp với allopurinol và nhóm bệnh nhân bị SCARs do

allopurinol.

b) Các chỉ tiêu nghiên cứu

▪ Các chỉ tiêu nghiên cứu đối với nhóm bệnh nhân dung nạp với allopurinol

o Thông tin về nhân khẩu học: tuổi, giới, dân tộc, hộ khẩu thường trú, địa chỉ

o Thông tin về sử dụng thuốc allopurinol: thời gian dùng allopurinol, chỉ định dùng

allopurinol (gút, tăng acid uric máu không có triệu chứng, dự phòng tăng acid uric

máu), liều dùng khởi đầu, liều dùng hàng ngày.

o Các yếu tố nguy cơ: tiền sử bệnh, tiền sử dùng thuốc cùng allopurinol trong vòng ba

tháng gần nhất, tiền sử dị ứng, bệnh mắc kèm.

o Có hay không các dấu hiệu bất thường trong vòng ba tháng sau khi bắt đầu sử dụng

allopurinol.

o Kiểu gen HLA của các đối tượng nghiên cứu: xác định sự có mặt hay không của 3 alen

HLA-A*33:03, HLA-B*58:01, HLA-C*03:02 ở từng bệnh nhân.

o Mức lọc cầu thận ước tính eGFR (ml/ph/1,73m2) được tính theo công thức chuyển đổi

MDRD từ kết quả creatinin huyết tương [77], [92], [125].

▪ Các chỉ tiêu nghiên cứu đối với nhóm bệnh nhân bị SCARs do allopurinol

o Thông tin về nhân khẩu học: tuổi, giới, dân tộc, hộ khẩu thường trú, địa chỉ

o Thông tin về sử dụng thuốc allopurinol: thời gian dùng allopurinol, chỉ định dùng

allopurinol (gút, tăng acid uric máu không có triệu chứng, dự phòng tăng acid uric

máu), liều dùng khởi đầu, liều dùng hàng ngày.

o Thời gian kể từ lúc bắt đầu sử dụng allopurinol đến khi xuất hiện các triệu chứng dị

ứng, các biểu hiện lâm sàng và kết quả xét nghiệm cận lâm sàng liên quan đến phản

ứng trên da nghiêm trọng do allopurinol.

o Các yếu tố nguy cơ: tiền sử bệnh, tiền sử dùng thuốc cùng allopurinol trong vòng ba

tháng gần nhất, tiền sử dị ứng, bệnh mắc kèm.

o Týp SCARs của từng bệnh nhân phân loại theo tiêu chí của hệ thống các nghiên cứu

RegiSCAR [156].

o Kiểu gen HLA của các đối tượng nghiên cứu: xác định sự có mặt hay không của 3 alen

HLA-A*33:03, HLA-B*58:01, HLA-C*03:02 ở từng bệnh nhân.

o Mức lọc cầu thận ước tính eGFR (ml/phút/1,73m2) được tính theo công thức chuyển

đổi MDRD từ kết quả creatinin huyết tương [77], [92], [125].

c) Nguyên tắc các xét nghiệm cận lâm sàng thực hiện trong nghiên cứu

Các xét nghiệm hóa sinh được thực hiện tại Khoa Hóa sinh Bệnh viện Đa khoa tỉnh

Thái Bình và Khoa Hóa sinh Bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội. Mẫu máu được lấy và xét nghiệm

trong cùng ngày bằng máy Cobas 8000 (Roche, Hitachi, Đức).

 Mức lọc cầu thận ước tính eGFR (mL/ph/1,73m2)

▪ Là thông số đánh giá chức năng lọc của cầu thận, được tính theo công thức chuyển đổi

MDRD từ kết quả định lượng creatinin huyết tương bằng phương pháp enzym. Đơn vị đo

µmol/l.

▪ Nguyên tắc định lượng creatinin huyết tương bằng phương pháp enzym dựa trên quá trình

chuyển hóa creatinin với sự tham gia của các enzym creatininase, creatinase và sarcosine

oxidase thành glycin, formaldehyde và hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide giải phóng

ra phản ứng với 4 – aminophenazone và HTIB với sự xúc tác của peroxidase, tạo thành

quinoneimine có màu. Cường độ màu đậm nhạt của quinoneimine tạo thành tỷ lệ thuận

với nồng độ creatinin trong hỗn hợp phản ứng.

cretininase → Creatine

Creatinin + H2O

creatinase → Sarcosine + urea

Creatine + H2O

sarcosine oxidase → glycin + HCHO + H2O2

Sarcosine + O2 + H2O

peroxidase → quinoneimine + H2O + HI

H2O2 + 4 – aminophenazone + HTIB

▪ Áp dụng tính eGFR (mL/ phút/1,73m2) theo công thức quy đổi MDRD theo chương trình

trực tuyến tại trang web:

https://www.mdcalc.com/mdrd-gfr-equation

= 186 x (Creatinin huyết tương µmol/L x 0,011312)-1,154 x (tuổi)-0,203 x (0,742 cho nữ; 1 cho

nam).

 Hoạt độ enzym ASAT/GOT máu

▪ Nguyên tắc: phương pháp động học enzym. Hoạt độ ASAT được đo bằng sự giảm nồng

độ NADH theo thời gian ở bước sóng 340 nm.

AST ↔ Glutamat + Oxaloacetat

Aspartat +  - cetoglutarat

MDH → L. Malat + NAD+

Oxaloacetat + NADH + H+

 Hoạt độ enzym ALAT/GPT máu

▪ Nguyên tắc: phương pháp động học enzym. Hoạt độ ALAT được đo bằng sự giảm nồng

độ NADH theo thời gian ở bước sóng 340 nm.

ALT ↔ L – glutamate + Pyruvate

 - ketoglutarate + L – alanine

LDH ↔ L – lactate + NAD+

Pyruvate + NADH + H+

Xét nghiệm công thức máu được thực hiện tại Khoa huyết học – Truyền máu Bệnh

viện Đa khoa Thái Bình, tỉnh Thái Bình và Khoa Huyết học – Truyền máu, Bệnh viện Bạch

Mai, Hà Nội. Mẫu máu được lấy và xét nghiệm trong cùng ngày bằng máy ADVIA 2120

(Siemens, Berlin, Đức).

 Tổng phân tích tế bào máu ngoại vi

▪ Nguyên tắc tổng phân tích tế bào máu ngoại vi bằng máy ADVIA: Hỗn dịch pha loãng tế

bào máu ngoại vi được chuyển từ buồng trộn tới buồng đếm. Hỗn dịch được bơm vào dòng

dung dịch Sheath Rinse đang chảy nhanh. Dòng dung dịch Sheath Rinse và hỗn dịch pha

loãng tế bào máu ngoại vi chảy với tốc độ khác nhau và không bị hòa lẫn vào nhau. Cấu

trúc hình học đặc biệt của buồng đếm và tốc độ chảy cao của dòng dung dịch Sheath Rinse

ép dòng tế bào dịch chuyển theo thứ tự từng tế bào một. Khi tế bào tiếp xúc với tia laser, tế

bào làm tia laser khuếch tán theo nhiều hướng khác nhau. Các dữ liệu đo được ở các góc

khác nhau sẽ cho thông tin về kích thước tế bào, cấu trúc nội tại, hạt tế bào. Các dữ liệu đo

quang học thu được sẽ chuyển thành xung điện và được lưu trữ, phân tích bằng máy tính

[50].

2.3.4.2. Phương pháp thu mẫu

▪ Với nhóm bệnh nhân dung nạp với allopurinol

o Tiến hành thu mẫu các bệnh nhân theo tiêu chuẩn lựa chọn tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh

Thái Bình.

o Thu thập thông tin theo biểu mẫu

o Quá trình lấy mẫu máu, bảo quản và vận chuyển mẫu:

- Lấy 3 ml máu tĩnh mạch toàn phần chia vào 2 ống nghiệm: ống nghiệm tráng chất

chống đông EDTA (mẫu dùng để xét nghiệm gen HLA) và ống nghiệm tráng chất

chống đông Heparin (mẫu dùng để xét nghiệm sinh hóa). Các ống mẫu được dán

code tương ứng với phiếu thông tin của đối tượng nghiên cứu.

- Mẫu máu để xét nghiệm sinh hóa được bảo quản ở nhiệt độ phòng và thực hiện

xét nghiệm ngay trong ngày lấy mẫu tại Khoa Hóa sinh của bệnh viện.

- Mẫu máu để xét nghiệm gen HLA được bảo quản và vận chuyển ở 4 - 8°C về

Phòng sinh học phân tử ứng dụng, Trung tâm Nghiên cứu Y sinh học, Viện Vệ

sinh Dịch tễ Trung ương trong vòng 24 giờ. Tất cả mẫu máu để xét nghiệm gen

HLA được bảo quản ở -20oC tại Phòng sinh học phân tử ứng dụng, Trung tâm

Nghiên cứu Y sinh học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cho tới khi tách chiết

ADN.

▪ Với nhóm bệnh nhân bị SCARs do allopurinol

o Tiến hành thu mẫu các bệnh nhân SCARs do allopurinol theo tiêu chuẩn lựa chọn tại

Trung tâm Dị ứng – Miễn dịch Lâm sàng, Bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội.

o Thu thập thông tin theo các biểu mẫu.